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背景和目的:蛋白酶激活受体(PARs)假设在肠道炎症中发挥作用。存在和票面所扮演的角色4在胃肠道功能尚未完全阐明。本研究的目的是:(i)检查票面的表情4在大鼠近端结肠;(2)确定力学效应引起的标准4在纵肌的激活;和(3)描述底层机制。
方法:票面价值4表达式是由逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)和免疫组织化学。机械活动被记录为等长张力的变化。
结果:PCR产品对应的预计规模标准4信号放大从RNA制备大鼠的结肠,显示一样的存在4在这些组织。免疫组织化学显示一样4蛋白表达在上皮表面和黏膜下层。票面价值4激活肽,GYPGKF-NH2和AYPGKG-NH2依赖,产生浓度对纵肌收缩的影响。河豚毒素(TTX)或阿托品显著降低AYPGKG-NH的收缩反应2后,阿托品TTX没有造成任何进一步的减少。NK1受体拮抗剂、SR140333或NK2受体拮抗剂,SR48968,单独或组合,产生降低标准4产生收缩效应,当coadministered TTX废除它。辣椒素显著减少了由AYPGKG-NH引发子宫收缩2。
结论:目前的结果表明,标准4功能表现在大鼠结肠及其活化诱发纵肌的收缩通过TTX敏感速激肽释放乙酰胆碱释放,可能从感官神经。这些行动可能导致运动性障碍在肠道损伤和炎症。
- 蛋白酶激活受体
- 肠神经系统
- 肠道平滑肌
- 标准杆4杆
- 速激肽
- 帕尔斯、蛋白酶激活受体
- PBS、磷酸盐缓冲盐水
- TTX,河豚毒素
- GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
- 电子商务50,一半最大收缩浓度
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
来自Altmetric.com的统计
- 帕尔斯、蛋白酶激活受体
- PBS、磷酸盐缓冲盐水
- TTX,河豚毒素
- GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
- 电子商务50,一半最大收缩浓度
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
除了他们的蛋白水解作用,蛋白酶如胰蛋白酶、凝血酶,或组织蛋白酶G也可以作为细胞信号分子通过蛋白酶激活受体(PARs)。这个家庭的七个跨膜受体G蛋白耦合目前包括四个受体亚型(PAR1,票面2,票面3,票面4)。票面价值1,票面3,票面4,但不一样2由凝血酶被激活,而胰蛋白酶能激活不相上下2和标准4。12票面价值4也可以由中性粒细胞颗粒蛋白酶激活组织蛋白酶G。3激活细胞外的部分是由蛋白水解乳沟N终端域的揭露导致细胞外N端序列作为拴在受体激活配体。票面价值1,票面2,票面4也可以激活体内应用合成短肽序列的基础上拴在配体。
许多研究已经进行澄清的作用PARs生理学和病理生理学的胃肠道作为这些组织,超过其他人,暴露于蛋白酶和整个胃肠道PARs高度表达。4然而,大多数的研究有关的功能标准1和标准2。票面价值1和标准2最有可能发挥作用在炎症、过敏、和/或出血,凝血酶和/或肥大细胞类胰蛋白酶内生受体激动剂成为可用。票面价值2似乎是参与外分泌56在肠道离子运输。7票面价值1和标准2调节平滑肌蠕动8及其激活诱导松弛剂、收缩或两相的反应。9 -20.虽然北部污点分析表明,信使rna为标准4存在于人类、大小肠里,21表达水平的细胞类型4仍然是未知的和生理票面所扮演的角色4在胃肠道尚未完全阐明。Hollenberg和他的同事们12报道的纵肌收缩影响大鼠胃由于PAR激活吗4受体激活肽,GYPGQV-NH2,和缺乏交叉反应性标准1和标准2。此外,在大鼠食管粘膜肌层22和孤立的航空公司,23票面价值4诱发放松,一个函数不是标准1。相比之下,票面4似乎模仿的行为标准1在小鼠气道平滑肌。24
