你在这里gydF4y2Ba

条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
肝gydF4y2Ba
hepcidin前:肝脏中的表达和细胞特异性定位及其在遗传性血色素沉着症、慢性肾功能不全和肾性贫血中的调节gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. H KulaksizgydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. S G格尔克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. 一个JanetzkogydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. D罗斯特gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. T布鲁克纳gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. B KallinowskigydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  7. W StremmelgydF4y2Ba1gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba德国海德堡海德堡大学医院消化内科gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2BaDRG仪器有限公司，马尔堡，德国gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba德国海德堡大学医院社会医学系、职业和环境皮肤科gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    H Kulaksiz博士gydF4y2Ba
    德国海德堡贝格海默58号消化内科D-69115;gydF4y2BaHasan_Kulaksizmed.uni-heidelberg.degydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景与目的:gydF4y2Ba最近从人类血浆和尿液中分离出的肝脏肽激素hepcidin被认为是铁稳态的中心调节器。我们研究了hepcidin在肝脏中的存在和细胞定位，并开发了一种非侵入性检测方法来分析其在遗传性血色素沉着症(HH)、慢性肾功能不全(CRI)和肾性贫血(RA)患者中的调节。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba通过逆转录-聚合酶链反应、western blot、免疫细胞化学和免疫荧光在人和豚鼠肝脏中表达和定位hepcidin。采用灵敏的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组患者的血清浓度。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Ba用区域特异性抗体进行Western blot分析，鉴定出与hepcidin前分子质量相对应的~10 kDa肽。定位研究显示，前hepcidin表达在肝细胞的基底外侧膜结构域，也存在于血液中。建立了一种稳定、灵敏的人血清hepcidin前体酶联免疫吸附测定方法。健康人血清中hepcidin的平均水平为106.2 ng/ml。在CRI患者中发现hepcidin前水平升高(148.1 ng/ml)，但血红蛋白值正常，这表明肾脏可能代谢和/或消除循环激素。相反，与CRI组相比，HH患者(70.2 ng/ml)和RA患者(115.0 ng/ml)的前hepcidin浓度显著降低。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba通过人血清中hepcidin原的检测，我们推测该原激素可能参与了HH铁代谢的调节。前hepcidin水平降低可能在HH发病机制中起重要作用。gydF4y2Ba

  • hepcidingydF4y2Ba
  • 慢性肾功能不全gydF4y2Ba
  • 铁的吸收gydF4y2Ba
  • 遗传haemochromatosisgydF4y2Ba
  • 肝gydF4y2Ba
  • Aa，氨基酸gydF4y2Ba
  • CRI，慢性肾功能不全gydF4y2Ba
  • 酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba
  • EPO(促红细胞生成素)促红细胞生成素gydF4y2Ba
  • HH，遗传性血色沉着症gydF4y2Ba
  • PBS，磷酸盐缓冲盐水gydF4y2Ba
  • 风湿性关节炎，肾性贫血gydF4y2Ba
  • RT-PCR，逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
  • TfR1，经典转铁蛋白受体gydF4y2Ba
  • TfR2，转铁蛋白受体2型gydF4y2Ba
  • TBS, Tris缓冲盐水gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2003.022863gydF4y2Ba

数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    铁是所有生物生长发育所必需的微量元素;它是DNA合成和一系列代谢过程所不可缺少的。然而，铁代谢紊乱与一些重要的人类疾病有关，包括缺铁性贫血、血色素沉着症或铁过载病血色素沉着症。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba在生理条件下，人体的铁含量是通过控制吸收来调节的。在哺乳动物中，铁的吸收主要发生在十二指肠和上空肠，这是唯一的机制，铁的储存是由生理控制。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba吸收后，铁与循环中的转铁蛋白结合，并输送到全身各组织。在肝脏，铁储存的主要部位，转铁蛋白结合的铁通过受体介导的内吞作用通过经典的转铁蛋白受体(TfR1)进入细胞。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba并且可能通过最近发现的同源转铁蛋白受体2 (TfR2)而增加。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba

    存在一种反馈机制，增强铁缺乏的人对铁的吸收，而铁过载的人对铁的吸收则减少。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba然而，在遗传性血色素沉着症(HH)中，这种调节机制似乎受损;尽管铁超载，但从饮食中吸收的铁量增加，导致体内器官积累过量的铁，导致器官功能障碍和衰竭。肠道对人体铁需求变化作出反应的分子机制尚不清楚。在这种情况下，最近发现的一种哺乳动物肽hepcidin，gydF4y2Ba6,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba被预测为调节铁稳态的关键信号成分。gydF4y2Ba2，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba

    Hepcidin最初从人血浆和尿液中分离出25个氨基酸(aa)的肽，表现出抗菌活性。gydF4y2Ba6,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba一个hepcidin cDNA在小鼠中编码一个83 aa前体，在大鼠和人类中编码一个84 aa前体，包括一个推测的24 aa信号肽，随后在搜索受铁调控的肝脏特异性基因时被鉴定出来。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba由于上游刺激因子2 (Usf2)基因的靶向破坏，Hepcidin表达在显示铁过载的小鼠中被取消，类似于在hfe−/−小鼠中发现的相同表型。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba因此，这表明该肽在铁代谢中起着关键作用。相反，过度表达hepcidin会导致转基因小鼠出现严重的缺铁性贫血，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba表明hepcidin是铁稳态的中枢调节因子。此外，最近的研究表明，hfe敲除小鼠的肝脏hepcidin表达下降，gydF4y2Ba11gydF4y2Bahepcidin肽的突变与严重的青少年血色沉着症有关，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba为我们理解铁超载的分子发病机制提供了新的视角。然而，hepcidin在生理和病理条件下平衡人体铁储备或调节饮食铁吸收的机制仍未明确。gydF4y2Ba

    在这方面，该肽的细胞定位及其在各种铁状态下的调节在hepcidin功能的研究中具有重要意义。虽然对人和小鼠各器官hepcidin mRNA水平的northern blot分析显示，hepcidin主要在肝脏中表达，gydF4y2Ba6 -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba没有关于这种肽的细胞定位的数据。为了更好地了解hepcidin在生理条件下和相关疾病中的作用，我们生成了针对hepcidin前体分子中部和C端的特异性抗体。这些抗体使我们能够确定hepcidin在人类和豚鼠肝脏中的细胞定位。我们建立了一种敏感的酶联免疫吸附试验(ELISA)，使我们能够检测HH、慢性肾功能不全(CRI)和肾性贫血(RA)患者血清中的hepcidin前。我们的结果表明，前hepcidin通过肝细胞基底外侧膜释放到血液中，并在肾脏中被消除。由于hepcidin在HH和慢性RA中的血清水平显著下调，我们认为hepcidin在这些疾病的病理生理学中起作用。gydF4y2Ba

    材料与方法gydF4y2Ba

    组织和组织制备gydF4y2Ba

    成人肝转移患者半肝切除术后获得人肝样本(n = 7)。将健康组织固定于4%多聚甲醛中进行免疫组化或立即冷冻于液氮中进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、western blot和免疫荧光分析。gydF4y2Ba

    麻醉豚鼠(n = 7)，随后颈椎脱位处死。切除肝脏和骨骼肌组织标本，立即冷冻于液氮中进行western blot分析或固定于多聚甲醛中。gydF4y2Ba

    多肽合成，免疫程序和抗体gydF4y2Ba

    从已发表的pro-hepcidin序列来看，gydF4y2Ba6,gydF4y2Ba9gydF4y2Bahepcidin-(28-47)和hepcidin-(70-84)采用标准Fmoc方法合成C端酰胺。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba利用间马来酰亚胺苯甲酰-将多肽偶联到锁眼帽贝血色素上gydF4y2BaNgydF4y2Ba-羟基琥珀酰亚胺酯和两只SPF兔(Charles River-Iffa Credo Eurogentec, Seraing，比利时)分别用每种肽缀合物免疫(Eurogentec, Seraing，比利时)。在ELISA检测滴度后，在本研究中使用了三种抗血清(EG(1)- hepc靶向hepcidin-(70-84)和EG(1)- hepn和EG(2)- hepn，每种靶向hepcidin-(28-47))(图1)。用于生成抗血清的肽表位与迄今报道的任何蛋白质均无同源性，这一点已通过BLAST P2搜索得到证实。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    人类hepcidin前体蛋白的氨基酸序列，在N端包含一个典型的24个氨基酸(aa)信号肽(aa 24和25之间的线表示假设的信号序列切割位点)，一个35个氨基酸前体区域，以及C端20-，22-和25-aa hepcidin肽的不同之处在于它们的N端截断，如箭头所示。信号肽从hepcidin前体裂解后，生成由60个aa组成的hepcidin前体分子。hepcidin 25的二硫化物连通性为1 - 8,2 - 7,3 - 6和4-5，如折线所示。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba如抗体符号所示，抗血清EG(1和2)-Hep N抗hepcidin前体aa 28-47升高，抗血清EG(1)-HepC抗aa 70-84升高。gydF4y2Ba

    由于种与种之间的序列同源性，多肽抗血清通常跨物种工作，针对人类hepcidin培养的hepcidin抗血清也用于豚鼠组织。gydF4y2Ba

    人类肝脏的表达分析gydF4y2Ba

    采用Qiagen RNAeasy试剂盒进行RNA分离，包括DNA消化。RT-PCR分析如前所述gydF4y2Ba14日,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba使用以下引物和5 ' -3 '方向给出的规格:human hepcidin (GenBank数据库登录号NM021175)， 5 ' -CTG CAA CCC CAG GAC AGA G-3 '和5 ' -GGA ATA AAT AAG GAA GGG AGG GG-3 ';对应位置147-165和338-316。在94°C初始变性4分钟后，反应进行以下热程序的35个循环:94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 30秒;在此程序之后，在72°C下进行最后5分钟的延伸步骤。扩增产物在溴化乙矾染色1.8% 89 mM Tris/89 mM硼酸/2 mM EDTA (pH 8.3)琼脂糖凝胶上运行。适当的对照排除了显著水平的基因组DNA扩增。gydF4y2Ba

