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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
肠道炎症gydF4y2Ba
乳酸菌在肠道运输后分泌的代谢物保留抗炎特性gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. 年代MenardgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. C CandalhgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. J C竹子gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. K TerpendgydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. N Cerf-BensussangydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. M海曼gydF4y2Ba
  1. INSERM EMI-0212, Faculté法国巴黎Necker Enfants MaladesgydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    海曼博士gydF4y2Ba
    INSERM EMI 0212, Faculté neck - enfants Malades, 156 rue de Vaugirard, 75730，法国巴黎;gydF4y2Baheymannecker.frgydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景:gydF4y2Ba益生菌对肠道炎症有有益的作用。在本研究中，我们研究了乳酸和共生革兰氏阳性(+)细菌条件培养基(CM)对肿瘤坏死因子α (TNF-α)释放的影响及其机制。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba观察脂多糖(LPS)诱导的外周血单个核细胞或THP-1细胞系分泌TNF-α的情况，观察从两种益生菌株中获得的CM是否存在，gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba),gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba)和三株共生菌(gydF4y2Ba双歧杆菌bifidumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba瘤胃球菌属gnavusgydF4y2Ba，且身份不明gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba)．gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba细菌CM被允许交叉过滤生长的肠上皮细胞单分子层(HT29-19A)，以评估活性细菌产物的肠道运输。对这些产物进行了表征，并评估了它们对LPS结合THP-1细胞和核因子κB (NFκB)激活的影响。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2BaLPS诱导的TNF-α分泌对两种益生菌CM均有剂量依赖性抑制(对CM有64%和71%的抑制gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba对共生菌CM的抑制程度较低(21-32%)。活性产物gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba耐消化酶，分子质量<3000 Da。它们的抑制作用在通过肠细胞单分子层经上皮转运后保留，主要在炎症条件下。LPS-FITC与THP-1细胞的结合及nf - κ b的激活被显著抑制gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba厘米。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba释放具有抗tnf -α作用的代谢产物，能够跨越肠道屏障。共生菌也表现出TNF-α抑制能力，但程度较低。这些结果强调了共生菌在肠道内稳态中的有益作用，并可能解释某些益生菌在缓解消化炎症中的作用。gydF4y2Ba

  • 益生菌gydF4y2Ba
  • 炎性细胞因子gydF4y2Ba
  • 肠屏障gydF4y2Ba
  • FCS，胎牛血清gydF4y2Ba
  • 干扰素,干扰素gydF4y2Ba
  • ,白介素gydF4y2Ba
  • LBP, LPS结合蛋白gydF4y2Ba
  • 有限合伙人,脂多糖gydF4y2Ba
  • LTA，脂磷选择酸gydF4y2Ba
  • NFκB，核因子κBgydF4y2Ba
  • PBMC，外周血单个核细胞gydF4y2Ba
  • SAB，人血清ABgydF4y2Ba
  • BbgydF4y2Ba厘米,gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba的媒体gydF4y2Ba
  • 圣gydF4y2Ba厘米,gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba的媒体gydF4y2Ba
  • TGF-β转化生长因子βgydF4y2Ba
  • TNF-α，肿瘤坏死因子αgydF4y2Ba
  • toll样受体TLRgydF4y2Ba
  • IEC，肠上皮细胞gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2003.026252gydF4y2Ba

统计数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    益生菌对人体健康的各种有益作用都被归因于益生菌，主要是在肠道层面。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba有一致的证据表明益生菌可能具有抗炎作用。过敏性炎症可以从使用益生菌作为常规治疗的辅助。的确，据报道，对牛奶过敏的婴儿，用广泛的水解奶粉补充gydF4y2Ba鼠李糖乳杆菌GGgydF4y2Ba与只使用水解配方的婴儿相比，他们的临床评分更好，粪便中的肿瘤坏死因子α (TNF-α)更少。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与胃炎症相关的gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba通过补充益生菌常规治疗，感染得到改善。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba有趣的是，不同的乳酸菌、双歧杆菌或益生菌混合物(VSL#3)已被证明可以缓解实验动物的消化系统疾病gydF4y2Ba4，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在人类的炎症性肠病中也是如此gydF4y2Ba6 -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba应激性坏死性小肠结肠炎新生大鼠初步给药gydF4y2Ba双歧杆菌属对象gydF4y2Ba对小肠结肠炎的发展具有保护作用。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba最近，也有研究表明gydF4y2Ba鼠李糖乳杆菌GGgydF4y2Ba条件培养基降低巨噬细胞体外TNF-α的产生gydF4y2Ba10gydF4y2Ba通过一个与接触无关的机制。然而，明确的有益作用仍然存在争议。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba其他研究强调了细菌菌株在诱导抗炎或促炎细胞因子方面的特异性。事实上，一些乳酸菌或其分泌产物口服给小鼠(gydF4y2Ba这种乳酸菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba短乳gydF4y2Ba)，对促炎细胞因子如白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的分泌有刺激作用。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba

