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摘要
背景:在怀孕期间，铁的吸收增加，以适应不断增长的胎儿对铁的需求。
目的:目的探讨十二指肠铁转运分子和肝脏铁调节分子在协调妊娠期铁吸收变化中的作用。
方法:采用核糖核酸酶保护试验、western blotting和免疫组化方法检测大鼠在妊娠不同天和产后24-48小时的肝脏中hepcidin、转铁蛋白受体1、2和HFE(最常见的遗传性血色素病突变基因)的表达，以及二价金属转运蛋白1 (DMT1)、十二指肠细胞色素b (Dcytb)、铁调控mRNA (Ireg1)和hephaestin (Hp)的十二指肠表达。
结果:肝脏非血红素铁和转铁蛋白饱和度降低，表达增加转铁蛋白受体1肝脏显示孕妇体内铁储备在怀孕期间逐渐减少。妊娠期间十二指肠铁转运分子DMT1、Dcytb和Ireg1的表达增加，与之对应的是hepcidin,HFE,转铁蛋白受体2肝脏的表达。产后24-48小时，所有分子的表达恢复到对照值。
结论:这些数据表明，关键铁转运分子表达的增加是与怀孕相关的铁吸收升高的原因，并暗示hepcidin, HFE和转铁蛋白受体2在决定母体铁稳态机制如何响应伴随怀孕的铁需求增加。
- 十二指肠细胞色素b
- 二价金属转运蛋白1
- 遗传haemochromatosis
- 铁调控
- 十二指肠细胞色素b
- 二价金属转运蛋白1
- 甘油醛3-磷酸脱氢酶
- HFE基因在最常见的遗传性血色素沉着病中发生了突变
- 惠普,hephaestin
- IRE，铁响应元件
- irreg1，铁调节mRNA(也称为运铁素1)
- NP,没有怀孕
- PP、产后
- 核糖核酸酶保护试验
- 总和生育率,转铁蛋白受体
来自Altmetric.com的统计
- 十二指肠细胞色素b
- 二价金属转运蛋白1
- 甘油醛3-磷酸脱氢酶
- HFE基因在最常见的遗传性血色素沉着病中发生了突变
- 惠普,hephaestin
- IRE，铁响应元件
- irreg1，铁调节mRNA(也称为运铁素1)
- NP,没有怀孕
- PP、产后
- 核糖核酸酶保护试验
- 总和生育率,转铁蛋白受体
在怀孕期间，由于母体红细胞的膨胀和胎儿的高铁需求，铁的需求量增加。这些需求最初是通过调动母体储存的铁(主要来自肝脏)来满足的，但随着铁储存的消耗，肠道对铁的吸收增加，以维持母体和后代充足的铁供应。1 -3.胎儿通过胎盘获取铁元素，胎盘将转铁蛋白结合的铁从母体循环中隔离出来。母胎移植率随胎儿和胎盘大小的增加而增加，在分娩前达到最大值。4,5这时候铁的吸收也是最大的。例如，人类在妊娠12周到36周之间，铁的吸收增加了9倍6而大鼠从第16天到第21天吸收率显著增加。1产后吸收迅速恢复到控制水平(例如，大鼠在18小时内)，7说明怀孕所提供的吸收刺激的强度。
小肠对妊娠铁需求的反应能力表明这是一个高度调节的过程。在正常生理条件下，调节铁吸收的两个主要因素是体内铁的储存水平和红细胞生成率。8铁的吸收在储存量低时增加，而在储存量高时减少，所以与怀孕有关的体内铁的消耗水平与铁的吸收增强有关，这并不奇怪。然而，一项研究发现，铁含量高的大鼠在怀孕期间吸收增加，尽管它们的铁储量很高。1这一观察结果表明，母体铁储存水平可能不是怀孕期间铁吸收的唯一调节因素。
