条文本
PDF
摘要
背景与目的:虽然再生基因(REG) Iα蛋白可能参与胃肠道炎症和癌变，其在溃疡性结肠炎(UC)及其引起的结肠炎中的病理生理作用尚不清楚。我们研究的表达REG我αUC和结肠癌组织中的基因及其蛋白。我们检查了细胞因子是否对REG我α基因表达以及REG Iα蛋白是否对结肠癌细胞有营养和/或抗凋亡作用。
方法:的表达REG我α分别采用实时逆转录-聚合酶链反应和免疫组化方法分析UC组织中的mRNA及其基因产物。细胞因子的作用REG我α荧光素酶报告法检测LoVo细胞启动子活性。REG Iα蛋白对生长发育和H2O2分别用MTT法和TUNEL法检测LoVo细胞诱导的凋亡。
结果:REG Iα蛋白在UC组织中的炎症上皮、异常增生和癌性病变中表达强烈。的水平REG我αUC组织中的mRNA表达与炎症严重程度和疾病持续时间显著相关。REG我α用干扰素γ或白介素6刺激启动子活性增强。REG Iα蛋白促进细胞生长，增强细胞对H2O2诱导LoVo细胞凋亡。REG Iα蛋白促进Akt磷酸化，增强LoVo细胞中Bcl-xL和Bcl-2的表达。
结论:的REG我α该基因可被细胞因子诱导，其基因产物可能在uc -结肠癌序列中发挥有丝分裂和/或抗凋亡因子的作用。
- Reg，再生基因
- 干扰素,干扰素
- 肿瘤坏死因子
- ,白介素
- CINC，细胞因子诱导的中性粒细胞趋化剂
- UC，溃疡性结肠炎
- TUNEL、TdT介导的dUTP缺口端标记
- MTT, 3，-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑
- wst - 8,2 -甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)- 2h -四唑钠盐
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
- 增殖细胞核抗原
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- EGFP，增强绿色荧光蛋白基因
- 注册
- antiapoptosis
- 细胞因子
- 扩散
- 溃疡性结肠炎
数据来自Altmetric.com
- Reg，再生基因
- 干扰素,干扰素
- 肿瘤坏死因子
- ,白介素
- CINC，细胞因子诱导的中性粒细胞趋化剂
- UC，溃疡性结肠炎
- TUNEL、TdT介导的dUTP缺口端标记
- MTT, 3，-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑
- wst - 8,2 -甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)- 2h -四唑钠盐
- RT-PCR，逆转录聚合酶链反应
- 增殖细胞核抗原
- 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
- EGFP，增强绿色荧光蛋白基因
的再生基因（注册)最初是从再生大鼠胰岛的互补DNA (cDNA)文库中分离出来的，其人类同源物被命名REG我α．1REG Iα蛋白主要在正常胰腺中表达，在胃和结肠中表达水平较低，这意味着REG Iα在这些器官中具有生理作用。2，3.事实上，最近的研究报告称，REG Iα在胰腺炎中过度表达，4，5幽门螺杆菌诱发胃炎、6在胃溃疡损伤中，7,8提示其在胃肠道炎性疾病的发病机制中具有重要作用。此外，有趣的是REG我α基因芯片分析表明，该基因在炎症性肠病中明显过表达。9日,10然而，目前尚不清楚如何做到这一点REG我α在这种炎症条件下，基因表达增强。
虽然我们和其他人之前已经提出Reg蛋白对哺乳动物上皮细胞有营养作用，11 -13其生物学功能尚不清楚。最近，REG Iα被认为不仅参与炎症性疾病，还参与各种胃肠组织的癌变，如胃、14日,15结肠癌、16胆管,17和胰腺3.；然而，其在溃疡性结肠炎(UC)相关的结直肠癌(结肠炎癌)中的作用尚不清楚。随着REG我α基因可能在UC中过度表达9日,10REG Iα可能作为一种营养或其他因素在结肠癌的发展中发挥重要作用。在本研究中，为了阐明REG Iα在uc -结肠癌序列中的作用，我们研究了REG Iα与uc -结肠癌序列之间的关系REG我αUC和结肠癌的表达及临床病理因素。此外，在体外研究中，我们检查了细胞因子是否增强REG我α基因表达以及REG Iα是否对结肠癌细胞有营养和/或抗凋亡作用。