    益生菌通常通过口服途径给药，肠道上皮屏障限制了它们与局部免疫系统的相互作用。目前的研究旨在描述两种乳酸菌(gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba)与三株共生菌进行比较。对乳酸菌代谢物进行了表征，并研究了其抗炎特性的可能机制，以及在正常或炎症条件下其穿越肠道屏障的能力。gydF4y2Ba

    方法gydF4y2Ba

    细菌条件培养基的制备gydF4y2Ba

    两种乳酸菌菌株，gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba(菌株BbC50)和gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba(菌株St065)，以及从革兰氏阳性人类菌群中分离出的3株细菌。G Corthier (INRA, Jouy en Josas, France)提供的共生菌株由gydF4y2Ba两歧双歧杆菌菌株B536gydF4y2Ba最初是从一个健康母乳喂养婴儿的粪便菌群中分离出来的，gydF4y2Ba胃球菌(FRE1)gydF4y2Ba从一个健康成年人的主要粪便菌群中分离出来，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba以及从一个月大婴儿的粪便菌群中分离出的一种未鉴定的链球菌菌株(此处命名为新生儿链球菌)。所有菌株先在脑心培养基(双歧杆菌和瘤胃球菌)或富乳糖M20培养基(链球菌)上培养。离心收集细菌，在含有20%胎牛血清(FCS)并添加3%菊粉(双歧杆菌和瘤胃球菌)或3%菊粉的RPMI培养基中培养48小时以上gydF4y2BadgydF4y2Ba葡萄糖(链球菌)。细菌条件培养基(CM)超离心(10万gydF4y2BaggydF4y2Ba1小时，4℃)，在0.22 μm滤膜上过滤，冷冻(−80℃)直到使用。细菌CM对应5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和8×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaCFU /毫升gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba而且gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba，并登录2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba, 1.3×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba、3.3×10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU /毫升gydF4y2BaR gnavusgydF4y2Ba，gydF4y2BaB bifidumgydF4y2Ba和新生儿链球菌。gydF4y2Ba

    在比较益生菌和共生菌CM抗tnf -α作用的实验中，在RPMI/FCS中进行稀释，得到相同的最终浓度，对应2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaCFU /毫升。共生菌CM也在高浓度(即稀释一半)下进行测试。gydF4y2Ba

    在一些实验中，用0.15 mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶处理细菌CM来水解蛋白质。为了表征活性细菌产物的大小，我们将细菌CM通过分别保留大于3000 Da或10000 Da分子的Centriplus m -3或m -10膜进行超滤。保留和过滤的组分被调整到初始体积并冷冻直到使用。gydF4y2Ba

    免疫细胞培养和实验方案gydF4y2Ba

    健康患者外周血单个核细胞(PBMC)培养于添加10%人血清AB (SAB)、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、0.05 mM β-巯基乙醇和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。在某些情况下，THP-1原单核细胞细胞系(ATCC No TIB-202)在含有FCS的相同培养基中培养。PBMC或THP-1细胞在5×10处接种于24孔(Falcon)板上gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/。让PBMC粘附1小时，然后用1-1000 ng/ml脂多糖(LPS，参考L2654;Sigma, La verpillère, France)在存在或不存在本地或处理(如上所述)细菌CM稀释的情况下进行4小时。离心后收集上清，测定TNF-α。在某些情况下，在CM和LPS存在的情况下也检测IL-10的分泌。激活最大TNF-α分泌的最佳LPS浓度为10 ng/ml(数据未显示)。采用碘化丙啶掺入流式细胞术(BDLSR和CELLquest软件;Becton Dickinson, Le Pont de Claix，法国)。在一些病例中，脂磷磷磷酸(LTA 100 ng/ml;Sigma)在CM细菌存在或不存在的情况下进行6小时。gydF4y2Ba

    使用商用酶联免疫吸附法(ELISA试剂盒;多赛特研发系统，里尔，法国)。gydF4y2Ba

    流式细胞术分析在细菌条件培养基中LPS与THP-1原单核细胞的结合gydF4y2Ba

    在LPS-LBP复合物能够识别CD14受体之前，LPS必须与LPS结合蛋白(LBP)结合。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba它还可以结合toll样受体4 (TLR4)。为了测试乳酸菌CM是否与LPS与单核细胞的结合相互作用，我们测量了LPS- fitc (gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba055年:B5;Sigma)，用流式细胞术作为荧光标记。THP-1细胞在2×10孵育48小时gydF4y2Ba6gydF4y2Ba在维生素D3 (12 ng/ml)的存在下，细胞/ml的CD14受体表达上调。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba以最优菌量CM在4℃预孵育30分钟，然后在含有10% SAB为LBP源、2 μg/ml LPS-FITC的RPMI中4℃孵育1小时。在某些情况下，牛血清白蛋白0.2%代替SAB作为阴性对照来评估CD14独立LPS结合。gydF4y2Ba

