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摘要
背景和目的:虽然在遗传性血色素沉着症(HH)患者中有十二指肠肠细胞内二价金属转运体1 (DMT1)和铁调节基因1 (IREG1)上调的报道，但这些发现存在争议。此外，HH中突变的HFE基因对这些分子表达的影响尚不清楚。本研究检查了这三种分子在HH患者(静脉切开术前后)、缺铁患者(ID)和对照组的十二指肠表达。
方法:采用实时聚合酶链式反应检测C282Y纯合子的HH患者、血清铁蛋白浓度低于20 μg/l的C282Y突变阴性的ID患者和铁指数正常的C282Y和H63D突变阴性的对照组十二指肠组织中DMT1、IREG1和HFE mRNA的表达。
结果:与对照组相比，未抽血的HH患者中DMT1和IREG1 mRNA水平无显著差异。与对照组相比，接受过静脉切开治疗的HH患者和ID患者DMT1表达明显增加。与对照组相比，ID患者的IREG1表达显著增加，而在接受治疗的HH患者中IREG1表达增加1.8倍，但这并不具有统计学意义。与对照组相比，HFE mRNA表达在任何研究组中均无显著差异。
结论:这些结果表明，未经治疗的HH患者十二指肠DMT1和IREG mRNA没有增加，但静脉切开术增加了这些分子的表达，反映了静脉切开术诱导红细胞生成的作用。最后，HFE似乎在十二指肠肠细胞铁吸收的调节中起着次要的作用。
- 二价金属转运蛋白1
- IREG1，铁调节基因1
- 科幻、血清铁蛋白
- TS、转铁蛋白饱和度
- Hb,血红蛋白
- HH,世袭haemochromatosis
- ID、缺铁
- 聚合酶链式反应
- 铁的吸收
- 铁运输分子
- 商店的监管机构
- 红色的监管机构
- 缺铁
来自Altmetric.com的统计
铁的吸收是由几个因素调节的，包括体内铁的储存水平(通过储存调节剂)，红细胞生成率(通过红系调节剂)和缺氧。1 -4尽管与红系调节因子相比，存储调节因子改变铁吸收的能力较低，但从遗传性血色素沉着症(HH)的研究结果来看，其功能对正常铁稳态至关重要。HH患者的大多数(>90%)是HFE基因单错义突变(C282Y)的纯合子，他们从饮食中吸收了过多的铁，相对于体内的铁储备，这表明储备调控器的设定值可能被改变。5，6
储备和红系调节剂反映了人体对铁的需求，并通过调节十二指肠成熟肠细胞中几个关键蛋白的表达来决定铁被十二指肠吸收的速率，包括二价金属转运蛋白1 (DMT1)，一种跨膜蛋白，能主动将减少的膳食铁运输到肠细胞，以及铁调节基因1 (IREG1)，第二种跨膜蛋白，被认为是铁通过基底外侧膜向血浆的输出者。7 -12
储存量和红系调节剂如何影响这些铁转运分子的表达尚不清楚，但人体铁需求和铁转运在十二指肠中的表达之间的联系已被确认为hepcidin，被认为是铁吸收的主要负调控因子。13 -15
相对较少的研究检测了铁转运蛋白在人类HH受试者中的表达，结果相互矛盾。这种冲突的来源似乎主要来自于纳入了接受静脉切开术治疗的HH患者，这些患者本身会导致铁的吸收显著增加。16 -18最近，对未治疗的HH患者的研究也显示出相互矛盾的结果。19日,20.此外，在研究HH小鼠模型的研究中也观察到类似的不一致。21 -25
野生型HFE在铁吸收和维持正常铁稳态中的作用尚不清楚，这阻碍了阐明HFE基因突变如何导致HH患者不适当的铁吸收的进展。26因此，HFE对铁转运分子表达的影响尚不清楚，尽管动物研究表明其作用可能有限，因为缺乏HFE的小鼠保留了调节铁吸收的能力。27日,28
在这里，我们从未治疗和治疗的HH患者、缺铁(ID)受试者和正常对照组中发现了DMT1、IREG1和HFE mRNA的表达水平。
材料和方法
病人
52例患者在上消化道内窥镜下进行十二指肠活检。活组织切片在液氮中快速冷冻或存储在Qiagen RNAlater介质中(Qiagen Ltd, UK)。同时，所有个体抽血测定空腹血清铁、血清铁蛋白(SF)、转铁蛋白饱和度(TS)、血红蛋白(Hb)和HFE基因分型。18
