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背景和目的:最近的研究表明,肝干细胞在骨髓可以分化成成熟的肝细胞,这表明骨髓细胞可以用于替代受损的肝细胞在各种肝脏疾病。肝细胞癌(HCC)被认为起源于肝干细胞。在这项研究中,我们研究了肝干细胞的恶性潜能来源于骨髓的小鼠模型化学hepatocarcinogenesis。
方法:骨髓细胞从男性获得β-galactosidase(β-gal)转基因小鼠和移植到雌性受体小鼠。Hepatocarcinogenesis诱导了一年的治疗与diethylnitrosamine和苯巴比妥(NDEA / PB)。一年后,肝脏被从每个处理鼠标和评估由半乳糖苷染色、免疫组织化学和荧光原位杂交(鱼)。
结果:百分之四十的受体小鼠存活和发展多个肝癌。偶尔发现了集群β-gal积极的成熟肝细胞在整个肝脏NDEA / PB对老鼠进行了骨髓移植(BMT)虽然没有发现这样的肝细胞在肝脏BMT老鼠不接受NDEA / PB。Y染色体检测具有相同频率的捐赠者的男性肝集群β-gal积极成熟肝细胞的鱼。然而,没有阳性肝癌β-gal或Y染色体。免疫组织化学,β-gal积极成熟肝细胞不表达CD34或α-fetoprotein。
结论:我们的研究结果表明,肝干细胞来源于骨髓恶性潜力较低,至少在我们的模型中。
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- 据法新社,α-fetoprotein
- β-gal,β-galactosidase
- BMT,骨髓移植
- 鱼,荧光原位杂交
- 肝癌,肝细胞癌
- NDEA / PB, diethylnitrosamine /苯巴比妥
- 他走时,haematoxylin-eosin
来自Altmetric.com的统计
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尽管高危患者肝细胞癌(HCC)是定义良好的临床,hepatocarcinogenesis不是很好理解的过程。1,2B或C型肝炎病毒可以引起慢性肝炎,可能导致肝硬化和肝癌,而这些病毒感染患者中最常见的肝癌患者。3然而,病毒感染的后果的过程中hepatocarcinogenesis并不清楚。在这方面,原始细胞发展成肝细胞癌的癌细胞讨论。4两个细胞谱系视为候选人:第一个是肝干细胞,第二个是成熟的肝细胞。然而,没有明确证据细胞直接参与肝细胞癌的发展。5,6
广泛的研究一直在进行肝干细胞,但结果是有争议的。描述了几个候选人肝干细胞在啮齿动物实验模型(包括椭圆形细胞、肝上皮细胞和小肝细胞)。7 -9先前的研究表明,骨髓细胞可以分化成椭圆形细胞在啮齿动物和类似的过程可能发生在人类身上。10 -12如果这种情况下是正确的,孤立的肝干细胞从骨髓细胞可能是一个有价值的战略未来发生故障损坏或hapatocytes的替代疗法。10然而,肝干细胞的安全性和有效性来自骨髓细胞前应该充分证实任何此类疗法在人类身上进行测试。
为了评估肝干细胞,在目前的研究中我们调查肝干细胞的恶性潜能来源于骨髓体内。识别肝干细胞,骨髓细胞的β-galactosidase(β-gal)转基因雄性小鼠移植到受体雌性老鼠。骨髓移植(BMT)后,肝癌是接受者通过化学诱导hepatocarcinogenic化合物和β-gal和HCC的Y染色体进行评估。
材料和方法
骨髓移植
六周大男性b6 - 129 s - gtrosa和女性b6 - 129 - f2老鼠从杰克逊实验室购买(美国缅因州酒吧里面)。b6 - 129 s - gtrosa老鼠表达转基因β-gal整个身体和b6 - 129 - f2老鼠的亲代菌株b6 - 129 s - gtrosa。13按照机构的指导方针,进行了动物实验和研究是长崎大学的伦理委员会批准。BMT进行报道。14短暂,大腿被撤一个死去的男性b6 - 129 s - gtrosa和骨髓细胞被收获,悬浮在磷酸缓冲盐的密度1×107细胞/毫升。女性b6 - 129 - f2老鼠辐照亚致死的5×106上面的骨髓细胞通过尾静脉注射。确认成功的移植供者骨髓细胞,收件人骨髓细胞的样本是来自b6 - 129 - f2老鼠后牺牲和半乳糖苷染色检查。
