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目的:本研究的目的是建立一个方法,研究肠道嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞通过流式细胞术,并比较这些细胞的分布和活动在溃疡性结肠炎(UC)的不同阶段。
方法:活检样本取自六个位置的整个结肠和回肠末端10总UC患者活跃,不活跃的患者10总加州大学,八个活跃的远端UC,患者和11个对照组。细胞悬浊液活检和外周血孵化了荧光团共轭单克隆抗体。使用散射plot-gating和特定抗体成立于流式细胞术分析。
结果:嗜酸性粒细胞是更多和更积极的活跃UC患者比控制。有趣的是,在不活跃的加州大学,激活嗜酸性粒细胞的数量更大。嗜酸性粒细胞活性高的直肠远端结肠炎患者近端结肠但也略有升高。中性粒细胞增加在数量和活动活跃但不是不活跃的加州大学。在远端结肠炎患者,激活中性粒细胞只有在乙状结肠和直肠。
结论:通过这种方法,我们确认中性粒细胞参与炎症过程活跃的加州大学,并表达一个休息的表型在缓解。激活嗜酸性粒细胞的发现肠道发炎加强认为这些细胞的促炎和组织破坏。然而,我们的新发现的高嗜酸性粒细胞激活在不活跃的加州大学表明,嗜酸性粒细胞在修复受伤的上皮细胞中发挥作用。
- 加州大学,溃疡性结肠炎
- 马伯,单克隆抗体
- ECP,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白
- EPX,嗜酸性粒细胞蛋白质X
- EPO(促红细胞生成素)嗜酸性粒细胞过氧化物酶
- 转化生长因子,转化生长因子
- 流式细胞仪、荧光激活细胞分类
- FITC,异硫氰酸荧光素
- PE、藻红蛋白
- PerCP, peridinin叶绿素蛋白质
- MPO、髓过氧物酶
- 小额信贷机构,平均荧光强度
- ,白介素
- 嗜酸性粒细胞
- 流式细胞术
- 炎症性肠病
- 中性粒细胞
- 溃疡性结肠炎
来自Altmetric.com的统计
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溃疡性结肠炎(UC)是一种原因不明的慢性炎性疾病。它的特点是时间的恶化(活动性疾病)和缓解(不活跃的疾病);主要症状恶化期间腹泻和直肠出血。积累的影响结肠粘膜炎症,淋巴细胞,单核细胞,肥大细胞,嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞粒细胞。直肠总是涉及到,这种疾病可能仍然作为一个直肠炎或扩展检查乙状结肠、降结肠(远端结肠炎)或整个结肠长度(总结肠炎)。1
嗜酸性粒细胞与生产能力和释放促炎细胞毒性蛋白,如嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP),嗜酸性粒细胞蛋白质X (EPX)和嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO),以及一些促炎细胞因子如白细胞介素(IL) - 1α,22,3IL-5,4IL-3, il - 4、引发肿瘤坏死因子α和咆哮,5活性氧代谢和脂质介质。除了他们的能力杀死入侵的寄生虫,嗜酸性粒细胞参与免疫事件通过释放不同的介质6;它也建议他们可以作为抗原呈递细胞的刺激T细胞增殖和活化能力。7嗜酸性粒细胞与支气管哮喘和过敏性疾病的炎症过程6和有重要作用的病理生理学嗜酸性粒细胞相关的胃肠道疾病。8
最近的研究表明,嗜酸性粒细胞也可能通过刺激纤维母细胞参与改造和组织修复ECP的释放和转化生长因子(TGF) -β。9日,10
在加州大学中的嗜酸性粒细胞粒细胞的作用还不是很清楚。这些细胞通常存在于肠道粘膜,参与宿主防御。8然而,嗜酸性粒细胞的数量在UC患者高度增加,11发现和提高水平的嗜酸性粒细胞颗粒蛋白在肠道灌流液12和粪便13从UC患者。嗜酸性粒细胞趋化因子浓度升高14和增加粘附分子的表达15在结肠活跃UC表明,嗜酸性粒细胞正在积极招募粘膜发炎。
