一氧化氮的制约腺苷酸环化酶的亚型调节上皮细胞分泌功能障碍后暴露在电离辐射|肠道gydF4y2Ba

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肠道炎症gydF4y2Ba

一氧化氮的制约腺苷酸环化酶的亚型调节上皮细胞分泌功能障碍后暴露于电离辐射gydF4y2Ba

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S L·弗里曼gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
W K关于gydF4y2Ba

粘膜炎症研究小组和生理学和生物物理学系,卡尔加里大学,卡尔加里,加拿大gydF4y2Ba

通信:gydF4y2Ba
W博士关于gydF4y2Ba
卡尔加里大学生理学和生物物理学系,3330医院开车NW,卡尔加里,阿尔伯塔,加拿大T2N 4 n1;gydF4y2Bawmacnaugucalgary.cagydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景:gydF4y2BaHyporesponsiveness肠道上皮细胞的促分泌素发生在不同的肠道损伤的模型,包括辐射肠病,在人类疾病。虽然这屏障功能受损有关增加诱导一氧化氮合酶(间接宾语)活动,细胞的目标没有不知道这个现象,尽管最近的研究表明,一些亚型的腺苷酸环化酶抑制了没有。gydF4y2Ba

目的:gydF4y2Ba确定腺苷酸环化酶在结肠上皮细胞同种型分布,特别是没有制约的生理意义腺苷酸环化酶亚型5和6在辐射诱导上皮分泌功能障碍。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)、免疫细胞化学和免疫组织化学检查腺苷酸环化酶的表达。鼠标的响应性结肠促分泌素72小时post-15 Gy伽马辐射或体外接触后没有捐赠者以美国腔。同时,营地,cGMP, ATP水平测定。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Bart - pcr、免疫细胞化学和免疫组织化学显示,腺苷酸环化酶5表达小鼠结肠癌、和亚型5和6是人类活检和肠道上皮细胞中表达。药理研究表明,这些亚型在氯化物分泌功能重要。没有介导hyporesponsiveness促分泌素主要是腺苷酸环化酶活性下降的结果,而不是GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba激活或减少细胞ATP水平。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba没有制约的腺苷酸环化酶亚型表达在老鼠和人类分泌结肠上皮细胞,并似乎目标的辐射诱导没有依赖的促分泌素减少响应营地。gydF4y2Ba

电离辐射gydF4y2Ba
一氧化氮合酶gydF4y2Ba
一氧化氮gydF4y2Ba
氯化物分泌gydF4y2Ba

Isc,短路电流gydF4y2Ba
AC,腺苷酸环化酶gydF4y2Ba
SNP,硝普酸钠gydF4y2Ba
(爸爸NONOate, 1-propyl-1′) - aminopropyl 2-hydroxy-2-nitrohydraxinegydF4y2Ba
不,一氧化氮gydF4y2Ba
伊诺,诱导一氧化氮合酶gydF4y2Ba
rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应gydF4y2Ba
有限合伙人,脂多糖gydF4y2Ba
甘油醛3磷酸脱氢酶GAPDHgydF4y2Ba
TBS,三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐gydF4y2Ba
PBS,磷酸缓冲盐gydF4y2Ba
1400 w, N -(3 -(氨甲基苄基乙酰胺gydF4y2Ba
L-NIL, L -gydF4y2BaNgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba——(1-iminoethyl)赖氨酸gydF4y2Ba
PKA,蛋白激酶AgydF4y2Ba
PTX、百日咳毒素gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2003.023895gydF4y2Ba

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请求的权限gydF4y2Ba

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快速发展和持续肠上皮屏障的缺陷特征abdominopelvic暴露在治疗剂量的电离辐射和限制成功的癌症治疗,可能导致慢性辐射肠下垂。gydF4y2Ba^{1 -gydF4y2Ba}^3gydF4y2Ba几项研究已经联系一个腔的因素的发展辐射肠炎,以及炎症性肠病,这表明违反肠道屏障引发基因易感个体免疫介导的炎症反应。gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba ^5gydF4y2Ba对老鼠的研究显示,细菌易位从腔固有层暴露于电离辐射后发生。gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba临床、放射损伤使细菌脂多糖(LPS)穿过肠道屏障并启动一个反馈回路,有限合伙人和炎症介质引起进一步的上皮屏障功能障碍。gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba因此上皮屏障功能障碍是一种常见的行列式的胃肠道炎症条件,包括辐射肠病。gydF4y2Ba

隐窝上皮细胞的能力应对用氯,因此水促分泌素分泌上皮屏障的重要组成部分,保护肠道,防止细菌易位,细菌产品,固有层和抗原。gydF4y2Ba^8gydF4y2BaHyporesponsiveness促分泌素已经建立在不同型号的肠道损伤,包括暴露于电离辐射。gydF4y2Ba^{9 -gydF4y2Ba}^11gydF4y2Ba我们已经联系减少响应营地依赖的促分泌素诱导增加一氧化氮合酶(间接宾语)活动在一些动物模型。gydF4y2Ba^{10 -gydF4y2Ba}^12gydF4y2Ba然而,伊诺的细胞目标派生一氧化氮(NO)在氯化物分泌的抑制发生机理尚不清楚。根据先前的观察,没有调和hyporesponsiveness营地但不是CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}依赖的促分泌素,gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba ^13gydF4y2Ba在这项研究中我们主要集中在营地相关的分泌在辐射损伤。的相对丰度不同的腺苷酸环化酶(AC)亚型在调节中起着重要作用营相关的细胞反应。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba九个forskolin敏感膜结合腺苷酸环化酶亚型识别到目前为止,gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba亚型5和6 (AC5 AC6)特别感兴趣,因为他们是由没有选择性地抑制。gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba因此,我们假设,上皮AC5和/或AC6伊诺派生的直接目标是没有因此腺苷酸环化酶亚型负责营地依赖的促分泌素能够降低响应机理。为了验证这个假设,我们确定的分布腺苷酸环化酶亚型在肠粘膜和药物证明AC5和/或AC6功能氯化结肠分泌的重要方面。此外,我们使用急性辐射损伤的小鼠模型,以及没有捐赠者硝普酸钠(SNP)和爸爸NONOate,确定机制不依赖hyporesponsiveness促分泌素在小鼠结肠。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