本研究旨在调查是否一样4存在于大鼠结肠癌和如果它影响肠道运动功能。目的是:(i)检查票面的表情4在大鼠近端结肠;(2)确定力学效应引起的标准4在纵向激活平滑肌;和(3)描述底层机制。具体来说,可能参与神经源性机制和相对贡献不同的神经递质进行分析。
方法
动物
雄性Wistar鼠体重250 - 300克获得Morini(意大利)和查尔斯河实验室(加拿大魁北克)。所有的动物都被安置在温度控制的房间,可以免费获得食物和水。当地动物保护委员会批准所有实验协议。老鼠被颈椎脱位,牺牲和组织都被立即删除进行分析。
rt - pcr
为标准4逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),从大鼠结肠组织总RNA是孤立使用试剂盒方法(Gibco、加拿大)。RNA(2μg)反向转录和DNA是放大按照下列循环条件:核酸链的离解为一分钟94°C,退火30秒55°C,和扩展为一分钟72°C。老鼠PAR的引物序列45′gga AGT呕吐AGA亚美大陆煤层气有限公司总部的GCA和3′棉酚CCA AGA GGC ATC ACC答C和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GADPH) 5′CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG答和3′agc CTT CTC猫GGT GGT棉酚广汽。二十个七个周期执行标准4和23 GADPH周期。PCR产物被分离与溴化乙锭1%琼脂糖凝胶,凝胶扫描紫外线照射下。
免疫组织化学
大鼠结肠组织收集和固定在一夜之间Zamboni的缓冲区。组织被洗了三次在磷酸缓冲盐(PBS)和放置在20%蔗糖PBS。组织是嵌入在10月和冻结部分(10μm)被放置在“superfrost +”幻灯片。组织部分与PBS单独洗,然后孵化一小时在室温下与PBS含有10%驴血清。部分被孵化与初级抗体(山羊多克隆anti-PAR亲和纯化4抗体;美国加州圣克鲁斯生物技术;1/100在PBS稀释)10%驴血清一夜之间在4°C。在控制实验中,anti-PAR4抗体preincubated(24 - 48小时在4°C 1或10µM)阻断肽用于免疫(肽图C终端域的老鼠一样4;圣克鲁斯生物技术)。幻灯片在PBS和孵化洗二次抗体(Cy3共轭AffiniPure驴antigoat, 1/500在PBS稀释+ 1.5%驴血清)在室温下一个小时。组织部分被覆盖着Fluorsave试剂和检查使用奥林巴斯IX50佛罗里达州/荧光显微镜配备coolsnap-fx相机。
机械记录
大鼠结肠切除盲肠远侧地。结肠腔与柠檬酸清洗解决方案和部分约2厘米的长度被削减。准备被放置在一个持续灌注器官含5毫升的加油(95%啊2和5%的公司2)和加热(37°C)柠檬酸溶液用以下成分(毫米):氯化钠119;氯化钾4.5;MgSO42.5;NaHCO325;KH2阿宝41.2;CaCl22.5;和葡萄糖11.1。准备被与丝线等距测力传感器(DY2;Comerio尤格巴西,意大利瓦雷泽)记录纵向肌肉的等长张力的墨水作家记录器(双子座;尤格Basile)。段被允许平衡至少30分钟1 g在实验开始前负荷。
试验协议
