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摘要
背景与目的:基于关于纤维化间质反应在癌症发展中的作用的相互矛盾的报告——即，结缔组织形成反应可以有利于宿主或肿瘤——很明显，间质反应的作用是不同的。基于组织学鉴定的间质成分，我们对穿透固有肌层的直肠腺癌的纤维化间质进行了分类。
方法:使用了三种类型的基质:成熟的-基质由成熟的胶原纤维组成(细而细长的纤维成多层);中间-瘢痕样胶原蛋白与成熟纤维混合;不成熟的-由不含成熟纤维的黏液样间质组成。
结果:在862例患者的数据集中，53%的患者有成熟的纤维癌间质，33%的患者有中间间质，15%的患者有未成熟间质。5年生存率下降如下:成熟间质(80%)、中间间质(55%)和未成熟间质(27%)。不良的肿瘤表型，肿瘤细胞出芽(明显的孤立细胞或小簇癌细胞)，在具有不良纤维间质的肿瘤的癌前沿观察到(p<0.0001)。基于多变量分析，选择分类的纤维化间质作为独立的预后参数(危险比1.39;95%置信区间1.17-1.64)与肿瘤分化有关。通过免疫组化检查，随着纤维化间质成熟程度的降低，间质T细胞明显稀疏。此外，肌成纤维细胞广泛分布在未成熟的纤维间质中，与成熟和中间的纤维间质相比。
结论:纤维性癌间质的形态学分类突出了间质反应与直肠腺癌的行为和宿主免疫反应的关系，并将成为预测患者预后结果的有用工具。
- 直肠癌
- 纤维性癌间质
- myofibroblast
- 黏液样基质
- 预后
数据来自Altmetric.com
有人认为，纤维化间质可能代表着宿主抵御肿瘤细胞的一种尝试，从而发挥拮抗生物力量。另外，这一过程可能有利于肿瘤，通过新生血管和阻碍进入宿主淋巴细胞、巨噬细胞和其他免疫调节细胞。1，2已经证明l-3,4-脱氢脯氨酸诱导的促结缔组织反应抑制导致实验性小鼠黑色素瘤自发转移的增加。2此外，观察到肿瘤细胞在宿主组织中诱导基质反应的能力与其在克隆Lewis肺癌细胞中的转移潜力呈负相关。3.
这些报告支持了促结缔组织反应限制肿瘤侵袭性的假设，并与引发最大促结缔组织反应的肿瘤比引发较不明显反应的肿瘤表现得更侵袭性的概念相矛盾。后者不仅在结直肠癌中被注意到4但在其他肿瘤中，包括乳腺癌，5肺部癌,6胆管癌,7还有皮肤鳞状癌。8这一矛盾表明，在促结缔组织反应中有多个过程对癌症行为有相反的影响。可以想象，这些不同的过程可能在肿瘤生长过程中独立运作，并可能同时发生在同一肿瘤的不同位置。为了了解肿瘤细胞与周围基质之间如此复杂的相互作用，不仅需要检查迄今为止作为基质反应病理指标的纤维化量，还需要检查其定性性质。
纤维结缔组织包括基质成分(如纤维连接蛋白、间质胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖)和负责基质合成的细胞(如成纤维细胞、肌成纤维细胞和组织细胞)。9通过对这些成分的适当强调，我们确定了纤维化癌间质的组织学特征，并对其进行了组织学分类。10本研究的目的是验证我们的分类的临床病理意义，通过研究纤维性癌基质与肿瘤行为、宿主细胞反应和术后生存结果的关系，使用一组长期随访的患者数据。
材料与方法
病人
对1960年至1980年间在圣马可医院接受根治性手术的一系列直肠癌患者进行了生存分析。数据集包括862例直肠腺癌患者(226例在直肠下部，250例在直肠中部，317例在直肠上部，69例在直肠乙状结肠交界处)。此数据集不包括伴有同步肿瘤或腺癌并发家族性腺瘤性息肉病或炎症性肠病的患者。手术后一个月内死亡的患者也被排除在外。所有肿瘤经病理证实均穿透肠壁到达直肠周围组织。所有患者术前均未接受化疗或放疗。所有患者随访至死亡或至少5年;平均随访时间为140个月。
纤维性癌间质的组织学分类标准
当纤维癌间质由成熟的胶原纤维组成时，即由纤维细胞分层成多层的细而细长的纤维组成时，即由具有明亮嗜酸性透明质化的胶原带组成的中间间质，类似于瘢痕疙瘩中所见的胶原带，10与成熟胶原纤维混合(图1)。当基质由随机定向的瘢痕样胶原束包围的粘液样基质(图1)组成时，将其归类为未成熟的纤维化基质。每种病例的基质评估均在肌肉层或直肠系膜的侵袭额区进行，并根据最不利的基质区域进行分类(图2)。急性炎症细胞聚集周围的基质，它有时伴随胃肠道肿瘤并对间质有影响，被排除在考虑之外。
纤维化癌间质成熟。(A)成熟基质;(B)中间基质;(C)未成熟基质。放大×100。