T84细胞(段落40 - 64)是生长在1:1的混合物火腿的F12混合物和杜尔贝科的修改鹰的介质(σ,奥克维尔,安大略省,加拿大)补充谷氨酰胺为2.5毫米,0.09毫克/毫升泰乐菌素、青霉素110单位,0.11毫克/毫升链霉素,10%胎牛血清(σ)。细胞生长在75厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba水瓶(公司,正欲富兰克林湖,新泽西,美国)融合在每个实验之前的100%(5 - 7天)。细胞被维持在37°C的氛围中5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在空气中。汇合的时候,细胞通过使用1.5×胰蛋白酶和美联储每48小时。gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

雄性C57BL / 6小鼠(查尔斯河,蒙特利尔,魁北克,加拿大),4 - 6周的年龄,被安置在一个恒定的温度(22°C),光周期(12小时光:12小时黑暗周期),并提供免费的标准实验室食物和自来水。老鼠被允许5 - 7天来适应这些条件在实验开始之前。卡尔加里大学的动物保健委员会批准了所有程序涉及动物和实验按照规定建立的加拿大委员会动物保健。gydF4y2Ba

辐照协议gydF4y2Ba

有意识的老鼠身体约束在辐照或虚假的治疗。一个gydF4y2Ba^{127年gydF4y2Ba}Cs小动物辐照器(GammaCell 40勒索者;加拿大安大略省MDS Nordion, Kanata)被用来提供一个15 Gy平行的反对,全身γ辐照剂量率1.1 Gy /分钟。虚假的小鼠治疗相似但并不暴露在放射性源。老鼠研究治疗后72小时,根据我们以前的观测辐射诱导的分泌功能障碍。gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba

rt - pcr对腺苷酸环化酶同种型表达式gydF4y2Ba

逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),腺苷酸环化酶的表达亚型的鼠标是在粘膜被刮削下进行的冒号取自辐照和虚假的对待老鼠,结肠镜病人结肠活检标本,在T84细胞(左半结肠癌细胞株)。在小鼠研究中,结肠切除,纵向剖开,放在一个玻璃显微镜幻灯片在冰上。粘膜层从肌轻轻刮掉。20至30毫克的粘膜刮,在人类研究中,活检样本,被冻结在−70°C处理之前RNA提取使用RNAeasy迷你工具,根据制造商的说明(加拿大安大略省试剂盒Inc,米西索加)。简单、组织解冻和单一化裂解缓冲提供的工具包。样品是三分钟的最大速度(20 800gydF4y2BaggydF4y2Ba)和上层清液混合同等体积的70%乙醇。样品被加载到一个RNAeasy旋转列。核糖核酸纯化使用一系列的15秒洗旋转(9000gydF4y2BaggydF4y2Ba)提供的洗缓冲区。最后,从列筛选了RNA在30μl超纯核糖核酸酶游离水。T84为研究细胞,汇合的25厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba瓶的细胞直接刮成RNAeasy迷你工具包提供的裂解缓冲和细胞被分解在一个细胞粉碎机列(试剂盒)和处理如上所述。所有研究RNA的纯度和浓度测量使用II基因定量核酸分析仪(法玛西亚生物技术,乌普萨拉,瑞典)。RT反应,RNA(2μg)添加到2μl 10×PCR缓冲,核苷酸μl 10毫米,2μl NgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba0.5μl RNAguard, 300单位的上标酶,反应(10分钟20°C, 50分钟42°C, 10分钟在95°C)在ptc - 200珀尔帖效应进行热循环仪(美国加州MJ的研究中,阿拉米达)。互补脱氧核糖核酸从这个反应是冷却到4°C和储存在−20°C到PCR一步进行。gydF4y2Ba

结果cDNA放大了PCR利用以前发表的引物序列为人类AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, AC7 AC8, AC9。gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba引物序列为人类AC6(向前:5′-TGCCTCCATTGCCAACTTCT和反向:5′-GTGCTGTCCATACGACTAGA),鼠标AC6(转发:5′-GTACTACCAGTCGTGTGAATG和反向:5′-GTGCTGTCCATACGACTGGA),和鼠标AC4(转发:5′-GGAAGACGAGAAGGGCACCGCAAA)从Chabardes发表的序列和他的同事们进行了修改。gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba鼠标AC5正向和反向引物和AC4反向引物与引物出版。gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物作为内部控制。gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba最后的PCR反应混合物包含1×PCR缓冲,200μM每个核苷酸,0.5μM每个5′和3′底漆,2.5单位HotStartTaq DNA聚合酶(试剂盒),和2μl cDNA模板。反应是骑车40倍(在94°C,一分钟一分钟55°C,和一分钟72°C)。最后扩展步骤10分钟前在72°C的反应是冷却到4°C。样本含有溴化乙锭1%琼脂糖凝胶上分离了五分钟在80 V 100 V和35分钟。使用BioRad凝胶凝胶被拍到医生2000 (BioRad Inc .,赫拉克勒斯,加州,美国。gydF4y2Ba

免疫细胞化学gydF4y2Ba

T84细胞被播种在6.25×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞在胶原蛋白涂层/室和增长了3.5小时室幻灯片(Lab-tek Naperville,伊利诺斯州,美国)。媒体被和细胞被洗1×三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS)。细胞被固定在冰冷的甲醇为20分钟,洗在TBS,孵化30分钟0.1%叠氮化钠+ 0.3% HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在TBS,洗3×5分钟,阻塞在1%牛血清白蛋白和5%胎牛血清在修改鹰的媒介30分钟。主要antiadenylate环化酶5/6兔多克隆抗体(1:50)(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,加利福尼亚,美国)是用来确定没有制约亚型的蛋白表达。主要的抗体被3×5分钟在TBS耐洗。猪antirabbit生物素标记二次抗体(摘要;Dako诊断加拿大Inc .)、美国安大略省米西索加)是细胞孵育一小时之前被在TBS(3×5分钟)。Streptavidin-biotin-horseradish过氧化物酶混合细胞孵育一小时,细胞被洗了3×5分钟前在TBS与原子能委员会孵化基质系统(Dako诊断加拿大Inc .)在室温下15分钟。细胞在TBS,一旦在蒸馏水洗一次,和迈耶的苏木精复染色(丙烯酰胺Biochemika,奥克维尔,安大略,美国)。一滴Aquaperm安装介质被添加到每个室(Immunon Shandon,匹兹堡,宾夕法尼亚州,美国)。幻灯片使用DPX盖玻片(丙烯酰胺Biochemika)和被观察者不知道治疗的蔡司Axioplan显微镜。gydF4y2Ba