材料与方法
组织标本和组织学检查
24例UC患者(男性15例，女性9例;平均年龄45.6岁(19-79岁);平均病程6.4年(范围0-19年)，4例克罗恩病患者(2男2女;平均年龄36.0岁(26-50岁);平均病程5.5年(范围0-15年)，8例直肠炎患者(6男2女;年龄40-79岁)，散发性结肠腺瘤10例(男7例，女3例;年龄55-85岁)，5名正常对照组(5名男性;年龄33-38岁)，就读于京都大学医学大学院。组织标本用于实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和组织学分析。这项工作是在京都大学医院审查委员会的批准下完成的，并获得了所有患者的知情同意。
共7处大肠癌病灶(部位:直肠5处，乙状结肠1处，下行1处;组织学:4个分化良好的腺癌，3个粘液腺癌)来自4名UC患者(2男2女;年龄44-58岁;病程11-25年)和8个散发性结肠癌病变(部位:直肠3个、乙状结肠2个、降部1个、升部1个、盲肠1个;2个高分化腺癌，6个中分化腺癌)来自8名非uc患者(5名男性，3名女性;年龄为65岁~ 79岁)。结肠癌组织标本在10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，并进行组织学分析。采用散发性结肠癌组织标本进行实时RT-PCR和组织学分析。这项工作得到了Dokkyo大学外科病理委员会的批准，并获得了所有患者的知情同意。
UC的诊断是基于已建立的内镜和组织学标准，18根据Matts分级评估炎症程度18在整个实验中。
免疫组织化学染色
如前所述，进行增殖细胞核抗原(PCNA)和REG Iα蛋白免疫组化染色，6,14使用抗人PCNA抗体(PC10;Dako Japan，日本京都;稀释1:1000)和抗人REG Iα抗体(稀释1:2000)。3.当超过20%的肿瘤细胞被阳性染色时，癌标本被认为是REG Iα阳性。14
实时RT-PCR
用Trizol试剂(Gibco BRL, Rockville, Maryland, USA)从结肠活检样本和7种人结肠癌细胞系(Caco-2, COLO 205, DLD-1, HT-29, LoVo, SW403和WiDr)中分离总RNA。总RNA (5 μg)用oligo-dT引物(Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA)反转录，RT产物用PCR扩增，如前所述。6,14TaqMan实时定量PCR采用ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)进行。以下为一套引物和探针人REG Iα准备:人REG Iα5 ' -CTA GAG GCA ACT GGA AAA TAC ATG TCT-3 '(意义)，5 ' -GTT GGA GAG ATG GTC CGG TTT-3 '(反义)，和5 ' -FAM-AAC GGA GTC AAA AAT T(探针)。此外，还有一套引物和探针供人体使用glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶（GAPDH)由应用生物系统公司合成。
每次扩增由50 μl含有50 ng cDNA的反应混合物、250 nM REG Iα探针(或100 nM GAPDH探针)、900 nM REG Iα引物(或200 nM GAPDH引物)和1×TaqMan通用PCR主混合物(应用生物系统公司)组成。PCR循环条件为50°C持续2分钟，95°C持续10分钟，95°C持续15秒，60°C持续60秒，循环45次。所有扩增均包含无模板阴性对照，每次检测均重复进行。测定了荧光染料的强度和表达水平REG我αmRNA归一化为GAPDHmRNA表达水平。
细胞培养及处理