    NFκB核易位gydF4y2Ba

    核因子κB (NFκB)的激活以其核易位为特征。这种易位在核提取物上通过电泳迁移移位试验得到证实。gydF4y2Ba

    THP-1细胞(10×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaRPMI/FCS 1%中的细胞/ml)用10 ng/ml LPS刺激30分钟，在存在或不存在<3 kDa的一半稀释CM过滤组分的情况下，制备核和细胞质提取物。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba

    核提取物(5 μg)置于含有1 μg聚(dI-dC)和0.5 ng的结合缓冲液(10 mM HEPES, pH 7.8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10%甘油)中gydF4y2Ba32gydF4y2BaκB位点对应的p标记DNA探针(5 ' -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3 ';Promega, Charbonnières，法国)。在室温下孵育30分钟后，样品在含硼酸三酯- edta缓冲液的5%聚丙烯酰胺凝胶上运行。凝胶干燥，暴露于phospimager屏幕(Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA)，并使用ImageQuant软件(Molecular Dynamics)进行密度分析。gydF4y2Ba

    在控制和炎症条件下，活性细菌代谢物通过过滤生长的上皮细胞系HT29-19A的肠道运输gydF4y2Ba

    为了分析活性细菌代谢物是否能通过肠道屏障，我们使用过滤培养的肠道细胞单分子层。HT29-19A细胞以0.8×10浓度接种于微孔过滤器(Falcon)上gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba添加10% FCS和1%庆大霉素的杜尔贝科改良Eagle培养基。三周后，这导致了一个紧密的极化单分子层，显示了上皮间电阻~150 Ω×cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba．细胞分别用100 U/ml干扰素(IFN)-γ和10 ng/ml TNF-α处理(炎症条件)或未处理(对照组)，放置于基底外侧隔室，孵育48小时。经过两次广泛的RPMI清洗后，细菌CM(或RPMI作为对照)被添加到根尖隔室。24小时后，收集基底外侧隔室中的培养基，并测试其抑制LPS诱导的PBMC分泌TNF-α的能力，如上所述。实验结束时(即在基底外侧用IFN-γ和TNF-α处理后)测量肠道细胞单分子膜的电阻，然后用CM或RPMI细菌在顶端孵育24小时。上皮细胞分泌转化生长因子β (TGF-β)，这是一种抑制TNF-α分泌的抗炎细胞因子。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba由于这将掩盖CM细菌的抗炎能力，基底外侧隔室被抗tgf -β抗体(MAB240;在根尖室加入CM菌前，以2 μg/ml的浓度给药。gydF4y2Ba

    统计分析gydF4y2Ba

    使用SAS包进行统计分析。结果用平均值(SD)表示，组间不同参数的比较采用方差分析和非参数检验(Wilcoxon)。p<0.05为差异显著。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    乳酸菌和共生菌CM对LPS刺激PBMC分泌TNF-α的影响gydF4y2Ba

    图1显示，乳酸菌和共生菌CM使用的最终浓度均为2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaCFU/ml对LPS诱导的TNF-α分泌有抑制作用。乳酸菌CM的抑制效果显著高于对照组(43%和71%)gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba与共生菌CM相比(分别为21%、32%和22%)gydF4y2BaR gnavusgydF4y2Ba，gydF4y2BaB bifidumgydF4y2Ba、新生儿链球菌;p < 0.04)。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    乳酸菌条件培养基(CM)的抑菌效果比较(gydF4y2Ba短双歧杆菌，嗜热链球菌gydF4y2Ba)和来自人类主要菌群的革兰氏阳性菌(gydF4y2Ba瘤胃球菌属gnavusgydF4y2Ba，gydF4y2Ba双歧杆菌bifidumgydF4y2Ba和新生儿链球菌)。对照条(100%)为脂多糖(LPS)刺激外周血单个核细胞(PBMC)释放的肿瘤坏死因子α (TNF-α)。加入细菌CM(相同浓度2.5×10)gydF4y2Ba5gydF4y2BaCFU/ml)对LPS刺激的PBMC诱导TNF-α分泌明显减少。乳酸菌比人体菌群中的细菌具有更强的抑制作用。N = 8次实验。***与对照组差异显著(p<0.0001);†明显不同于gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba(p < 0.04);传统的，与传统的有显著不同gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba(p < 0.0001)。gydF4y2Ba

    我们还测试了共生菌CM在最高浓度(即0.65×10)时的抑制效果gydF4y2Ba6gydF4y2Ba1.65×10gydF4y2Ba8gydF4y2BaCFU/ml)的抑制作用更为明显，分别为36%、77%和96%gydF4y2BaR gnavusgydF4y2Ba，gydF4y2BaB bifidumgydF4y2Ba、新生儿CM链球菌。乳酸菌CM无法达到如此高的浓度，因为在相同的培养条件下，乳酸菌CM的生长仅限于5和8×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba分别CFU /毫升。gydF4y2Ba