免疫组织化学gydF4y2Ba

小鼠结肠在Zamboni的固定剂固定15个小时,洗在磷酸缓冲盐(PBS: 0.55 KgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba0.01米,不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2BaHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba啊,叠氮化钠0.31 M氯化钠)为0.01%。冒号cryoprotected PBS中含20%蔗糖,嵌入到10月,冻结在−70°C。部分(10μm)被荣格厘米3000低温恒温器(加拿大安大略省徕卡微系统,里士满希尔),放在硅烷涂层的幻灯片,沾染了选择性AC5/6兔多克隆抗体(如上所述)一夜之间在4°C。一个CY3共轭驴antirabbit二级抗体(1:50 0;杰克逊Immunoresearch实验室、加拿大安大略省米西索加)是孵化的部分90分钟。然后他们被洗了三次在PBS,盖玻片,使用蔡司Axioplan数字化显微镜下呈现。图像捕获和数字化与CCD摄像机和北部曝光成像软件(Carsen视野,埃德蒙顿,加拿大阿尔伯塔省)。gydF4y2Ba

研究氯分泌gydF4y2Ba

老鼠辐照或虚假的治疗,如上所述,通过颈椎脱位72小时后死亡。结肠迅速切除,切肠系膜边境,安装在Ussing-type扩散室(哈佛装置,圣罗兰,魁北克,加拿大),和沐浴黏膜和浆膜面克雷布斯缓冲区,如前所述。gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba ^18gydF4y2Ba ^19gydF4y2Ba短路电流(Isc)电夹组织所需零伏特被用作测量有源电致离子运输的上皮。gydF4y2Ba

组织被允许建立一个稳定的基线Isc(约10分钟)在孵化前没有捐赠者硝普酸钠(SNP,钠pentacyanonitrosylferrate)或爸爸NONOate (1-propyl-1′- (aminopropyl) 2-hydroxy-2-nitrohydraxine),选择性伊诺抑制剂1400 w (N -(3 -(氨甲基苄基乙酰胺;5μM)gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba和L-NIL (L -gydF4y2BaNgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba——(1-iminoethyl)赖氨酸(3μM)gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba或适当的车辆控制。孵化后SNP与爸爸NONOate 25分钟或15分钟,组织受到浆膜附近一个最大浓度(10μM)直接的腺苷酸环化酶激活剂forskolin、钙依赖的促分泌素碳酰胆碱(10μM),或蛋白激酶a (PKA)活化剂8-Br-cAMP(1毫米)。一旦促分泌素补充说,最大的变化从基线Isc(ΔIsc)记录和表达为μA /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba。所有的药物都添加到浆膜的组织。gydF4y2Ba

在一些实验中,Isc的变化以应对forskolin测试单独或结合腺苷酸环化酶监管者10μM 8-Br-cAMP(激活PKA)或10μM碳酰胆碱(增加细胞内钙gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba})确定功能显著的腺苷酸环化酶亚型。在这些聚集有关的研究中,应对forskolin(10μM)单独比较与共同服用10μM forskolin + 10μM碳酰胆碱或10μM forskolin + 10μM 8-Br-cAMP辐照和虚假的对待老鼠,以及与没有冒号preincubated捐赠SNP。gydF4y2Ba

腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶的活动gydF4y2Ba

代营和cGMP测定小鼠黏膜被刮削下的碎屑或T84细胞。粘膜被刮削下得到如上所述,体重,和悬浮在克雷布斯的缓冲区(10毫米葡萄糖,pH值7.4,蛋白酶抑制剂亮抑酶肽,aprotonin,和抑肽素)。另外,1×10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaT84细胞被刮进1毫升新鲜杜尔贝科修改鹰的媒介。T84细胞或结肠粘膜被刮削下的碎屑被孵化与车辆(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO)、50 mM SNP或30 mM爸爸NONOate 25分钟或15分钟,分别在37°C。腺苷酸环化酶活性测定使用10μM forskolin反应混合物。最后100μM营地磷酸二酯酶抑制剂浓度4 - (3-butoxy-4-methoxy-benzyl) imidazolidin-2-one)(σ,奥克维尔,安大略省,加拿大)添加到反应混合物以防止营退化。反应停止后4分钟通过液氮快速冻结。因为没有可以在可溶性鸟苷酸环化酶,我们还测量了cGMP水平。组织或细胞悬浮液被解冻,单一化。乙醇(100%)被添加到最终的浓度总量的66%。组织离心机在8600年gydF4y2BaggydF4y2Ba五分钟,清除浮在表面的干燥速度使用真空吸尘器(SC110;莎凡特,霍尔布鲁克,美国纽约)。包含环核苷酸的干样品在250年resuspendedμl化验的缓冲区。未稀释的样本化验营地或cGMP使用商用环评工具根据制造商的协议(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。gydF4y2Ba

ATP水平的测量机理gydF4y2Ba

确定辐射诱导上皮hyporesponsiveness forskolin不是由于损耗腺苷酸环化酶的底物,组织中ATP含量测定使用商用ATP测定工具包(美国加州圣地亚哥Calbiochem-Novabiochem公司)基于luciferin-luciferase系统。在72小时或虚假的治疗机理,老鼠死亡,结肠切除。鼠标粘膜被刮削下1毫升的克雷布斯的缓冲孵化10分钟有或没有1400 w(5μM)。实验1400 w包括确定任何辐射诱导ATP水平变化是由于伊诺派生。根据制造商的协议样本化验。样本使用Monolight 2010光度计测量为70秒(发光分析实验室,安阿伯市密歇根,美国)。gydF4y2Ba

药物gydF4y2Ba

BDH(加拿大安大略省多伦多市)常规缓冲试剂供应商,除非另有指示。1400 w是来自亚历克西斯公司(美国加州圣地亚哥)。爸爸NONOate从开曼群岛获得化学(美国密歇根州安阿伯市)。gydF4y2Ba