结肠癌细胞株LoVo和SW403常规维持在RPMI1640培养基(Invitrogen, Grand Island, New York, USA)中，加入10%胎牛血清(Invitrogen)，在37°C和5% CO的湿度培养箱中2．这些细胞系被用于评估REG我α干扰素γ启动子活性(IFN-γ;Roche, Mannheim, Germany)，肿瘤坏死因子α (TNF-α;Roche)、白细胞介素(IL)-1β (Roche)、IL-5 (Pepro Tech Inc, Rocky Hill, New Jersey, USA)、IL-6 (Roche)、IL-8 (Roche)和IL-13 (Pepro Tech Inc)。另外，用LoVo细胞进行细胞生长和凋亡的检测。
荧光素酶活性测定和转染
人类的REG我α从−1195到+78的启动子通过PCR从人胃DNA中生成，使用以下一组引物包含我反光镜锁定而且Bgl二世限制位点分别为:5 ' -CTTACG资本利得GAA TTC CTG GGC TCA AGT GA-3 ' and 5 ' ' -CCC GAA GAT TTTAGA TCTAca GTG c-3 "。将克隆的启动子核苷酸插入pGL3-Basic载体中荧光素酶基因上游的Mlu I和Bgl II限制位点之间，构建物命名为hREG Iα- luc (Promega, Madison, Wisconsin, USA)。
LoVo和SW403细胞(2×104)在转染前24小时在12个孔板(Iwaki, Funabashi, Japan)中播种。根据制造商的协议，在Optimen培养基(Gibco, Grand Island, New York, USA)中，使用FuGENE 6转染试剂(Roche, Indianapolis, Indiana, USA)，用700 ng hREG Iα-Luc结构物和7 ng Renilla荧光素酶质粒pRL-TK(作为转染效率的对照)共转染细胞。48小时后，细胞被IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-8和IL-13刺激3、6、12和24小时。
荧光素酶检测使用双荧光素酶报告检测系统(Promega)根据制造商的协议进行。荧光素酶和Renilla荧光素酶活性采用荧光仪(Lumat LB 9506;贝特,德国)。对Renilla荧光素酶活性进行归一化处理，并表示为未处理细胞组在0小时时间点的活性的倍数。
人的转染和表达REG我α互补脱氧核糖核酸
人的全长REG我αcDNA被插入到含有巨细胞病毒启动子的pIRES2-EGFP载体中，驱动增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP) (Clontech, Palo Alto, California, USA)。在克隆和验证人类的核苷酸之后REG我α通过cDNA测序，构建物命名为pIRES2-hREG Iα，以无插入的pIRES2-EGFP载体作为对照。
如上所述，使用FuGENE 6转染试剂将质粒稳定转染到LoVo细胞中。为了选择稳定表达pIRES2-hREG Iα和pIRES2-EGFP的细胞，将细胞在含有G418 (Gibco;400 μg/ml)和存活菌落混合。
条件介质的制备
为了制备条件培养基，我们在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养人胚胎肾(HEK) 293T细胞。根据制造商的方案，使用FuGENE 6转染试剂用10 μg pIRES2-hREG Iα或对照质粒转染细胞。培养48小时后，用无血清的RPMI1640培养基替代。然后收集条件培养基并冷冻保存作为重组REG Iα蛋白的来源。
细胞生长试验
细胞生长用细胞计数试剂盒-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan)进行评估。LoVo细胞(5×103.)，经pIRES2-hREG Iα (LoVo-REG Iα细胞)或pIRES2-EGFP (LoVo-EGFP)载体稳定转染后，分别镀于96孔微板中。细胞在无血清RPMI1640培养基中孵育24、48和72小时。加入10 μl Cell Counting Kit-8试剂，孵育3小时后，在450nm的分光光度计(Molecular Devices Co.， Sunnyvale, California, USA)中读取板。为了评估REG Iα在培养基中的作用，我们在无血清的RPMI1640培养基中添加抗REG Iα抗体(50 μg/ml)，13日,19同样的程序也评估了培养72小时的细胞。