    乳酸菌CM对TNF-α分泌的剂量依赖性作用gydF4y2Ba

    图2A显示，在没有任何其他刺激的情况下，gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM刺激TNF-α分泌(487 (192)pg/ml;p < 0.0003)gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba与基础分泌(49 (44)pg/ml)相比，CM无显著增加(150 (96)pg/ml)。这种基础刺激可能是由于CM中残留的革兰氏阳性膜成分，如肽聚糖或LTA，已知可刺激TNF-α的分泌。gydF4y2Ba18，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba两种CM菌均对LPS诱导的TNF-α分泌具有剂量依赖性抑制作用。与LPS诱导的TNF-α分泌(1315 (413)pg/ml)相比，PBMC对TNF-α分泌有显著抑制作用gydF4y2BaB谕令gydF4y2BaCM 1/2稀释(804 (400)pg/ml，抑制率39%;P <0.001)和3/4稀释(468 (172)pg/ml，抑制率64%;p < 0.001)。gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM还抑制LPS诱导的TNF-α分泌，1/2稀释时效果最大(抑制71%;P <0.001)， 3/4稀释对免疫细胞有毒性。用于生产CM细菌的培养基本身并没有抑制TNF-α的分泌(未显示)。在基础条件下的THP-1细胞(图2B)中，gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba与基础分泌(46 (34)pg/ml)相比，CM显示TNF-α分泌无显著增加(323 (101)pg/ml)gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba与PBMC相比，CM不刺激TNF-α分泌(81 (52)pg/ml)。同样，在LPS存在的情况下，TNF-α分泌增加(2938 (501)ng/ml)gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba或gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM高度抑制(分别为1160(184)和560 (124)ng/ml;P <0.001)这样的分泌。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    的影响gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba),gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba通过外周血单个核细胞(PBMC) (A)和原单核细胞细胞系THP-1 (B)诱导肿瘤坏死因子α (TNF-α)分泌的基础多糖和脂多糖(LPS)条件培养基(CM)。在从两种菌株获得的条件培养基存在时，观察到TNF-α分泌的剂量依赖性抑制。***与LPS诱导的TNF-α分泌显著不同(p<0.0001)。n = 8 (THP-1实验);n = 9-18 (PBMC实验)。gydF4y2Ba

    用流式细胞术进行的活力研究表明gydF4y2BaB谕令gydF4y2BaCM即使在高剂量(3/4稀释)下也不会诱导细胞死亡，因为在对照条件下PBMC的凋亡率约为11%，而在存在CM时则为13%gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba厘米。然而，孵化gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM合并PBMC在1/2稀释时死亡率为20%，而在最高浓度(3/4稀释)时死亡率为90%。gydF4y2Ba

    细菌CM对LTA诱导PBMC分泌TNF-α的影响gydF4y2Ba

    图3显示，革兰氏阳性菌细胞壁的主要化合物LTA刺激TNF-α分泌(880 (147)pg/ml)，乳酸菌CM均抑制LTA刺激TNF-α分泌(383(50)和642 (39);p < 0.0001gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba厘米,分别)。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    的影响gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba),gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba脂磷选择酸(LTA)条件培养基(CM)诱导外周血单个核细胞分泌肿瘤坏死因子α (TNF-α)。观察到TNF-α分泌受到抑制gydF4y2BaBbgydF4y2Ba-CM(3/4稀释)和gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba-CM(1/2稀释)。***与LTA诱导的TNF-α分泌有显著差异(p<0.0001);†††与LTA+明显不同gydF4y2BaBbgydF4y2Ba厘米(p < 0.0001);N = 4-7个独立实验。gydF4y2Ba

    细菌CM对PBMC分泌IL-10的影响gydF4y2Ba

    在存在或不存在LPS时，PBMC分泌IL-10是相同的(未显示)。图4显示IL-10的基础分泌(52 (27)pg/ml)显著增加gydF4y2BaB谕令gydF4y2BaCM(3/4稀释)(98 (24)pg/ml;p < 0.0005)。在…面前gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM(1/2稀释)，IL-10分泌明显减少(13 (5)pg/ml;P <0.0006)与基础分泌物比较。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    的影响gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba),gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba外周血单个核细胞分泌白介素10 (IL-10)的条件培养基(CM)。CM在最大浓度(1/2和3/4)时使用gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba而且gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba分别)。**与脂多糖显著差异(p<0.0005);n = 4。gydF4y2Ba

    活性细菌代谢物的特征gydF4y2Ba

    Pepsin-trypsin水解gydF4y2Ba

    胃蛋白酶、胰蛋白酶处理gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba(462 (153) pg/ml)和gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM (394 (139) pg/ml)与对照组LPS刺激(1185 (165)pg/ml)相比具有抑制作用;p<0.0001)(图5)。原生和水解细菌CM具有相同的抑制作用，表明消化酶不改变其抑制能力，活性细菌代谢物可能不是蛋白质。gydF4y2Ba

    图5gydF4y2Ba

    的影响gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba),gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba)条件培养基(CM)，经胃蛋白酶/胰蛋白酶(PT)处理后，诱导肿瘤坏死因子α (TNF-α)分泌脂多糖(LPS)。原生菌和PT水解菌CM对LPS诱导的TNF-α分泌具有相同的抑制作用。***与LPS差异显著(p<0.0001);n = 8-13。gydF4y2Ba