近年来，我们对肠道铁转运机制和调控的理解取得了进展，这得益于发现了参与这一过程的一些关键分子。其中包括铁转运体二价金属转运体1 (DMT1)和铁调控mRNA (Ireg1;也被称为运铁素1)，以及酶十二指肠细胞色素b (Dcytb)和肝磷脂素(Hp)。在缺铁的情况下，刷状边界转运体DMT1、基底外侧转运体Ireg1和铁还原酶Dcytb均上调9这些变化是伴随铁的消耗而增加的铁吸收的基础。铜蓝蛋白同源物Hp(一种假定的铁氧化酶)的破坏导致小鼠微细胞低色素贫血10但这种蛋白质似乎并没有受到铁水平变化的显著调节。11其他一些分子也与决定人体对铁需求变化的反应有关，包括HFE(在最常见的遗传性血色素沉着病中发生突变的基因)、转铁蛋白受体2 (TfR2)和抗菌肽hepcidin。这些基因都在肝脏中高度表达，其中任何一个基因的突变都可能导致铁超载。12 -14的确,HFE是流行的铁负荷紊乱遗传性血色素沉着病中最常发生突变的基因。Hepcidin分泌进入循环，被认为是体内铁储存和铁被十二指肠肠细胞吸收之间的信使。15
目前还没有关于与怀孕相关的铁吸收增强的分子机制的全面分析。因此，我们试图研究十二指肠铁转运分子和肝脏调节分子在协调妊娠过程中观察到的铁吸收变化中的作用。这些研究表明，怀孕期间十二指肠铁转运分子的表达逐渐增加，与身体铁储备的减少和肝脏的减少相对应hepcidin表达式。有趣的是,的表达HFE而且TfR2也会随着怀孕的进行而下降。出生后，所有参数在两天内恢复到正常水平。
方法
动物
从澳大利亚布里斯班的赫斯顿医学研究中心获得了喂养标准啮齿动物颗粒饲料(370 mg铁/kg)和交配时间为10-12周龄的雌性斯普拉格-道利大鼠。大鼠分别在妊娠9、15、18和21天及产后24-48小时处死。那些没有怀孕的被用作未怀孕的对照组。大鼠腹腔麻醉(44 mg/kg氯胺酮和8 mg/kg羟嗪)，腹主动脉放血，供血测定血清铁。取肝脏和十二指肠样本，如前所述分离十二指肠肠细胞。16组织和分离的细胞小球被快速冷冻在液氮中。这项研究得到了昆士兰医学研究所动物伦理委员会的批准。
血清和组织铁分析
使用铁和铁结合能力试剂盒(Sigma-Aldrich, Sydney, Australia)测定血清转铁蛋白饱和度。肝脏组织在110°C下干燥一夜，用酸提取，如前所述，使用比色法测定非血红素铁含量。17
核糖核酸酶保护分析
使用5 μg用TRIzol试剂(Invitrogen, Melbourne, Australia)按照制造商说明分离的总RNA，通过核糖核酸酶保护试验(RPA)分析肝脏和肠细胞中的基因表达。管家基因的表达甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH)和铁代谢基因惠普,HFE,hepcidin,Dcytb,Ireg1,转铁蛋白受体1,TfR2,DMT1(包含剪接变体的铁响应元件(IRE)和非IRE形式)使用与这些基因的互补DNA序列相对应的核探针进行检测，如前所述。9，11TfR2的核探针对应于GenBank中列出的cDNA序列的1859 - 2039核苷酸(登录号为XM 2222)。用密度法定量条带强度，铁代谢基因表达作为GAPDH基因表达的比例被报道。
免疫印迹分析
从分离的十二指肠肠细胞中提取蛋白质，使用前面描述的多克隆抗体进行western blotting检测DMT1和Ireg1蛋白表达。9，11，18通过密度法量化带强度，并报告DMT1和Ireg1的表达作为肌动蛋白表达的比例，以控制凝胶负载的任何差异。
免疫组织化学
从包埋并在OCT包埋化合物(Sakura Finetek, Torrance, California, USA)中快速冷冻的十二指肠组织中切下的切片被用于免疫荧光显微镜定位DMT1和Dcytb蛋白，如上所述。9
统计分析