    HepG2细胞的表达分析gydF4y2Ba

    人肝癌HepG2细胞来自德国微生物和细胞培养集(Braunschweig, Germany)，在37°C的5% CO中培养gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在RPMI 1640培养基(Gibco, Karlsruhe, Germany)中添加10% (vol/vol)热灭活胎牛血清、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100µg/ml)。使用上述引物规格进行RT-PCR分析细胞。在免疫荧光显微镜下，HepG2细胞在载玻片上生长，在甲醇中固定4分钟，并用0.5% Triton X-100在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中渗透。hepcidin抗体(1:2000)孵育60分钟后，再用cy -3偶联抗兔抗体(Dianova, Hamburg, Germany)孵育，在Olympus AX70显微镜下使用适当的滤镜进行免疫染色。gydF4y2Ba

    从血清、组织和HepG2细胞中提取hepcidingydF4y2Ba

    作为更大的hepcidin来源，我们使用了从慢性肾功能衰竭患者收集的血清。为了提取hepcidin，用0.01 N HCl将20 ml血清样品1:1稀释，用浓HCl调整到pH 3.0。冷冻组织和HepG2细胞混合在0.5 M醋酸中煮沸8分钟，如前所述。gydF4y2Ba13日,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba在Ultra-Turrax均质机(Janke and Kunkel, Staufen, Germany)均质后，样品在20000的温度下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下浸泡20分钟，上清液通过0.45 μ m孔径过滤器过滤。为了丰富蛋白质，将血清样品、细胞和总组织提取物应用于十八烷基(C18) Sep-Pak药筒(Waters, Massachusetts, USA)。柱用0.01 M HCl洗涤，用30% (vol/vol) 2-丙醇/30% (vol/vol)甲醇/0.01 M HCl洗脱。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba将蛋白质部分冻干并在−80°C保存，直至使用。gydF4y2Ba

    免疫印迹分析gydF4y2Ba

    用于western blot分析，蛋白质提取物在94°C的样品缓冲液中孵育7分钟，其中含有4% (wt/vol)十二烷基硫酸钠(Merck, Darmstadt, Germany)， 50 mM Tris HCl (pH 8.45)， 1 mM EDTA, 3.24 mM二硫苏糖醇(Roth, Karlsruhe, Germany)， 12.5% (wt/vol)甘油(Merck)和0.002%溴酚蓝(Merck)。为了检测hepcidin，根据已发表的协议，使用了16.5%的三甲-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。gydF4y2Ba13 -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba电泳后，蛋白质通过半干印迹转移到疏水聚偏氟乙烯基膜上(Pall, Portsmouth, UK)。膜与hepcidin抗体在上述稀释度下孵育过夜。在含有10 mM Tris HCl (pH 8.0)、150 mM NaCl和0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水中洗涤后，用碱性磷酸酶偶联山羊抗兔抗体(稀释后1:50 000;Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国)使用硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸作为显色剂(Sigma)。抗体与相应的肽免疫原预孵育后，特异性阻断了免疫反应。通过适当的对照，排除了与第二种山羊抗兔抗体的交叉反应。gydF4y2Ba13 -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba

    免疫组织化学和免疫荧光gydF4y2Ba

    组织在4%多聚甲醛中4℃固定18小时。在分级乙醇系列脱水后，标本用石蜡包埋。石蜡切片(5µm)采用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术和孵卵序列对hepcidin(抗体EG(1)-HepN, EG(2)-HepN和EG(1)-HepC进行免疫染色，各稀释1:2000)，如前所述。gydF4y2Ba14日,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba切片用各自的抗体在4℃下孵育24小时，然后用生物素化的抗兔IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania, USA)孵育30分钟，稀释1:200。然后切片用预先形成的生物素-过氧化物酶/链霉霉素复合物(Jackson免疫研究)孵育30分钟，在PBS中稀释(最终浓度:生物素-过氧化物酶0.7µg/ml;链霉亲和素5µg/ml)。在0.7 mM盐酸二氨基联苯胺/0.002% H中孵育切片，可见抗原抗体结合位点gydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba0.05 M Tris HCl (pH 7.6)。gydF4y2Ba

    对于免疫荧光显微镜，使用冷冻机(FrigoCut 2800E;徕卡，Nussloch，德国)，风干两小时，并在冷丙酮(- 20°C)中固定10分钟。如前所述进行双免疫荧光标记gydF4y2Ba17gydF4y2Ba使用hepcidin特异性抗体(稀释1:100)和单克隆抗体C219gydF4y2Ba17gydF4y2Ba对管性p -糖蛋白(Centocor, Malvern, Pennsylvania, USA)进行培养，稀释1:30。用各自的抗血清孵育后，用Cy2-(1:200)和Cy3-(1:60)标记的抗小鼠和兔IgG抗体孵育进行染色(Dianova，汉堡，德国)。显微摄影使用奥林巴斯AX70显微镜，配备数码相机(彩色视图12，软成像系统SIS, Münster，德国)和分析软件(SIS, Münster，德国)。gydF4y2Ba

    特异性控制gydF4y2Ba

    方法相关的非特异性被运行控制排除，如前所述。gydF4y2Ba13日,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba用同源和异源抗原肽(6.25-100µg/ml抗血清)预吸附抗体，检测抗体特异性。gydF4y2Ba14日,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba低至6.25 μ g/ml的同源抗原抗体预吸附完全阻断了肝组织和细胞的免疫染色，而高至100 μ g/ml的异源抗原抗体预吸附对免疫染色无影响。gydF4y2Ba