纤维化癌间质的异质性。在肿瘤中观察到成熟的纤维间质(见(B)(见(A)中的星号)和未成熟的纤维间质(见(C)中的星号)。(A)肿瘤侵袭性前额区。根据最不成熟间质的区域来评估纤维化间质的成熟程度。(一)×2.7;(B)×50;(C)×50。
肿瘤萌芽分级
已知对预后有重要影响的形态学特征，如肿瘤直径、肿瘤类型、分化、淋巴结受累和壁外静脉侵犯，先前已在病理报告中记录。除了这些参数外，癌症前沿的肿瘤萌芽被选为表明癌症行为的一个病理特征。在侵袭性活跃区域内，孤立的单个癌细胞或少于5个癌细胞的癌细胞簇被定义为萌芽灶。11，12经过细致的调查，选择出芽最密集的区域，如先前报道的那样，在直径为700 μm的显微镜下计算出了出芽病灶的数量。110-4、5-9、10-19、> - 20分别被分为I、II、III、IV。
免疫组织化学
在每个分类组中随机选取具有代表性的石蜡包埋标本块，按5 μm的高度连续切片。用苏木精-伊红染色每个待研究标本的切片块，以确认纤维化间质的成熟。在50例检查中，20例肿瘤有成熟的纤维间质，17例肿瘤有中间的纤维间质，13例肿瘤有未成熟的纤维间质。使用标记链霉亲和素生物素技术进行免疫染色研究。简单地说，脱蜡再水化切片用0.2%过氧化氢酶在甲醇中处理3分钟，以阻断内源性过氧化物酶。对于非酶促表位的提取，切片在pH值6.0的柠檬酸缓冲液中加压煮3分钟。让切片冷却，然后切片在1:5稀释的正常马血清中孵育。切片用小鼠单克隆抗人CD3(在磷酸盐缓冲盐水中1:50稀释;Dako, Carpinteria, California, USA)或小鼠单克隆抗人平滑肌肌动蛋白(在磷酸盐缓冲盐水中稀释1:500;Dako)在室温下。 Biotinylated antimouse IgG (Vector, Burlingame, California, USA) (1:200 dilution) was used as the secondary antibody (30 minutes, room temperature). Following a wash in phosphate buffered saline, the avidin-biotin complex complex (Vector) was added for 30 minutes before the final DAB (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA) was applied to develop the peroxidase.
T淋巴细胞和肌成纤维细胞的分布
通过观察泛T细胞标记CD3的免疫组化，我们能够评估侵袭额叶区的T细胞密度。在直径500 μm的显微镜范围内计数免疫反应细胞的数量。选取分布最丰富的3个区域，计算平均数量。关于由抗平滑肌肌动蛋白抗体识别的肌成纤维细胞的分布，在癌前周围的反应性纤维带的定位模式分为两类:A，受限;B，普遍存在(图3)。
肌成纤维细胞在反应性纤维带的定位模式。(A)受限:肌成纤维细胞随着与肿瘤距离的增加而变得稀疏(×50)。(B)弥漫性:在整个反应性纤维带，可见到密集、弥漫性肌成纤维细胞(×50)。
统计分析
生存率采用Kaplan-Meier法计算，比较采用log秩检验。在分类后，将每个临床和病理变量输入Cox比例风险回归分析，以确定哪个参数对术后生存有独立影响。除癌间质和肿瘤萌芽外，其他变量均已在病理报告中记录。未配对的t采用CD3淋巴细胞数与纤维化癌基质类型的相关性检验。通过Spearman试验分析了分类纤维癌间质和肿瘤萌芽之间的关系。纤维癌基质的成熟和肌成纤维细胞的分布进行Mann-Whitney 's U检验。使用StatView ver.5.0软件(SAS研究所，Cary, North Carolina, USA)进行统计计算。
结果
纤维化癌基质成熟对生存的影响
在数据集中，52.6%的患者有成熟的纤维癌间质，32.9%的患者有中间间质，14.5%的患者有未成熟间质。基质反应的类型不受肿瘤位置的影响。未成熟间质组5年和10年生存率最差，中间间质组较好，成熟间质组最好(图4)。各组癌症特异性5年生存率分别为79.5%、54.5%和27.2%(表1)。
Kaplan-Meier对862例穿透肌肉层的直肠癌患者的癌症特异性生存期进行了估计，根据纤维性癌间质成熟度(成熟、中期和未成熟)的组合数据集。注意患者生存期与纤维化癌间质成熟的相关性。各组间P <0.0001(对数秩检验)。