所有值都表示为平均值(SEM)。平均数之间的统计差异用方差分析和学生的计算t测试，校正样本方差的差异(Microsoft Excel;微软有限公司，北赖德，澳大利亚)。
结果
随着妊娠的进展，胎儿对铁的需求增加，母体的铁储备也相应下降。3.在本研究中，未妊娠对照大鼠的肝脏非血红素铁水平在妊娠第21天从8.27 (0.9)μmol铁/g干重下降到2.43 (0.5)μmol铁/g (p<0.01)(图1A)。出生后肝脏铁含量略有增加，达到3.80 (0.4)μmol Fe/g，但仍远低于对照组(p<0.05)。转铁蛋白饱和度在整个妊娠过程中逐渐下降，从非妊娠动物的45.1%(4.6)%下降到第21天的6.5 (0.8)% (p<0.01)，但在产后48小时恢复到对照水平(图1B)。与肝脏铁浓度和转铁蛋白饱和度的降低相对应的是肝脏表达的增加TfR1RPA测定的mRNA(第21天为非妊娠水平的5.9倍;p < 0.05)(图2)。TfR1产后24-48小时，表达量下降，但仍是未怀孕时水平的3.5倍(p<0.01)。
妊娠期肝脏非血红素铁和血清转铁蛋白饱和度。大鼠在妊娠不同天数和产后24-48小时(PP)进行研究，并与未妊娠大鼠(NP)进行比较。数值以μmol非血红素铁/g干重肝组织(A)和血清转铁蛋白饱和度百分比(B)表示。数据以均值(SEM)表示，n = 4。与未孕大鼠差异显著:*p<0.05， **p<0.01。
转铁蛋白受体1 (TfR1)，hepcidin,HFE(该基因在最常见的遗传性血色素沉着病中发生了突变)和TfR2信使rna。动物如图1所示。用核糖核酸酶保护法检测各基因的表达。(A)每个基因的代表性分析。(B)用密度法测量每个基因的条带强度，并将其作为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)．数据为均值(SEM)， n = 4。与未孕大鼠差异显著:*p<0.05， **p<0.01。
由于最近的研究表明，肝脏分子hepcidin, HFE和TfR2在铁的吸收调节中起着关键作用，我们研究了它们在妊娠期间的表达。hepcidin的表达逐渐下降(图2)，在第15天达到统计学意义，在第21天至少为非妊娠水平的1.9% (p<0.05)。出生后，hepcidin的表达迅速恢复到接近对照水平。两者在肝脏的表达HFE而且TfR2随着怀孕的进展而减少(图2)。HFE表达式遵循了类似的模式hepcidin在第21天显著降低至非妊娠水平的18%(与非妊娠对照相比p<0.05)，在出生后24-48小时恢复到对照组水平。减少TfR2表达不那么明显，在妊娠第18天下降到对照值的70% (p<0.01)。
由于母体肠道铁吸收的增加在怀孕期间已被很好地描述过，1，6我们研究了妊娠期间十二指肠铁转运分子的表达。刷缘铁转运体mRNA的表达DMT1IRE型和非IRE型在妊娠第18天分别达到非妊娠水平的7.9倍(p<0.05)和2.4倍(p<0.01)，之后逐渐下降。Western blot分析显示DMT1蛋白水平类似上调(未怀孕对照动物的8.1倍;p<0.05)，产后24-48小时降低到对照组水平(图4)。免疫荧光显示，与未妊娠大鼠(图5)和产后24-48小时大鼠相比，第18天和21天刷缘处的DMT1增加。毛刷缘铁还原酶Dcytb的表达也在妊娠后期升高。第15天，mRNA的表达量上升到非妊娠动物的2.9倍，到第21天基本保持不变(第18天和第21天分别比非妊娠动物增加3.3倍和3.1倍;p<0.05)，出生后下降(图3)。免疫组化显示未妊娠动物Dcytb染色很少，但在第18和21天有明显的刷状边界染色。这在出生后24-48小时内大大减少(图5)。
