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摘要
背景与目的:作为肠抗原的第一个接触点，肠上皮细胞(IEC)可能是调节黏膜免疫反应的关键。因此，我们确定了小鼠结肠上皮细胞(CEC)是否对CD4 T细胞有耐受或激活作用。
方法:使用一种新的CEC、巨噬细胞和CD4 T细胞共培养系统，评估了naïve和抗原引物CD4 T细胞的丝裂原和抗原特异性反应。
结果:尽管部分CEC表达共刺激分子B7.1、B7.2、CD40和CD54，但即使在外源共刺激信号存在的情况下，它们也不能促进有丝分裂原或抗原驱动的CD4 T细胞活化。与CEC共培养的CD4 T细胞为CD25罗和CD45RB罗并保持在细胞周期的G1期。CEC还能阻止CD4 T细胞被专业抗原提呈细胞激活。CEC介导的T细胞活化抑制是细胞接触依赖和转化生长因子β独立。
结论:这些观察结果表明，CEC通过防止CD4 T细胞的不适当激活，有助于维持肠道中的T细胞耐受性。
- CD4 T淋巴细胞
- 宽容
- 结肠上皮细胞
- 鼠标
- APC，抗原提呈细胞
- CBA，流式细胞仪珠阵列
- CFSE，羧基荧光素二乙酸琥珀酰酯
- CEC，结肠上皮细胞
- 胎牛血清
- IBD，炎症性肠病
- IEC，肠上皮细胞
- IFN-γ，干扰素γ
- ,白介素
- LAP，潜伏期相关肽
- LP，固有板
- 中位荧光
- MHC，主要组织相容性复合体
- PMA, 12-肉豆蔻酸磷13-乙酸酯
- TcR, T细胞受体
- TGF-β，转化生长因子β
- 肿瘤坏死因子α
数据来自Altmetric.com
- APC，抗原提呈细胞
- CBA，流式细胞仪珠阵列
- CFSE，羧基荧光素二乙酸琥珀酰酯
- CEC，结肠上皮细胞
- 胎牛血清
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- MHC，主要组织相容性复合体
- PMA, 12-肉豆蔻酸磷13-乙酸酯
- TcR, T细胞受体
- TGF-β，转化生长因子β
- 肿瘤坏死因子α
肠上皮细胞(IEC)是肠抗原的主要接触点，可能在黏膜免疫中发挥直接作用，特别是在调节T细胞对肠抗原的反应方面。1IEC能够构成或诱导地表达参与抗原提呈的分子，包括主要组织相容性复合体(MHC) I类和II类以及MHC I-like (MHC Ib, MIC-A, MIC-B, HLA-E, CD1d)分子，以及吸收和处理可溶性蛋白抗原和分泌细胞因子的能力，表明它们可以作为抗原提呈细胞(APC)。1 -7此外，IEC在人类炎症性肠病(IBD)中表达MHC II水平升高。2在IBD动物模型中，8与他们参与IBD的发展和维持相一致。
大部分研究IEC与T细胞相互作用的工作都集中在小IEC上。然而，结肠和小肠的结构、功能和抗原负荷是非常不同的，包括常驻T细胞的组成。而小肠中的T细胞主要是CD8+αβ或γδ上皮内淋巴细胞，结肠中的大多数T细胞是上皮细胞相关的CD4+αβ T细胞。在小鼠小肠中，被称为M细胞的特化上皮细胞吸收和运输抗原，并可能充当APC9；相比之下，对结肠固有层内的专业APC知之甚少。我们最近的工作表明，小鼠结肠上皮细胞(CEC)具有APC的特性10表明它们可能是结肠APC。
T细胞激活需要APC发出两个主要信号。抗原必须在MHC分子的背景下呈递给T细胞受体(TcR)复合体(信号1)。信号2涉及APC上的共刺激分子与其T细胞上的反配体的相互作用。B7蛋白家族成员(例如，B7.1, B7.2)与T细胞上的对抗受体CD28和CTLA-4的相互作用分别在T细胞的激活和抑制中起重要作用。11大多数正常的上皮细胞，如胆道上皮细胞和肝细胞不表达B7.1或B7.2，但表达其他共刺激分子，包括CD40和CD54 (ICAM-1)。12 -14我们和其他人已经证明，缺乏B7表达的胆道和肺上皮细胞等上皮细胞可以抑制T细胞的活化。15 -17由于在缺乏B7的情况下激活T细胞会导致T细胞无反应性或无能，而大多数正常上皮细胞缺乏B7，因此可以预测正常上皮细胞会使T细胞无能。胃肠道上皮细胞在感染反应中表达B7.2的能力13或炎症18，19可能提供了结肠炎CD4 T细胞介导的免疫应答机制。