平衡期后,准备在10μM挑战与碳酰胆碱,在初步试验中,被证明产生最大的效果。然后,GYPGKF-NH准备累积浓度的响应2,小鼠合成标准4激活肽,AYPGKG-NH2据报道,这是更强的受体激动剂的标准4,25或YAPGKG-NH2不活跃的控制肽,检查。肽被添加到卷50μl浴后关掉灌注浓度表示。每个浓度在接触组织了两分钟。在初步实验中,为了评估的再现性反应,我们发现浓度相关反应获得第一量效曲线没有显著不同于第二条曲线。
PAR的响应4激活与AYPGKG-NH2在没有评估,存在下列抑制剂/拮抗剂:河豚毒素(TTX 1μM),钠+通道阻断剂;阿托品(1μM)胆碱能毒蕈碱的受体拮抗剂;的选择性拮抗剂SR140333 NK1受体(1μM);的选择性拮抗剂SR48968 NK2受体(1μM);和辣椒素的浓度10μM,据报道,导致消耗速激肽的感觉神经纤维。2627一些对手coadministered澄清的效应器代表不同的步骤是否相同的途径。每种药物的浓度是已知有效的用于我们的准备。2829日对手被添加到灌注解决方案测试之前至少30分钟激活肽,除了辣椒素。证明TTX治疗是有效的,白金戒指的制备是通过一对刺激电极。
数据分析和统计
因为自发阶段组织的收缩,纵肌的收缩反应定义为休息语调的变化(底部水平张力振荡),并被表示为一个百分比的收缩引起的10μM碳酰胆碱。所有数据都表示为手段(SEM) n表示,肠段的动物数量。半最大收缩浓度(EC50通过非线性回归)从个人计算实验。肽诱导反应的差异没有(控制)和抑制剂的存在被学生的分析t测试或方差分析(方差分析)和Bonferroni调整,在需要时。一个概率值小于0.05被认为是重要的。
药物
以下药物使用:carbamylcholine氯(碳酰胆碱),辣椒素,河豚毒素(TTX)(σ,化学集团,圣路易斯,密苏里州,美国),((S) -N-methyl-N [4 - (4-acetyl-amino-4-phenylpiperi-dino) 2 (3 4-dichloro-phenyl)丁基]苯甲酰胺(SR48968), (S) 1 - [2 - (3 - (3, 4-dichlorphenyl) 1 (3-isopropoxy-phenylacetyl) piperidin-3yl]乙基]4-phenyl-1 azaniabicyclo(2.2.2)氯辛烷(SR140333)(从赛诺菲异国风味的一种礼物,蒙彼利埃Cedex,法国),(特别行政区9会见(O2)11]- sp,[β-Ala8]-NKA(十)(Calbiochem-Novabiochem AG)、Laufelfingen、瑞士)。所有的药物都溶解在蒸馏水,除了以下几点:SR48968 SR140333溶解在DMSO,辣椒素溶解在绝对乙醇,特别行政区9会见(O2)11]- sp溶解在稀醋酸,[β-Ala8]-NKA(十)溶解在稀氨。当天工作的解决方案准备新鲜的实验稀释股票的解决方案。控制实验使用不同溶剂单独显示,没有对组织反应的影响进行了研究。
GYPGKF-NH2,AYPGKG-NH2,活性肽YAPGKF-NH控制2从多肽合成购买核心设施卡尔加里大学(加拿大)和标准由固相合成过程。
结果
票面价值4表达式
463个基点的预期大小的PCR产物从RNA放大准备从大鼠的结肠(通道1和2;图1),显示标准4在这些组织的存在。在缺乏标准4底漆,只有GAPDH放大产品(306个基点)中检测出这些组织(巷3;图1)。标准4蛋白质免疫反应性也观察到大鼠结肠(图2)。标准4表达式是突出局部粘膜表面(colonocytes;箭头在图2),但染色也观察到黏膜下层(箭头在图2)。染色已经被preabsorption受体的抗体片段用于提高anti-PAR4抗体(图2 b)。