所有HH患者(n = 33)的诊断均基于C282Y HFE突变的纯合性和持续升高的铁指数，定义为女性的SF大于或等于200 μg/l，男性的SF大于或等于300 μg/l。所有HH患者都接受了内窥镜检查，作为静脉曲张筛查的一部分，或在完全知情同意后自愿作为研究方案的一部分。未治疗的HH组(n = 21)在开始静脉切开治疗前进行活检。接受治疗的HH组(n = 12)在静脉切开术后进行活检，这些受试者不包括任何未接受静脉切开术治疗的HH组。
ID患者定义为SF <20 μg/l的患者。ID组的平均Hb为10.6 g/dl。至于ID组是否存在贫血，8名女性中有6名Hb水平<11.5 g/dl，唯一的男性Hb水平为12 g/dl。所有患者都接受内窥镜检查以评估缺铁的原因。对照组患者在选择性内镜检查检查消化不良症状时入组，内镜检查结果、Hb和铁指数正常(即TS 25-56%， SF 20-330 μg/l)。
RNA的准备
总RNA提取使用Qiagen RNeasy迷你系统(Qiagen Ltd)。在制备cDNA之前，提取的RNA用DNase 1, Amp级(GibcoBrl, Paisley, UK)处理，它消化单链和双链DNA。
制备cDNA
使用标准试剂条件进行RNA的反转录。取1微克DNase处理的RNA，加入4 μl 5×第一链缓冲液、2 μl 0.1 M DTT(还原剂)、1 μl 10 mM dNTPs、1 μl随机引物(GibcoBrl)和1 μl(200单位)Superscript II逆转录酶(GibcoBrl)，在25℃孵育10分钟、42℃孵育50分钟、70℃孵育15分钟。
定量(实时)聚合酶链反应
用于DMT1和IREG1定量的TaqMan实时聚合酶链反应(PCR)引物和探针购自sigma - gensys (cambridge - eshire, UK)，并按照前面描述的方法使用。19利用引物表达软件设计HFE实时引物和探针，不区分野生型和突变型HFE。使用的HFE引物是正向-CCT TGT TTG AAG CTT TGG GC和反向-CAC GGC GAC TCT CAT GAT CA，下面是TaqMan探针5 ' -CGT GGA TGA CCA GCT GTT CGT GTT CT。
使用Applied Biosystems 7700序列检测器，实时定量DMT1, IREG1和HFE在研究中每个个体的cDNA样本中进行。三种分子的扩增条件相同。初始变性在50°C 2分钟，然后95°C 10分钟，然后95°C 15秒和60°C 1分钟扩增40个循环。
所有样品均重复分析，样品内重复性高。平均结果归一化到内控18S核糖体RNA，以纠正总mRNA含量的失衡或不平等的反转录效率。
DMT1免疫组织化学
每组5例患者的十二指肠标本固定于Carnoy液中并包埋于石蜡中。切片(5 μm)在二甲苯中脱蜡，在3%过氧化氢中封闭内源性过氧化物酶，然后用纯化的抗dmt1抗血清(由J Bastin博士捐赠)在室温下以0.03 mg/ml浓度孵育45分钟。阴性对照玻片忽略了初级抗血清。使用市售vecastain ABC Elite试剂盒(Vector Laboratories, Burlingame, California, USA)对抗体-抗原复合体进行可视化，并使用0.05% 3 ' 3 ' -二氨基联苯四盐酸盐和0.01%过氧化氢进行检测。切片用甲基绿反染色。DMT1染色强度由一位病理学家(CO’k)评估，分为弱、中等或强。
该研究方案得到了米塞里克迪亚大学医院伦理委员会的批准，所有参与者都给予了书面知情同意。
统计分析
采用SPSS for Windows (version 11)进行统计评价。所有患者特征均用均值(SD)表示。十二指肠中DMT1、IREG1和HFE的水平以18S核糖体RNA的比值表达，并报告为平均值(SD)。SF的结果和DMT1和IREG1的实时PCR定量结果呈偏态分布，并将其对数转化为统计学评价。患者组间比较采用独立样本t测试。使用斯皮尔曼秩法进行相关性分析。