发病机理的嗜中性粒细胞参与加州大学更成熟;事实上,渗透的结肠粘膜中性粒细胞被认为是这种疾病活动的标志。16日,17中性粒细胞从循环招募参加防御传染性病原体,但他们也可能导致组织破坏在宿主体内分泌的有毒蛋白质颗粒和活性氧。6释放嗜中性粒细胞颗粒蛋白一直在观察肠道的粘膜和腔活跃的加州大学和直肠炎患者。18日,19
在我们实验室之前的研究已经证明了的存在和活动在肠道嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞的测量产品灌注液、粪便和血液。12日,13我们相信这些分析提供一个良好的肠道疾病反映嗜酸性粒细胞活动。然而,在目前的研究中,我们旨在更密切地观察细胞本身和嗜酸性粒细胞炎症在现场进行调查。为此,我们建立了一个敏感和稳定流动仪测定,我们使用这个试验研究从肠活检样本和外周血粒细胞。使用这种方法,我们可以评估激活与休息的嗜酸性粒细胞的数量以及单个细胞的激活程度,从而获得更好的理解嗜酸性粒细胞在加州大学的不同阶段的作用。此外,免疫组织化学染色进行肠活检样本。
本研究的总体目标是量化和评估活动的嗜酸性粒细胞粒细胞在疾病的不同阶段过程中在UC患者和健康人,也比较发炎和non-inflamed部分患者的结肠远端结肠炎。嗜中性粒细胞的活性,研究了在同一病人和被认为是关于嗜酸性粒细胞与发现。
患者和方法
患者和对照组
病人的临床和人口特征和控制表1中给出。
建立的诊断是根据临床、内镜和组织学标准。20.病人被认为是在一个阶段的不活跃的疾病如果他们没有临床症状的疾病活动和内窥镜的图片是正常或最多显示粘膜血管的轻微的扰动。患者临床症状(至少2 - 4软大便/天粪便和血液)和内窥镜的迹象炎症与粘结剂3 - 4分21(粒度、易碎性、脓液或血液,溃疡)被认为有活动性疾病。控制招募患者贫血的检查(n = 5)或健康志愿者(n = 6)。活检样本在结肠镜检查(奥林巴斯160 AL内窥镜标准内镜钳)经过肠道准备,至于程序灵活rectosigmoid内窥镜检查:两天的饮食限制和口服泻药在早上和下午在考试的前一天。该项目是医学院伦理委员会批准,乌普萨拉大学,所有的病人给了他们的知情同意参与这项研究。
收集和准备样品
在结肠镜检查中,四个相邻的活检样本来自七个不同的位置在所有患者和对照组:末端回肠、盲肠、结肠的左右弯曲,降结肠、乙状结肠和直肠。两个样本的位置被常规组织学分析。剩下的两个样本立即转入管充满生理盐水溶液在室温下,在一小时内进一步处理。外周血也从所有参与收集患者和对照组。
活检样本比较的每个位置是分开处理的不同部分结肠。单细胞活检细胞悬浮液获得使用松散适合玻璃匀浆器,然后细胞被洗两次与一个缓冲区分配荧光激活细胞分类包含0.05%南(流式细胞仪)3、0.1%牛血清白蛋白和0.4%柠檬酸三钠二水合物在磷酸缓冲盐。Heparinised外周血红细胞溶解了来自同一个人0.83%氯化铵溶液,洗两次流式细胞仪缓冲区获取血液白细胞的暂停。这两种类型的细胞悬浮液与荧光团孵化共轭单克隆抗体(mab) 30分钟在黑暗中在室温下。最后一个洗后,细胞悬浮在500μl流式细胞仪缓冲区和分析。
抗体
Mouse-antihuman马伯共轭异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE),或者peridinin叶绿素蛋白质(PerCP)是用于所有抗原。同形像匹配控制标签也使用荧光团执行共轭鼠标反人类的IgMκ和IgG2bκ作为非特异性染色的控制。所有抗体用于流式细胞术都从正欲购买(BD)生物科学/ Pharmingen(美国加州圣地亚哥)。Anti-CD16共轭微珠子从Miltenyi购买生物技术,GmbH(德国)。
流式细胞术分析