    Hepcidin ELISA竞争性结合试验gydF4y2Ba

    从26名健康个体(13名女性，13名男性;年龄26-64岁，平均43岁)，HFE C282Y突变HH纯合患者35例(女性14例，男性21例;年龄23-82岁，平均54岁)，接受放血治疗(15例)，未接受放血治疗(20例)，慢性血液透析肾功能不全59例(女33例，男26例;年龄26-96岁，平均57岁)。在样本采集过程中，我们确保患者没有感染。肾功能不全组中有19例患者患有肾性贫血，其特征是最大血红蛋白浓度为11 g/dl。所有CRI患者每周用3000 IE重组人促红细胞生成素(EPO)治疗2-3次。血液样本(10ml)抽入血清管，在2500下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置10分钟。重复使用96孔微量滴定板，包被200µl/孔兔抗hepcidin抗体EG(2)-HepN稀释1:400，在含有40 mM Tris HCl (pH 7.3)， 100 mM NaCl的Tris缓冲盐水(TBS)中进行测定。将含有不同数量合成肽(0,20,100,500和1000ng /ml)或人血清样品的标准品(50 μ l)和150 μ l N末端生物素化hepcidin-(28-47) (Peptide Specialty Laboratories GmbH, Heidelberg, Germany) (2 ng/孔)添加到每个孔中，在室温下孵育1小时。TBST (TBS含0.05% Tween 20)洗涤后，以底物四甲基联苯胺(DRG Instruments GmbH, Marburg, Germany)为底物，用链霉亲和素过氧化物酶(Dako, Hamburg, Germany)检测生物素化抗原抗体复合物;显色反应在1 M H时停止gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在450/630 nm波长下测定溶液消光度。gydF4y2Ba

    ELISA描述gydF4y2Ba

    ELISA鉴定的详细信息可根据要求从作者处获得。gydF4y2Ba

    数据管理与统计gydF4y2Ba

    四组hepcidin的测量值输入EXCEL电子表格，并使用SAS WIN version 8.2进行评估。测量值通过以下诊断组的汇总统计进行汇总:观察数、算术平均值、SD、最小值、中位数和最大值。两组间可能的差异用Wilcoxon U检验进行分析。显著性α水平设为5%(0.05)。gydF4y2Ba

    使用Spearman秩相关分析hepcidin与铁、铁蛋白或转铁蛋白之间的相关性。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    hepcidin在肝脏和HepG2细胞中的表达gydF4y2Ba

    RT-PCR分析表明hepcidin在人肝脏中有表达。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba同样，在HepG2细胞(对照)中检测到192bp的预期PCR产物，该细胞已显示出hepcidin的表达(图2A)。gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba在western blot分析中，所有hepcidin抗体(EG(1)-HepN, EG(2)-HepN和EG(1)-HepC)都在人肝和豚鼠肝提取物中巧合地鉴定了一个~10 kDa的免疫反应带。该肝肽与HepG2细胞匀浆中hepcidin抗体识别的免疫反应带共移(图2B-D)。所有抗体还在装载人、豚鼠肝脏提取物或HepG2细胞提取物的所有通道中鉴定出一种约20 kDa的免疫反应蛋白。骨骼肌提取物的Western blot分析(对照组)显示既没有10 kDa的免疫反应条带，也没有20 kDa的免疫反应条带(图2B-D)。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    (A)逆转录聚合酶链反应分析人类肝脏(2和3车道)和HepG2细胞(4和5车道)显示hepcidin的基因表达。显示bp DNA阶梯(1和7车道)。6车道显示阴性对照。(B - D)用抗体EG(1)-HepN (B)、EG(2)-HepN (C)和EG(1)-HepC (D)对豚鼠(1通道)和人肝脏(2通道)提取物(3通道)、人血清(4通道)和豚鼠骨骼肌(5通道，对照)中的hepcidin进行Western blot分析。注意用所有识别hepcidin前体中不同表位的抗体获得的10和20 kDa的免疫反应条带。(分子质量标记:磷酸化酶B 105 kDa;谷氨酸脱氢酶53 kDa;碳酸酐酶34 kDa;肌红蛋白蓝23 kDa;肌红蛋白17 kDa;溶菌酶13kda;抑肽蛋白7 kDa; and insulin 3 kDa.)

