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背景:遗传即结直肠癌(HNPCC)是临床上大肠癌家族聚类的定义和其他相关的肿瘤。
方法:彻底的分子和临床评价的41个家庭,两个不同群体的特征是:组1,25个家庭删除突变种或MSH2(12小说突变);和组2、16阿姆斯特丹积极的家庭没有这些基因的突变和微卫星不稳定性在相应的肿瘤。
结果:重要的临床发现这两组之间的差异。首先,对所有直肠癌早期发病的年龄(平均41v55年;(p < 0.001),肿瘤平均43v56年;观察p = 0.022),比较组1和2。其次,68%的指数直肠癌局部向近端脾曲的组1组2的比例为14% (p < 0.010)。第三,更多的同步以及异时大肠癌(p = 0.017)和extracolorectal肿瘤(p < 0.001)被发现在1组。第四,提高大肠癌腺瘤/癌比率(p = 0.030)和一个更倾向同步或metachronous腺瘤组2 (p = 0.084),表明癌腺瘤的进展较慢。三个突变阴性肿瘤显示染色体不稳定性的比较基因组杂交后,这些肿瘤可能是由于一个或多个高渗透疾病等位基因的染色体不稳定途径。
结论:这些数据表明,HNPCC包括至少两个实体与临床和分子差异。这将用于监测项目和癌症研究的影响。
- HNPCC,遗传即结直肠癌
- 全息、比较基因组杂交
- CIN、染色体不稳定
- MSI、微卫星不稳定
- MSI-H、高微卫星不稳定
- DHPLC,变性高效液相色谱法
- PCR,聚合酶链反应
- 结肠直肠癌
- 遗传即结直肠癌
- 微卫星不稳定
- 突变
来自Altmetric.com的统计
最初,遗传即结直肠癌(HNPCC)描述结直肠癌的临床实体家族聚类,根据阿姆斯特丹标准。早发性与主要的肿瘤,结直肠癌淋巴细胞浸润,和高同步以及异时肿瘤风险已经证明。1 -3鉴定的微卫星不稳定性(MSI)的主要肿瘤的子集,后来发现DNA错配修复基因的种系突变给人的印象HNPCC作为分子遗传性肿瘤实体定义。4 -6引入基于经验的监测项目之后,很明显,有大量的家庭实现HNPCC没有MSI的阿姆斯特丹标准相应的肿瘤DNA错配修复基因的种系突变。监测策略,这些家庭不能局限于突变携带者但至少必须提供所有一级亲属。关于这些家庭临床HNPCC综合症但是没有高微卫星不稳定性(MSI-H)的分子特性,目前尚不清楚他们是否应该以同样的方式管理这些家庭窝藏一个生殖系突变的错配修复基因。阿姆斯特丹积极但突变消极的家庭通常被归类为临床HNPCC没有表明这可能是一个分子,或许也是一种临床上截然不同的实体窝藏至少两个子组:微卫星稳定和微卫星不稳定的肿瘤。
在这项研究中,我们提出MSI-H突变阳性的临床特征与突变-阿姆斯特丹有微卫星的家庭稳定的肿瘤会议标准为了更好的描述这个小组和有关临床管理提出建议,在这些家庭遗传咨询。
材料和方法
病人
四十人连续注册指数包括病人和他们的家庭,所有满足贝塞斯达标准或缪尔老爹表型,一级亲属获得完整的数据。25指数病人和他们的家属(106名肿瘤患者或结直肠腺瘤;50岁女性,56岁男性)是一种包含删除突变或MSH2,除错义突变(图1)。
删除突变的肿瘤范围的家庭在一种或MSH2没有突变(A)和(B)。肿瘤疾病的指数显示病人和家庭成员。遗传即结直肠癌肿瘤相关疾病的阴影区域所示。*发病的年龄,年龄索引的病人的时候第一个肿瘤疾病;†普通家庭年龄、发病的年龄之和所有肿瘤患者的家庭除以数量的病人;,腺瘤性息肉;公元前,乳腺癌;CC,结直肠癌;中枢神经系统,中枢神经系统癌症;电子商务,子宫内膜癌;GC,胃癌; L, leukaemia; OEC, oesophageal cancer; PAC, pancreatic carcinoma; PC, prostate cancer; PEC, pelvic carcinoma; SBC, small bowel cancer; SC, sebaceous cancer; TC, thyroid cancer; UC, urothelial cancer; UVC, unverified cancer.
