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摘要
背景:慢性乙醇摄入与上消化道癌的风险增加有关。由于乙醛似乎是一种与长期饮酒相关的致癌因素，具有醇脱氢酶(ADH) 1C*1等位基因的酗酒者似乎特别危险，因为该等位基因编码一种快速乙醇代谢酶，导致乙醛水平升高。最近的流行病学研究得出了相反的结果，因此我们只调查了重度酒精消费人群的ADH1C基因型。
方法:我们分析了107名患有上气消化道癌症的重度饮酒者的ADH1C基因型，以及103名年龄与未患癌症且饮酒量相近的酒精对照者的ADH1C基因型。利用基于白细胞DNA限制性片段长度多态性的聚合酶链反应对ADH1C位点进行基因分型。另外，21名ADH1C*1,1、ADH1C*1,2、ADH1C*2,2基因型健康志愿者口服乙醇(0.3 g/kg体重)，12名不同ADH基因型志愿者自由摄入乙醇(平均211 (29)g)，随后用气相色谱法或高效液相色谱法测定唾液乙醛浓度。
结果:ADH1C*1等位基因的等位基因频率在重度饮酒者的上气消化道癌患者中明显高于同龄无癌的酒精对照组(61.7%)v49.0%;p = 0.011)。所有癌症病例与所有酒精对照的未调整和调整的优势比分别为1.67和1.69。ADH1C*1等位基因纯合的健康志愿者在酒精摄入后唾液乙醛浓度高于ADH1C杂合的志愿者(p = 0.056)或ADH1C*2纯合的志愿者(p = 0.011)。
结论:这些数据表明，ADH1C*1等位基因纯合的重度饮酒者易患上气道癌，这可能是由于饮酒后唾液乙醛水平升高所致。
- 乙醇脱氢酶
- 上气性消化道癌
- 乙醛
- 唾液
- 抗利尿激素、酒精脱氢酶
- UADTC，上气性消化道癌
- ALDH,醛脱氢酶
- AA,乙醛
- 聚合酶链式反应
- HPLC，高效液相色谱法
- 济、2-diphenylacetyl-1 3-indandione-1-hydrazone
来自Altmetric.com的统计
- 抗利尿激素、酒精脱氢酶
- UADTC，上气性消化道癌
- ALDH,醛脱氢酶
- AA,乙醛
- 聚合酶链式反应
- HPLC，高效液相色谱法
- 济、2-diphenylacetyl-1 3-indandione-1-hydrazone
慢性过量饮酒是上气消化道癌(UADTC)发生的主要危险因素。1 -9由于大多数重度饮酒者吸烟，只有少数人(10-20%)患UADTC，10体质因素可能是导致一些酗酒者患上这些肿瘤的重要因素。
尽管乙醇相关的致癌机制尚不清楚，但越来越多的证据表明，乙醛(AA)而不是乙醇本身对酒精的共致癌效应负责。11AA在许多位点干扰DNA合成和修复，从而促进肿瘤的发展。11 -18它会导致某些基因的点突变，诱导姐妹染色单体交换，以及总的染色体畸变。19 -25AA还能诱导气管上皮的炎症和化生，18，26，27细胞周期进程的延迟，28刺激细胞凋亡,28以及与再生相关的细胞损伤增强。29 -31此外，当吸入时，它会引起鼻咽癌和喉癌。17日,18根据国际癌症研究机构，有足够的证据确定AA是动物的致癌物。32
AA主要由乙醇脱氢酶(ADH)产生，然后由醛脱氢酶(ALDH)进一步代谢为AA。33这两种酶都表现出遗传多态性，影响乙醇转化为AA和AA转化为醋酸酯的速率，从而影响体内AA的水平。33，34高比例的东方人具有ALDH2的非活性形式，其中突变等位基因ALDH2*2编码一个非活性亚基。当酶不活跃时，人体不能快速代谢AA，从而导致AA过量积累。在不活跃杂合子ALDH2*1,2血液的个体中35和唾液36AA浓度明显高于活性ALDH2*1,1组。事实上，研究表明，不活跃的ALDH2*2等位基因的频率在患有口腔、口咽、下咽、喉癌和食道癌的酗酒者中显著增加。37岁的38
由于在白种人中不存在ALDH2突变，ADH1C多态性的影响并不被掩盖。ADH1C*1等位基因编码的ADH酶将乙醇代谢成AA的速度比ADH1C*2等位基因编码的ADH酶快2.5倍。33尽管乙醇氧化主要发生在肝脏，抗利尿激素活性也存在于消化道粘膜。39岁,40有关ADH1C基因型和UADTC的研究结果相互矛盾。而一项来自法国的研究41患者人数相对较少，另一个在波多黎各进行，42法国的一项更大的研究报告了ADH1C*1等位基因频率与患UADTC的风险之间的正相关关系43以及来自北卡罗来纳州的病例对照研究44和德州45没有证实这些发现。必须强调的是，在所有这些流行病学研究中，对酒精摄入量广泛的个体进行了分析，主要使用访谈技术来量化酒精消费。