流式细胞术分析是两个激光流式细胞仪石中剑血细胞计数器(BD Immunocytometry系统,圣何塞,加利福尼亚,美国)。三种类型的荧光体被用来使分析三个不同的抗原在同一个样本:FITC,发射519海里FL1绿色;PE、发射578海里黄绿色FL2色彩;PerCP,发射675海里FL3红色。荧光测量收集使用对数放大器;向前和侧散射研究了使用线性放大器。一万细胞计数和分析每个样本。进行数据分析,细胞追求Pro软件(Becton Dickinson)使用。
细胞和活化的标志的识别
从外周血嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞或活检样本大门向前和侧向散射特性,进一步被标记(图1)。CD9曾被用作嗜酸性粒细胞的标志22但在我们设置专一性需要进一步增加。因此我们使用CD9结合anti-CDw125,嗜酸性细胞和嗜碱性细胞上表达。23这些标记的特异性分析证实了一个史诗XL流式细胞分析仪(库尔特电子,是海里,佛罗里达,美国)与光学过滤器嗜酸性粒细胞的识别。确保标记是表示在所有嗜酸性粒细胞,我们通过Percoll离心纯化外周血嗜酸性粒细胞和随后的磁珠分选与anti-CD16(去除中性粒细胞)。流式细胞仪上的净化嗜酸性粒细胞分析了石中剑。我们发现100%的嗜酸性粒细胞CD9和CDw125表示,因此得出的结论是,这些标记适合嗜酸性粒细胞的识别。透明质酸受体CD44,被用作标记的嗜酸性粒细胞激活。24嗜酸性粒细胞活动的另一个指标是平均荧光强度(MFI) CD9、高在激活休眠细胞,减少,可能是因为脱落。25CD15表达嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的MFI这个分子在中性粒细胞的10 - 100倍,26和中性粒细胞数量因此容易区别嗜酸性粒细胞。CD66b存储在二级颗粒表面活化的中性粒细胞和动员。因此,这个分子的MFI是用作衡量嗜中性粒细胞的激活。27日,28
免疫组织化学
免疫组织化学分析进行活检标本6总UC患者活动,五个总UC患者不活跃,活跃的远端结肠炎患者和5。嗜中性粒细胞是由多克隆Ab髓过氧化酶(MPO)(从部门获得医学科学,临床化学,大学的乌普萨拉,瑞典),和激活标记CD66b(研究诊断公司,弗兰德斯,新泽西,美国)随后染色相同的部分,以确保CD66b表示在中性粒细胞。促红细胞生成素单克隆抗体(医学科学、临床化学、大学的乌普萨拉,瑞典)和CD9 (Dakocytomation、斯特鲁普、丹麦)被用来识别嗜伊红粒细胞。部分从蜡嵌入块(准备常规组织学分析)在二甲苯deparaffinised,患者通过降低浓度的酒精,和三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗盐水(pH值7.6)。部分与马伯一夜之间在一个潮湿的孵化室在室温和加工如前所述。29日抗原抗体复合物呈现是使用商业APAAP工具包(K621;Dako、斯特鲁普、丹麦)和快速红底物,根据给出的说明手册。样本然后用迈耶的苏木精复染色(默克公司d - 6071,达姆施塔特,德国)。部分用徕卡DRMB显微镜检查。
统计评估
克鲁斯卡尔-沃利斯方差分析和Mann-Whitney U测试是用来评估统计组的患者之间的差异。弗里德曼配对分析,我们使用方差分析和Wilcoxon配对测试。采用p值< 0.05为显著。所有的计算都是在个人电脑上执行使用统计软件Statistica(美国俄克拉何马州的塔尔萨Statsoft Inc .,)。
结果
方法评价
我们测试和评估不同的激活细胞标记和标记,控制和优化过程的细胞。由此产生的方法已经应用在整个研究中,方法部分中描述。
四的第一个实验中,我们评估方法的再现性通过比较几个结肠活检样本相同的区域。我们分析了分布和激活的中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,CD4细胞+,CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和肠上皮细胞,流式细胞术,发现只有相邻样本之间的差异可以忽略不计(没有显示)。