用细胞生长试验检测REG Iα蛋白对结肠癌细胞的营养作用。简单地说，LoVo细胞(5×103.)在96孔微孔板中培养24小时。然后，将培养基改为含有人重组REG Iα的条件培养基或对照培养基，细胞孵育24、48和72小时。为了评估REG Iα在培养基中的作用，我们在对照或含有REG Iα的培养基中加入抗REG Iα抗体，并在同样的程序中评估培养72小时的细胞。
TUNEL分析
LoVo-REG Iα细胞(1×104)和对照LoVo-EGFP细胞在4个孔培养载玻片(Falcon, Bedford, Massachusetts, USA)中培养。24小时后，用不同浓度(0 ~ 10 mmol/l) H孵育2小时2O2在无血清培养基中。随后，细胞在常规培养基中孵育24小时。用磷酸盐缓冲盐水冲洗后，用10%缓冲福尔马林固定玻片15分钟，然后根据提供的方案用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche)染色。TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)指数以阳性细胞百分比计算。为了评估REG Iα在培养基中的作用，我们在H处理后立即在常规培养基中添加抗REG Iα抗体(50 μg/ml)2O2(5更易/ l)。
采用TUNEL法检测REG Iα蛋白对结肠癌细胞的抗凋亡作用。LoVo细胞(5×103.)在4个孔培养载玻片中培养24小时，然后用含有人重组REG Iα的条件培养基或对照培养基培养24小时。然后，用不同浓度的H (0 ~ 10 mmol/l)再孵育2h2O224小时后进行TUNEL实验。为了评估REG Iα在培养基中的作用，我们在对照中加入抗REG Iα抗体或在H处理后立即加入含有REG Iα的培养基2O2(5更易/ l)。
磷酸化、非磷酸化Akt和Bcl家族蛋白的检测
LoVo细胞在10cm培养皿中培养24小时。用磷酸盐缓冲盐水冲洗后，将培养基改为含有人重组REG Iα的条件培养基或对照培养基，细胞再孵育12小时。然后将细胞与含有20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1% Nonidet P-40 (NP-40)、50 mM NaF和1×proteinase抑制剂(Complete Mini;罗氏公司)。蛋白质提取物(10 μg)经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转移到聚偏氟乙烯膜后，使用抗Akt、抗磷特异性Akt (Ser473) (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USA)、抗bcl -2、抗bcl - xl、抗mcl -1 (BD Sciences, San Jose, California, USA)和抗β-肌动蛋白抗体(Sigma Chemical Co.， St Louis, Missouri, USA)进行western blot(如先前报道)。20.
统计分析
所有的值都表示为平均值(SEM)。两组间的统计学差异由未配对的双尾进行评估t当数据不含参数时，采用Mann-Whitney U检验。之间的关系REG我α通过线性回归分析mRNA水平与病程的关系。p值< 0.05为有统计学意义。
结果
的表达REG我α正常结肠和溃疡性结肠炎黏膜的mRNA表达