因此，我们首次调查了107例重度酒精消费和各种类型UADTC患者的ADH1C基因型和等位基因频率。研究人员将这些数据与年龄相仿的饮用类似量乙醇并患有其他酒精相关器官损伤(如肝硬化或胰腺炎)的患者进行了比较。此外，我们研究了ADH1C基因型对唾液AA水平的影响，因为已有研究表明，酒精摄入后ALDH 2不活跃的个体唾液AA浓度较高36是这些患者UADTC风险增加的原因。
方法
病人和控制
研究方案得到了曼海姆和海德堡大学医院伦理委员会的批准，所有患者都提供了书面知情同意。
对107名白种人的血清进行ADH1C基因分型，其中男性89例，平均年龄58(10)岁;18名女性，平均年龄60(12)岁)，在德国海德堡大学曼海姆耳鼻喉科医院接受UADTC治疗。表1列出了肿瘤部位、患者人数、性别、年龄、饮酒和吸烟习惯。饮酒史通过个人访谈获得。问题还包括酗酒的数量和持续时间。在麻醉前的多项选择问卷中完成数据的验证和完成。至于开放性问题，则采访了家庭成员。
年龄匹配的医院对照组包括39例活检证实为酒精性肝硬化、10年以上每日酒精摄入量超过100克的患者、38例酒精性胰腺炎患者和26例符合MS-III-R酒精依赖标准、无器官损伤的酒精依赖患者(表1)。46所有对照患者均从海德堡塞勒姆医学中心(海德堡大学)医学系招募。
在白种人中，ADH1C基因型对酒精性肝硬化的发展没有任何影响。47 -49
为了证明酒精对照组的ADH1C等位基因频率与一般人群相似，48名健康的不吸烟志愿者每周摄入酒精少于70克，另外对他们进行了基因分型。
ADH1C基因型测定
采用107例癌症患者血液样本进行限制性片段长度多态性分析。其中4例从肿瘤细胞中分离DNA, 56例从EDTA或柠檬酸处理过的全血白细胞中纯化DNA, 47例从染过的静脉血中提取DNA。从静脉血中分离出来的DNA吸在滤纸上，也用于所有对照。所有的测定都是一式两份。
从全血中提取DNA时，使用FTA卡作为血液载体(Life Technologies, Gibco BRL，佩斯利，英国)。在这些材料上，白细胞被溶解，核DNA被固定在纸的基质中。通过洗涤去除血红素和其他聚合酶链反应(PCR)扩增抑制剂。用Harris微型打孔机(Life Technologies, Gibco BRL)打孔三张2毫米厚的FTA纸，每张纸上都有干燥的血液样本。用300 μl FTA纯化试剂(Life Technologies, Gibco BRL)洗涤3次，用300 μl缓冲液(10 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)洗涤2次，然后在60°C干燥30分钟。
用PCR方法扩增ADH1C基因外显子8的多态部分50与特定的引物。51反应是在层流罩下的无DNA环境中通过使用抗气溶胶屏障尖端组装的。
为了确定ADH1C基因型，Groppi和同事描述了基于限制性片段长度多态性的方法51是使用。这是基于Ssp I酶切结合PCR定向突变的等位基因检测，这创造了一个新的Ssp I位点。引物321和351只允许ADH1C基因外显子8的扩增，并在检测区域外生成Ssp I识别序列AATATT作为内控。因此，可以区分具有两个片段(67和63 bp)的ADH1C*1等位基因，具有130 bp片段的ADH1C*2等位基因，以及它们可能的组合。