在这项研究中，我们研究了T细胞与CEC相互作用的性质，并确定CEC是否与许多其他上皮细胞类型一样，可以阻止T细胞活化。
方法
动物
C57BL/6和BALB/C-DO11.10 T细胞受体转基因小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor, Maine, USA)，并在利兹大学特定的无病原体条件下饲养。常规筛查哨鼠常见的老鼠病原体，但没有检测到。
CEC和固有层T细胞的分离培养
我们之前已经描述了CEC和固有层T细胞的分离和培养。20.通过细胞角蛋白和CD45染色评估CEC纯度。分离的CEC通常包括隐窝细胞、肠细胞和杯状细胞。在我们正常的培养条件下，隐窝样细胞簇或类器官附着在Matrigel底物上，与与Matrigel接触的上皮基外表面形成极性确定的半融合单分子层。然而，在与CD4 T细胞共培养时，类器官保持完整和悬浮状态，允许CD4 T细胞与基底和根尖上皮表面相互作用。从培养物中提取CEC，用disase消化:胶原酶IV (1 mg/ml;Sigma, Poole, Dorset, UK) 5-10分钟，之后细胞在含有20%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle 's培养基中洗涤两次。
CEC:CD4 T细胞共培养
脾CD4 T细胞通过塑料粘附消耗Mφ制备，然后进行负免疫磁选择(Miltenyi Biotec, Bisley, UK)，产生含有>98% CD4 T细胞的细胞悬液。如前所述，分离结肠固有层CD4细胞。20.在增殖实验中，T细胞用羧荧光素二乙酸琥珀酰亚酯(CFSE;剑桥生物科学，剑桥，英国)，立即加入CEC培养。CEC类器官(大约2×105细胞/ml)培养6-24小时后加入全脾细胞或CD4 T细胞(2×106ConA存在或不存在时(5 μg/ml;Sigma)，有丝分裂抗cd3抗体(1452C11)，抗cd3和抗cd28抗体(37.51)，或OVA (10 μM;σ)。CD4细胞与粘附的脾Mφ (2×10)一起培养，作为阳性对照5细胞/ml)在与CEC相同的条件下，在Matrigel涂层组织培养板(Becton Dickinson Biosciences, Oxford, UK)中:CD4 T细胞共培养。固有层T细胞:如上所述，在有丝分裂抗cd3抗体的存在下进行CEC共培养。在一些实验中，200 U/ml重组小鼠白细胞介素2 (IL-2;toam生物公司，剑桥郡，英国)，山羊抗转化生长因子β1 (TGF-β1)抗体，或山羊IgG (R&D Systems，阿宾顿，英国)被添加到CEC:T细胞共培养中。72小时后采集T细胞，抗体染色和流式细胞术分析。
抗原特异性CD4 T细胞反应
通过培养DO-11 CD4 T细胞获得抗原修饰的CD4 T细胞，其中>90%表达OVA特异性TcR (KJ1-26)+10 μM OVA和20 U/ml IL-2在完全RPMI培养基(10% v/v FBS, 100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，2 mM)中孵育5 dl-谷氨酰胺)，最终浓度为2×106细胞/毫升。免疫磁选择阳性分离CD4 T细胞，在存在或不存在OVA (10 μM)的条件下，用CEC或Mφ培养72小时。在CEC或Mφ共培养中，使用新鲜分离的非刺激DO11 CD4细胞作为naïve T细胞的来源。作为附加对照，FITC-OVA脉冲CEC与lacz诱导的OVA/I-A一起培养b特异性CD4杂交瘤KZO，如其他地方所述。20.