    选择超滤gydF4y2Ba

    图6显示，含有代谢产物<10 kDa的滤液仍然减少TNF-α的分泌(330 (46)pg/ml和680 (96)pg/ml)gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba分别;p<0.0001)与LPS诱导分泌(1189 (66)pg/ml)相比。含有代谢产物<3 kDa的滤液也显著降低了TNF-α的分泌(690 (74)pg/ml和759 (325)pg/ml)gydF4y2BaBbgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba分别;p<0.0001)，而残留部分则没有，这表明大多数活性细菌代谢物的分子质量低于3 kDa。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    活性细菌代谢物分子量的评估。细菌条件培养基(CM)的超滤是在选择性膜(分子量切断3和10 kDa)上进行的。保留和过滤的部分被测试其抑制肿瘤坏死因子α (TNF-α)分泌的能力。在最大抑菌浓度下使用超滤CM。只有过滤而没有保留的部分显示出抑制能力，表明活性细菌代谢物分子量低(<3 kDa)。***显著低于脂多糖(LPS)和残留部分(p<0.0001);N = 4-10个独立实验。gydF4y2Ba

    活性细菌代谢物抑制LPS与THP-1细胞的结合gydF4y2Ba

    如图7所示，在LBP(含在血清AB中)存在的情况下，LPS-FITC与成熟THP-1细胞上表达的CD14受体结合虽小但显著(平均荧光强度7.0(0.4))。在没有LBP (LPS+BSA)的情况下，也有少量(不显著)的LPS- fitc结合。然而,gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM完全抑制LBP依赖的LPS与THP-1细胞的结合(平均荧光5.2(0.6)和5.1 (0.5);p < 0.0001)。用于培养这两种乳酸菌的培养基本身并没有抑制这种结合。gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    的影响gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba),gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba)条件培养基(CM)对脂多糖(LPS)-FITC结合分化THP-1细胞的影响。流式细胞术测定平均荧光强度。与自身荧光相比，在牛血清白蛋白(BSA)存在的情况下，LPS与THP-1细胞有少量结合(CD14独立结合)。这种结合在LPS结合蛋白(包含在人血清AB (SAB)中)的存在下显著增加(CD14依赖性结合)。经4°C预处理后用gydF4y2Ba圣-gydF4y2Ba厘米或gydF4y2BaBb -gydF4y2BaCM在SAB存在时，CD14依赖的LPS-FITC与THP-1细胞结合被显著抑制。***与其他条件差异显著(p<0.0001);N = 6个独立实验。gydF4y2Ba

    活性代谢物gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba降低THP-1细胞NFκB核易位gydF4y2Ba

    本研究使用分子质量< 3kda的活性代谢物。如图8所示，LPS刺激NFκB的核易位，任意取该条带的密度为100%激活。在LPS存在的情况下，gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM(过滤分数<3 kDa)对LPS诱导的NFkB核易位的抑制作用分别为34%和35%。gydF4y2Ba

    图8gydF4y2Ba

    的影响gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba圣gydF4y2Ba),gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba（gydF4y2BaBbgydF4y2Ba)条件培养基(CM)对THP-1细胞核因子κB (NFκB)核易位的影响。提取核蛋白后进行电泳迁移移位分析，并与agydF4y2Ba32gydF4y2BaP标记DNA探针。两个独立实验的结果具有代表性。有限合伙人,脂多糖。gydF4y2Ba

    活性细菌产物在肠道运输后保留其抗tnf -α特性gydF4y2Ba

    我们测试了细菌代谢物跨越上皮屏障的能力，因为它们的抗炎作用通常应该发生在免疫细胞所在的固有层，而不是在肠腔。如图9A所示，在基础和炎症条件下，在细菌CM经上皮转运后，基底外隔室可能包含抑制因子，测试其抑制LPS诱导的PBMC分泌TNF-α的能力。如图9B所示，在基础条件(上皮控制)下获得的基底外侧隔室对TNF-α分泌有抑制作用(在基础条件和炎症条件下分别抑制44%和45%;p < 0.0001)。这表明上皮细胞自身释放的抗tnf -α因子可能与TGF-β不同，因为培养板被抗TGF-β所包裹。在基础条件下，gydF4y2BaB谕令gydF4y2BaCM在肠道运输后仍能抑制TNF-α分泌(p<0.0012) (gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba与上皮对照相比，CM也抑制分泌，但这并不显著(p = 0.07)。在用炎症因子TNF-α和IFN-γ处理肠单分子膜后，gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM进一步降低了TNF-α分泌量，分别为LPS激活分泌量的23(7)%和37 (8)% (p<0.0001)。在炎症条件下，CM菌的抑制能力高于基础条件(p<0.02)。作为上皮屏障完整性的对照，在使用TNF-α和IFN-γ处理48小时后，在Ussing腔中测量HT29-19A单分子膜的电阻R，然后在根尖室中与CM细菌孵育24小时(图9C)。在基础条件下，HT29-19A单层电阻R为122 (59)Ω×cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2BaB谕令gydF4y2BaCM未显著修改R (153 (44) Ω×cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)与对照单分子层相比gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM降低R至67 (7)Ω×cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba(p < 0.002)。在炎症条件下(IFN-γ和TNF-α)，在上皮对照中，R显著降低(78 (19)Ω×cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba；P <0.0001)与基础条件相比(122 (59)Ω×cmgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这种下降在细菌CM (R = 29(14)和24 (16)Ω×cm的存在下更加明显gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，分别为gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM;P <0.0001)，表明细菌代谢物对炎症的上皮屏障没有疗效。gydF4y2Ba