统计数据gydF4y2Ba

样本容量每组实验使用细胞系3 - 4,5 - 17组织实验,每组。统计分析的数据进行了使用GraphPad Instat软件(版本3.0,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。一维方差分析与事后图基测试是用来比较两组以上。一个未配对的学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试时使用的两个治疗组进行比较。数据表示为手段(SEM)的概率(p)值小于0.05被认为是重要的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

腺苷酸环化酶同种型表达式gydF4y2Ba

由rt - pcr、人类结肠活检样本mRNA表达对所有亚型除了AC1和AC8(图1)。T84细胞表达AC3, 4、5、6和7。在另一项研究中,一个混合人口分化HT-29细胞表达AC2, 3, 4, 5, 6, 7, 9(数据未显示)。AC4和AC5表达式是使用鼠标在鼠标粘膜被刮削下特定的引物(图1)。在老鼠腺苷酸环化酶的表达没有区别mRNA在结肠粘膜被刮削下辐照小鼠与虚假的治疗控制(图1)。由基因组DNA样本-当化验污染(数据没有显示)。AC5/6中特异性的免疫反应性是位于小鼠结肠粘膜的上皮细胞,最强烈的地穴地区染色(图2)。在T84 AC5/6阳性免疫反应性也观察到细胞(图3)。gydF4y2Ba

Distribution of adenylate cyclase isoforms 1–9 (AC1–9) in intestinal epithelium was identified by reverse transcription-polymerase chain reaction. cDNA from total RNA was amplified for 40 cycles by polymerase chain reaction. (A) Adenylate cyclase isoform mRNA expression in human biopsy samples (n = 2). (B) Adenylate cyclase isoforms in cultured intestinal T84 epithelial cells (n = 4). (C) Mouse specific primers were designed only for AC4, 5, and 6. AC4 and 5 were found in mucosal scrapings from colons taken from sham treated and irradiated mice (n = 4). There were no qualitative differences in expression of these adenylate cyclase isoforms three days post-irradiation. GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

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图1gydF4y2Ba

分布的腺苷酸环化酶亚型1 - 9 (AC1-9)在肠上皮细胞通过逆转录-聚合酶链反应被发现。互补脱氧核糖核酸的总RNA被聚合酶链反应放大40周期。(一)腺苷酸环化酶同种型mRNA表达在人类活检样本(n = 2)。(B)腺苷酸环化酶亚型在培养肠道T84上皮细胞(n = 4)。(C)鼠标只对AC4特定的引物设计,5、6。AC4和5中发现粘膜被刮削下的碎屑从冒号从虚假的对待和辐照小鼠(n = 4)。没有定性的差异表达的腺苷酸环化酶亚型三天机理。甘油醛3磷酸脱氢酶GAPDH。gydF4y2Ba

Immunoreactivity of adenylate cyclase isoforms AC5/6 was observed in epithelial cells of mouse colonic mucosa. Mouse colon was fixed and stained for AC5/6, as described in the methods section. (A) Section of mouse colonic mucosa incubated with only the secondary antibody (negative control). (B) The intestinal mucosa (m) exhibited positive AC5/6 immunoreactivity. The most intense staining was seen in the crypt epithelium (arrows). Some AC5/6 immunoreactivity was also observed in the submucosa. Scale bar 10 μm. Representative picture from a group of five.

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图2gydF4y2Ba

腺苷酸环化酶的免疫反应性亚型AC5/6小鼠结肠粘膜上皮细胞中观察到。小鼠结肠AC5/6固定和染色,在方法部分描述。(A)部分小鼠结肠粘膜孵化只有二级抗体(负控制)。(B)肠道粘膜(m)表现出积极AC5/6免疫反应性。最激烈的染色的隐窝上皮(箭头)。一些AC5/6免疫反应性也观察到在黏膜下层。10μm比例尺。代表从一组5人。gydF4y2Ba

Immunoreactivity of adenylate cyclase isoforms AC5/6 was observed in a human intestinal epithelial cell line. T84 cells were fixed in methanol and stained for AC5/6 immunoreactivity. Cells were counterstained with haematoxylin. A red colour was indicative of positive staining for adenylate cyclase. (A) As a negative control, cells were incubated with only the secondary antibody. (B) Cells were incubated with a rabbit polyclonal anti-AC5/6 antibody. Representative micrographs from a total of three in each group.

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图3gydF4y2Ba

腺苷酸环化酶的免疫反应性亚型AC5/6在人类肠道上皮细胞系。T84细胞被固定在甲醇和彩色AC5/6免疫反应性。细胞与苏木精复染色。红色是象征的腺苷酸环化酶阳性染色。(A)是一种消极的控制,细胞被孵化只有二级抗体。(B)与兔多克隆抗体anti-AC5/6细胞被孵化。代表显微图在每组一共有三个。gydF4y2Ba

一氧化氮介导hyporesponsiveness依赖氯化物分泌机理是特定的训练营gydF4y2Ba

Isc forskolin反应,激活腺苷酸环化酶,碳酰胆碱,通过增加细胞内钙刺激分泌gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba},测定实验中冒号从unirradiated老鼠没有捐赠者SNP或爸爸NONOate孵化。有浓度依赖性减少Isc应对10μM forskolin 25分钟后潜伏期与SNP或15分钟潜伏期与爸爸NONOate(图4)。碳酰胆碱的反应是不变的存在没有捐助者(图4)。gydF4y2Ba

Nitric oxide (NO) inhibited cAMP dependent chloride secretion in a dose dependent manner but did not alter calcium dependent chloride secretion. Unirradiated mouse colon was mounted in Ussing chambers and incubated with (A) sodium nitroprusside (SNP 0.1–50 mM) for 25 minutes or (B) 1-propyl-1′-(aminopropyl)-2-hydroxy-2-nitrohydraxine (PAPA NONOate 1–30 mM) for 15 minutes before the change in short circuit from baseline (ΔIsc) was measured in response to 10 μM forskolin (FSK), an activator of adenylate cyclase, or to 10 μM carbachol (CCh), a cholinergic agonist. *p<0.05; **p<0.01 compared with colonic samples not receiving pretreatment with the NO donor; NS, not statistically significant compared with colonic samples not receiving the NO donor. n = 5–14 per group.