    HepG2细胞的免疫荧光gydF4y2Ba

    利用表位特异性抗hepcidin抗体，通过免疫荧光分析研究hepcidin肽在HepG2细胞中的表达。所有抗体在HepG2细胞中相似地识别hepcidin，从而产生强烈的免疫反应性(图3)。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    免疫荧光显微镜检测HepG2细胞中的hepcidin，使用抗体EG(1)-HepN (A)、EG(2)-HepN (B)和EG(1)-HepC (C)(比例尺bar 8µm)。gydF4y2Ba

    hepcidin的细胞和亚细胞定位gydF4y2Ba

    不同区域特异性抗体的免疫组化研究始终将hepcidin定位于人肝脏的肝细胞(图4)。Kupffer细胞、内皮细胞、胆管和血管系统完全缺乏hepcidin的免疫反应性。同样的抗体在豚鼠肝脏中也检测到强烈的hepcidin免疫反应性(图4)。肝小叶的hepcidin免疫反应性是不均匀的:在肝小叶内，hepcidin免疫反应性细胞主要位于门静脉周围区，hepcidin阳性细胞的频率从门静脉三合组向中央静脉持续下降(图5)。值得注意的是，hepcidin阳性细胞之间存在明显的细胞间差异:虽然大多数肝细胞对hepcidin呈强阳性，但其他肝细胞对hepcidin仅显示微弱染色或完全无反应(图5)。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    hepcidin在豚鼠(A-F)和人(G-I)肝脏中的细胞定位。用区域特异性抗体EG(1)-HepN (A, D, G)、EG(2)-HepN (B, E, H)和EG(1)-HepC (C, F, I)免疫染色的石蜡切片显示，肝细胞基底外膜区域具有明显的免疫反应性(箭头)。(放大倍数:A-C ×180;d - i,×540)。gydF4y2Ba

    图5gydF4y2Ba

    豚鼠肝免疫组化切片(A，抗体EG(1)-HepN;B，抗体EG(2)-HepN;C，抗体EG(1)-HepC显示hepcidin在肝小叶内的清晰分区，从门静脉周围区(星形)到中央静脉(箭头)的免疫反应性降低。注意在中心静脉周围的肝细胞未发现免疫反应性。((B)中的箭头表示传送门三位一体。)(放大倍率:a - c ×180。)gydF4y2Ba

    在亚细胞水平，hepcidin的免疫反应性被免疫组化局限于肝细胞基底外侧(=正弦)膜区域;在各自细胞的根尖膜区域未发现免疫反应性(图4)。同样，免疫荧光分析显示在基底外侧膜区域hepcidin具有很强的免疫反应性;根尖膜区无免疫反应性，C219抗体双染色显示，C219抗体是针对根管p -糖蛋白的gydF4y2Ba17gydF4y2Ba(数据未显示)。gydF4y2Ba

    人血清hepcidin前肽的检测gydF4y2Ba

    使用hepcidin N末端特异性抗体EG(2)-HepN建立了稳定的hepcidin前酶联免疫吸附试验(DRG Instruments GmbH, Marburg, Germany)，具有高重复性和敏感性。如图6所示，ELISA在4 ~ 400 ng/ml之间的分辨率最高，这是人血清中hepcidin前浓度的测定范围。作为特异性对照，用异源多肽在ELISA中孵育。使用外源多肽时未观察到交叉反应。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    循环人hepcidin前的酶联免疫吸附试验(ELISA)。有代表性的标准曲线与浓度hepcidin-(28-47)和消光的ELISA溶液在450nm波长显示。注意hepcidin-(28-47)在4-400 ng/ml范围内的高分辨率。gydF4y2Ba

    western blotting分析证实血液中存在hepcidin前体。在人血清提取物中，所有hepcidin抗体都识别出一个分子质量为~10 kDa的hepcidin免疫反应条带，该条带与肝组织和HepG2细胞提取物中的免疫反应hepcidin共移(图2B-D)。gydF4y2Ba

    ELISA特点gydF4y2Ba

    灵敏度为3.95 ng/ml。与最低标准(20 ng/ml)无重叠。人原hepcidin连续稀释，溶解在零标品中，与原hepcidin ELISA标准曲线平行，回收率在90.6% ~ 111.6%之间。以预期浓度的百分数表示的回收率在91.8%至105.7%之间。在整个测定范围内对三种浓度的前hepcidin进行测试，证明了良好的精度(总方差系数<10%)。gydF4y2Ba

    hepcidin原水平在遗传性血色素沉着症、慢性肾功能不全和肾性贫血中的作用gydF4y2Ba

    使用敏感的hepcidin ELISA，在26名健康对照组的志愿者中检测到51.6-153.4 ng/ml的血清(平均106.2 (SEM 32.1) ng/ml)(图7，表1)。在HH患者中，前hepcidin浓度为12.1-153.9 ng/ml(平均70.2 (SEM 38.1) ng/ml)。与对照组相比，这些浓度显著降低(p<0.05)(图7，表1)。1 ~ 471.3 ng/ml(平均148.1 (SEM 88.0) ng/ml)，与对照组(p<0.01)和HH患者(p<0.001)相比显著升高。相反，RA血液透析患者hepcidin前水平显著降低(115.0 (53.1)ng/ml;范围20.5-252.4)(p = 0.05)，与CRI患者相比(图7，表1)。gydF4y2Ba

    查看该表:gydF4y2Ba
    表1gydF4y2Ba

    两两U检验结果(p值)gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    26例健康志愿者(对照组)、40例慢性肾功能不全患者、19例慢性肾功能不全合并肾性贫血患者和35例遗传性血色素沉着症患者静脉血清hepcidin前浓度的箱线图。框内的线表示中位数，圆表示平均值。方框的上下边缘表示第一和第三四分位数，胡须表示最小值和最大值。虚线标记对照组循环免疫反应性hepcidin的平均水平(106.16 ng/ml)。gydF4y2Ba