肠嗜伊红粒细胞
免疫组织化学染色对促红细胞生成素和CD9透露大量的嗜酸性粒细胞总UC患者积极的固有层(图2 a、B),和高释放活动促红细胞生成素在这些患者中发现。嗜酸性粒细胞的数量仅略减少总UC患者活检标本不活跃但释放促红细胞生成素组织在这些病人并不明显(图2 c, D)。
嗜酸性粒细胞激活的标志
没有明显差异的MFI CD44在嗜酸性粒细胞对照组,总UC患者活跃,不活跃的患者总加州大学(没有显示)。然而激活嗜酸性粒细胞的百分比总UC患者积极高于对照组。有趣的是,这一比例进一步提高患者的不活跃的加州大学,甚至在回肠末端(图3)。
我们找到了一个倾向较低的MFI CD9的嗜酸性粒细胞来自加州大学的活跃的患者总比那些对照组,并显著降低嗜酸性粒细胞CD9的表达从总UC患者活动与对照组相比。CD9的表达很低的回肠末端在所有三组(图4)。
活跃的远端结肠炎患者的比例要远远大于激活嗜酸性粒细胞的比近端结肠,直肠和乙状结肠的倾向更高的百分比(图5)。与对照组相比,激活嗜酸性粒细胞的比例高(p < 0.05)不仅在远端结肠还在正确的弯曲,在远端结肠炎患者回肠末端。
外周血嗜酸性粒细胞
没有显著差异在MFI CD44在外周血嗜酸性粒细胞对照组和患者之间,与活跃的或不活跃的疾病(没有显示)。CD44的百分比+嗜酸性粒细胞显著(p < 0.05)高于外周血嗜酸性粒细胞来自加州大学的不活跃的患者比活跃UC患者和对照组(80.1 6.9 (SEM) %, 53.4(12.5) %,和57.4(8.1)%,分别)。CD9的MFI显著(p < 0.05)高于对照组外周血嗜酸性粒细胞的活跃的和不活跃的患者比那些来自加州大学(525 118 (SEM), 203(42.1), 248(22.3),分别)。
肠嗜中性粒细胞
免疫组织化学显示,密集的染色和MPO(图6)和CD66b固有层(图6 b)的总UC患者活跃,表明大量的激活中性粒细胞的组织。在总UC患者活检标本不活跃,只有少数MPO阳性细胞(图6 c),和CD66b表达很低(图6 d)。
表达CD66b
嗜中性粒细胞的活性评估CD66b通过流式细胞术的表达式。CD66b MFI的患者中性粒细胞的活性明显高于总比从那些活动的总加州大学和加州大学对照组(图7)。没有显著差异CD66b表达式之间的不同的肠道位置总UC患者或对照组。
有高表达的CD66b中性粒细胞的乙状结肠和直肠远端结肠炎患者的活跃,而表达的CD66b近端结肠和回肠末端在这些患者作为对照组低(图8)。
外周血中性粒细胞
无显著差异在表达CD66b外周血中性粒细胞被发现与对照组患者,与活跃的或不活跃的疾病(没有显示)。
讨论
我们已经建立了一个描述方法肠道粘膜免疫和炎性细胞的基于流式细胞术。该方法允许我们评估细胞的分布和激活在活检标本和是一个有价值的工具,用于评估免疫活动的组织。从外周血淋巴细胞和组织很容易被流式细胞术,但识别嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞没有,据我们所知,是前面描述的。我们使用控制和细胞表面标记可以研究粒细胞炎症部位没有permeabilising细胞。这反过来允许排序活检粒细胞的功能研究和细胞培养。我们发现,流式细胞术是一种稳定的细胞激活和敏感的方法评估。它却不是最优量化比较不同样本之间的粒细胞。为此,免疫组织化学作为一种补充方法。
这项研究的结果证实早期发现中性粒细胞参与活跃的加州大学。30 -32免疫组织化学染色与MPO透露密集中性粒细胞浸润在活跃UC患者结肠黏膜,但是只有少数中性粒细胞在UC患者从无所作为。我们还表明,中性粒细胞在活跃的阶段高度激活的疾病而非活动期间加州大学这些细胞表达表型。我们的远端UC患者的结果表明,中性粒细胞激活仅限于炎症的重点,增加CD66b表达只在乙状结肠和直肠。综上所述,这些研究结果证实的观点作为效应细胞嗜中性粒细胞在加州大学,显然是不活跃的疾病中扮演任何角色。