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图4gydF4y2Ba

一氧化氮(NO)抑制营地依赖氯化物分泌以剂量依赖的方式,但没有改变钙依赖的氯化物分泌。Unirradiated小鼠结肠是安装在我们室和孵化(A)硝普酸钠(SNP 0.1 -50毫米)25分钟或(B) 1-propyl-1′- (aminopropyl) 2-hydroxy-2-nitrohydraxine(爸爸NONOate外墙面毫米)15分钟前短路从基线的变化(ΔIsc)以应对10μM forskolin(移频键控)、腺苷酸环化酶的激活剂,或10μM碳酰胆碱(CCh),胆碱能受体激动剂。* p < 0.05;* * p < 0.01相比,结肠不接收样品预处理与没有捐赠;NS,不是统计学意义与结肠的样品没有收到捐赠。n =每组为5 - 14。gydF4y2Ba

辐照效应或没有环核苷酸的一代gydF4y2Ba

有显著减少forskolin刺激在老鼠的组织和T84细胞治疗的捐助者SNP和PAPA-NONOate(图5)。没有观察到小鼠结肠cGMP浓度的变化或T84细胞暴露在没有捐赠者。当以0、1、5、10分钟后暴露在没有捐助,cGMP水平在小鼠结肠(nM): 0.13(0.01), 0.09(0.01), 0.16(0.04),和0.10(0.01),分别。cGMP水平T84细胞(nM): 8.74(2.92), 9.00(3.43), 7.50(2.32),和8.00(2.31)在同一时间点。gydF4y2Ba

Adenylate cyclase activity, as measured by generation of cAMP in the presence of a phosphodiesterase inhibitor, was decreased in mouse colon and T84 cells following treatment with nitric oxide (NO) donors. (A) Segments of mouse colon were incubated with 50 mM sodium nitroprusside (SNP), 30 mM 1-propyl-1′-(aminopropyl)-2-hydroxy-2-nitrohydraxine (PAPA), or vehicle (control) before adenylate cyclase activity was stimulated with forskolin. The amount of cAMP is expressed as the concentration per ml of homogenate, normalised to the mass of the tissue sampled. (B) T84 cells were incubated with 50 mM SNP or vehicle (control) before addition of 10 μM forskolin. The amount of cAMP is expressed as the concentration in the medium in which the cells were suspended. Accumulation of cAMP in both experiments was measured by a commercially available EIA kit. Basal levels of cAMP in the presence of NO donor were not different from untreated controls (data not shown). *p<0.05 versus control; †p<0.05 versus basal (not treated with forskolin). n = 5–8 per group.

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图5gydF4y2Ba

腺苷酸环化酶活性,以代营的磷酸二酯酶抑制剂,减少小鼠结肠癌和T84细胞治疗后一氧化氮(NO)。(A)段小鼠结肠孵化了50 mM硝普酸钠(SNP), 30毫米1-propyl-1′- (aminopropyl) 2-hydroxy-2-nitrohydraxine(爸爸),或车辆(控制)腺苷酸环化酶活性与forskolin刺激。营地的量表示为每毫升的匀浆浓度,正常组织样本的质量。(B) T84细胞孵化与50 mM SNP或车辆(控制)之前添加10μM forskolin。营的量表示为在中浓度的细胞被停职。积累在两个实验测量了商用环评工具包。基底的营地的存在没有捐赠者没有不同于未经处理的控制(数据未显示)。* p < 0.05与控制;†p < 0.05与基底(不接受forskolin)。n = 5 - 8每组。gydF4y2Ba

腺苷酸环化酶的测定同种型(s)调解没有诱导hyporesponsivenessgydF4y2Ba

由于缺乏腺苷酸环化酶受体激动剂和拮抗剂选择性不同亚型,我们利用最近的报告表明,AC5和6可以从其他亚型分化功能基于他们的活动都减少PKA激活和增加细胞内钙。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba ^22gydF4y2Ba8-Br-cAMP添加PKA的活化剂和卡巴可被用来增加细胞内钙。有显著减少Isc应对forskolin当组织costimulated 10μM forskolin,要么10μM 8-Br-cAMP或10μM碳酰胆碱,而引发的Isc反应forskolin独自(p < 0.05)(图6)。在使用浓度,8-Br-cAMP和卡巴可引起只有适度调整Isc当添加自己的(数据未显示)。gydF4y2Ba

Change in short circuit current (ΔIsc) in response to administration of forskolin (FSK). Tissues from sham treated (Control) mice were exposed to the nitric oxide donor sodium nitroprusside (SNP 10 mM) prior to being exposed to FSK alone or FSK plus either (A) 8-Br-cAMP or (B) carbachol (CCh). In addition, tissues from irradiated (15 Gy) mice were exposed to FSK alone or FSK plus either (A) 8-Br-cAMP or (B) carbachol (CCh) in the presence or absence of the inducible nitric oxide synthase inhibitor L-N6-(1-iminoethyl)lysine (L-NIL). Coadministration of either 8-Br-cAMP or CCh reduced the response to FSK in colons from control mice. This was not observed in tissues exposed to SNP or in tissues from irradiated mice. However, the ability of coadministration of 8-Br-cAMP and CCh to reduce the response to FSK was restored in L-NIL pretreated colons from irradiated mice. *p<0.05 versus FSK alone. n = 6–17 per group.