纤维癌基质成熟与肿瘤萌芽的关系
纤维性间质的类别与肿瘤出芽的程度有统计学意义(表2)。在未成熟间质中，肿瘤出芽的分数越高，出现的频率越高。由于这两个变量在多变量分析中对生存有统计学意义上的影响(表3)，纤维癌基质的成熟和肿瘤萌芽独立地影响患者的生存。
纤维癌基质成熟与T细胞和肌成纤维细胞分布的相关性
成熟纤维间质区域T细胞平均数量为404/500 μm直径场，而中间和未成熟纤维间质区域T细胞平均数量分别为221和107(图5)。
纤维癌间质成熟度与CD3阳性淋巴细胞数量的相关性。注意CD3淋巴细胞的数量随着周围基质成熟度的降低而减少。成熟vs中级，p = 0.0002;中间v不成熟，p = 0.0003;成熟的v未成熟，p<0.0001(未配对t测试)。Bar表示SD。
25%的成熟纤维间质肿瘤中可见肌成纤维细胞的普遍分布，而在中间纤维间质肿瘤中这一比例为47%(表4)。另一方面，所有未成熟纤维间质肿瘤均可见肌成纤维细胞的普遍分布。
讨论
关于细胞外基质的知识积累表明，要理解肿瘤细胞入侵的机制，需要分析肿瘤细胞与周围基质之间的复杂相互作用。13肿瘤细胞在侵袭边缘的去分化和解离过程被认为是肿瘤侵袭的第一步和必要步骤。14根据观察，这一过程始终严格局限于肿瘤侵袭前沿，来自宿主微环境的诱导信号被认为通过激活或抑制肿瘤细胞预先形成的遗传程序，参与了启动和维持这一快速甚至可逆的表型转移。14相反，在肿瘤中心的结缔组织反应中产生的I型胶原蛋白，据报道是抑制肿瘤去分化过程的微环境因素。15我们提出的纤维化癌基质成熟的概念将与这种情况相兼容;它已被证明与肿瘤萌芽的强度有显著的相关性，即组织学去分化，包括癌细胞的解离和入侵的第一步，16影响结直肠癌患者的生存结局。11，16日,17中间纤维间质和未成熟纤维间质实际上局限于特定肿瘤的肿瘤侵袭前沿;肿瘤中心由精细成熟的纤维分层成多层(成熟间质)组成。基于这些发现，中间和未成熟的纤维间质似乎是一种促进癌细胞去分化的短暂表型，而成熟间质是一种更晚、更稳定的表型，可能降低肿瘤细胞的侵袭活性，无论它们位于肿瘤中心还是侵袭前沿。
单因素和多因素分析显示，分类的纤维化癌间质与患者生存结局显著相关。一些在肿瘤分化、细胞迁移和肿瘤进展中必不可少的调节剂来源于成纤维细胞。18岁22考虑到成熟纤维间质和中间纤维间质在生存结局和肿瘤出芽程度上的差异，抗1型胶原抗体过度染色的“瘢痕样”胶原蛋白的合成，10可能被认为代表成纤维细胞的异常功能。因此，肿瘤行为和临床结果似乎可以由肿瘤基质的性质介导。
Shurlch等根据肌成纤维细胞分布与癌前位置的关系，将乳腺癌的间质反应分为三种类型(早熟、同步和晚期)。23与乳腺癌不同，肌成纤维细胞被观察到先于癌细胞进入反应性纤维带24直肠癌(即Shürlch分类的早熟型)。在癌浸润边缘周围的反应性纤维带，肌成纤维细胞的定位模式与纤维性癌基质的类别有关。肌成纤维细胞在未成熟的纤维间质中广泛分布，而在成熟间质和中间间质中，它们分别在75%和53%的病例中局限于浸润前周围。肌成纤维细胞最近引起了人们的关注，因为它能产生能够降解肿瘤腺体周围基底膜的溶解酶，并在肿瘤基质中合成细胞外基质成分，这可能随后改变上皮癌细胞的粘附和迁移特性。25
尽管长期以来，人们一直认为结直肠原发肿瘤中淋巴细胞浸润减少与预后不良有关，26日—28肿瘤抑制淋巴细胞运动的机制尚不清楚。Lieubeau等据报道，由于肌成纤维细胞的收缩特性和相关的细胞外基质，它们可能会阻止肿瘤内免疫细胞的渗透，在促进肿瘤生长和进展的同时，创建一个对抗免疫反应的物理屏障。29体外实验的结果也支持我们的发现，即T淋巴细胞在肌成纤维细胞广泛分布的未成熟纤维间质中浸润较少，而在成熟和中间纤维间质中浸润较少。上述结果可能表明，未成熟的纤维性癌基质可能充当癌症的“茧”，30.阻碍免疫细胞到达肿瘤，促进肿瘤细胞存活。这可能是间质不成熟导致预后不良的重要原因，我们的862例队列研究证实了这一点。
总之，在晚期直肠腺癌中对纤维性癌间质进行了组织学分类，这有助于我们理解纤维性间质反应在调节肿瘤行为和宿主免疫反应中的作用。我们认为，成纤维细胞和肌成纤维细胞被认为代表了一个共同祖先细胞的两种等工转变，它们是为了响应功能需求或微环境的变化而发展的，23确定基质的性质。通过对建立中间和未成熟纤维间质机制的清晰认识，有可能找到新的治疗策略来限制肿瘤的侵袭性。