化学诱导hepatocarcinogenesis
BMT诱发肝癌,两周后,80 mg / l diethylnitrosamine (NDEA;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到饮用水b6 - 129 - f2受体小鼠的六周启动hepatocarcinogenesis的过程。其次是管理700 mg / l苯巴比妥(PB);Wako、东京、日本)作为肿瘤促进剂,直到牺牲。十非移植小鼠骨髓移植和10个每个处理NDEA / PB,和四只老鼠进行BMT但不是NDEA / PB治疗和四只老鼠没有接受治疗的人保持在相同的条件下,控制。
半乳糖苷染色
NDEA开始一年后,老鼠幸存者是牺牲和肝脏和骨髓收获。肝脏在10%福尔马林固定24小时,石蜡包埋。同时,新鲜冷冻部分也准备好了。执行常规组织学与haematoxylin-eosin(圆))染色的福尔马林固定、石蜡包埋和新鲜冷冻的部分。确定骨髓衍生肝细胞标本,每个第五张幻灯片5μm厚串行部分(总125幻灯片)彩色半乳糖苷。半乳糖苷染色工具包(基因治疗系统,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)是使用新鲜冷冻的部分肝脏从每组根据制造商提供的说明。
免疫组织化学
免疫组织化学进行了使用antimouse CD34或antimouseα-fetoprotein(法新社)抗体作为主要抗体。组织样本的新鲜冷冻肝脏部分被切成5μm厚部分和安装在aminopropyltriethoxysilane镀膜玻璃幻灯片。streptavidin-biotin方法(Histofine染色设备;Nichirei公司,日本东京)是用于免疫组织化学检测,如前所述。15半乳糖苷与苏木精复染色和免疫组织化学治疗幻灯片。积极数字集群或细胞染色在每一节数和平均每个样本(SD)值计算。
荧光原位杂交
因为执行BMT男性供体老鼠女性受体小鼠,移植骨髓衍生的细胞可以确认收件人的细胞核的Y染色体。因此,荧光原位杂交(FISH)对鼠标进行Y染色体检测移植骨髓衍生细胞。肝脏标本新鲜冷冻部分是使用预处理试剂预处理设备(Vysis,,伊利诺斯州,美国)根据制造商提供的说明,和鼠标Y染色体杂交探针(:,剑桥,英国)。幻灯片在荧光显微镜下观察治疗。
结果
半乳糖苷染色供体老鼠和鱼
在这项研究中,我们使用了男性b6 - 129 s - gtrosa鼠标作为一个捐助者。据报道之前,这只老鼠表达β-gal整个身体。13为了证实这一点,我们执行半乳糖苷Y染色体的染色和鱼肝脏。肝细胞都为半乳糖苷阳性染色(图1)和98%的骨髓细胞半乳糖苷染色(数据没有显示)。鱼显示28%的肝细胞细胞核阳性的Y染色体(图1 b)。积极的鱼信号中检测出细胞核由复染色证实与DAPI(图1 b,插图)。此外,没有核显示两个或两个以上的信号。
半乳糖苷染色和荧光原位杂交(FISH)的Y染色体在肝脏供体老鼠。确认β-galactosidase的表情和状态的Y染色体供体老鼠,半乳糖苷进行染色和鱼。(一)半乳糖苷染色(放大×100)。(B)鱼的Y染色体(放大×100)。插图;高放大倍数的鱼与对比染色DAPI(放大×400)。
存活率
我们第一次评估小鼠的存活率进行BMT和/或NDEA / PB治疗(表1)。所有(100%,4/4)控制老鼠和老鼠进行BMT只在研究结束时还活着。然而,只有五10(50%)小鼠NDEA / PB治疗组没有进行BMT还活着的最后一年研究期间。老鼠的存活率受到BMT和NDEA / PB治疗最低(4/10的老鼠,40%)。
骨髓移植
证实骨髓替代β-gal基因转导细胞,骨髓细胞来源于每一组受体小鼠受到半乳糖苷染色(图2 a、2 b)。红细胞被小心的显微观察,只有排除核细胞检查。没有半乳糖苷彩色骨髓核细胞在小鼠中发现,没有收到BMT。相比之下,91 - 95%的骨髓细胞在小鼠半乳糖苷彩色收到BMT有或没有NDEA / PB治疗(表1)。这些结果显示成功BMT在这项研究中。