结果
患者临床特征
所有个体的临床特征见表1。所有ID患者的C282Y突变均为阴性，但有4例为H63D突变杂合。H63D杂合子不积累铁，表型正常。29日,30.所有对照组患者C282Y和H63D突变均为阴性。
定量实时PCR
DMT-1
ID组DMT-1 mRNA水平较对照组明显上调(4.00v0.30;p = 0.018)。总HH组DMT mRNA水平比对照组(0.98v0.30)，但差异无统计学意义(表2)。将总HH组分为治疗组和未治疗组，观察到显著差异。与未治疗组相比，治疗组DMT-1水平明显升高(1.90v0.44;p = 0.002)(表2)。与对照组相比，处理组DMT-1水平显著升高(1.90 . p = 0.002)v0.30;P = 0.006)，而未治疗组(0.44v0.30;p = 0.7) HH组。DMT1 mRNA水平在HH患者(1.90)和ID患者(4.00)之间无显著差异(图1)。
二价金属转运蛋白1 (DMT1) mRNA在遗传性血色素沉着病(HH)、铁缺乏症(ID)和对照组十二指肠活检标本中的表达数值为各患者组中DMT1/18S核糖体RNA比值的对数刻度、中位数(水线)、75%置信区间(方框)、最小值和最大值(垂线)。组间DMT1 mRNA水平均值比较显示以下显著差异:ID组与对照组相比，p = 0.018;未治疗组与治疗组比较，p = 0.002;对照组与对照组相比，p = 0.006。
在ID组、任何HH组或对照组中，DMT-1水平与SF、TS或Hb无相关性。本研究没有区分DMT1的IRE和非IRE形式，但已表明十二指肠组织中非IRE形式的水平极低，对DMT1总水平没有显著贡献。20.
IREG1
ID组IREG1 mRNA水平较对照组显著升高(2.20v0.79;p = 0.016)。全HH组与对照组IREG1 mRNA水平相近(0.96v0.79;p = 0.8)(表2)。当HH组进一步分为治疗组和未治疗组时，治疗组的mRNA水平是未治疗组的1.8倍，但这没有统计学意义(1.40 . p = 0.8)v0.70;p = 0.1)(表2)。最后，与对照组相比，治疗组IREG1 mRNA水平增加了(1.7倍)(1.40v0.79;P = 0.5)，而未治疗组无明显差异(0.70)v0.79;P = 0.3)(图2)。
铁调节基因1 (IREG1) mRNA在遗传性血色素沉着病(HH)、铁缺乏症(ID)和对照组十二指肠活检标本中的表达数值为各患者组IREG/18S核糖体RNA比值的对数刻度、中位数(水线)、75%置信区间(方框)、最小值和最大值(垂线)。组间IREG1 mRNA水平平均值的比较显示ID组与对照组之间有显著差异(p = 0.016)。没有观察到其他显著差异。
在ID组和HH组中，IREG1 mRNA水平与SF、TS或Hb无相关性。然而，在对照组中，IREG1 mRNA水平与TS (p = 0.028)和Hb (p = 0.003)相关，而与SF (p = 0.09)无关。
HFE
与对照组相比，ID组HFE mRNA水平升高，但不显著(3.40v1.80;p = 0.1)。全HH组HFE mRNA水平与对照组(1.7v1.80;p = 0.9)(表2)。当HH组被分为治疗组和未治疗组时，治疗组和未治疗组之间的mRNA水平有1.4倍的差异，但这并不显著(2.10 . p = 0.9)v1.50;p = 0.1)(表2)。最后，治疗组和未治疗组与对照组之间HFE mRNA水平无显著差异(图3)。在ID组、HH组中，HFE水平与SF、TS或Hb无相关性(只有一个例外，HFE与治疗组的Hb相关;P <0.001)，或对照组。