PCR产物(7 μl)与7.5 U Ssp I (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA)在Ssp I NEB缓冲液(50 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 10 mM MgCl)中混合2， 0.025% Triton X-100, pH 7.5)。限制性内切物在37℃下孵育40小时，孵育24小时后再加入5u Ssp I限制性内切酶。阴性和阳性对照的处理方法相同。用4% Metaphor琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts, Maine, USA)在1×TBE缓冲液(7 V/cm)中电泳分析与0.1体积的10×负载缓冲液混合的整个消化液体积60分钟。为了确定限制性片段的长度，使用了分子量标记V (Roche, Mannheim, Germany)。用溴化乙胺染色后，在Eagle Eye II设备(Stratagene, Amsterdam, Netherlands)的紫外线照射下拍摄照片。由独立调查员对两组样本进行两次基因分型，包括阳性(已知基因型的样本)和阴性对照(无DNA的PCR反应混合物，无DNA的限制性消化)。
给志愿者口服乙醇
根据上述方法筛选健康志愿者的ADH1C基因型。健康志愿者21例(男10例，女11例)，ADH1C*1,1 (n = 7;年龄38(8)岁)，ADH1C*1,2 (n = 7;年龄36(11)岁)，ADH1C*2,2 (n = 7;年龄34(8)岁，检测基因型。在研究前四周，没有人使用过任何药物或抗菌漱口水。研究人员要求所有参与者在研究开始前至少48小时内戒酒。在吃完标准早餐(包括一片涂有黄油和橘子酱的面包和一杯加牛奶和糖的咖啡)一小时后，将0.3克/公斤体重的乙醇口服给每名志愿者。52将乙醇稀释于橙汁中，浓度为5 g/100 ml，在2分钟内口服。在给药前15分钟，志愿者接受了口服杀菌剂，以减少从乙醇中产生乙醛的口腔细菌。53在摄入乙醇后，志愿者立即用水仔细漱口，以去除局部的乙醇。分别在摄入乙醇后0、10、20、40、60、100、130、160和240分钟采集血液(3ml)和唾液(3 - 5 ml)样本，用于测定AA。AA测定在体内实验结束后立即进行。
此外，12名健康的芬兰男性也参与了这项自由研究。年龄18 ~ 35岁，平均体重78 (4)kg。该部分研究得到赫尔辛基大学中心医院医学部伦理委员会的批准，并获得所有受试者的知情同意参与研究。所有的研究都在18:00开始，志愿者被允许在研究前两小时吃一顿清淡的晚餐。一种市售的石蜡口香糖(Orion Diagnostics, Espoo, Finland)被用来刺激唾液的产生。在基线唾液采集后，每位志愿者开始随意摄入标准的10% v/v无水乙醇橙汁溶液中的乙醇。为了去除局部乙醇，受试者用清水漱口三次。随后，唾液样本每30分钟采集一次，持续4小时。使用酒精计(Lion Laboratories, Barry, UK)采集唾液，同时测量呼吸乙醇水平，以监测全身乙醇浓度。
乙醛的决心
如前所述，在与2-二苯基乙酰-1,3-茚二酮-1-腙(DHI)形成加合物后，采用高效液相色谱法(HPLC)和荧光检测法测定血液和唾液中的AA浓度。53DHI 30 mg溶于100 ml乙腈-甲醇(80:20 v/v)中，37℃加热10分钟，4℃保存。取1.0 ml血液或唾液加入2.0 ml DHI试剂玻璃管中，盖上盖子，混合后加30 μl水。在冰上冷却5分钟后，混合物在室温下2800克离心10分钟。转移上清液，加入30 μl 5m HCl旋动。将小瓶加热到37°C 10分钟，然后在室温下保存20分钟。样品经0.45 μm过滤器过滤后，注入200 μl于HPLC柱(Hypersil-Mos (c6) 250×5 mm;Medchrom,德国)。同时绘制血和唾液中AA的校准曲线。
在芬兰的研究中，如前所述，唾液AA浓度是通过气相色谱法测定的。54
统计数据
不同组的等位基因频率用Fisher精确检验进行分析。用标准方法计算粗优势比。随后，在控制每日酒精消费(20-100克、101-150克、151-200克和>200克)、每日香烟消费(0、1-10、11-20、21-30、31-40和>40)、年龄和性别后，进行无条件logistic回归估计比值比。
方差分析和学生的t检测ADH1C基因型间唾液AA浓度的显著差异。使用皮尔逊相关系数评估可能的相关性。所有统计检验均为双面检验。
结果
