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摘要
背景:胰高血糖素样肽2 (GLP-2)是一种肠道营养介质，在肠功能受损的情况下具有治疗潜力。然而，肠系统的生长刺激可能会加速肠内现有肿瘤的生长。
目的:在本研究中，研究了GLP-2处理对化学诱导结肠肿瘤生长的影响。
方法:在210只雌性C57bl小鼠中，首先用甲基化致癌物1,2-二甲基肼(DMH)诱导结肠肿瘤，然后用GLP-2治疗小鼠。在停止致癌物治疗的两个月后，135只小鼠被分配到六组中的一组，每组每天用25 μg GLP-2、25 μg Gly2-GLP-2(稳定的类似物)或磷酸盐缓冲盐水治疗两次，疗程短(10天)或长(一个月)。剩下的75只老鼠有3个月的免费治疗期，然后被分配到长期治疗组，如上所述。
结果:无论治疗方法如何，100%的小鼠出现结肠息肉。生存数据显示，不同组之间没有统计学上的显著差异，但组织病理学分析显示，使用Gly2-GLP-2治疗的小鼠肿瘤负荷明显增加。原生GLP-2的促瘤作用不明显，但长期治疗后小息肉数量增加。
结论:目前的结果清楚地表明，GLP-2促进粘膜肿瘤的生长。我们的研究结果强调了未来需要对GLP-2在需要长时间治疗或胃肠道癌症易感性增加的情况下的影响进行研究。
- 胰高血糖素样肽2
- DMH 1 2-dimethylhydrazine
- PBS，磷酸盐缓冲盐水
- 肠道致癌作用
- 1, 2-dimethylhydrazine
- glucagon-like肽2
- 老鼠
来自Altmetric.com的统计
越来越多的证据表明，33个氨基酸肽胰高血糖素样肽2 (GLP-2)在肠道中作为粘膜增殖的中介作用。1 -4GLP-2与肠道内分泌L细胞的GLP-1共同分泌，腔内营养物质的存在是分泌的主要刺激。4 -8GLP-2受体定位于肠道和下丘脑，GLP-2已被证明在这些组织中发挥作用。9 -12除了调节粘膜生长外，GLP-2还能提高几种吸收酶的活性，并调节回肠制动效应，表明其生理意义可能是确保最佳的肠道吸收。2，13 -16
由于这些器官的特异性作用得到了一些肠道疾病实验动物模型研究的支持，已经有人提出GLP-2的治疗作用。7，8，17，18最近，观察到GLP-2治疗的功能性短肠综合征患者的临床改善。8这一发现，连同GLP-2的实验数据，无疑将导致更多的临床研究。然而，GLP-2的潜在副作用还没有引起足够的重视。特别是，研究GLP-2对肠道癌变的影响将是相关的。因此，有研究表明，炎症性肠病患者可能受益于GLP-2治疗。18然而，这类患者被认为有更高的肠癌风险，而GLP-2可能会进一步增加这种风险。因此，我们在已经建立的1,2-二甲基肼(DMH)结肠癌小鼠模型中研究了GLP-2潜在的肿瘤生长促进活性，该模型的临床和病理特征与在人类观察到的相似。19日,20.在反复暴露于甲基化致癌物DMH诱导肿瘤后，小鼠接受原生GLP-2或Gly2-GLP-2(一种代谢稳定的类似物)治疗，时间或长或短。然后检查结直肠肿瘤的发生率。
材料和方法
动物
动物研究得到了丹麦国家动物研究委员会的批准。从Panum研究所(哥本哈根大学，哥本哈根，丹麦)获得210只雌性C57bl小鼠，体重约为18-20克(8周龄)。在水和食物的实验过程中(No 1314;Altromin, Lage, Germany)在温度(21°C)和湿度(55%)控制的12小时明暗循环的动物设施中自由使用。
实验的程序