与CEC共培养后CD4 T细胞的再刺激
CEC和CD4 T细胞在有丝分裂抗cd3抗体的存在下共培养。72小时后，通过阳性免疫磁选择分离CD4细胞，用抗cd3抗体重新刺激72小时，或用10 nM phorbol12 -肉肉蔻酸13-乙酸酯(PMA)和500 nM离子霉素(CN Biosciences, Nottingham, UK)刺激24小时，如前文所述。17通过细胞周期分析和活化标志物的表达来评估T细胞的活化。在与CEC共培养后，也评估了OVA启动的CD4 T细胞对抗原的反应能力。从初始CEC中分离CD4 T细胞:T细胞通过Percoll密度梯度离心共培养，清洗，并在分析前72小时镀在脉冲Mφ抗原上。
流式细胞术
在FACScan流式细胞仪上使用CELLQuest软件(Becton Dickinson)对细胞进行流式细胞分析。用荧光色素和/或生物素偶联抗体CD45、B7.1 (CD80)、B7.2 (CD86)、ICAM-1 (CD54)、CD40、KJ1-26、CD25、CD69、H-2D染色b， CD45RB, CD62L, CD44, CD8α， CD4, NK1.1, GR-1, F4/80 (TCS Biologicals, Towcester, UK)， Fas (CD95)， CTLA-4 (CD152)， I-A/I-E (Becton Dickinson)，泛活性抗细胞角蛋白- fitc抗血清(Sigma)， CD3 (1452C11;ATCC, Rockville, Maryland, USA)， CD28(克隆37.51;M Glennie博士，南安普顿，英国)，山羊抗人潜伏期相关肽TGF-β1 (LAP)，鸡抗人TGF-β和鸡IgY (Stratech，剑桥郡，英国)。用不相关特异性的同型匹配抗体来确定非特异性染色水平和用测试抗体染色的细胞频率。20.凋亡细胞用FITC-annexin V和碘化丙啶标记。细胞内染色时，细胞表面染色，用0.1%多聚甲醛固定，染色前用0.1%皂苷/1%乳蛋白渗透。对于细胞内细胞因子染色，如前所述，新分离的细胞在染色前用Brefeldin A (10 mg/ml)孵育5小时。对于细胞周期分析，在获取前立即添加碘化丙啶。细胞因子多重珠检测试剂盒(Becton Dickinson)用于检测CEC:T和Mφ:T细胞条件培养基中干扰素γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素-5、IL-4和IL-10的水平。
统计数据
数据以均值(SEM)表示。采用Mann-Whitney检验评估统计学意义。
结果
CEC抑制有丝分裂原激活T细胞
在Mφ存在的情况下，结肠固有层(LP)和脾脏CD4 T细胞呈母细胞状形成，具有活化细胞的大颗粒形态特征。相当比例的脾和固有层CD4 T细胞处于细胞周期的S和G2期(图1D, E)，并通过CFSE染色确定其增殖，其中脾T细胞反应最大。活化相关的表面抗原CD69和CD25(图1A, C)的表达被诱导或上调(CD95 (Fas)， CD44和CD45RB;图1B)对CD4 T细胞的影响。
结肠上皮细胞(CEC)抑制T细胞对常规有丝分裂原的反应。脾脏CD4 T细胞(A, B, D, F, G)或结肠固有层CD4 T细胞(C, E)与新鲜C57BL / 6 CEC和培养巨噬细胞(Mφ)的促有丝分裂的CD3抗体前72小时流量仪的分析表达CD25脾(A)和固有层T细胞(C), CD45RB脾脏CD4 T细胞(B),细胞周期的进展脾T细胞(D)和固有层T细胞(E)和细胞因子的生产使用细胞因子珠化验脾T细胞(F,(A)、(B)、(C)中填充线和实线剖面分别表示T细胞与Mφ和CEC共培养后的抗体染色水平，虚线表示同型匹配的对照抗体。(D, E)细胞周期G1、S、G2期脾和固有层CD4 T细胞的比例。(F, G)脾T细胞在有丝裂原存在下分别用CEC和Mφ培养后产生的细胞因子。结果至少代表了六个独立实验的结果。IFN-γ，干扰素γ;IL,白介素;肿瘤坏死因子α。