患有UADTC和慢性过度饮酒的患者与同龄的无癌重度饮酒者相比，ADH1C*1等位基因频率显著升高(表2)。癌症患者中ADH1C*1等位基因频率升高在两名男性中均可见(60.7%)v52.9%;P = 0.20)和女性(66.7%)v41.7%;p = 0.016)。癌症患者ADH1C*1等位基因频率的增加是由于adh3 *1纯合子的增加。ADH1C*1等位基因频率在口腔癌和喉癌患者中最高。38%的口腔癌患者和37%的喉癌患者被发现ADH1C*1等位基因是纯合的，而分别只有6%和7%的ADH1C*2等位基因是纯合的。所有癌症病例与酒精对照的相关粗优势比为1.67(95%置信区间(CI) 1.13-2.47)。在控制了其他风险因素(包括饮酒、吸烟、年龄和性别)后，出现了类似的关联(优势比1.69 (95% CI 1.12-2.56)。ADH1C基因型在健康对照组和非癌症重度饮酒患者之间无差异。健康对照组的ADH1C*1等位基因频率为50%。无器官损伤的酗酒者、酒精性肝硬化和酒精性胰腺炎患者在ADH1C基因型方面没有差异。
酒精摄入和吸烟习惯在所有酒精患者中都是过量的，无论他们是否患有癌症。虽然每天饮酒超过100 g的癌症患者与每天饮酒20-50 g的癌症患者相比，ADH1C*1等位基因的纯合度(39.2%)似乎更高(28.5%)，但未发现饮酒量与ADH1C基因型之间存在显著相关性(表3)。
在德国和芬兰志愿者中，唾液AA浓度显著受ADH1C基因型的调节。ADH1C*1等位基因纯合子的德国志愿者唾液中AA浓度显著高于ADH1C杂合子和ADH1C*2纯合子的志愿者(图1)。当比较ADH1C杂合子和ADH1C*2纯合子志愿者唾液中AA浓度时，未检测到显著差异。
酒精脱氢酶1C (ADH1C)多态性对口服乙醇(0.3 g/kg体重)后唾液乙醛浓度的影响ADH1C*1,2和ADH1C*2,2的被试唾液乙醛浓度无显著差异。对比乙醛浓度-时间曲线下面积，ADH1C*1,1组乙醛浓度高于ADH1C*1,2组和ADH1C*2,2组(p = 0.056和p = 0.011)。40分钟后测定的乙醛浓度峰值也有显著差异(p = 0.033和p = 0.017)。值为平均值(SD)。
血液AA浓度和血浆乙醇浓度在不同研究组之间均未发现显著差异(数据未显示)。值得注意的是，0.3 g/体重的乙醇剂量导致血浆乙醇浓度不超过30 mg/100 ml。
ADH1C基因分型显示，4例芬兰受试者ADH1C*1等位基因为纯合(ADH1C*1,1)， 6例为杂合(ADH1C*1,2)，其余2例为纯合(ADH1C*2,2)。这三组在性别、年龄、平均体重、吸烟习惯或饮酒方面没有显著差异。
所有组在4小时内的无水酒精平均摄入量为211 (29)g。唾液AA与乙醇水平之间存在显著(p<0.001)相关性，其中ADH1C*1,1基因型的受试者产生的唾液AA明显多于其他基因型的受试者(图2)。不同组的曲线斜率分别为:2.06 (ADH1C*1,1)， 0.95 (ADH1C*1,2)和1.01 (ADH1C*2,2)。
自由摄入酒精后不同酒精脱氢酶1C (ADH1C)基因型唾液乙醛与乙醇的相关性（r=皮尔逊相关系数)。ADH1C*1,1的受试者唾液乙醛浓度高于ADH1C*1,2和ADH1C*2,2的受试者。
讨论
本研究结果表明，ADH1C*1等位基因纯合的重度酒精消费人群发生酒精相关UADTC的风险增加。与其他调查ADH1C基因型对UADTC风险影响的研究相比，我们首次比较了患有癌症和没有癌症的重度饮酒者。我们的发现与Harty和同事的报告一致42以及Coutelle和同事们。41哈蒂的流行病学研究等是在波多黎各进行的，这是世界上口腔癌发病率最高的国家。因此，除ADH1C基因型外的其他因素可能调节乙醇相关的口腔癌和咽喉癌，如酒精饮料的类型和污染物或额外的饮食习惯。然而，值得注意的是，与我们的研究相比，ADH1C*1,1基因型在口腔肿瘤中的相关风险比在咽喉癌中更大。来自法国的数据虽然数量有限，但也类似。在一项39名受试者的病例对照研究中，发现携带ADH1C*1,1等位基因的个体发生口咽癌和喉癌的风险分别高出2.6倍和6.1倍。同样，在我们的研究中，我们发现喉部的这种风险高于咽部。