适应两周后，小鼠被分配到皮下注射DMH (Sigma Chemical Co.， St Louis, Missouri, USA)的时间表。小鼠每7天给予每公斤体重20毫克DMH的周剂量，持续12周。每周用0.001 M EDTA新配制DMH溶液，并用碳酸氢钠缓冲至pH为6.5。在之前的一项使用DMH致癌模型的研究中，使用了不同的免费治疗间隔时间。21基于这些经验，我们选择将小鼠分为两组，无治疗间隔时间为2个月(2MO)或3个月(3MO)。2MO无治疗期组的小鼠被随机分为6个亚组之一，3MO组的小鼠被随机分为3个亚组。这些亚组的处理如图1所示。分别选择10天和1个月的治疗期来研究急性和慢性疗效。所有治疗包括每日两次皮下注射25 μg GLP-2(1-33)(由Lars Thim, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark慷慨提供)，25 μg Gly2-GLP-2 (Pepceuticals Ltd, Leicester, UK)或磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照组)，所有剂量均为100 μl每次注射。这些剂量是基于以往对多肽的肠道营养特性的研究。22gl2 -GLP-2是GLP-2的一个代谢稳定的类似物，在2号位置发生了丙氨酸→甘氨酸取代。
研究设计时间表示意图，根据最后一次注射1,2-二甲基肼后的无治疗间隔时间，将动物分成主要组。然后将小鼠分成不同疗程的亚组，每日注射25 μg天然胰高血糖素样肽2 (GLP-2)、25 μg Gly2-GLP-2或磷酸盐缓冲生理盐水(对照组)。
在实验过程中，每周观察动物结肠肿瘤的证据(即血粪、直肠脱垂或恶病质)(表1)。
出现血性粪便、直肠脱垂或恶病质的小鼠的百分比(可由进行性体重减轻(与初始体重相比下降30%)和肌肉消瘦迹象证明)。用1,2-二甲基肼诱导结肠肿瘤，然后小鼠进行无治疗期，然后每天用天然胰高血糖素样肽2 (GLP-2)、Gly2-GLP-2或磷酸盐缓冲盐水治疗(对照组)。
尸体解剖时，小鼠用CO进行献祭2，用4%多聚甲醛填充结肠和直肠并取出。然后在结肠的反肠系膜部位纵向切开，安装在聚乙烯板上，并进一步固定24小时。然后用水冲洗标本，用阿利新绿3BX染色作为整个标本。23染色后，用自来水冲洗，并储存在70%乙醇中。浸泡在乙醇中的结肠表面，用Wild照片显微镜进行研究和拍照。肿瘤的数量和大小的测定是用盲法进行的，研究人员不知道组织样本的来源。肿瘤根据大小进行分类:小的<0.5 mm;中0.5 - -1.0毫米;和大>1.0毫米(最大直径)。在宏观评分后，从一些肿瘤(大多数疑似癌症)上切下组织切片进行组织学评估。组织样品脱水后石蜡包埋，用切片机切成10 μm切片。切片用PAS苏木精染色，用盲法进行组织学检查。在210只小鼠中，有13只在注射DMH后的不同时间间隔死亡。 They were found dead in their cages, and postmortem necrosis hampered inspection of the colonic mucosa.
统计数据
结果显示为平均值(SEM)。数据分析采用方差分析，事后分析采用Fisher的保护最小显著性差异检验。p<0.05的概率值被认为是显著的。
结果
存活率和体重
在DMH注射期间，最后一次注射DMH与第一次注射GLP-2(1-33)、Gly2-GLP-2或PBS(数据未显示)中间期两个月(2MO)或三个月(3MO)组的平均体重或周增重分别无显著差异。在研究结束时，Gly2-GLP-2治疗组(3MO)小鼠的生存率低于其他组，但组间差异无统计学意义(表2)。只有对照组(2MO，治疗一个月)的初始体重和最终体重存在差异(表2)。与对照组和GLP-2治疗组相比，gl2 -GLP-2治疗1个月组(3MO)小鼠最终体重增加(表2)。