检测蛋白酶激活受体4 (PAR4)在大鼠结肠通过逆转录-聚合酶链反应。通道1和2,结肠组织标准4和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)引物被放大;一个特定的463个基点片段对应标准4而GAPDH显示306个基点的预期扩增片段。巷3显示了漏报不相上下4底漆。
Immunolocalisation蛋白酶激活受体4 (PAR4在大鼠结肠)。在(A),组织孵化anti-PAR4主要抗体,然后用Cy3共轭二次抗体。控制(B)显示了主要anti-PAR的孵化4抗体与阻断肽,其次是Cy3共轭二次抗体。m,粘膜,sm,黏膜下层,厘米,圆形肌肉。箭头显示colonocyte染色,箭头显示黏膜下层染色。比例尺,10μm。
功能的研究
在目前的实验条件下,大鼠结肠平滑肌自发的机械活动,包括在有节奏的等距紧张形势的变化(从1到2.5克)。标准4激活肽,GYPGKF-NH2(0.01 -10μM)和AYPGQV-NH2(0.01 -10μM),造成浓度依赖的纵肌收缩反应大鼠结肠癌、增加基底组成的张力与维护阶段的收缩AYPGQV-NH(图3)2(EC50= 0.08(0.06)μM;n = 6)比GYPGKF-NH更有效2(EC50= 0.3(0.1)μM;n = 8)但功效相似,两个肽能够达到大约90%的碳酰胆碱引起的收缩(10μM)的最大浓度测试(图4)。为了验证响应的特异性,我们应用于制剂活性肽YAPGQV-NH控制2(0.01 -10μM),这没有影响(无花果3、4)。
代表录音的收缩效应引起的蛋白酶激活受体4 (PAR4)激活肽,GYPGKF-NH2和AYPGKF-NH2控制活性肽,YAPGKF-NH2,碳酰胆碱(CCh 10μM)对大鼠结肠的纵肌。箭头表示激动剂的应用。W,惨败。
量效曲线效应诱发的蛋白酶激活受体4 (PAR4)激活肽,GYPGKF-NH2和AYPGKF-NH2控制活性肽,YAPGKF-NH2在大鼠结肠的纵肌。收缩效果表示为一个百分比的收缩碳酰胆碱(CCh 10μM)。每个值是4 - 8的意思(SEM)实验。
阐明机制产生的收缩效应4激活,我们评估了由AYPGQV-NH引发反应2在TTX的存在。TTX(1μM),它本身没有修改自发收缩,显著降低反应诱导的标准4激活肽,但没有废除,表明部分参与神经机制(图5)。
(A)河豚毒素(TTX)和阿托品的影响,单独或结合,由蛋白酶激活受体4(票面所引起的收缩反应4)激活肽,AYPGKF-NH2在大鼠结肠的纵肌。AYPGKF-NH的收缩反应2被TTX显著降低(1μM)或阿托品(1μM)。(1μM)阿托品和TTX(1μM)没有造成任何进一步的减少。(B)的影响SR140333 SR48968,孤独,在组合,或与TTX治疗后,由票面所引起的收缩反应4激活肽,AYPGKF-NH2在大鼠结肠的纵肌。AYPGKF-NH的收缩反应2被SR140333显著降低(1μM) NK的对手1受体,通过SR48968(1μM)拮抗剂NK2受体,更结合SR48968(1μM)和SR140333(1μM)。AYPGKF-NH2没有引起任何反应的结合SR48968(1μM) SR140333(1μM)和TTX(1μM)。收缩效果表示为一个百分比的收缩碳酰胆碱(CCh 10μM)。每个值意味着(SEM)五个实验。* p < 0.05相比,控制价值;†p > 0.05相比TTX单独或阿托品;‡p < 0.05相比SR140333 SR48968孤独;§相比p < 0.05 SR140333和SR48968的结合。