    在我们的样本(HH、CRI和RA的血清)中，未发现hepcidin pro-与铁、铁蛋白或转铁蛋白饱和度之间的显著相关性(图8)。从零的检验差异不显著。gydF4y2Ba

    图8gydF4y2Ba

    治疗和未治疗的遗传性血色素沉着症患者样本中hepcidin与铁(A)、铁蛋白(B)和转铁蛋白饱和度(C)的相关性。请注意，在我们的样本中没有发现显著的相关性。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    特异性引物RT-PCR分析显示hepcidin在分化良好的肝癌细胞系HepG2细胞(对照)中高度表达gydF4y2Ba19gydF4y2Ba在许多方面证明了正常肝细胞的生理功能。使用适当的引物规格和组合成功应用于HepG2细胞，RT-PCR研究证实了hepcidin在人肝脏中的表达。三种不同的抗体识别hepcidin前体分子中的不同表位(图1)，通过western blot分析，不仅在HepG2细胞中，而且在人类和豚鼠两种物种的肝脏提取物中，同时识别出~10 kDa的免疫反应肽。这种免疫反应肽的表观分子质量与从cDNA序列推断的hepcidin原激素的预测分子质量一致(图1)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba有趣的是，所有hepcidin抗体在HepG2细胞、人和豚鼠肝脏提取物中都检测到~20 kDa的第二个免疫反应带，但在对照组织中没有。这种免疫反应蛋白可能反映一种二聚型的hepcidin。事实上，在之前的一项研究中，描述了hepcidin-25的聚合特性和可能形成的多聚体，但没有描述hepcidin-20。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba

    hepcidin区域和分子域特异性抗体的免疫细胞化学研究显示，hepcidin在HepG2细胞中具有很强的免疫反应性，表明hepcidin在这些细胞中表达，正如已经使用分子生物学技术显示的那样。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba用这些不同的hepcidin抗体进行的免疫组化和免疫荧光研究表明，在人和豚鼠肝脏中，hepcidin特异性定位于主要位于门脉三联组周围的肝细胞。不同区域特异性抗体对人、豚鼠肝脏及HepG2细胞的一致性染色表明，肝细胞是hepcidin的来源。Hepcidin的免疫反应性从门静脉周围向中央静脉下降。门静脉小叶内的这种分区可能具有功能意义，因为门静脉周围肝细胞首先通过门静脉，从肠道带来富含铁的血液。值得注意的是，hepcidin阳性细胞之间在hepcidin免疫反应密度方面存在明显的细胞间差异，这可能反映了hepcidin表达或分泌的细胞间差异。gydF4y2Ba

    在亚细胞水平上，hepcidin集中于肝细胞基底外侧膜区域。根尖膜区未见免疫反应。hepcidin在亚细胞水平的离散分布模式可能推断hepcidin在肝窦基底外侧定向释放。在人血清中检测hepcidin原激素(图1)进一步证实了这种定向分泌途径(见下文);因此，这些发现进一步证明了肝细胞可能通过分泌前hepcidin以内分泌方式调节铁代谢。gydF4y2Ba

    由于造血组织和储存铁的部位，如肝脏，被认为会向肠道细胞传递信号，表明身体对膳食铁的需求，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba我们推测hepcidin是肝细胞分泌并调节肠道铁吸收的候选信号因子。然而，关于血液中是否存在某些分子形式的hepcidin仍存在争议。gydF4y2Ba6,gydF4y2Ba7,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba

    为分析hepcidin原激素是否分泌到血液中，并评价健康志愿者和不同疾病患者血清中hepcidin原激素水平的变化范围，应用针对hepcidin原激素的N端抗体EG(2)-HepN建立了ELISA方法。虽然C端抗体EG(1)-HepC在dot blot(数据未显示)、western blot、免疫组化和免疫荧光实验中显示特异性结果(图1 - 4)，但在ELISA实验中未获得免疫反应性。hepcidin在血液中的紧密折叠模式及其三级结构可能是EG(1)-HepC抗体无法识别循环hepcidin的原因。gydF4y2Ba

    EG(2)-HepN抗体ELISA具有重复性、稳定性和灵敏度高的特点，检出限为3.95 ng/well，分辨率在4-400 ng/ml范围内;测定hepcidin浓度的范围。在健康个体(n = 26)的人血清中，测得hepcidin前在51.6-153.4 ng/ml(平均106.2 (SEM 32.1) ng/ml)范围内，这与已知的调节肽激素的浓度相当，大约比人类尿液中的hepcidin浓度高11倍。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba有趣的是，测得的浓度显示出广泛的前hepcidin，表明肽可能受到强调控。gydF4y2Ba