相反，LP(图1C, E)和脾CD4细胞(图1A, B, D, F, G)对CEC激活的反应受到抑制。大多数CD4细胞体积小且处于静止状态，>90%仍处于细胞周期的G1期(图1D, E)。CEC共培养的CD4 T细胞很少增殖(数据未显示)，大多数为CD25−/罗(p < 0.001;图1A, G)表达较低水平的CD45RB (p<0.001;图1B)和CD95 (p<0.01)与Mφ培养的CD4 T细胞相比。CEC还影响T细胞因子的产生，与Mφ:CD4 T细胞共培养相比，CEC:CD4 T细胞共培养的上清液中IL-10、IL-5、IL-4、IFN-γ和TNF-α的浓度显著降低(图1F, G)。使用CBA分析系统(检测限10-20 pg)，无法在单独全培养基培养的CEC上清液中检测到任何这些细胞因子的存在(数据未显示)。使用抗细胞因子抗体进行细胞内染色，新分离的CD4 T细胞未表达可检测到的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4或IL-10(数据未显示)。
由于LP T细胞对TcR的刺激相对难受，21由于难以测量T细胞功能的正常指标，后续实验使用脾CD4 T细胞。
CEC抑制CD4 T细胞抗原特异性反应
为了评估CEC是否可以启动抗原特异性T细胞，来自DO11.10 TcR转基因小鼠的CD4细胞，其中CD4 T细胞表达一种针对OVA和H-2肽的TcRd用OVA脉冲DO11.10 CEC培养。通过缺乏CD25和CD69的表达以及缺乏胚细胞形成(数据未显示)，CEC无法启动CD4 T细胞。
CEC不能在回忆反应中激活抗原引物T细胞。在不含抗原的情况下，用Mφ或CEC培养的OVA修饰的CD4细胞处于静止状态，停留在细胞周期的G1期(图2C)，并表达低水平的CD25(图2A)、CD45RB(图2B)和Fas。将抗原添加到引物T细胞和CEC共培养中，不诱导T细胞活化。CD4细胞在细胞周期的G1期保持静止(图2C)， CD25和CD45RB低表达(图2A, B)，很少或不产生IFN-γ、TNF-α或IL-10(图2D)。相比之下，用Mφ和抗原培养的启动CD4细胞表达高水平的CD25 (p<0.005)和CD45RB (p<0.005)，保持在细胞周期(图2A)，并产生细胞因子，包括IL-10(图2D)。值得注意的是，CEC能够向OVA特异性CD4杂交瘤株KZO呈递抗原6(图2 e)。
抗原特异性T细胞的反应被结肠上皮细胞(CEC)抑制。我一d在流式细胞术分析T细胞CD25 (A)、CD45RB (B)、细胞周期进展(C)和细胞因子产生(D)之前，在存在或不存在OVA的情况下，将-限制性DO11.10 CD4 T细胞与OVA启动的DO11.10 CEC或巨噬细胞(Mφ)共培养72小时。(A, B)在不存在或存在OVA的情况下培养的细胞:**p<0.005 (A)和**p<0.005 (B)比较BALB/C存在时CD4 T细胞的活化(I-Ad) CEC或Mφ。(C) CD4 T细胞在细胞周期G1、S、G2期的比例，正负符号表示共培养中是否存在OVA。(D) CD4 T细胞分别与CEC和Mφ共培养产生细胞因子。结果至少代表了从八个独立实验中得到的结果。IFN-γ，干扰素γ;IL,白介素;肿瘤坏死因子α。(e) c57bl /6 (i-ab) CEC可以将OVA呈现给OVA特异性I-Ab限制性CD4 T细胞杂交瘤KZO。用OVA脉冲培养的CEC，清洗，并与KZO一起孵育24小时，KZO已经转染了NFAT-lacZ报告基因构建。采用分光光度法测定T细胞杂交瘤活化和lacZ活性，使用显色底物并在595 nm处测量吸光度(OD 595)。