REG我α通过实时RT-PCR检测对照组和UC患者所有结肠黏膜的mRNA表达。如图1A所示，的水平REG我αUC组织中mRNA的表达明显高于正常结肠组织。此外，REG我αmRNA在克罗恩结肠炎和直肠炎组织中的表达也明显高于正常结肠组织。我们接下来分析了之间的关系REG我αmRNA表达与几种临床病理因素相关，并发现REG我α随着内镜或组织学特征严重程度的增加，mRNA表达显著增强(图1B, 1C)。此外,REG我α长时间(小于10年)的UC患者的mRNA表达明显高于短时间(小于10年)的UC患者(图1D)。我们进一步根据病程和组织学结果对患者进行细分并进行分析REG我α各组mRNA表达。如图1E所示，在高matts评分组REG我α长病程UC患者的基因表达水平明显高于短病程UC患者。此外，在低matts评分组REG我α病程长患者的基因表达水平也高于病程短患者，但无统计学意义(p = 0.16)。REG我αUC组织中的mRNA表达与病程显著相关(图1F)，但与年龄或性别无关(数据未显示)。
REG我α溃疡性结肠炎组织中mRNA的表达。(一)REG我α正常结肠(NC)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩结肠炎和直肠炎组织中mRNA的表达水平。的比较REG我α各组间mRNA表达水平按内镜外观(B)、组织学表现(C)或病程(D, E)进行细分。(F)各组间的相关性REG我α表达水平和病程。所有结果均表示为折变REG我α信使rna /GAPDH相对于正常对照组的mRNA比值。两组间差异显著:＊* * p < 0.05, p < 0.01。甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
REG Iα蛋白和PCNA在正常结肠和溃疡性结肠炎黏膜、发育不良和结肠癌中的表达
在正常结肠黏膜中，仅在隐窝基底部的少数上皮细胞中检测到REG Iα免疫反应性(图2A)。在隐窝基底部也观察到PCNA阳性的结肠上皮细胞(图2B)。
REG Iα蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)在正常结肠(A, B)、溃疡性结肠炎(C, D)、发育不良(E, F)和结肠炎(G, H)组织中的免疫染色。Reg iα: a, c, e, g;PCNA: B, D, F, h, Bars = 100 μm。
UC黏膜隐窝中REG Iα阳性细胞数量增加，REG Iα免疫反应强度增加。REG Iα强阳性细胞主要分布于结肠黏膜下部(图2C)。隐窝中PCNA阳性细胞数量也增加，其分布与REG Iα阳性细胞相似(图2D)。
不仅在发育不良细胞的细胞质中检测到REG Iα免疫反应，而且在结肠癌细胞的细胞质中也检测到REG Iα免疫反应(图2E, 2G)。REG Iα的表达在所有7个结肠癌病变中都被检测到，这些病变来自4名被检查的患者。PCNA在所有结肠癌组织中异常增生细胞和癌变细胞中均有强表达(图2F, 2H)。
的表达REG我α在结肠癌细胞系、散发性结肠腺瘤和癌症中的mRNA
的表达REGIαRT-PCR方法检测的7个结肠癌细胞系均检测到mRNA(图3)REG我α实时RT-PCR检测结肠腺瘤、肿瘤及其邻近正常结肠黏膜mRNA表达。REG我α结肠腺瘤mRNA表达水平(n = 10;159(51))显著高于正常结肠黏膜(n = 10;1.0 (0.2)) (p<0.05)。此外,REG我α结肠癌mRNA表达水平(n = 8;1260(710))显著高于正常结肠黏膜(p<0.05)。
检测REG我α逆转录-聚合酶链反应在不同人结肠癌细胞系中的mRNA表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
细胞因子的作用REG我α结肠癌细胞系中的启动子活性
几种细胞因子对人体的影响REG我α启动子活性通过两种人结肠癌细胞系的瞬时表达分析(图4)。在转染hREG Iα-Luc结构的LoVo和SW403细胞中，荧光素酶活性在IFN-γ刺激后3小时(100和500 U/ml)显著升高，并且这种升高持续了24小时。同样,人类REG我α在IL-6处理后3小时(100和1000 IU/ml)，两种细胞系的启动子活性均增强，并且再次持续24小时。相比之下，TNF-α， IL-1β， IL-5, IL-8或IL-13处理不影响两种细胞系中的荧光素酶活性。