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图6gydF4y2Ba

短路电流的变化(ΔIsc)在回应政府forskolin(移频键控)。从虚假的对待组织(控制)老鼠暴露在一氧化氮供体硝普酸钠(SNP 10毫米)接触之前移频键控单独或移频键控+ 8-Br-cAMP (A)或(B)碳酰胆碱(CCh)。此外,组织从辐照(15 Gy)小鼠暴露于移频键控单独或移频键控+ 8-Br-cAMP (A)或(B)碳酰胆碱(CCh)存在与否的诱导一氧化氮合酶抑制剂L -gydF4y2BaNgydF4y2Ba^6gydF4y2Ba——(1-iminoethyl)赖氨酸(L-NIL)。共同服用8-Br-cAMP或CCh减少了响应的移频键控控制老鼠的冒号。这不是观察到组织暴露于SNP或辐照小鼠的组织。然而,共同服用8-Br-cAMP的能力和CCh减少响应移频键控在L-NIL冒号从辐照预处理小鼠恢复。* p < 0.05和移频键控。n = 6 - 17日每组。gydF4y2Ba

组织用SNP预处理时,8-Br-cAMP和CCh的能力减少响应失去了移频键控(图6),这表明它是制约亚型的腺苷酸环化酶被聚集有关。同样的,当辐照冒号与forskolin costimulated一起8-Br-cAMP或者碳酰胆碱,没有进一步抑制Isc应对forskolin观察(图6)。此外,聚集有关的能力与8-Br-cAMP或碳酰胆碱减少forskolin刺激Isc返回在冒号辐照小鼠治疗与伊诺抑制剂L-NIL 10分钟(图6)。在虚假的对待老鼠L-NIL没有效果。gydF4y2Ba

辐射诱导的效果没有8-Br-cAMP反应gydF4y2Ba

来测试假设辐射诱导没有直接是腺苷酸环化酶,而下游的酶,抑制营地依赖分泌,鼠标结肠分泌分泌反应浓度(1毫米)的营地模拟8-Br-cAMP(1毫米)在辐照冒号或评估的存在没有捐赠者PAPA-NONOate(30毫米)。这个剂量的8-Br-cAMP被选中,是因为控制老鼠产生一个响应比得上引起10μM forskolin (96 (12)gydF4y2BavgydF4y2Ba100(25)μA /厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba分别)。辐照后,应对8-Br-cAMP降低了50.5%的冒号小鼠暴露于15 Gy伽马辐射相对于反应引起虚假的治疗小鼠(p < 0.05),这种效果并没有改变通过预处理伊诺抑制剂L-NIL(减少59.8%,假的gydF4y2BavgydF4y2Ba15 Gy L-NIL的存在;p < 0.05)。此外,应对8-Br-cAMP不是没有的存在显著降低的捐赠者PAPA-NONOate(30毫米),而是增加1.6倍(p < 0.05)。gydF4y2Ba

辐照对结肠的影响ATP水平gydF4y2Ba

减少阵营水平观察照射后可以减少衬底的一个间接结果可用性对腺苷酸环化酶。然而,大量的ATP在组织之间没有不同的骗局和辐照小鼠(2.8 (1.2)gydF4y2BavgydF4y2Ba1.4 (0.4)nmol /毫克组织;p > 0.05),不受抑制伊诺活动1400 w(骗局,2.0 (0.4)gydF4y2BavgydF4y2Ba15 Gy, 2.1 (0.3) nmol /毫克组织;p > 0.05)。gydF4y2Ba

G的作用gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba在没有介导hyporesponsiveness促分泌素gydF4y2Ba

hyporesponsiveness观察照射后的另一种解释或接触没有捐赠者可能是抑制信号通路,如GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba,激活没有减少营活动,因此氯分泌。gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba为了测试这种可能性,我们首先评估G的影响gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba激活forskolin Isc响应。事实上,应对forskolin时显著降低forskolin(10μM)和生长抑素(1μM),它通过GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba,同时添加到室浴(图7)。这种影响的预培养组织与250 ng / ml的GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba抑制剂百日咳毒素(PTX)。这个实验证实,氯化forskolin刺激分泌鼠结肠调制敏感的GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba。然而,阻止GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba与PTX没有影响hyporesponsiveness移频键控观察后接触SNP或冒号从辐照小鼠(图7)。gydF4y2Ba

Nitric oxide mediated reduction of adenylate cyclase activity was independent of an inhibitory G protein coupled mechanism. In Ussing chambers, the change in short circuit current (ΔIsc) was measured in response to 10 μM forskolin in the presence 1 μM somatostatin (SST), an activator of the Gi signalling cascade, and a Gi inhibitor, pertussis toxin (PTX 250 ng/ml). Costimulation with forskolin and SST significantly reduced the secretory response compared with forskolin alone. This effect was reversed when the tissue was incubated for 25 minutes with PTX. When tissue from sham treated mice was incubated with 50 mM SNP±PTX for 25 minutes (black bars), or when tissue from irradiated mice (15 Gy) was incubated with PTX (grey bars), there was a significant hyporesponsiveness to FSK which was not reversed by PTX. *p<0.05, ***p<0.001 versus forskolin in the presence of vehicle; NS, not significantly different. n = 5–12 per group.

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图7gydF4y2Ba

减少一氧化氮介导的腺苷酸环化酶活动的独立抑制G蛋白耦合机制。在我们房间,短路电流的变化(ΔIsc)以应对10μM forskolin在1μM生长抑素(SST), G的一个催化剂gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba信号级联,GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba抑制剂、百日咳毒素(PTX 250 ng / ml)。与forskolin聚集有关,海温与forskolin相比显著减少分泌反应。这种效应被推翻时,组织与PTX孵化25分钟。当从虚假治疗小鼠组织孵化了50 mM SNP±PTX 25分钟(黑条),或者当组织辐照小鼠(15 Gy)与PTX孵化(灰色酒吧),有显著hyporesponsiveness PTX移频键控并没有逆转。* * * * p < 0.05, p < 0.001和forskolin车辆的存在;NS,不是明显不同。n = 5 -每组。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

我们以前所示的结肠炎大鼠模型失去响应促分泌素与细菌易位,增加相关gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba表明缺乏反应促分泌素有助于上皮屏障功能的不足。暴露于电离辐射也容易使动物transepithelial运动的细菌,gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba我们已经证明了一个不依赖组件辐射诱导上皮hyporesponsiveness促分泌素。gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba不,来自伊诺,抑制营地依赖但不是CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}依赖的分泌,gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba所以理解的机制没有对腺苷酸环化酶活性的影响是关键在理解辐射诱导上皮屏障功能障碍,最终,辐射肠下垂。gydF4y2Ba

我们这里有证明,人类和小鼠结肠的粘膜mRNA表达几个腺苷酸环化酶亚型。相关性的研究中,无制约亚型AC5 AC6gydF4y2Ba^15gydF4y2BaT84表达细胞和结肠活检,AC5表达小鼠结肠。此外,数据从T84细胞和免疫组织化学的小鼠结肠表明AC5和/或AC6也表示在氯化物分泌结肠上皮细胞。这些亚型因此能够参与营依赖分泌,和消极监管情况下粘膜没有水平升高。gydF4y2Ba