CEC表达共刺激分子
研究了CEC无法激活CD4 T细胞的可能性是由于缺乏共刺激(图3)，并与新鲜分离的脾Mφ进行了比较。所有Mφ均表达CD54，中位荧光较高(MFI 149 (SD 22.47))，而CEC为7.3% (MFI 10.54 (SD 3.8))。12%的Mφ (MFI 10.62 (SD 0.66))和3%的CEC (MFI 9.5 (SD 4)表达B7.1。74%的Mφ表达B7.2 (MFI 89.7 (SD 3.21))，不同比例的CEC(20% ~ 50%)也表达B7.2 (MFI 37.01 (SD 10))。约29%的Mφ表达CD40 (MFI 17.7 (SD 4))，而4.5%的CEC表达CD40 (MFI 12.7 (SD 7.1))。因此，CEC的CD40和B7.1表达水平与Mφ相当，而B7.2和CD54的表达水平(MF)在Mφ上高于CEC。通过逆转录-聚合酶链反应和CEC mRNA的Southern blot分析证实B7.1和B7.2的表达(Baumgart和Carding，未发表观察)。值得注意的是，共刺激分子在CEC上的表达在培养中被保留。
结肠上皮细胞(CEC)表达共刺激分子。新鲜分离的CEC经流式细胞术分析，使用上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白和共刺激分子B7.1 (CD80)、B7.2 (CD86)、CD40和CD54特异性抗体。象限是根据同型和单染色对照绘制的。百分数是指染色呈阳性的细胞比例。结果代表了从10多个独立实验中得到的结果。
CEC不是惰性的，不会引起CD4 T细胞的无能
研究了通过添加外源性IL-2 (200 U/ml)或CD28交联提高T细胞激活阈值对已知能克服无能的T细胞的影响。在CEC存在时，添加IL-2或抗cd28抗体均不能恢复T细胞的活化(图4)。相反，向Mφ添加抗cd28抗体或IL-2:CD4 T细胞共培养增强了T细胞反应，增加了细胞周期中的细胞比例和CD25表达水平(图4)。值得注意的是，CD4 T细胞对有丝分裂原的反应被CEC抑制，即使在包括Mφ在内的专业APC存在时(图4E)。证明CEC不是惰性的，而是积极地抑制或阻止CD4 T细胞的活化。
与结肠上皮细胞(CEC)一起培养的T细胞不缺能。CD4 T细胞培养与新鲜分离小鼠CEC或巨噬细胞(Mφ)和促有丝分裂的CD3抗体(+)存在与否(−)的200 U /毫升白介素2 (2)(A, B)或10μg / ml CD28抗体交联(C, D)。整个脾脏细胞(Spl)培养CEC的存在与否和促有丝分裂的anti-CD3抗体(E, F)。激活进行细胞周期分析(A, C, E)和激活标记的表达CD25 (B, D, F)。(A、C、E) CD4 T细胞在细胞周期G1、S和G2阶段的比例。阳性和阴性分别表示是否存在IL-2 (A)、抗cd28交联抗体(C)和抗cd3抗体(E)。(B, D, F)缺乏或存在IL-2 (B)，抗cd28抗体(D)，抗cd3抗体(F)。结果代表了从至少五个独立实验中获得的结果。
CEC介导的CD4 T细胞活化抑制机制
抑制性细胞因子或可溶性因子的产生、共刺激的反调节分子的作用(例如CTLA-4)或MHC分子水平不足被排除为CEC介导的CD4 T细胞激活抑制机制。CEC条件下的培养基不能抑制Mφ对CD4细胞有丝分裂原的激活，这表明CEC介导的抑制不是由于产生抑制性可溶性因子，包括IL-10(图1G, 2D)，而是依赖于细胞接触。
CTLA-4 (CD152)参与CEC介导的T细胞活化抑制的可能性被排除，因为虽然在Mφ:CD4 T细胞共培养的T细胞表面和细胞质上检测到低水平的CTLA-4，但CEC共培养的CD4细胞均为CTLA-4阴性(数据未显示)。在CEC存在的情况下，CD28在T细胞上的交联(图4C, D)未能恢复T细胞功能，这与CTLA-4配体B7.2在CEC介导的T细胞抑制中没有作用一致。