    cDNA结构表明hepcidin被翻译为一个84 aa的前前肽，最终被N加工成20-25 aa的肽gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(图1)。虽然信号序列的强一致序列解理位点位于Gly之间gydF4y2Ba24gydF4y2Ba和爵士gydF4y2Ba25gydF4y2Ba这将导致60个残留的前肽，之前的研究未能从肝组织和血液等天然来源分离出较大的前肽。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba除了技术上的困难之外，肝脏中丰富的前肽转化酶可能会抑制某些前肽的分离。在这种情况下，最近的研究表明，人类血液循环形式的hepcidin，由两个研究小组描述gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在尿液中，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba由蛋白质的C端20 - 25aa组成。然而，我们的ELISA检测是使用针对hepcidin前体N末端的特异性抗体进行的，这意味着除了20-25 aa加工的形式外，hepcidin原激素也会分泌并在人血液中循环。事实上，western blot分析证实了pre -hepcidin可能释放到血液中。在人血清提取物中，所有hepcidin抗体都识别出一个~10 kDa的hepcidin条带，该条带与肝脏和HepG2细胞组织提取物中的免疫反应性hepcidin完全共移(阳性对照;图1)。未检测到小于10 kDa的Hepcidin片段。人血清中hepcidin原激素的存在提示肝细胞分泌hepcidin原激素，可能通过内分泌途径减少膳食铁的吸收。gydF4y2Ba

    为了分析hepcidin在铁过载患者中的意义，我们测定了35例HFE C282Y突变纯合的HH患者血清中hepcidin的浓度，在所有被研究的HH患者中都检测到典型的铁过载特征。Hepcidin的浓度在这些个体中并没有像之前认为的那样增加，从而减少肠道铁的吸收。gydF4y2Ba21gydF4y2BaHH患者血清中的前hepcidin水平意外下调，不仅在未经治疗的患者中，而且在每周进行放血治疗的患者中也是如此。与健康志愿者相比，hepcidin前浓度从106.2 ng/ml血清显著降低到70.2 ng/ml血清。治疗组和未治疗组之间无差异。这些发现与之前的HH研究一致，即hfe敲除小鼠的肝脏hepcidin表达显著降低gydF4y2Ba11，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba以及HFE相关血色沉着症患者。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba这也与体外研究表明，原代人肝细胞和HepG2细胞的铁负荷下调了hepcidin mRNA的表达。gydF4y2Ba18，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba尽管铁过载，但在HH中铁的吸收会增强，gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba3.gydF4y2Bahepcidin的本构表达阻止了血色沉着症小鼠模型中的铁过载，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba我们假设HH患者hepcidin的调节被打乱。降低hepcidin浓度显然不能充分抑制升高的肠道铁吸收。此外，基于研究结果，hfe敲除小鼠肝脏hepcidin表达显著降低gydF4y2Ba11，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba在HH患者中，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba尽管铁过载，HFE仍缺乏hepcidin前上调，这表明HFE可能参与了血清hepcidin水平的调节。gydF4y2Ba

    尽管之前的研究表明尿hepcidin排泄与血清铁蛋白浓度有很好的相关性，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba在本研究中，未发现HH或透析患者循环中hepcidin前与血清铁或铁蛋白水平之间的相关性。同样，在前hepcidin和转铁蛋白饱和度之间没有检测到相关性，转铁蛋白饱和度被认为调节肝脏hepcidin的表达，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba虽然我们的HH患者不受贫血、缺氧或炎症(hepcidin影响因素)的影响。因此，我们认为铁储备对血清中hepcidin前水平的调节涉及复杂的间接影响。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba

    由于hepcidin也从尿液中分离出来，我们对肾功能不全患者的hepcidin调节很感兴趣。与HH患者和健康受试者相比，CRI患者血清中免疫反应性hepcidin原浓度从健康受试者的106.2 ng/ml显著升高至148.1 ng/ml。透析患者hepcidin前水平的升高提示肾脏可能参与了循环肽的代谢和/或消除。然而，目前还不清楚尿hepcidin是从血液中过滤出来的，还是来源于肾脏。根据我们目前的研究，我们不能排除hepcidin至少部分从肾脏释放的事实，因为它也在肾小管细胞中被发现。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba

    有趣的是，在最近一项关于hepcidin基因调控的研究中，肾脏激素EPO被证明可以下调肝脏hepcidin基因的表达。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba因此，EPO一方面可以作为促红细胞生成因子，另一方面可以作为抑制hepcidin的激素。因此，透析患者hepcidin浓度升高的另一种解释可能是EPO的相对缺乏，这在终末期肾功能不全中经常遇到。gydF4y2Ba27日,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba然而，在我们的CRI患者中，尽管他们接受了hepcidin抑制激素EPO治疗，但测得hepcidin前水平升高，支持hepcidin的肾滤过。gydF4y2Ba

    最近的一项研究讨论了hepcidin作为炎症性贫血的中介物，因为它是由炎症引起的。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba在另一项研究中，hepcidin的不适当高表达与肝腺瘤患者的难治性贫血有关，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba提示hepcidin可能在慢性疾病贫血中起主要的致病作用。在本研究中，我们测定了RA透析患者血清中hepcidin的水平，RA是一种公认的进行性肾功能衰竭并发症，其特征是红细胞正常色变。与健康受试者相比，RA患者的免疫反应性hepcidin原浓度没有显著升高(平均115.0 ng/ml)。尽管这些患者终末期肾功能不全导致肽激素积累，但hepcidin前水平明显低于无贫血的透析患者(平均148.1 ng/ml)。从这些发现我们得出结论，hepcidin在RA中的调节不同于炎症性贫血或肝腺瘤。RA中hepcidin的下调可能反映了该肽的反应性生理调节，以增强肠道铁的吸收和网状内皮巨噬细胞的铁释放。RA中hepcidin水平的降低与实验性贫血的情况一致，贫血对hepcidin基因表达的负面影响显著高于铁的正面影响。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba事实上，除了CRI中EPO产生不适当缺陷导致红细胞生成受损外，gydF4y2Ba27日,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba肾性贫血是由透析时失血、胃肠道隐蔽性出血、红细胞半衰期缩短、溶血和尿毒性血小板减少引起的。gydF4y2Ba27gydF4y2BaRA患者的EPO治疗可能与hepcidin抑制有关，但我们在无贫血的CRI患者组的研究结果显示，尽管使用EPO治疗，但hepcidin前体仍增加。因此，我们认为RA中hepcidin因失血而降低，这可能是hepcidin下调的原因之一。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba

    综上所述，目前尚不清楚近端肠上皮细胞调节铁吸收的信号的分子性质。在这种情况下，最近检测到的肽激素hepcidin可能在从身体铁储存到铁吸收细胞的调节途径中发挥核心作用。gydF4y2Ba8日,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba然而，要了解hepcidin的作用，细胞起源的知识是必要的。在这方面，我们鉴定了hepcidin在人和豚鼠肝脏中的免疫反应性，它定位于肝细胞的基底外侧膜结构域。gydF4y2Ba

    我们开发了一种ELISA方法来检测人血清中hepcidin的水平。这种检测是非侵入性的，易于执行，因此适合于常规工作。前hepcidin试验的成功在于其精确性、敏感性、可重复性和精确测定人血清样本中的hepcidin-(28-47)。应用目前的ELISA，第一次允许检测和确定前hepcidin在患有几种铁代谢障碍的患者。需要进一步的研究来确定前hepcidin在各种铁态下的确切分子机制。尽管如此，我们相信hepcidin激动剂和拮抗剂可以为预防和治疗铁紊乱提供潜在的药物。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    我们感谢M Franke医生为慢性肾功能不全患者提供血液。K Bents和A Fiedler的技术援助得到了极大的认可。本研究由德国科学研究院STR 216/10-1基金、dietmar - hop -基金会和海德堡大学医院Forschungsförderungs-Programm资助(8/ 2001,76 / 2002,58和79/2003)。gydF4y2Ba

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    23. ↵gydF4y2Ba
      马勒基米-雷克南gydF4y2Ba，弗雷泽DM，威尔金斯SJgydF4y2Baet al。gydF4y2Bahepcidin在hfe相关血色沉着症中的调控被破坏，肝脏作为体内铁稳态的调节器。gydF4y2Ba《柳叶刀》gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba361gydF4y2Ba：gydF4y2Ba669gydF4y2Ba-73年。gydF4y2Ba
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      Nemeth EgydF4y2Ba， Valore EV, Territo M，gydF4y2Baet al。gydF4y2BaHepcidin是一种II型急性期蛋白，被认为是炎症性贫血的中介物。gydF4y2Ba血gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba101gydF4y2Ba：gydF4y2Ba2461gydF4y2Ba3所示。gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba 摘要gydF4y2Ba/gydF4y2Ba免费的gydF4y2Ba全文gydF4y2Ba
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      尼古拉斯·GgydF4y2Ba， Viatte L, Lou DQ，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba组构hepcidin表达在血色素沉着症小鼠模型中防止铁过载。gydF4y2BaNat麝猫gydF4y2Ba2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba34gydF4y2Ba：gydF4y2Ba97gydF4y2Ba-101年。gydF4y2Ba
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      尼古拉斯·GgydF4y2Ba， Viatte L, Bennoun M，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba一种新的铁调节肽Hepcidin。gydF4y2Ba血液细胞Mol DisgydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba29gydF4y2Ba：gydF4y2Ba327gydF4y2Ba-35年。gydF4y2Ba
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      的时候存储库gydF4y2Ba．肾性贫血的病理生理学。gydF4y2Ba中国NephrolgydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba53gydF4y2Ba：gydF4y2BaS2gydF4y2Ba8。gydF4y2Ba
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      澳网一gydF4y2Ba．肾功能不全的贫血。gydF4y2BaRev Clin Exp HematolgydF4y2Ba2002gydF4y2Ba16; (5):gydF4y2Ba12gydF4y2Ba-20年。gydF4y2Ba
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      温斯坦达gydF4y2Ba， Cindy NR, Fleming MD，gydF4y2Baet al。gydF4y2Bahepcidin的不恰当表达与铁难治性贫血有关:慢性疾病贫血的意义gydF4y2Ba血gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba3776gydF4y2Ba-81年。gydF4y2Ba
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      尼古拉斯·GgydF4y2Ba，夏维特C，维亚特L，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba编码铁调节肽hepcidin的基因受贫血、缺氧和炎症的调节。gydF4y2BaJ临床投资gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba110gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1037gydF4y2Ba-44年。gydF4y2Ba
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      安德森GJgydF4y2Ba，弗雷泽DM，威尔金斯SJgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba肠道铁转运蛋白表达、肝脏hepcidin水平与铁吸收控制的关系。gydF4y2Ba生物化学gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba724gydF4y2Ba6。gydF4y2Ba
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