相比之下，其他研究并没有证实携带ADH1C*1等位基因的重度饮酒者患UADTC的风险会增加。43 -45在布查迪和同事的研究中，43121例口腔癌患者和129例喉癌患者与172例对照组进行比较。然而，在他们的对照组中，ADH1C*1的等位基因频率远远高于我们的研究，几乎与我们在癌症患者中观察到的ADH1C*1等位基因频率相似。事实上，据报道，欧洲人ADH1C基因型的地理变异在法国南部有惊人的高ADH1C*1等位基因频率47布查第的研究在哪里等是执行。因此，在这样的人群中，ADH1C*1等位基因对酒精相关致癌的影响尤其难以确定。
对于奥尔山及其同事的研究来说，这可能也是正确的44在北卡罗莱纳进行，并对斯特吉斯和同事进行了研究45在德克萨斯州实施。在北卡罗来纳的研究中，患者的种族没有具体说明，但似乎是混合人群调查，因为讲西班牙语的患者已经纳入了方案。在两项研究中，ADH1C*1等位基因频率在UADTC患者中相对较高(分别为62%和57.4%)。
随后，在此背景下应该提到的是弗罗伊登海姆及其同事的一项研究55研究了ADH1C基因型对患乳腺癌风险的影响，他们的初步数据支持这样一个假设，即ADH1C*1等位基因也是女性乳腺癌的一个相当大的风险因素，特别是当酒精摄入很高时，就像我们的研究一样。
体外动力学研究表明，ADH1C*1等位基因编码的酶代谢乙醇的速度比ADH1C*2等位基因编码的酶快2.5倍。33因此，有ADH1C*1等位基因的个体在长期饮酒时AA水平可能会增加。AA是一种众所周知的诱变剂和致癌物。AA作为酒精相关致癌的一个重要因素及其通过一种重要的AA代谢酶的突变调节的支持证据来自亚洲。40%的亚洲人都有ALDH2基因突变。这些人不能充分地将AA代谢为醋酸盐，因此AA积累，随后导致器官毒性，56包括UADTC的发展。37岁的38最近观察到，在酒精摄入后，ALDH2不活跃的个体唾液中AA浓度增加，这可能有助于阐明在与唾液直接接触的部位发生这些肿瘤的风险增加。36
我们在此报告ADH1C的类似观察结果。ADH1C*1,1基因型个体唾液中AA浓度的增加可能直接影响上气相消化道的癌变，可能是其肿瘤风险增加的原因之一。与σ-ADH相反，γ-ADH在口腔黏膜中不表达39因此，唾液AA水平的变化不能用ADH1C引起的乙醇粘膜代谢的变化来解释。由于ADH1C基因型不影响血液中AA的浓度，唾液中发现的部分AA可能在唾液腺中产生，就像缺乏ALDH2的亚洲人一样。36岁,57确实，有证据表明唾液腺在UADTC中起着关键作用。已有研究表明，由于慢性乙醇摄入，口腔黏膜的再生变化与在啮齿类动物中观察到的慢性AA给药相似29涎腺切除术后可完全消除。58
然而，AA也可以由口腔细菌或酵母产生。53岁,59 -62研究表明，这些细菌的数量和类型受口腔卫生的影响60和吸烟习惯。61不良的口腔卫生和大量吸烟是UADTC发展的危险因素。
需要强调的是，ALDH2突变没有出现在我们的高加索人群中，ADH1B*2的等位基因频率在我们的人群中极低(1.2%)，ADH1B*2是另一个编码乙醇快速代谢ADH酶的等位基因。47因此，我们的数据不太可能受到这两种酶的影响，这两种酶本身可能负责调节AA水平。我们的研究是在年龄匹配的酒精对照和酒精相关的器官损伤中进行的，因为在白种人中没有检测到ADH1C多态性对酒精或酒精性肝硬化的发展有影响。47这些组与健康对照组ADH1C基因型相似。47需要注意的是，ADH1C*1,1基因型只是增加重度饮酒者患UADTC风险的因素之一。过量和长期饮酒本身、饮用高浓度酒精饮料、吸烟、某些饮食成分和食物制备类型以及口腔卫生不良是与UADTC高风险相关的其他因素。
总之，ADH1C*1,1基因型似乎大大增加了重度饮酒者患UADTC的风险，尤其是口腔癌和喉癌。这种风险似乎是由于饮酒后ADH1C*1,1基因型个体唾液中AA浓度升高所致。这些数据为AA的致癌性提供了进一步的证据，对人类也是如此。
致谢
作者感谢位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室(EMBL)基因组学核心设施Vladimir Benes和Wilhelm Ansorge博士提供了他们特定的实验室设施。该研究得到了德中医学协会和大众汽车基金会给予J Li的资助。
参考文献
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