REG我αLoVo和SW403细胞的启动子活性对各种细胞因子的反应。用hREG Iα(−1195/+78)-Luc构建物和Renilla荧光素酶质粒pRL-TK共转染细胞(作为转染效率的对照)。48小时后，用干扰素γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白介素-1β、IL-5、IL-6、IL-8或IL-13刺激细胞。在转染的LoVo和SW403细胞提取物中测定荧光素酶活性，并归一化为Renilla荧光素酶活性。所有结果均以未处理细胞组在0小时时间点活性的倍数表示。垂直线表示四个独立实验的均值(SEM)。＊与对照组相比，P <0.05。
REG Iα对LoVo细胞生长的影响
转染pIRES2-hREG Iα (LoVo- reg Iα)的LoVo细胞的WST-8切割水平明显高于转染pIRES2-EGFP (LoVo- egfp;对照组)在孵育的每个时间点(24-72小时)(图5A)。添加抗REG Iα抗体后，LoVo-REG Iα细胞中增加的WST-8切割几乎被抑制到控制水平(图5B)，这表明LoVo-REG Iα细胞中增强的细胞生长是由分泌的REG Iα蛋白引起的。
的影响REG我α基因诱导或REG Iα条件培养基对人结肠癌细胞生长的影响。(A)的影响REG我α人结肠癌细胞生长的基因诱导。转染pIRES2-hREG Iα (LoVo- reg Iα)或pIRES2-EGFP (LoVo- egfp;对照组)质粒分别培养24、48、72小时。采用ELISA法(吸光度OD450)测定各组WST-8的裂解量，方法和材料均有说明。(B)抗reg Iα抗体对LoVo-REG Iα和LoVo-EGFP细胞生长的影响。LoVo-REG Iα和LoVo-EGFP细胞分别与抗reg Iα抗体(Ab, 50 μg/ml)孵育72小时。(C) REG Iα蛋白的来源。用人REG Iα cDNA表达质粒或对照质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞，收集经这些细胞调节的培养基。用抗人REG Iα单克隆抗体进行western blot分析，证实了REG Iα蛋白释放到人REG Iα cDNA转染细胞的条件培养基中。(D) REG Iα条件培养基对人结肠癌细胞生长影响的时间过程。 LoVo cells were incubated with REG Iα or control medium for 24–72 hours. (E) Effect of anti-REG Iα antibody on growth of colon cancer cells promoted by REG Iα protein. Anti-REG Iα antibody (50 μg/ml) was added to control or REG Iα medium, followed by incubation for 72 hours. All results are expressed as the mean (SEM) of four samples. *p<0.05, **p<0.01 versus control (LoVo-EGFP cells (A, B) or control medium treated cells (D, E)) group at the same time point. ††Significantly lower than LoVo-REG Iα cells (B) or REG Iα medium treated cells (E) (p<0.01).
REG Iα条件培养基在孵育24-72小时后显著增加了LoVo细胞中WST-8的裂解(图5D)。如图5E所示，在REG Iα处理过的LoVo细胞中增加的WST-8切割被同时给予抗REG Iα抗体所消除。
REG Iα在LoVo细胞中的抗凋亡作用
H处理后，LoVo-REG Iα细胞组TUNEL阳性明显低于LoVo-EGFP组2O2浓度为2.5 ~ 10 mM，表明过表达REG Iα的细胞对H2O2(图6)。LoVo-REG Iα细胞组中TUNEL阳性下降的情况经抗REG Iα抗体处理后显著逆转(图6B)，提示分泌的REG Iα蛋白对结肠癌细胞具有抗凋亡作用。