遗传性血色素沉着病(HH)、缺铁(ID)组和对照组十二指肠活检标本中HFE mRNA水平的变化各患者组的值为HFE/18S核糖体RNA比值、中位数(水线)、75%置信区间(方框)、最小值和最大值(垂线)。两组间HFE mRNA水平无显著差异。
免疫组织化学
在所有队列中，十二指肠DMT1蛋白表达水平与mRNA水平平行。DMT1染色在十二指肠腔表面最强烈。HH治疗组、HH未治疗组、ID组和对照组的平均染色分别为中度/重度、轻度、中度/重度和轻度。无抗体处理的切片未见染色(图4)。
二价金属转运蛋白1 (DMT1)的免疫组化染色来自对照患者(A)，缺铁患者(ID)， (B)，未治疗的遗传性血色素沉着症(HH) (C)和治疗的HH患者(D)的十二指肠活检标本。与未治疗和对照的十二指肠组织相比，ID和治疗的遗传性血色素沉着症患者(D)的十二指肠组织顶端膜免疫染色最强。
讨论
在这项针对爱尔兰个体的研究中，在未治疗的HH患者、抽血(治疗)的HH患者、ID患者和对照组的大队列中检测了DMT1、IREG1和HFE的十二指肠mRNA表达。在未治疗的HH组，十二指肠DMT1和IREG1 mRNA表达与对照组无显著差异。相比之下，与对照组相比，接受静脉切开术治疗的HH患者DMT1显著增加(6倍)，IREG1 mRNA表达增加(1.8倍)。ID患者的DMT1和IREG1 mRNA水平均显著高于对照组(分别为13倍和2.8倍)。通过免疫组化评估，十二指肠DMT1蛋白表达水平与所有队列的mRNA水平一致。未对IREG1进行免疫组化分析，但其蛋白表达与mRNA表达密切相关。19HFE mRNA水平在所有研究组中与对照组没有显著差异。
对未治疗的HH患者十二指肠DMT1和IREG1表达的研究结果不一致。19日,20.Zoller等与正常对照相比，DMT1表达增加8 - 10倍，IREG1表达增加2 - 5倍。相比之下,斯图尔特等DMT1和IREG1 mRNA水平与对照组相似，但未治疗的HH患者往往有相对于其SF浓度不适当的这些转运蛋白表达。在未经治疗的患者的研究中，这些不一致的原因还不完全清楚，但将当前研究中的患者队列与Zoller的患者队列进行比较等和斯图尔特等表明我们研究的未处理队列(平均SF 1804 μg/l)和Stuart检查的未处理队列等(SF平均900 μg/l)比Zoller具有更重的体铁负荷等未治疗的HH队列(平均SF 642 μg/l)。
HH患者的十二指肠肠细胞表现与体内铁超载程度不一致。然而，肠细胞内铁转运体的表达水平取决于假定的储备和红细胞生成调节因子的影响。我们建议HH患者最初加载铁的速度与铁缺乏症患者观察到的速度相当，当体内铁负荷充分增加时，假定的铁储备调节器受到刺激(尽管在一个不适合体内铁储备程度的设定值)以降低铁负荷。支持这一提议的证据来自最近的一项研究，该研究描述了HFE敲除小鼠模型中与年龄相关的铁负荷影响。研究表明，DMT1和IREG1在积极加载铁的年轻小鼠中表达增加，而在肝脏铁加载持续但没有进展的老龄小鼠中，DMT1和IREG1表达水平与野生型小鼠相当。31
长期以来，人们一直认为，在HH患者中，十二指肠肠细胞的行为就好像身体比实际更缺铁一样。26支持这一假设的证据来自于一些研究，这些研究表明，在未治疗的HH患者的十二指肠肠细胞中，转铁蛋白受体mRNA表达增加，铁蛋白mRNA表达降低。32岁的33尽管我们的数据表明未治疗的HH患者的肠细胞似乎没有表现出缺铁，因为该队列中的铁转运表达谱与对照组相比，而不是与ID相比，我们的研究结果实际上表明，肠细胞的表现似乎表明身体比实际更缺铁。未经治疗的HH患者的铁转运蛋白表达水平与对照组相似，尽管体内铁储量显著增加，因此，由于他们不能像健康对照组一样下调铁吸收，可以认为这种反应受到了损害。34 -36接受治疗的HH患者的铁转运蛋白表达水平甚至高于铁缺乏症患者的铁转运蛋白表达水平，尽管铁储量正常。我们认为铁转运蛋白表达的增强是次要的影响假定的红细胞生成调节剂。有趣的是，在这两种情况下，身体的反应方式是相同的(也就是说，相对于身体铁负荷，铁转运蛋白表达过高)。