    Inhibitory capacity of bacteria conditioned media (CM) after crossing the intestinal epithelial monolayer. (A) HT29-19A intestinal cells were grown as tight monolayers on microporous filters separating apical and basolateral compartments. After 48 hours of treatment with (or without) tumour necrosis factor α (TNF-α)/interferon γ (IFN-γ), cells were washed and bacteria CM were added to the apical compartment for 24 hours. Basolateral compartments were then tested for their inhibitory capacity on TNF-α secretion. (B) Basolateral epithelial cell CM, by themselves (epithelial control), already inhibited lipopolysaccharide (LPS) induced TNF-α secretion. The inhibitory capacities of bacteria CM were retained after crossing the intestinal epithelial layer of HT29-19A cells, especially under inflammatory conditions. The inhibitory capacity of Bifidobacterium breve CM was retained after transepithelial transport, under basal and more extensively under inflammatory conditions. The inhibitory capacity of Streptococcus thermophilus CM was statistically significant under inflammatory conditions. **Significantly different from epithelial control under basal conditions (p<0.0012); †††significantly different from epithelial control under inflammatory condition (p<0.0001); ‡significantly different from bacteria CM under basal conditions (p<0.02); §§§significantly different from LPS alone (p<0.0001); n = 4–15 separate experiments. (C) Electrical resistance of epithelial layers 48 hours after treatment with inflammatory cytokines, followed by incubation for 24 hours with S thermophilus and B breve CM or RPMI in the apical compartment. **Significantly different from epithelial control under basal conditions (p<0.002); †††significantly different from epithelial control under inflammatory conditions (p<0.0001); ‡‡‡significantly different from B breve CM under basal conditions (p<0.0001); n = 10 monolayers per condition.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图9gydF4y2Ba
    图9gydF4y2Ba

    细菌条件培养基(CM)通过肠上皮单层后的抑制能力。(A) HT29-19A肠细胞在分离根尖和基底外侧隔室的微孔过滤器上生长成紧密的单分子层。在使用(或不使用)肿瘤坏死因子α (TNF-α)/干扰素γ (IFN-γ)治疗48小时后，细胞被清洗，细菌CM被添加到根尖室24小时。然后测试基底外侧间室对TNF-α分泌的抑制能力。(B)基底外侧上皮细胞CM本身(上皮控制)已经抑制脂多糖(LPS)诱导的TNF-α分泌。细菌CM的抑制能力在穿过HT29-19A细胞的肠上皮层后仍然保留，尤其是在炎症条件下。的抑制能力gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba在基础条件下和炎症条件下，经上皮转移后的CM保留更广泛。的抑制能力gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba炎症条件下CM有统计学意义。**基础条件下与上皮对照差异显著(p<0.0012);†††与炎性条件下的上皮细胞对照显著不同(p<0.0001);‡与细菌CM在基础条件下有显著差异(p<0.02);§§与LPS组差异显著(p<0.0001);N = 4-15个独立实验。(C)用炎症因子治疗48小时后上皮层电阻，然后用gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba而且gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba根尖室CM或RPMI。gydF4y2Ba**gydF4y2Ba基础条件下与上皮对照差异显著(p<0.002);†††与炎性条件下的上皮细胞对照显著不同(p<0.0001);传统的，与传统的有显著不同gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba基础条件下CM (p<0.0001);每个条件N = 10个单分子层。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    益生菌作为佐剂用于各种消化系统疾病的治疗已被观察到有益的效果。最令人信服的效果是在治疗袋炎中观察到的。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba然而，与消化系统疾病相关的炎症状况改善的机制还不完全清楚，可能很复杂。益生菌的有益活性可能通过肠道相关淋巴组织的免疫调节发挥作用。共生菌可能在诱导抗炎信号中起作用，正如在肠上皮细胞系中测试的那样，在一项研究中报告了非致病性gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba能够通过阻止IκB的泛素化从而抑制NFκB激活途径，从而抑制促炎细胞因子的释放。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba这些结果表明，共生细菌，也许还有益生菌，可能通过NFκB介导的促炎信号下调，NFκB是一种转录因子，参与许多促炎细胞因子或趋化因子的产生。gydF4y2Ba