半乳糖苷染色小鼠骨髓细胞和肝细胞癌的发展,接受骨髓移植(BMT)和diethylnitrosamine /苯巴比妥(NDEA / PB)治疗。一年后开始治疗,骨髓细胞从每个鼠标和沾半乳糖苷被移除。β-Gal阳性细胞显示为蓝色染色细胞。代表照片所示。(一)骨髓细胞来源于一个摘要控制鼠标。(B) BMT和NDEA / PB治疗老鼠。(C)肝脏从摘要控制鼠标。(D) BMT和NDEA / PB治疗小鼠(放大A和B×200)。
受体小鼠的肝脏组织病理学分析
NDEA / PB治疗导致多个宏观的外观在肝脏肿瘤治疗一年后BMT和non-BMT老鼠(图2 c, d)。)这些肿瘤的彩色部分证实了他们是肝细胞癌(见图6),基于前面定义的标准。16没有其他类型的肝脏肿瘤,如肝母细胞癌或cholangiocellular癌,一被发现在我们的实验。除了肝癌,变性肝细胞丰富,椭圆形细胞,囊肿,观察胆管增生NDEA / PB治疗小鼠相比,控制肝脏。
半乳糖苷的表型分析染色、免疫组织化学和鱼
在初步研究中,我们牺牲了两个BMT老鼠和肝脏样本NDEA / PB治疗前删除。在这些样本,β-gal积极肝细胞没有确定(数据未显示)。此外,未发现β-gal积极成熟的肝细胞在肝脏BMT老鼠不接受NDEA / PB BMT后一年除了血血管细胞(图3)。然而,半乳糖苷染色的新鲜冷冻四个BMT小鼠肝脏样本处理NDEA / PB显示零星的集群β-gal积极的成熟肝细胞(图4,4 b)。这些集群的数量在四只老鼠是平均0.18(标准差0.10)在53个(15)毫米2部分(0.34(0.10)集群/厘米2n = 125幻灯片)。此外,17(4.2)肝细胞出现在一个集群的直径。免疫组织化学分析表明,β-gal积极成熟的肝细胞负染色CD34和法新社(图5)。此外,鱼显示β-gal积极成熟的肝细胞阳性的Y染色体相同频率的肝脏供体雄性老鼠(26%,图4 c)。然而,没有半乳糖苷阳性染色或鱼肝细胞癌的Y染色体(图6,n = 10肿瘤)。
Haematoxylin-eosin())和半乳糖苷染色肝段获得从一只老鼠进行了骨髓移植(BMT)但不是diethylnitrosamine /苯巴比妥治疗。BMT一年后,鼠标是牺牲和肝脏切除和染色,如材料和所述方法。(一))染色。(B)半乳糖苷染色(放大×100)。
外观β-galactosidase(β-gal)阳性细胞集群和确认的Y染色体。(A)数字集群β-gal阳性细胞数在每个半乳糖苷彩色幻灯片检查在低放大率(×40)。(B)代表β-gal阳性细胞集群在高放大倍数下的照片(×100)。(C)荧光原位杂交(FISH)执行中描述的材料和方法来证实细胞起源(放大×100)。
免疫组织化学分析β-galactosidase集群(β-gal)阳性细胞在骨髓移植和diethylnitrosamine /苯巴比妥治疗老鼠。β-gal积极集群的表型是由免疫染色。(一)Haematoxylin-eosin(圆))染色。(B)半乳糖苷染色。(D)疣状antimouse CD34抗体。(C) Antimouseα-fetoprotein(法新社)(放大×100)。
肿瘤的组织病理学分析和半乳糖苷染色。引起的肝细胞癌(HCC)是一年的治疗diethylnitrosamine /苯巴比妥(NDEA / PB)中描述的材料和方法。提取肝脏组织病理学观察显微镜下(×100)。(A)代表的照片haematoxylin-eosin(圆))染色肝部分从骨髓移植和NDEA / PB获得治疗的老鼠。T,肝细胞癌肿瘤;N,相邻的正常肝组织。(B)半乳糖苷连续切片没有任何对比染色的染色。β-Galactosidase阳性细胞显示为蓝色染色细胞(×100)。(C)荧光原位杂交(FISH)的连续切片(放大×100)。
讨论