在CEC上增加MHC II水平也无法克服CEC介导的T细胞抑制，CD4 T细胞对有丝分裂原(交联CD3)的反应不依赖于MHC水平，在CEC存在时也被抑制(图1)。
虽然新分离的CEC既表达细胞表面相关TGF-β(图5A)，也表达TGF-β的潜伏期相关肽(LAP;图5B)， TGF -β1-3的中和抗体(20 μg/ml)对CEC介导的CD4 T细胞活化抑制无影响(图5C)。然而，该抗体能够阻断TGF-β介导的成纤维细胞增殖抑制(图5D)。这些实验证明TGF-β不参与CEC介导的T细胞抑制，无论是可溶性的还是细胞表面结合的形式。
结肠上皮细胞(CEC)介导的T细胞抑制反应是转化生长因子β (TGF-β)独立的。用流式细胞仪分析新分离的CEC细胞表面TGF-β (A)和TGF-β (B)潜伏期相关肽(LAP)的表达。填充直方图显示抗体标记与同型对照(黑线)比较。(C)中和TGF-β抗体(20 μg/ml)对存在CEC或巨噬细胞(Mφ)时CD4细胞周期进程的影响;CD4 T细胞在细胞周期的G1、S和G2阶段的比例，正负符号表示共培养中是否存在中和性TGF-β抗体。(D)在存在或不存在TGF-β1的情况下，中和抗体对Matrigel中生长的成纤维细胞增殖的影响(100 ng/ml)。结果至少代表了四个独立实验的结果。
从CEC共培养物中去除并重新刺激CD4 T细胞使其有反应
CEC不能不可逆地抑制T细胞活化。从CEC或Mφ共培养中回收的CD4 T细胞，并与新分离的Mφ一起培养，被PMA/离子霉素或抗cd3抗体激活(图6B)。事实上，先前用CEC培养的CD4 T细胞比先前用Mφ培养的CD4 T细胞对药理学挑战的反应更强烈，更大比例的细胞进入细胞周期(图6A)。因此，CEC没有诱导CD4 T细胞死亡，这是独立证实的，通过膜联蛋白V和碘化丙啶染色未能检测到细胞凋亡增加(数据未显示)。
以前与结肠上皮细胞(CEC)共培养的CD4细胞对重新刺激反应正常。天真(A, B)或抗原致敏(C, D) CD4细胞与CEC cocultured或巨噬细胞(Mφ)72小时的促有丝分裂的anti-CD3抗体或卵子,之后他们隔绝cocultures和刺激phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA) / ionomycin +新鲜Mφ(A, B)或卵细胞脉冲Mφ(C, D)。T细胞激活是通过细胞周期分析评估(A、C)和激活标记的表达CD25 (B, D)。(A, C)比例的CD4 T细胞G1,年代,细胞周期的G2阶段。(B, D) CD25在分别用CEC或Mφ培养的CD4 T细胞上的表达。所显示的结果至少代表了从四个独立实验中得到的结果。
CD4 T细胞活化的抗原特异性抑制也是可逆的。通过细胞周期分析和CD25表达评估，从含有抗原(OVA)的CEC共培养中回收的DO11 T细胞与新分离的Mφ和OVA一起重新培养被激活(图6C, D)。先前与CEC一起培养的T细胞的反应比先前与Mφ一起培养的T细胞的反应略大。这可能反映了在Mφ存在的情况下，T细胞在对OVA的初始反应期间的激活诱导细胞死亡。这与之前用CEC培养的CD4 T细胞形成对比，后者仍处于静息状态，没有发生任何明显的凋亡，因此当用新鲜Mφ和OVA重新刺激时，提供了更大的应答T细胞池。综上所述，这些数据表明，CEC不会永久地使CD4 T细胞功能丧失功能，当CEC被去除后，正常功能恢复。
讨论