二价金属转运蛋白1 (DMT1)(铁反应元件(IRE)和非IRE形式)，十二指肠细胞色素b (Dcytb), hephaestin (惠普)和铁调控的mRNA (Ireg1) mRNA。动物如图1所示。用核糖核酸酶保护法检测各基因的表达。(A)每个基因的代表性分析。(B)用密度法测量每个基因的条带强度，并将其作为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)．数据为均值(SEM)， n = 4。与未孕大鼠差异显著:*p<0.05， **p<0.01。
二价金属转运体1 (DMT1)和铁调节mRNA (Ireg1)蛋白在十二指肠中的表达。动物如图1所示。用蛋白印迹法测定每种蛋白的含量。(A)每种蛋白质的代表性蛋白印迹图。(B)用密度法测量每种蛋白质的能带强度，并绘制成肌动蛋白的比例图。数据为均值(SEM)， n = 4。与未孕大鼠差异显著:*p<0.05。
免疫组化定位十二指肠细胞色素b (Dcytb)和二价金属转运蛋白1 (DMT1)。十二指肠切片取自未妊娠大鼠(NP)、妊娠第18和21天的妊娠大鼠以及产后24-48小时的大鼠(PP)。使用Dcytb或DMT1特异性抗体进行免疫荧光染色。在每个时间点研究了四只动物的切片，并显示了代表性的切片。原来100×放大。
Ireg1mRNA的表达在妊娠后期略有增加，但与妊娠后期不同DMT1而且Dcytb然而，Ireg1蛋白水平在第15天增加到非妊娠对照的1.8倍(p<0.05)，并在第18天和第21天分别增加了1.6倍和1.7倍(p = 0.06)。出生后，蛋白质表达恢复到正常水平(图4)。惠普mRNA的表达在怀孕期间和出生后没有变化(图3)。
讨论
生长中的胎儿对铁有很高的需求，必须从母亲那里得到满足。由于整个怀孕过程中转移到胎儿体内的铁量超过了正常情况下母体储存的铁量，因此母体对铁的吸收必须有补偿性增加，以提供额外所需的铁。在这项研究中，我们在分子水平上对这一过程进行了初步的表征。
作为母胎转移和母体铁动员增加的证据，我们观察到转铁蛋白饱和度和肝脏非血红素铁的下降，以及随着妊娠进展TfR1表达的增加。转铁蛋白饱和度和母体铁储备的降低伴随着十二指肠中刷状缘铁转运体DMT1和铁还原酶Dcytb表达的增加，在妊娠的最后几天观察到最高水平。另一个小组进行了研究DMT1他们还发现在妊娠后期的mRNA表达水平最高。19与DMT1和Dcytb一样，基底外侧铁输出蛋白Ireg1在妊娠后期表达上调，但仅在蛋白质水平上显著升高。这三种分子的表达在出生后急剧下降。此时转铁蛋白饱和度也增加，从而加强了系统铁需求增加与母体转运蛋白表达之间的关系。铁氧化酶的表达无明显变化惠普．
随着妊娠期的推进，肠道铁转运分子的表达量逐渐增加，出生后表达量急剧下降，这与以往研究显示的铁吸收在妊娠后期达到最大一致1，6，7,20.在出生后迅速下降。1，6这些研究使用了各种各样的技术来证明吸收变化，包括59铁通过十二指肠袢吸收(大鼠)，摄取59铁从饮食(大鼠)和稳定同位素研究(人类)。观察到的调节也与之前的许多研究一致，这些研究表明，铁需求的增加和铁储量的减少与肠道铁运输机制表达的增加有关。11，21其他研究强调了这样一个事实:虽然许多铁转运分子是转录调控的，但它们也可以在翻译和细胞水平上通过亚细胞定位中的铁依赖变化进行调控。18，22例如，后一种调节模式可能对Ireg1和Hp很重要，因为最近的数据表明，铁吸收的基底外侧转移步骤可能在肠如何响应系统铁需求的变化中发挥关键作用。23，24事实上，在这项研究中，我们发现Ireg1在mRNA水平上的调控很少，但在蛋白质研究中，Ireg1的调控显著增加，这表明在怀孕期间，转录后机制对该分子的调控是最重要的。