肝脏是归类为有条件地重新组织和正常情况下几乎所有的肝细胞增殖静止,只有0.3 - -0.5%的细胞显示活跃的细胞分裂。17在正常生理条件下,不需要肝干细胞,他们只有成为明显的需求(例如,在环境与严重的肝肝损伤和同时代的受损肝细胞分裂)。先前的研究表明,椭圆形细胞,这被认为是肝干细胞,化学诱导肝损伤后出现。18尽管椭圆形细胞明显出现在这样的条件下,其精确的起源和存在在正常情况下仍不清楚。最近的研究报道,骨髓细胞可以分化成椭圆形细胞。12日,19这一发现表明不仅椭圆形细胞的起源还体内标签的可行性,至少在某种程度上,椭圆形细胞。
在这项研究中,我们通过β-gal染色标记骨髓细胞。肝细胞都是阳性β-gal捐赠老鼠。同时,灵敏度Y染色体的鱼几乎是一样的报道11日,12虽然这对供体细胞的检测灵敏度不足。因此我们相信,我们的方法来跟踪供体小鼠的骨髓细胞可以接受目前的研究。BMT后,集群β-gal阳性细胞仅出现在BMT小鼠接受NDEA / PB和不在BMT的小鼠没有收到NDEA / PB。这些结果表明,在我们的模型中,骨髓细胞在有限的条件下可以分化为成熟肝细胞。骨髓衍生肝干细胞似乎并不需要正常肝细胞替换。此外,所有肝干细胞来源于骨髓细胞可能没有被这种方法和预先存在的标签,而肝干细胞的起源尚不清楚,可能存在于肝脏。据报道,某一特定组织的干细胞可以分化成另一个组织。20.21干细胞网络可能存在于整个身体和组织涉及对方变体。最近,一些研究人员报道,细胞融合肝谱系细胞和骨髓细胞是骨髓衍生肝细胞的来源在华氏温标−−/小鼠模型。22日,23然而,其他研究已经表明,这样的融合并不总是扮演一个角色在造血的上皮细胞移植。24因此,细胞融合可能发生在特定条件下,如在华氏温标−−/小鼠模型。25事实上,在目前的研究中,我们发现,在β-gal积极的肝细胞,没有核两个或两个以上的Y染色体鱼。这一发现表明,分化转移,而不是细胞融合,是主要的过程在我们的模型中。
在这项研究中,我们的兴趣是专注于肝癌的原始细胞谱系。两个主要的假设(“干细胞理论”和“hepatocytic理论”)已经被讨论了近20年。6,26日,27争论集中在在发育异常的肝细胞结节是否负责hcc去分化和增殖的过程,还是椭圆形细胞分化后恶性变化的首要目标是“块”,提出了一些动物模型。5,28hepatocarcinogenesis椭圆形细胞参与的可能性是基于以下几点:(1)大量存在的椭圆形细胞在动物啮齿动物hepatocarcinogenic模型29日;(2)肝细胞癌的发展经过转换的椭圆形细胞30.31日;(3)发生的混合肝细胞和cholangiocarcinomatous肿瘤(椭圆形细胞表现出双电位的发育能力)。32岁的33然而,椭圆形细胞和癌症之间的关系只是间接的。在这项研究中,没有β-gal阳性肝癌,和所有β-gal阳性细胞集群是椭圆形细胞或成熟肝细胞的牺牲,即使长期致癌的感应。这些结果让干细胞理论的排斥和接受hepatocarcinogenesis hepatocytic理论。然而,正如所有肝干细胞可能没有被我们的方法标记,正如上面提到的,我们不能完全排除干细胞理论。虽然我们的研究结果可能有限BMT老鼠NDEA / PB,对待我们可以状态,肝干细胞的恶性潜能来源于骨髓似乎很低。高危患者肝细胞癌在临床设置,明确和病毒性肝炎和/或相关的肝硬化是最关键的因素。3,34我们选择NDEA / PB模型在目前的研究中,因为它是一个有用的模型引起的人类hepatocarcinogenesis病毒性肝炎病毒性肝炎中硝酸盐和亚硝胺合成增加。35岁,36还需要进一步的研究来阐明骨髓细胞的精确交互与肝再生和使用其他动物模型或人类致癌研究。
肝移植已经介绍了治疗慢性或急性肝衰竭患者和先天性或恶性肝脏疾病,和一个大比例的患者此前据报道,从这个过程中受益。37然而,与肝移植存在一些问题,包括捐助者的短缺。38基于细胞治疗正在开发更换损坏或发生故障的肝细胞。39骨髓细胞可能被用于基于细胞替代治疗或基因传递系统。在这种情况下,我们的研究结果表明,干细胞疗法是安全的。
确认
我们感谢Drs Tomoya Nishino和Masanobu宫崎骏的第二个内科,长崎大学医学院BMT技术建议。我们感谢Tomomi休假和洋子Iwasaki娴熟的技术援助。