嗜酸性粒细胞粒细胞在加州大学的作用,另一方面,并不清楚。在正常non-inflamed肠有一个基线水平的嗜酸性粒细胞居民固有层中可能受eotaxin IL-5一起。33在炎症、嗜酸性粒细胞是高度增加的数量。形态学和免疫组织化学研究显示激活肠道嗜酸性粒细胞炎性疾病,34岁,35和增加项目的管腔内的释放,EPO(促红细胞生成素)和EPX一直在观察活跃的加州大学。11日,36岁,37我们发现增加的数量的激活嗜酸性粒细胞活跃UC患者与对照组相比,符合作为促炎细胞嗜酸性粒细胞的观点。CD9的表达个人的减少嗜酸性粒细胞确认激活细胞的百分比的变化并不是由于一个总体变化的嗜酸性粒细胞数量,但嗜酸性粒细胞活动的真实反映。
结果我们活跃UC患者和对照组的比较可能会让我们得出这样的结论:嗜酸性粒细胞在加州大学的作用类似于中性粒细胞。然而,包含不活跃的UC患者给我们学习免疫学在静止条件下疾病的可能性。我们发现,嗜酸性粒细胞的活动期间在不活跃的阶段高于炎症,当CD44的比例来衡量+细胞和CD9的表达。这部小说的观察表明,嗜酸性粒细胞可能参与炎症和修复受损的肠道组织的决议。最近,有报道称在组织嗜酸性粒细胞的作用改造和修复在过敏和哮喘,在人类和动物模型。10日,38岁的39这些研究表明,嗜酸性粒细胞衍生TGF-β1 myofibroblasts IL-13促进成纤维细胞的变换,并刺激tenascin及胶原的表达我通过这些细胞。IL-5被发现在这个过程中有至关重要的作用。
Stenfeldt Wenneras发现嗜酸性粒细胞承认和危险信号释放激活受损的上皮细胞。40他们发现受损HT29细胞(一种肠道肿瘤上皮细胞株)非常强烈刺激嗜酸性粒细胞趋化作用和颗粒的释放蛋白质,以及纤维母细胞生长因子1和TGF-β。
因此嗜酸性粒细胞似乎有能力组织破坏和修复,并在加州大学的不同阶段可能产生不同的动作,可能取决于刺激或药物暴露。嗜酸性粒细胞的另一个方面TGF-β1生产必须考虑是不受控制的因素刺激纤维母细胞活动的表达可能导致纤维化现象描述的哮喘和炎症性肠病。41岁的42我们还展示了在这项研究中,嗜酸性粒细胞的活动,与中性粒细胞相比,似乎并不局限于网站的活跃炎症。尽管激活嗜酸性粒细胞的百分比明显高于直肠远端结肠炎患者,我们还发现更高比例的嗜酸性粒细胞激活更多的近端部分结肠与控制。这与先前的报道是一致的高嗜酸性粒细胞计数的发炎和non-inflamed肠道组织从克罗恩病的患者,35在看似健康的粘膜切除边缘的加州大学标本。43管腔内的水平升高的EPX已发现乙状结肠的孤立的直肠炎患者,说明近端结肠嗜酸性粒细胞活动。12这些发现的一个可能的解释是嗜酸性粒细胞可能有作用的传播炎症和起源的早期病变。如果是这种情况,那么明显的嗜酸性粒细胞激活水平正常粘膜可以传播疾病的先兆。有趣的是,也有高度的嗜酸性粒细胞的回肠末端活动远结肠炎患者。肠的这一部分是通过定义不影响在加州大学,和活动无法解释的现象“后洗回肠炎”远结肠炎患者。在这一点上,在这个问题上我们不能猜测,但进一步的调查可能会感兴趣的。
总之,中性粒细胞在加州大学的促炎作用进一步建立了这个方法。流式细胞术是一种非常有用的方式研究组织细胞,特别是细胞活化。我们的发现的嗜酸性粒细胞明显影响地区的活动在不活跃的加州大学和结肠远端结肠炎生成几个问题:主要是嗜酸性粒细胞参与组织破坏,组织修复,纤维化或所有这些过程?粒细胞存在早期的事件事件加州大学还是他们招募了后来?他们参与疾病的发病机理或他们保护已经受伤的上皮免受传染性病原体吗?在寻找这些问题的答案,我们目前正在执行功能研究肠道嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞UC患者在疾病的不同阶段。
确认
我们承认Ingrid Stolt的娴熟的技术援助和内窥镜检查单位的人员。
引用
脚注
网上发布的第一个2005年5月10日
利益冲突:没有宣布。