在确定没有制约的腺苷酸环化酶亚型表达分泌上皮细胞,然后我们考虑是否这些亚型负责辐射诱导hyporesponsiveness促分泌素。我们的技术无法在活检标本进行离子运输研究杜绝我们追求在人体组织的研究。因此因为我们显示表达式的mRNA在小鼠结肠AC5 AC5表情并没有受到暴露于电离辐射的影响,我们使用鼠标进行后续功能的研究。确定如果没有制约腺苷酸环化酶参与肠道氯化物分泌,我们使用了一个方法,利用监管性质差异的几个腺苷酸环化酶亚型forskolin响应。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba类似的方法被用于人类气管平滑肌细胞表明尽管细胞表达七种九腺苷酸环化酶亚型,AC5主导功能的作用。gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba我们表明,共同forskolin PKA活化剂8-Br-cAMP或CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}激活卡巴可导致显著降低氯化forskolin诱导分泌与分泌反应单独forskolin相比,这些化合物的影响一致AC5或AC6 forskolin诱导激活,而不是其他的腺苷酸环化酶亚型。gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba ^16gydF4y2Ba ^22gydF4y2Ba ^{24 -gydF4y2Ba}^26gydF4y2Ba观察类似用卡巴可共同在研究中forskolin与thapsigargin coadministered,也增加细胞内钙gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}(数据没有显示)。gydF4y2Ba

采取这种方法从细胞自由系统,将它应用于我们的研究是复杂的信号系统反馈AC5和6也氯化系统调节分泌。因此我们的数据存在的悖论forskolin Isc是减少介质的变化,刺激自己,增加Isc。可以调和这种矛盾,考虑到观测响应独自forskolin氯化的净效应刺激分泌反应和抑制反馈机制。事实上,如果这些化合物没有分泌的抑制作用除了分泌效果,期望一个添加剂Isc响应与forskolin coadministered时。gydF4y2Ba

下一步是确定hyporesponsiveness forskolin之后没有捐赠者或老鼠后接触电离辐射是通过抑制AC5发生的。要做到这一点,我们重复的聚集有关的研究(forskolin + 8-Br-cAMP或forskolin +碳酰胆碱)在SNP的存在或从辐照小鼠结肠样本。在每种情况下,独自应对forskolin降低了SNP或辐照,但没有进一步减少共同服用8-Br-cAMP或碳酰胆碱的建议没有和共同服用8-Br-cAMP或碳酰胆碱的工作通过一个类似的机制。我们预计,如果不采取行动通过AC5独立通路,然后antisecretory AC5抑制的影响和没有捐赠者或辐照添加剂。事实并非如此,加强我们的论点,没有通过抑制AC5诱导分泌抑制营地。此外,在辐照结肠癌、预处理与伊诺抑制剂L-NIL恢复的能力共同8-Br-cAMP或碳酰胆碱减少forskolin Isc响应。如果一个人认为这些结果的研究表明,增加PKA和CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}抑制AC5 AC6,gydF4y2Ba^{24 -gydF4y2Ba}^26gydF4y2Ba然后从我们的数据可以推断出的辐射诱导hyporesponsiveness依赖的促分泌素小鼠结肠营地发生通过抑制AC5伊诺派生。gydF4y2Ba

我们进行下一个实验来确定没有介导抑制分泌的机制。首先,我们评估了腺苷酸环化酶活性通过测量一代的阵营。没有捐赠者抑制forskolin刺激阵营形成T84上皮细胞和从小鼠结肠粘膜被刮削下的碎屑。这些观察结果一致与孤立cholangiocytes制造的。gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba通过可溶性鸟苷酸环化酶的影响没有被我们没有观察到增加cGMP水平后暴露在没有捐赠者。我们试图测试cGMP的作用进一步通过测量的影响没有捐赠者Isc响应鼠标结肠段的热稳定肠毒素gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba通过cGMP,抒发分泌。然而,当观察到其他人,热稳定肠毒素没有分泌影响自己的远端结肠段的老鼠gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba(数据没有显示)。gydF4y2Ba

我们还没有采取行动的能力评估的下游腺苷酸环化酶影响营依赖氯化物分泌通过确定Isc回应相对较高的浓度(1.0毫米)的PKA活化剂8-Br-cAMP,在辐照和虚假的对待组织。我们发现辐照组织表现出小得多的回应1毫米8-Br-cAMP而虚假的对待动物的组织。hyporesponsiveness程度低于forskolin观察。gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba有趣的是,hyporesponsiveness 8-Br-cAMP没有逆转的预处理与伊诺抑制剂L-NIL组织。这表明hyporesponsiveness观察在某种程度上是多因子的机理,没有依赖(可能在腺苷酸环化酶)和没有独立从腺苷酸环化酶(下游)组件。相比之下,我们的观察,莫雷尔gydF4y2Ba等gydF4y2Ba显示,而大鼠结肠分泌反应forskolin降低机理,反应8-Br-cAMP和Db-cAMP没有虚假和辐照组织之间的不同,表明这个过程被抑制腺苷酸环化酶或进一步上游。gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba研究和我们之间的差异可能是由于不同的物种(老鼠使用gydF4y2BavgydF4y2Ba鼠标)或交付的放射剂量(10gydF4y2BavgydF4y2Ba15 Gy)。然而,从我们的研究很清楚,不抑制腺苷酸环化酶活动我们明确证明,预培养没有捐赠者forskolin刺激腺苷酸环化酶活力显著降低和没有改变1毫米8-Br-cAMP的响应。更多的工作需要充分描绘的更微妙的影响辐射对细胞事件下游腺苷酸环化酶在我们的模型中。gydF4y2Ba

进一步调查机制辐射诱导hyporesponsiveness营地促分泌素的依赖,我们试图确定辐射诱导伊诺的角色在细胞内ATP。同意泰勒gydF4y2Ba等gydF4y2Ba谁证明缺氧后,减少了营地刺激离子运输是独立于ATP水平降低,gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}没有虚假和辐照结肠的区别(在伊诺抑制剂的存在与否1400 w),表明没有被抑制衬底的可用性。同样,在同意道gydF4y2Ba等gydF4y2Ba证明没有介导抑制营地积累forskolin刺激细胞膜被PTX不受影响,gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba我们确定不依赖forskolin诱导分泌的抑制是独立于GgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba激活PTX是无法扭转SNP诱导hyporesponsiveness forskolin。这是尽管forskolin刺激敏感,抑制了氯化物分泌生长激素抑制素,G的一个催化剂gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba途径。gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba

总之,我们的研究没有扩展先前的证据显示,伊诺派生依赖分泌抑制营地gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba ^11gydF4y2Ba ^13gydF4y2Ba通过证明腺苷酸环化酶亚型AC5和/或氯化AC6调解肠道上皮细胞分泌,的目标没有来自暴露于电离辐射引起的进气阀打开,以及调节辐射诱导分泌功能障碍。没有介导减少氯可能使肠道分泌增加有限合伙人和细菌易位可能发起一个正反馈循环的最初的辐射损伤,永久地改变了上皮细胞微环境。没有介导hyporesponsiveness促分泌素可能是急性和慢性炎症之间的联系。期间维持上皮屏障功能的选择性抑制剂急性损伤可能代表一个重要的新的治疗策略,以防止辐射肠下垂。未来的研究将需要描绘伊诺衍生的细胞来源没有影响腺苷酸环化酶活性,并确定在环化酶的作用机制也没有。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作是支持格兰特(拖把- 14660)从加拿大卫生研究院的研究(CIHR)。SLF是博士的接受者从加拿大消化健康基金会奖,与CIHR,阿尔伯达省传统医学研究基金会(AHFMR)。WKM AHFMR高级学者。作者感谢保罗·贝克博士,卡尔加里大学,提供mRNA活检样本从患者获得知情同意,和海伦Raybould博士,加州大学戴维斯分校的,有用的评论的手稿。gydF4y2Ba

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关于工作gydF4y2Ba洛党卫军,库欣k .一氧化氮在inflammation-induced分泌的抑制小鼠急性结肠炎模型。gydF4y2Ba是杂志gydF4y2Ba1998年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba275年gydF4y2Ba:gydF4y2BaG1353gydF4y2Ba-60年。gydF4y2Ba
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关于工作gydF4y2Ba库欣k .角色的本构cyclooxygenase-2 prostaglandin-dependent在小鼠体外结肠分泌。gydF4y2BaJ杂志ExpgydF4y2Ba2000年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba293年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba539年gydF4y2Ba-44年。gydF4y2Ba

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加维EPgydF4y2BaOplinger JA Furfine ES,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba1400 w是一个缓慢的、紧密的绑定和高度的选择性抑制剂诱导一氧化氮合酶在体外和体内。gydF4y2BaJ临床生物化学gydF4y2Ba1997年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba272年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba4959年gydF4y2Ba-63年。gydF4y2Ba

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小康纳gydF4y2Ba曼宁PT,解决SL,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba抑制adjuvant-induced关节炎诱导一氧化氮合酶的选择性抑制作用。gydF4y2Ba欧元J杂志gydF4y2Ba1995年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba273年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba15gydF4y2Ba-24年。gydF4y2Ba

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Hanoune JgydF4y2Ba,推迟联合国监管和腺苷酸环化酶的作用亚型。gydF4y2Ba为杂志ToxicolgydF4y2Ba2001年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba41gydF4y2Ba:gydF4y2Ba145年gydF4y2Ba-74年。gydF4y2Ba

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道YPgydF4y2Ba纳杰菲L·希普利年代,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba一氧化氮对腺苷酸环化酶的影响刺激N18TG2神经母细胞瘤细胞。gydF4y2BaJ杂志ExpgydF4y2Ba1998年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba286年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba298年gydF4y2Ba-304年。gydF4y2Ba

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Chiono米gydF4y2Ba泰特,Mahey R, G,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba容性CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}条目完全抑制阵营C6-2B神经胶质瘤细胞中合成。证据表明,生理唤起Ca2 +入口调节Ca (gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba})的制约在non-excitable细胞腺苷酸环化酶。gydF4y2BaJ临床生物化学gydF4y2Ba1995年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba270年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba1149年gydF4y2Ba-55年。gydF4y2Ba

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石见GgydF4y2Ba,Kawabe J, Ebina T,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba腺苷酸环化酶的调节蛋白激酶。gydF4y2BaJ临床生物化学gydF4y2Ba1995年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba270年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba12481年gydF4y2Ba4所示。gydF4y2Ba

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陈YgydF4y2Ba李,哈利,J,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba腺苷酸环化酶6是选择性地由蛋白激酶磷酸化地区参与gα的刺激。gydF4y2Ba《美国国家科学院刊年代gydF4y2Ba1997年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba94年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba14100年gydF4y2Ba4所示。gydF4y2Ba

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恰尼一个gydF4y2Ba艾格诺RW Alexander-Chacko JT,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba大肠杆菌热稳定肠毒素的影响在缺少guanylyl酸环化酶C受体的老鼠们注入了结肠运输。gydF4y2Ba是杂志gydF4y2Ba2001年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba280年gydF4y2Ba:gydF4y2BaG216gydF4y2Ba-21年。gydF4y2Ba

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莫雷尔EgydF4y2Ba,Dublineau Lebrun F,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba改变VIP-stimulated阵营在腹部照射后大鼠远端结肠途径。gydF4y2Ba是杂志gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba282年gydF4y2Ba:gydF4y2BaG835gydF4y2Ba-43年。gydF4y2Ba

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泰勒CTgydF4y2Ba里斯SJ Awtrey CS,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba缺氧抑制循环nucleotide-stimulated上皮离子运输:角色为核苷酸环化酶氧传感器。gydF4y2BaJ杂志ExpgydF4y2Ba1998年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba284年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba568年gydF4y2Ba-75年。gydF4y2Ba

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Warhurst GgydF4y2Ba,希格斯NB Turnberg拉gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba多个G-protein-dependent途径调解的antisecretory影响生长激素抑制素和可乐定HT29-19A结肠细胞线。gydF4y2Ba中国投资gydF4y2Ba1993年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba92年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba603年gydF4y2Ba-11年。gydF4y2Ba

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