为了研究怀孕期间人体是如何向小肠发出信号以吸收更多的铁，我们研究了肝源性调节肽的表达hepcidin．Hepcidin在整个怀孕过程中，表达逐渐减少，在分娩前达到最低水平，然后在出生后不久恢复到接近正常水平。表达式的逆关系hepcidin本研究中观察到的肝脏和十二指肠铁转运蛋白与越来越多的证据一致，表明肝磷脂作为肠道铁吸收的抑制剂。小鼠与人类同废hepcidin表达发展铁超载14日,25而过度表达该基因的小鼠会患缺铁性贫血。26同样，实验诱导的铁超载导致增加hepcidin表达和肠道转运蛋白表达减少，而缺铁则相反。11，27我们的数据表明，hepcidin是一个关键的信使控制肠道铁吸收在怀孕期间。
导致hepcidin表达改变的因素尚不明确，但最近的证据表明HFE和TfR2是潜在的调控分子。这两种基因中的任何一种突变都会导致铁的过量，继而导致铁的吸收增加。12日,13此外,hepcidin在HFE相关血色素沉着症中，尽管铁含量升高，28而且在与TfR2相关的铁超载中也会出现相同的反应，因为HFE患者、hepcidin和TfR2突变都具有非常相似的表型。因此，HFE(可能还有TfR2)似乎是hepcidin表达的上游调控因子，是hepcidin对体内铁水平变化做出适当反应所必需的。因此，有趣的是，我们观察到的表达减少HFE，在较小的程度上TfR2怀孕期间的mRNA水平。我们最近提出了一种机制，HFE和TfR2可以响应转铁蛋白饱和度的变化，进而影响hepcidin的表达。15由于母体铁水平和转铁蛋白饱和度在怀孕期间降低，这是影响hepcidin水平的一个潜在机制。然而，其他改变HFE和/或TfR2表达的因素也可能有类似的影响。在这方面值得注意的是，巴蒂和加拉格尔1研究发现，保持高铁饮食的怀孕大鼠铁的吸收率仍然升高，尽管没有达到与控制饮食的动物相同的水平。这表明，铁依赖和铁不依赖因素都参与决定了怀孕期间的吸收反应。胎盘衍生因子可能在这一调节中发挥重要作用，因为胎盘对铁元素输送到胎儿至关重要。
HFE和TfR2本身是如何被监管的尚不清楚。先前的研究表明，在铁负荷的肠细胞系中HFE的表达增加29肠内缺铁会减少。30.然而，调控的范围远小于我们在怀孕期间在肝脏观察到的表达范围。这可能是由于组织特异性调节，肝脏中的HFE对组织铁含量变化的反应比肠道中的HFE要强烈得多。或者，也可能与怀孕有关。为了支持这种可能性，早期的研究未能找到当体内铁负荷变化时，肝脏中TfR2调节的证据，31而我们看到了明显的下降TfR2妊娠后期的表达。一个候选的妊娠特异性因子是雌激素。在怀孕期间，雌激素最初由黄体分泌，后来由胎盘分泌。32在怀孕期间，雌激素水平逐渐增加，在分娩前达到峰值，与此同时铁的吸收是最大的，然后在出生后不久急剧下降(当胎盘被排出时)，再次类似于吸收。32，33此外，当给切除卵巢的大鼠注射雌激素时，雌激素的浓度与妊娠后期相似，铁的吸收增加了。34雌激素是否在HFE和/或TfR2的调控中起作用还有待确定。
综上所述，妊娠期铁吸收的变化与十二指肠铁转运体表达的增加和小肠铁转运体表达的减少是一致的hepcidin本研究中观察到的表达。减少的表达HFE而且TfR2在妊娠期间也可能很重要，可能是hepcidin反应的基础。这些分子是否对母体铁水平和转铁蛋白饱和度(一种妊娠特异性因素)或两者的结合有反应，还需要进一步的研究。
致谢
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会和人类前沿科学项目(赠款RGY0328/2001-M)的部分资助。