携带肿瘤动物的体重和比例。用1,2-二甲基肼诱导结肠肿瘤，然后小鼠进行无治疗期，然后每天用天然胰高血糖素样肽2 (GLP-2)、Gly2-GLP-2或磷酸盐缓冲盐水治疗(对照组)。
肠道的重量
使用天然GLP-2治疗10天或1个月可增加小肠的绝对重量(数据未显示)和与最终体重相关的重量(图2A)。在Gly2-GLP-2治疗组，小鼠的绝对小肠重量和相对小肠重量均高于原生GLP-2治疗组。在接受GLP-2治疗10天或1个月后，结肠的相对重量没有增加(图2B)。然而，所有接受Gly2-GLP-2治疗的组都增加了结肠重量，包括相对于最终体重表达的重量。
(A)在1,2-二甲基肼(DMH)诱导的结肠肿瘤小鼠中，然后用天然胰高血糖素样肽2 (GLP-2)、Gly2-GLP-2或磷酸盐缓冲生理盐水(对照组)治疗的小鼠中，小肠和(B)大肠重量占最终体重的百分比。小鼠在DMH后进行两到三个月的免治疗期，然后开始每天治疗10天或一个月。* * p < 0.01与控制;†与天然GLP-2相比p<0.05。
肠道肿瘤
100%的小鼠出现结肠息肉(表2)。
肿瘤为无梗斑块或息肉样病变，大小从0.1到5mm(最大直径)不等。与对照组和GLP-2治疗组相比，在两个系列中使用Gly2-GLP-2治疗一个月导致所有类别息肉的数量增加(图3A, 3B)。在经过3MO免治疗期后使用Gly2-GLP-2治疗的组中，小肿瘤的数量非常高，肿瘤通常或多或少地融合在一起，这使得无法计算不同肿瘤的确切数量。使用本地GLP-2治疗在很大程度上没有影响大或中型息肉的数量，但在使用本地GLP-2治疗一个月(2MO)的小鼠中，小息肉的数量增加了(图3C)。与对照组相比，使用天然GLP-2 (3MO)治疗的小鼠也出现了更多的小息肉。
(A)结肠内大(最大直径>1.0 mm)， (B)中(最大直径0.5 - 1.0 mm)和(C)小(最大直径<0.5 mm)息肉的发生率。用1,2-二甲基肼诱导结肠肿瘤，然后小鼠进行2- 3个月的无治疗间隔，然后每天用天然胰高血糖素样肽2 (GLP-2)、Gly2-GLP-2或磷酸盐缓冲盐水(对照组)治疗10天或1个月。*p<0.05， **p<0.01与对照组比较;†与天然GLP-2相比p<0.05。在(C)中，许多小型肿瘤形成了更大的集合体，这使得在3MO Gly-2-GLP-2小鼠组中无法精确计数。
组织学检查
所有肿瘤均为非恶性管状腺瘤;中型和大型息肉最常带蒂(图4A-C)。小息肉可与“异常隐窝灶”相比较。所有肿瘤均局限于粘膜，未见肌肉层粘膜穿透，提示有侵袭性生长。两组间在肿瘤组织病理学上没有发现差异。
所有肿瘤均为局限于结肠粘膜的非恶性管状腺瘤。(A)小型肿瘤与“异常隐窝灶”相当，(B)小型肿瘤，(C)中型肿瘤，(D)大型肿瘤最常带蒂。未见肌肉层粘膜浸润性生长。原来放大×160。
讨论
小鼠反复皮下注射DMH后，所有动物的结肠都形成了肿瘤。主要发生在结肠下部和直肠的肿瘤被诊断为管状腺瘤。这可能反映了肿瘤发育的相对较短的时间，似乎这些腺瘤最终可能发展为腺癌。24，25我们的数据表明，Gly2-GLP-2治疗显著增加结肠肿瘤的发生率。
DMH肿瘤模型以前曾被用于测试外源给药的有丝分裂原(例如，表皮生长因子)的致癌作用，它显著增加了肛门肿瘤的发病率，但对结直肠息肉没有影响。26有趣的是，DMH诱导的结肠肿瘤结合手术切除或肠旁路也已被研究。27，28后者操作激活适应性肠生长机制，也导致结肠肿瘤的发病率增加。27，28这表明肿瘤促进因素可能是适应性反应的一部分，这些因素可能包括“全身性”而不是局部因素。28由于目前的研究结果，随着内源性GLP-2水平在适应性肠道生长条件下的增加，29这些影响肿瘤生长的全身性因素似乎也包括GLP-2。