    在本研究中，两种乳酸菌(gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba)和三种共生革兰氏阳性菌(gydF4y2BaR gnavusgydF4y2Ba，gydF4y2BaB bifidumgydF4y2Ba和新生儿链球菌)被证明能够在体外抑制LPS诱导的免疫细胞分泌TNF-α。gydF4y2Ba

    目前的结果表明，共生细菌自身促炎能力的自我限制特性的可能性，因为共生细菌是优势菌群的一部分，也显示出剂量依赖的抗炎作用。因此，当共生菌群对炎症有同样的有益作用时，使用益生菌的好处就出现了问题。益生菌的优势之一可能是在上消化道保持较高的细菌密度(尽管是短暂的)，而上消化道通常只有很少的细菌。这种“短暂定植”可能有利于肠道炎症过程的下调，这些炎症过程发生在通常不与共生菌群接触的肠道区域或驻留菌群组成发生改变的肠道区域。益生菌可能是一种“外源性”菌群，在肠道运输过程中发挥局部有益作用，需要持续摄入才能发挥这种作用。相比之下，定居菌群会产生永久性的影响，至少在小肠和结肠的远端是这样。gydF4y2Ba

    B谕令gydF4y2BaCM比gydF4y2Ba嗜热菌CMgydF4y2Ba发挥抗炎作用，特别是在肠道运输后，对上皮细胞或免疫细胞活性无副作用。的抑制能力gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM可能不涉及相同的活性代谢物，因为一些不一致的实验已经被观察到，以更好地理解抑制作用的机制(降低IL-10分泌通过gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM和低抑制LTA诱导的TNF-α分泌)。gydF4y2Ba

    活性代谢物似乎是非蛋白质分子(<3000 Da)，但其确切性质仍有待研究。在肠上皮细胞系中，一些细菌代谢物，特别是由细菌发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸，如丁酸盐，已被证明对NFκB激活具有抑制作用，特别是在TNF-α两者存在的情况下gydF4y2Ba21gydF4y2Ba在巨噬细胞中。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba在目前的研究中，这种可能性被排除，因为细菌CM不含有大量的丁酸盐。丁酸浓度非常低(15和20 μM)gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2BaCM，分别)表明丁酸不参与，因为已报道的活性浓度在微摩尔范围内。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba发现了大量的乳酸(4.5和9毫米)gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba年代酸奶gydF4y2Ba但在这些浓度下，乳酸不能抑制LPS诱导的TNF-α分泌(数据未显示)。gydF4y2Ba

    有趣的是，尽管乳酸菌CM是从一个相对较小的细菌密度中获得的(~2.5×10gydF4y2Ba5gydF4y2BaCFU/ml)，抑制作用显著，强调了活性细菌代谢物的效率。事实上，在体内，口服益生菌的密度通常很高(~10gydF4y2Ba10gydF4y2BaCFU/day)，我们的研究结果表明，尽管大量的细菌由于有害的肠道环境(胃酸、消化酶、防御素)而流失，但存活的细菌可能在炎症调节中发挥作用。细菌分泌产物抑制LPS激活免疫细胞的机制可能是多因素的。在目前的研究中，细菌产物似乎限制了LPS对单核/巨噬细胞上CD14受体的访问。这与免疫细胞中NFκB信号的降低和TNF-α分泌的下调有关。虽然肠道巨噬细胞在基础条件下不表达CD14，但在炎症条件下表达上调，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba强调益生菌在这些条件下的潜在有益作用。然而，抑制TNF-α分泌的机制可能不仅仅依赖于对LPS受体的抑制，因为细菌CM也抑制LTA诱导的TNF-α分泌，这一过程依赖于TLR-2。因此，不排除细菌CM也通过影响细胞内信号级联导致NFκB激活的可能性。gydF4y2Ba

    B谕令gydF4y2BaCM还能刺激IL-10的分泌，IL-10是一种具有抗炎特性的细胞因子。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba事实上，IL-10下调了巨噬细胞TNF-α的分泌gydF4y2Ba25gydF4y2Ba降低抗原提呈细胞上MHC II类的表达。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba在过敏性儿童，给药gydF4y2Ba鼠李糖乳杆菌GGgydF4y2Ba(2×10gydF4y2Ba10gydF4y2Ba连续4周的CFU会导致血清IL-10水平的升高，并增加PBMC诱导的有丝分裂原IL-10分泌。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba同样，灌胃给药gydF4y2BaLactococcus lactisgydF4y2Ba分泌IL-10的蛋白可使小鼠右旋糖酐诱导的结肠炎减少50%。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba

    有趣的是，细菌CM在跨越上皮屏障后仍然发挥抑制作用，尤其是在炎症条件下。很难将细菌CM的抑制能力与肠上皮细胞(IEC)本身的抑制能力分离开来，因为后者是已知的释放抑制因子，包括前列腺素和TGF-β。gydF4y2Ba29日,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba虽然我们试图通过使用抗TGF-β抗体捕获滤过生长的上皮细胞基底侧间室中的TGF-β来消除这个问题，但上皮细胞CM仍然会产生抑制作用，这表明要么是TGF-β没有被抗TGF-β抗体完全阻断，要么是IEC释放了TGF-β以外的抑制因子。然而，细菌CM(特别是来自gydF4y2BaB谕令gydF4y2Ba)显著增加了上皮抑制作用，这表明细菌活性代谢物本身有助于抑制炎症。有两种可能性可以解释肠道环境中的这种抑制活性:(1)与细菌代谢物调节上皮细胞衍生的抗炎化合物有关的间接抑制作用;(2)最有可能的是，活性细菌代谢物穿过上皮屏障的经上皮通道。细菌代谢物可通过上皮屏障的经上皮途径既可跨细胞，也可旁细胞。事实上，虽然已经很清楚地认识到促炎细胞因子促进细胞旁渗漏到小分子，但在IFN-γ存在的情况下，也可以观察到通过跨细胞途径通过跨细胞作用增加分子运输。gydF4y2Ba31gydF4y2Ba另外，肠细胞顶端膜的活性代谢物的受体介导转运也可能参与其中。gydF4y2Ba

    综上所述，目前的结果表明，共生革兰氏阳性菌和益生菌都存在gydF4y2Ba双歧杆菌谕令gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba乳酸链球菌gydF4y2Ba至少在体外具有抗tnf -α的作用。此外，研究结果表明，益生菌在肠道转运过程中释放的活性代谢物可能会穿过肠层发挥抗炎作用。这将在基础条件下增加肠道微环境的抑制性，并有助于在病理条件下降低炎症。因此，肠道相关淋巴组织的免疫调节可以解释(至少部分地)益生菌作为辅助剂在消化炎症治疗中的有益作用。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    这项工作得到了Blédina-SA和摩纳哥公主基金会的部分资助。我们也感谢Butel博士在短链脂肪酸测定方面的帮助，以及G Corthier博士为我们提供共生菌株的帮助。gydF4y2Ba

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      Timmerman CPgydF4y2BaMattsson E, Martinez-Martinez L，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba葡萄球菌和葡萄球菌肽聚糖诱导人单核细胞释放肿瘤坏死因子。gydF4y2Ba感染ImmungydF4y2Ba1993gydF4y2Ba；gydF4y2Ba61gydF4y2Ba：gydF4y2Ba4167gydF4y2Ba-72年。gydF4y2Ba
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      Neish作为gydF4y2Ba， Gewirtz AT，曾浩，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba通过抑制ikappab - α泛素化对上皮反应的原核调控。gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba289gydF4y2Ba：gydF4y2Ba1560gydF4y2Ba3所示。gydF4y2Ba
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      一转眼女士gydF4y2Ba，拉苏普尔RJ，尹磊，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba腔内短链脂肪酸丁酸调节人结肠上皮细胞系中的NF-kappaB活性。gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba118gydF4y2Ba：gydF4y2Ba724gydF4y2Ba-34年。gydF4y2Ba
      OpenUrlgydF4y2Ba CrossRefgydF4y2Ba PubMedgydF4y2Ba 科学网gydF4y2Ba
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      Segain摩根大通gydF4y2Ba， raineard DLB, Bourreille A，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba丁酸盐通过抑制NFkappaB抑制炎症反应:对克罗恩病的意义gydF4y2Ba肠道gydF4y2Ba2000gydF4y2Ba；gydF4y2Ba47gydF4y2Ba：gydF4y2Ba397gydF4y2Ba-403年。gydF4y2Ba
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      格林MCgydF4y2BaPavli P, Van de PE，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba炎症性肠病粘膜中单核细胞CD14+群体的证据-发病机制的意义gydF4y2Ba临床试验免疫gydF4y2Ba1995gydF4y2Ba；gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba：gydF4y2Ba291gydF4y2Ba7所示。gydF4y2Ba
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      Asseman CgydF4y2Ba， Mauze S, Leach MW，gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba白介素10在抑制肠道炎症的调节性T细胞功能中的重要作用gydF4y2BaJ临床医学gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba190gydF4y2Ba：gydF4y2Ba995gydF4y2Ba-1004年。gydF4y2Ba
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      佛罗伦萨DFgydF4y2Ba兹洛尼克A，莫斯曼TR，gydF4y2Baet al。gydF4y2BaIL-10抑制激活的巨噬细胞产生细胞因子。gydF4y2BaJ ImmunolgydF4y2Ba1991gydF4y2Ba；gydF4y2Ba147gydF4y2Ba：gydF4y2Ba3815gydF4y2Ba-22年。gydF4y2Ba
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      麦克布莱德JMgydF4y2BaJung T, de Vries JE，gydF4y2Baet al。gydF4y2BaIL-10通过调节细胞表面分子改变DC功能，导致t细胞反应受损。gydF4y2Ba细胞ImmunolgydF4y2Ba2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba215gydF4y2Ba：gydF4y2Ba162gydF4y2Ba-72年。gydF4y2Ba
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