速激肽和乙酰胆碱在肠道平滑肌主要的兴奋性神经递质中,我们评估如果这些介质可以参与标准4受体激动剂引起的收缩反应。因此,我们测试了他们的对手对诱发反应的影响不相上下4激活没有和TTX的存在。预处理的组织毒蕈碱的拮抗剂阿托品(1μM)显著降低AYPGKF-NH引起的收缩反应2(图5)。收缩反应10μM卡巴可缺席在这些组织(数据未显示)。有趣的是,降低标准4阿托品引起的收缩效果相同的程度,引起TTX;此外,后续的阿托品后(1μM) TTX没有造成进一步降低标准4产生收缩效应(图5)。
两个NK1和NK2受体拮抗剂,SR140333(1μM)和SR48968(1μM)分别减少独立收缩效应引起的标准4激活肽(图5 b)。NK的浓度1受体选择性拮抗剂SR140333使用(1μM)得罪了NK收缩反应1受体激动剂(特别行政区9会见(O2)11]- sp但不是NK2受体激动剂(β-ala8]神经激肽(十)。NK的浓度2受体选择性拮抗剂SR48968使用(1μM)得罪了NK收缩反应2受体激动剂(β-ala8]神经激肽(电场),但不是NK1受体激动剂(特别行政区9会见(O2)11]- sp(数据未显示)。NK的抑制效果1受体选择性拮抗剂SR140333(1μM)诱导的NK添加剂2受体选择性拮抗剂SR48968(1μM)(图5 b)。当对手都coadministered TTX(1μM)收缩效应诱发的标准4激活肽被废除(图5 b)。
最后,预处理的准备与辣椒素(10μM) 90分钟显著降低收缩效应引起的标准4激活肽(图6)。
量效曲线效应诱发的蛋白酶激活受体4 (PAR4)激活肽AYPGKF-NH2鼠结肠的纵肌缺失或辣椒素的存在。辣椒素(10μM)大大得罪了PAR收缩反应4受体激动剂。收缩效果表示为一个百分比的收缩碳酰胆碱(CCh 10μM)。每个值均值(SEM)五个实验。* p < 0.05值与控制。
讨论
可能的生理/病理生理角色标准4组织或细胞中除了血小板知之甚少,尽管广泛分布于不同的组织。122130 -32考虑水平的影响4在平滑肌受体激动剂,一些证据表明标准4没有参与调制的大鼠十二指肠的能动性16或豚鼠胆囊。18然而,Hollenberg和同事12报道称,票面4受体激动剂诱发胃纵行平滑肌的收缩和一氧化氮依赖血管平滑肌的松弛。目前尚不清楚是否标准4激活扮演了一个角色相似或相反的标准1。事实上,票面4激活似乎模仿标准的影响1激活在胃和气管平滑肌,1224而在大鼠食管粘膜肌层,标准4似乎调节放松,与标准1。22
目前的研究表明标准4存在于大鼠结肠及其激活唤起肠道纵向平滑肌的收缩。两个GYPGKF-NH2,对应于小鼠标准4受配体和AYPGKF-NH2,据报道一个更强有力的肽模拟为标准4,25诱导浓度依赖的收缩反应。控制活性肽YAPGKF-NH2没有对纵向平滑肌收缩影响制剂,从而确认这两个标准的特异性的行动吗4肽受体激动剂使用。AYPGQV-NH2是比GYPGKF-NH更强大吗2从文学,它是按照数据。25GYPGKF-NH的有效浓度范围2和AYPGQV-NH2感应的收缩反应低于在其他准备生产所需的收缩。12这个观察是一个可能的解释,在我们准备的标准4激活肽不容易快速蛋白酶降解,或者高效力的受体激动剂可能反映了更大的这种类型的受体的表达比胃结肠,据徐和同事。21