的影响REG我α基因诱导或REG Iα条件培养基对H2O2诱导人结肠癌细胞凋亡。(A)对H的抗性2O2转染REG Iα cDNA诱导人结肠癌细胞凋亡。转染pIRES2-hREG Iα (LoVo- reg Iα)或pIRES2-EGFP (LoVo- egfp;对照组)质粒用H2O2(0-10 mM)孵育2小时，然后在新鲜培养基中孵育24小时。评估TUNEL阳性细胞的百分比，如材料和方法所述。(B)抗reg Iα抗体(Ab, 50 μg/ml)对H .2O2(5 mM)诱导LoVo-REG Iα和LoVo-EGFP细胞凋亡。(C)对H2O2REG Iα条件培养基诱导人结肠癌细胞凋亡。LoVo细胞在含重组人REG Iα的条件培养基或对照培养基中孵育24小时，然后用含H的培养基孵育2小时2O2(清廉毫米)。(D)抗reg Iα抗体对H2O2(5 mM)诱导LoVo细胞凋亡。在对照或REG Iα培养基中添加抗REG Iα抗体(50 μg/ml)。所有结果均表示为四个样本的平均值(SEM)。*p<0.05， ** p<0.01与对照(LoVo-EGFP细胞(A, B))或对照培养基处理的细胞(C, D)相比。††显著高于LoVo-REG Iα细胞(B)或REG Iα培养基处理的细胞(D) (p<0.01)。
REG Iα条件培养基处理的LoVo细胞暴露于H时，TUNEL阳性显著低于对照培养基处理的细胞2O2浓度为2.5-10 mM(图6C)。在REG Iα处理的LoVo细胞中，TUNEL阳性的下降通过同时给予抗REG Iα抗体而显著逆转(图6D)。
REG Iα条件培养基处理增强了LoVo细胞中Akt的磷酸化(图7A)。此外，REG Iα条件培养基明显增加了LoVo细胞中Bcl-2和Bcl-xL的表达，而REG Iα不影响Mcl-1的表达(图7B)。
REG Iα条件培养基对结肠癌细胞中Akt磷酸化及Bcl家族蛋白表达的影响Western blotting显示，在REG Iα条件培养基培养12小时后，LoVo细胞中Akt磷酸化(A)和Bcl-2和Bcl-xL表达增强，而Mcl-1表达增强(B)。
讨论
在目前的研究中，我们发现REG Iα仅在结肠隐窝的中部和基底部分的少数小细胞中表达，而这些小细胞被认为是干细胞存在的地方，并且正在发生持续的细胞更新。21，22有趣的是，在胃上皮中，REG Iα不仅在肠嗜铬素样细胞和主细胞中表达，而且在胃腺增殖颈区的未成熟小细胞中也有表达。14日,23由于REG Iα蛋白确实对胃肠道上皮细胞有丝分裂，11增殖区产生的REG Iα可能在一定生理条件下参与胃肠上皮细胞的自我更新。
值得注意的是，一些调查人员已经确定REG我α作为UC患者结肠黏膜基因芯片分析中表达量最多的基因之一，9日,10尽管正常结肠黏膜中只有少量REG Iα阳性细胞。为了确认这些数据，我们在本研究中证明了两者的水平REG我α基因及其蛋白表达明显增加。此外，我们还证明了增强REG我α通过内窥镜和组织学评估，结肠粘膜中的基因表达与UC炎症的严重程度相关。这些数据有力地表明，REG Iα在UC的炎症过程中很重要。
是什么因素导致的REG我α在UC黏膜的表达?由于多种细胞因子在UC炎症中起着重要的作用，我们在本研究中检查了这些细胞因子是否增强了UC的转录REG我α结果表明，IFN-γ和IL-6均受到显著刺激REG我α结肠癌细胞启动子活性。而IL-8、IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-13均不能增强REG我α结肠癌细胞启动子活性。先前的研究表明，除了IFN-γ和IL-6外，TNF-α和IL-8的小鼠同源物cc -2β也可以增强REG我α大鼠胰腺腺泡细胞的基因表达19，24在体内的大鼠胃粘膜。25这些结果与我们目前的数据之间的差异可能是由于使用了不同的物种、细胞类型或实验条件。众所周知，UC黏膜中IL-6和IFN-γ的表达均显著增加。26日—28因此，尽管我们在本研究中没有测量这些细胞因子的水平，但似乎有理由假设UC黏膜中IL-6和IFN-γ水平的升高至少部分原因是UC的表达增强REG我α基因及其产物。值得注意的是，虽然UC被称为Th2显性疾病，29日,30.本研究中检测的Th2细胞因子均无影响REG我α启动子活动。这些数据可能表明增强REG我αUC黏膜的表达不是Th2特有的现象，而是反映了一般炎症状况，其中IL-6和IFN-γ表达升高。