使用一种新的原代CEC培养体系，我们已经证明了CEC，与脾Mφ相比，抑制CD4 T细胞的激活。这种抑制作用依赖于CEC的持续存在，并且是可逆的。因此，CEC介导的T细胞应答抑制可能在维持对肠道抗原无应答性方面发挥作用。虽然我们所采用的实验方法有些人为，并且没有考虑到结肠粘膜的细胞异质性以及其他粘膜细胞对CEC功能的可能影响，但它提供了一个体外可达的系统，用于解剖结肠粘膜免疫反应。观察到CEC抑制幼稚和启动的脾和结肠LP CD4 T细胞的激活，这表明CEC的抑制作用不仅限于驻留的粘膜T细胞，而且还包括来自其他组织的可能迁移到结肠的细胞。
先前的研究表明，小鼠小肠上皮细胞和CEC可以将可溶性蛋白抗原呈递给CD4特异性抗原+T细胞杂交瘤。10这些发现与我们目前观察到的小鼠CEC抑制原代CD4 T细胞的反应相冲突。这种明显的差异可能是由于T细胞杂交瘤和原代T细胞对激活的要求不同，T细胞杂交瘤的激活阈值较低，且与共刺激无关。22虽然已经证明CEC可以处理抗原并呈现可溶性蛋白抗原，1 -6在缺乏共刺激的情况下，原代T细胞不会对抗原产生反应。我们发现，来自两株小鼠的小鼠CEC组成性表达共刺激分子与之前对正常人类CEC的分析形成对比。19这可能反映了物种差异或检测方法的差异，因为我们对小鼠CEC的分析表明，只能使用敏感的间接染色程序检测到B7.2的表达，而使用直接方法无法检测到B7.2的表达(Cruickshank和Carding，未发表的观察结果)。
尽管表达B7，但观察到CEC未能促进有丝分裂原或抗原特异性反应，这表明它们的共刺激分子没有功能。用CEC培养的T细胞缺乏CTLA-4表达，排除了这种对抗受体的参与。此外，在脾Mφ或抗cd28抗体存在时，CEC抑制T细胞活化的能力与CEC不是惰性的而是积极抑制CD4 T细胞活化的解释是一致的。CEC不能抑制CD4 T细胞，因为先前用CEC培养的T细胞对有丝分裂原或抗原的再攻反应正常。因此，上皮细胞的持续存在是抑制作用所必需的。类似的抑制作用已被报道为小的IEC。23
与之前使用不可存活(固定)的主要或已建立的CEC系的研究相比，24 -26我们一直无法证明与CEC一起培养的CD4 T细胞成为T调节细胞或抑制细胞。虽然CD4 T细胞与小鼠CEC培养的Treg细胞相似，都是CD45RB罗它们也是CD25——/罗不分泌IL-10，对各种刺激的再挑战反应正常。因此，我们的数据表明CEC本身是调节细胞。
我们无法确定CEC抑制T细胞激活的机制。从生长培养的CEC中提取的上清液对T细胞活化没有影响，这与细胞效应一致，可能依赖于接触。然而，不能排除这种抑制是由一种可溶性因子介导的可能性，这种因子仅在T细胞存在时产生，或仅在细胞接近时起作用。尽管最近发表的一篇文章认为细胞表面结合TGF-β在调节调节性T细胞的抑制功能中起作用，27我们的数据表明，TGF-β不参与CEC介导的CD4 T细胞活化抑制。潜在机制包括黏蛋白和新型抑制性共刺激分子。黏蛋白相关分子muc1已被报道对T细胞活化具有抑制或促凋亡作用28，29小鼠CEC表达muc1 (Cruickshank和Carding，未发表数据)。然而，由于缺乏合适的试剂，我们无法确定它可能在CEC介导的CD4 T细胞抑制中发挥什么作用(如果有的话)。最近观察到B7家族的新成员(B7x，30.PD-1的配体;B7-H1 (PD-L1)和PD-L231)对T细胞活化有抑制作用，可能也为CEC介导的抑制T细胞活化提供了另一种机制，尽管尚不清楚CEC是否表达这些负受体。
总之，我们已经证明了正常小鼠CEC积极抑制CD4 T细胞的反应，这种作用是可逆的。我们认为，CEC作为结肠中抗原接触的主要部位，在阻止基质中的底层T细胞对肠内抗原做出反应方面发挥了作用，而肠内抗原可由上皮细胞呈递。我们的发现也可能解释了黏膜T细胞对CEC取样的大量肠道抗原的整体无应答性是如何维持的。CEC介导的T细胞反应抑制的失调也可能导致炎症性肠病中出现的不受控制的炎症。
致谢
这项工作得到了公共卫生服务基金AI-41562和PO1RR12211的支持，(SR Carding, PJ Felsburg)