最近，对HFE缺乏小鼠十二指肠铁转运蛋白表达的微阵列分析也显示其表达模式与铁超载而非铁缺乏基本一致。25在野生型小鼠、继发性铁超载的野生型小鼠和HFE缺乏小鼠中也发现了相似的DMT1表达水平，尽管在HFE缺乏小鼠中，IREG1的同源基因Slc391a的表达水平较低。作者推测，这种IREG1的相对缺乏可能在肝脏铁积累中起作用。我们还发现，与对照组相比，未治疗的HH患者IREG1表达降低(尽管没有显著差异)，并观察到在未治疗的HH患者的一个小队列(n = 5)中，肝脏铁浓度与十二指肠IREG1和DMT1表达之间存在显著相关性(未发表的观察结果)，这可能支持十二指肠IREG1表达不足在肝脏铁积累中的作用。
与正常对照组相比，ID导致DMT1表达增加了13倍，而静脉切开术也显著影响了DMT1表达，与对照组相比，静脉切开术的HH患者DMT1表达增加了6倍。这表明，静脉切开术治疗不仅诱导HH患者铁吸收增加(DMT1的增加证明了这一点)，而且这些患者尽管是C282Y HFE突变纯合子，但保留了对静脉切开术诱导的红细胞生成的反应能力。
我们的发现具有潜在的临床意义。目前的指导方针是保持血清铁蛋白水平低于50 μg/l，这可能是一种相对缺铁状态，最终导致铁负荷增加。37在较高的生理范围内容忍一个维持SF可能会导致长期较少的铁消耗需求。此外，对于那些病情非常轻微且没有末端器官损伤证据的患者，铁消耗的开始可能最终导致更严重的铁积累。有必要进行临床研究，以确定修改当前临床指南的潜在益处和安全性。
检测DMT1和血清铁蛋白之间关系的研究结果也不一致。16 -20.在目前的研究中，没有发现血清铁蛋白和铁转运蛋白表达之间的显著负相关关系。相比之下，一些研究表明，在HH、ID和对照组患者中，SF和DMT1表达之间存在显著的负相关关系，而另一些研究报告仅在ID和对照组中存在相关性。16 -20.这些不一致可能源于这样一个事实:尽管SF是体内铁负荷的最佳实验室指标，但它与体内铁负荷的相关性并不强，通过静脉切开术(可能是测量铁储病患者铁负荷最准确的方法)计算出的铁量。38也有可能SF和DMT1表达之间的关系在所有SF值中可能不是线性的，很可能是其他影响促成了这种关系。
现在越来越多的人支持HFE作用的主要部位位于肝脏，而不是十二指肠，有人提出HFE在肝脏hepcidin表达的调节中发挥重要作用，以应对体内铁储备的变化。29支持肝脏作为HFE作用的主要部位的证据最近也在HH的小鼠模型中得到证明，在这些动物中，hepcidin的本构表达防止了铁超载39然而，HFE如何感知体内铁水平并产生适当的hepcidin反应的机制尚未阐明。40
尽管本研究结果并没有提供确凿的证据证明HFE作用的主要部位可能不在十二指肠，但在我们的队列中，HFE mRNA表达没有显著变化，而且功能性HFE的缺乏并没有阻止C282Y纯合子HH患者通过上调DMT1对静脉切开术诱导的相对ID状态做出反应。后一个观察结果得到了HFE突变小鼠铁吸收研究的支持，在HFE突变小鼠中，通过静脉切开术减少铁储存或刺激红细胞生成，使铁吸收增加的能力保持在与野生型动物相同的程度。28
总之，本研究证明十二指肠DMT1和IREG1 mRNA表达在未治疗的HH患者中相对于对照组没有增加，这与在ID患者和治疗的HH患者中这些分子水平增加的结果相反。尽管未接受治疗的HH患者与对照组患者的水平相当，但这些水平实际上相对于体内铁负荷过高。此外，静脉切开术显著增加了这些转运蛋白的表达，表明静脉切开术诱导的红细胞生成明显影响铁的吸收。最后，DMT1和IREG1 mRNA表达在ID患者中显著增加，表明这些分子确实是对体内铁储备减少的反应的重要介质。
致谢
这项工作得到了爱尔兰健康研究委员会和爱尔兰都柏林Mater College基金会的资助。作者感谢牛津大学分子医学研究所的Judy Bastin博士慷慨地提供DMT1抗血清。最后，作者还想感谢都柏林大学康威研究所的Catherine Moss对实时PCR的技术支持。