然而,收缩效果我们证明标准4受体激动剂在大鼠结肠平滑肌准备建议这种受体的作用在肠道的蠕动功能。这个角色是否与病理生理情况下的可用性可能取决于受体的内源性蛋白酶在附近。内源性蛋白酶激活相提并论4在肠组织中还有待建立。凝血酶和胰蛋白酶激活已报告标准4所示。21在先前的研究中,我们表明,凝血酶和胰蛋白酶诱导大鼠结肠纵肌收缩效应准备,显示两相的反应:放松收缩交替的最高浓度。19这些影响被PAR模仿1和标准2激活肽,这表明凝血酶和胰蛋白酶可能负责激活内源性的标准1和标准2,分别。然而,目前的结果突出不相上下4凝血酶和胰蛋白酶的另一个潜在的效应。PAR的类似的效果1,票面2,票面4可能使冗余的影响凝血酶和胰蛋白酶在大鼠肠道纵肌作为血小板和建议从胃平滑肌,血管,气管组织。122430.31日33最近,中性粒细胞颗粒蛋白酶组织蛋白酶G3已经发现刺激相提并论4。这增加了组织蛋白酶G的潜在内生活化剂PAR的列表4在肠组织。此外,它链接标准4激活这些组织粒细胞的存在,表明炎症病理生理情况下,如炎症性肠道疾病,可能与标准4激活。
我们检查的机制标准4活化诱导大鼠结肠纵肌收缩效应通过与TTX治疗准备,神经传导阻断剂,来评估的神经诱发效应的作用。发现收缩反应的标准4激活肽对着干,虽然不完全,TTX,表明神经源性组件参与标准4受体激动剂诱发的效果。先前的研究已经报道,标准1和标准2大部分神经元表达的豚鼠小肠肌间神经丛34和标准2在胆碱能神经受体表达猪回肠。35然而,信息的细胞本地化标准4在肠道缺乏组织。在鼠标,票面4表达对周围神经的膀胱已经证明。36我们观察到应用的标准4在黏膜下结构可黏膜下神经元(图2),但双标签与神经元标记需要确定标准4表达神经元在大鼠结肠。我们已经评估如果乙酰胆碱或速激肽可以负责标准4神经介导的效果,因为这些化学介质被认为是主要的肠道平滑肌的兴奋性神经递质。阿托品减少收缩反应标准4激活程度类似于TTX但未能进一步减少TTX治疗后。这表明PAR4激活可以通过动作电位引起乙酰胆碱释放相关的神经机制。此外,NK1和NK2受体拮抗剂,当分别或者同时管理,减少收缩,由于标准4激活,暗示这些受体参与由AYPGKF-NH引发的影响2。这些受体的存在,调节大鼠结肠收缩,已经证明之前,组织化学和功能的研究。263738另一方面,SR140333和SR48968的行动被认为是专门与NK的入住率1或NK2受体,分别,因为这些药物不完全收缩引起的相应受体的选择性受体激动剂。因为NK的抑制效应1和NK2受体拮抗剂添加剂TTX的效果,它可以是假定的标准4激活能引起速激肽释放没有传播动作电位的贡献(TTX耐药释放)。事实上,TTX可能不会抑制直接刺激后释放神经递质受体存在于神经终端。因此,我们假设prejunctional标准4可能直接诱发速激肽的释放,这主要是肠道神经元释放的。26
此外,辣椒素显著降低响应引起的标准4激活肽。尽管辣椒素会导致不同的效果,比如VR1受体的脱敏或电压门控钙通道的封锁,10μM辣椒素的影响很可能90分钟可以归因于一个抑制作用释放生物活性物质,如速激肽,通过感觉神经纤维。2627消耗速激肽的感觉神经可以考虑减少收缩效果标准4激活。据报道,标准2从终端激活刺激P物质的释放辣椒素敏感的初级感觉神经元,从而导致周围组织神经源性炎症反应。39有趣的是,一个类似的系统也被描述为胰蛋白酶诱导豚鼠支气管收缩,速激肽的释放与感觉神经负责最后的收缩反应。4041此外,我们最近的数据表明,标准1和标准2激活能引起神经速激肽释放。29日
总之,本研究首次表明,标准4在大鼠结肠功能表达。它可以调解纵肌的收缩反应通过TTX敏感释放乙酰胆碱和动作电位独立速激肽释放,可能从感官神经。这种机制的行动可能支持PAR的促炎作用4期间,这可能导致运动性扰动观察肠道创伤和炎症。
确认
这项工作由拨款支持Ministero戴尔'Universita e德拉Ricerca scientifica,意大利(FM),加拿大健康研究所(NV)和加拿大胃肠病学协会(NV)。
引用
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