在本研究中，原生GLP-2对结肠肿瘤的诱导作用不及gl2 -GLP-2。然而，应该注意的是，本研究中使用的原生肽和类似物的剂量不是等效的，而是完全根据它们对小肠的肠道营养特性和对肠道生长的影响的以往经验选择的。22Gly2-GLP-2的效力大于原生肽，因此，使用Gly2-GLP-2治疗可诱导小肠和大肠的生长，而长期使用原生肽治疗只能诱导小肠的生长。大鼠结肠中存在GLP-2受体RNA水平，但受体的确切细胞定位仍不清楚。9日,10日,12然而，似乎有理由相信GLP-2的一些作用是通过其他介质(例如，局部产生的营养因子)引起的。这些也可能与外源给药的Gly2-GLP-2或GLP-2对肠道肿瘤的促进作用有关。
当评估生存数据时，没有观察到统计学上的显著差异。然而，在3个月的无治疗期后，只有75%的Gly2-GLP-2治疗小鼠存活到研究终止，这表明该组中只有最健康的动物存活了下来。因此存在一种潜在的风险，即该组中感染最严重的小鼠是在治疗期间死亡的小鼠。因此，这可能导致低估了Gly2-GLP-2治疗组的息肉数量。矛盾的是，这组人在研究期间体重增加最多。然而，这些小鼠也有最明显的肠道生长(结肠息肉)的任何组。大肠和小肠的平均重量分别约为300毫克和100毫克，比处理过GLP-2的动物多。
使用结肠癌DMH模型的一个主要原因是DMH诱导的结肠腺瘤和腺癌在组织学上与人类结肠肿瘤相似。19日,30.此外，DMH及其前致癌衍生物在代谢激活后会导致DNA、RNA和其他蛋白质的甲基化，通过使用小剂量的重复给药，可以避免DMH及其前致癌衍生物的一般毒性。有人认为，DMH的高器官特异性是由于诱导结肠细胞的异常凋亡模式，使甲基化损伤的细胞增殖。31DMH模型的另一个主要优势是，致癌物被迅速代谢并从体内清除。27因此，在本研究中观察到，在连续暴露于原发致癌物数月后，使用gl2 -GLP-2治疗后，肿瘤的增强程度小于使用原生GLP-2治疗后观察到的程度，这表明GLP-2促进了现有结肠息肉的发展。当潜在的GLP-2治疗候选者有未被发现的结肠腺瘤时，可能会出现类似的临床情况。
目前发现的临床意义仍不确定。一方面，从生物学的角度来看，这一结果并不出乎意料，因为在正常生理条件下调节生长的因素最有可能在病理生理条件下也起同样的作用，包括癌前条件。然而，GLP-2或其类似物的治疗使用极有可能是短期使用或在疾病状态下间歇性使用。这可能会降低潜在的肿瘤促进作用。本研究的两个明显的警告也应该被提及。首先，小鼠反复暴露在高剂量的结肠特异性致癌物中。这与人类结肠细胞可能遇到的长期低水平暴露于DNA甲基化剂形成对比。此外，小鼠结肠腺细胞与人类结肠腺细胞的区别在于，它们通常对甲基化剂的杀伤不太敏感。32因此，将目前的研究结果直接外推到人类疾病上还为时过早。然而，如果将GLP-2作为治疗药物引入炎症性肠病患者中，肠道和结肠直肠癌的发病率增加，因此需要谨慎。GLP-2对肠道系统的生长刺激作用可能会加速肠道内现有息肉或癌症的生长。然而，已知已有肿瘤的受试者应排除使用GLP-2治疗，特别是长期治疗或在治疗后密切监测。另一方面，内源性的GLP-2水平还没有被证明能诱导癌变，但应该研究GLP-2对肿瘤发展早期阶段的影响(例如，在DMH的同时进行GLP-2治疗)。
总之，目前的数据清楚地证明了GLP-2对结肠肿瘤发病率的刺激作用，并强调了未来需要对GLP-2的促肿瘤特性进行研究(例如，在癌症易感性增加的模型中)。
致谢
该研究得到了丹麦信号肽研究生物技术中心、丹麦医学研究委员会和诺和诺德基金会的资助。作者感谢Grazyna Hahn Poulsen和jeette Schousboe的技术援助。
参考文献
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