阐明REG Iα是否参与UC相关结直肠癌的发生是很重要的。有趣的是，我们在本研究中发现，REG Iα不仅在UC黏膜上皮细胞中表达，而且在异常增生病变上皮细胞和结肠癌细胞中也有表达。此外，我们已经清楚地表明了这一点REG我α在患有长期结肠炎的患者中表达明显增加，这是结肠癌的高风险。31日,32这些发现强烈提示REG Iα参与了uc -结肠癌序列。在UC过程中，结肠上皮细胞被炎症持续损伤，可能诱导上皮细胞持续再生。在本研究中，我们发现REG Iα蛋白不仅对结肠细胞具有促进生长的作用，而且还具有抗凋亡的作用，并且至少部分通过激活Akt信号通路和增强Bcl-xL和Bcl-2的表达来发挥其抗凋亡作用。由此可见，UC诱导的REG Iα蛋白可能在结肠上皮细胞凋亡中起保护作用。然而，相反，由于REG Iα在慢性UC中持续高水平表达，其抗凋亡作用和促生长作用可能有助于UC组织发生结肠炎。值得注意的是，我们还发现REG Iα阳性细胞的分布与PCNA阳性细胞在结肠炎组织、发育不良和结肠炎黏膜中的分布相似。因此，在结肠炎中，上皮细胞产生的REG Iα可能直接作用于上皮细胞，也可能直接作用于癌细胞本身。为支持这一观点，在培养培养基中加入抗REG Iα抗体，不仅消除了REG Iα条件培养基的促生长作用，而且增强了REG Iα转染细胞的生长。同样，抗REG Iα抗体阻断了REG Iα条件培养基的抗凋亡作用，并消除了REG Iα转染细胞的凋亡减少。这些数据有力地表明，上皮细胞或癌细胞分泌的REG Iα以旁分泌或自分泌的方式发挥促进生长和抗凋亡的作用。 On the other hand, it may be noted in this study that colitic cancers develop in only a limited number of patients with UC, although REG Iα is ubiquitously expressed in the inflamed UC mucosa. However, it may be emphasised that carcinogenesis is a complicated event in which many factors are involved. Thus REG Iα may play a role in the UC-colitic cancer sequence as one of the growth promoting as well as antiapoptotic factors, and function in colitic cancer development not as a tumour initiator but as a tumour promoter.
在目前的研究中，我们已经证明了REG我α通过实时RT-PCR分析，该基因的表达不仅在UC粘膜和结肠癌中增加，而且在散发性结肠腺瘤或癌症中也增加，尽管其表达并不总是在散发性结肠癌中被检测到。16日,33此外,REG我α7个结肠癌细胞系均检测到基因表达。这些发现可能表明REG Iα不仅参与UC-结肠癌序列，而且参与腺瘤-癌序列，尽管UC相关结直肠癌的致癌机制被认为与散发性结直肠癌不同。34岁,35REG Iα在腺瘤-癌序列中的作用也应该在未来的研究中得到澄清。
综上所述，我们发现REG Iα不仅在UC黏膜上皮细胞中表达，而且在癌前发育不良上皮细胞和结肠癌细胞中也有表达。的启动子活性REG我α基因被IFN-γ和IL-6刺激。此外，REG Iα蛋白在体外对人结肠癌细胞具有有丝分裂和抗凋亡作用。综上所述，这些结果表明细胞因子诱导的结肠黏膜REG Iα在UC相关结直肠癌的发生发展中起着重要作用。
致谢
这项工作部分得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部的赠款支持。
我们感谢日本仙台东北大学医学研究生院的Hiroshi Okamoto博士提供抗reg Iα抗体。
参考文献
脚注
利益冲突:没有声明。
2005年5月24日在线发布