16个指标病人和他们的家属(71肿瘤患者或结直肠腺瘤;33岁女性,男性38)包括满足阿姆斯特丹阿姆斯特丹我(n = 14)或二世与证明标准(n = 2)微卫星稳定、免疫组织化学错配修复基因表达的一种积极和MSH2,或负突变筛查(变性高效液相色谱(DHPLC) /外显子缺失)为一种和MSH2和部分MSH6(图2)。患者被遗传咨询或部门的手术和慕尼黑大学胃肠病学。所有患者给予书面知情同意参加本研究由德国癌症援助和经伦理委员会批准。
突变阳性(A)和突变阴性(B)家庭发病的年龄和肿瘤类型。
DHPLC分析一种MSH2和MSH6
所有外显子的一种,MSH2和MSH6基因放大使用底漆之前出版。7 -9种和MSH2对所有患者进行分析而分析了MSH6另外所有的病人在一种没有突变或MSH2。
DHPLC分析进行自动DHPLC设备配备一个DNA分离柱(波;美国加州圣何塞,Transgenomic),发表之前。7
删除筛选
基因组DNA的病人没有删除所有外显子点突变分析了外显子缺失的一种MSH2按照制造商的指示使用MLPA工具包(MRC荷兰)。聚合酶链反应(PCR)产品运行在ABI 3100基因分析仪。
微卫星分析
显微解剖和提取后,mono -和二核苷酸重复序列用于微卫星分析标准程序。10日,11多态标记BAT25、BAT26 D2S123, D5S346, D17S250放大从肿瘤DNA和基因组DNA分离外周血白细胞的病人。如果肿瘤没有揭示MSI-H表型,扩展标记面板包括p53、D7S1824, D18S58, TGFβRII, MYCL1, D10S197分析。12PCR产品运行在应用生物系统公司377 DNA测序仪。样本判断MSI-H显示MSI的至少两个五到四的位点,与MSI MSI-low四分之一或1 - 3的基因座,和微卫星不稳定MSI。
免疫组织化学的一种MSH2和MSH6
抗体(单克隆鼠标反人类的MSH2 Calbiochem致癌基因研究产品、海德堡、德国)和MSH6抗体(德国海德堡,正欲)使用的稀释1:200或1:400,分别。单克隆鼠标反人类的一种抗体(病菌,柏林,德国)接触的稀释使用。
免疫组织化学染色microdissected石蜡包埋组织块进行以下标准程序。13 -15
抗体是核染色模式。肿瘤被定义为积极的,如果10%以上的肿瘤细胞显示核染色模式。负染色反应肿瘤细胞只被视为损失的蛋白质表达的阳性染色反应基质细胞和淋巴细胞作为控制。特异性染色证明了替代的主要免疫球蛋白抗体与鼠标同形像(英国伯明翰南方生物技术Associates INC .)导致负染色反应。
比较基因组杂交(CGH)
肿瘤的DNA和non-tumorous从石蜡包埋组织中提取了手动显微解剖。切割DNA和参考健康供者的DNA被尼克标签翻译使用荧光标记核苷酸。等量的两人都与人类的中期染色体杂交。基于计算机分析系统已被用于评估染色体的收益与损失。全息技术应用像欧斯特和他的同事所描述的那样。16
统计数据
本地化和肿瘤疾病的频率差异由于MLH1和MSH2组以及突变阴性组使用Mann-Whitney U检验进行了分析。一个χ2测试是用来比较的大小肿瘤组和发病年龄(SPSS软件包;SPSS Inc .)、芝加哥,伊利诺斯州,美国)。统计学意义是假定在p < 0.05。
结果
家庭
我们分析了临床的家庭之间的差异,没有一种突变或者MSH2。25我们比较有删除的家庭突变种或MSH2突变被认为是积极的有16个阿姆斯特丹积极的家庭的家庭没有DNA错配修复基因突变,没有MSI(突变-家庭)。
16阿姆斯特丹积极的家庭没有DNA错配修复基因的突变和没有MSI,家庭没有41显示一个胃,一个子宫内膜癌除了两个结肠直肠癌。密集的突变筛查与DHPLC种MSH2, MSH6和删除一种筛查MSH2没有揭示疾病导致突变在这种特殊的情况下,家庭是判定为突变阴性。MSH6也放映家庭没有27两个结直肠和一个子宫内膜癌发生的地方。
突变种,MSH2
20个不同突变在25个家庭被确定。精确的基因变化的一种和MSH2基因家庭如表1所示。
这25突变,12种和13中被发现MSH2,包括14个不同的一种新的删除突变(6)和MSH2(8), 7个影响接头地点,六移码突变,和一个无义突变。值得注意的是,12删除的突变中发现一种六个(50%)的影响只在一种两种不同的核苷酸。
微卫星分析
25组内变异积极的家庭,我们可以分析直肠癌来自23个家庭,所有展示优质MSI(有关详细信息,请参见表1)。
在16个突变-阿姆斯特丹积极的家庭,肿瘤有10个家庭进行分析。从六个家庭(34号27日,38岁,39岁,40岁,41)没有肿瘤的材料可用于微卫星分析。肿瘤显示亏损heterzygosity标准的一个标记面板有额外的标记分析了面板。没有显示MSI标记测试。
免疫组织化学
MSH2基因突变造成积极的家庭中,我们可以分析肿瘤10的13个家庭。所有肿瘤显示完全丧失MSH2蛋白表达的肿瘤细胞。三个肿瘤(13号、18和19)此外分析MSH6显示完整的蛋白表达。一种内变异积极的家庭,我们分析了肿瘤样品11 12个家庭。十个肿瘤显示完全丧失的一种表达,一个肿瘤(1)显示表达下降。核苷酸交流和拼接突变导致残余蛋白表达,通过免疫组织化学方法检测到。在突变阴性组,所有肿瘤分析显示积极为错配修复蛋白免疫组织化学检测(表1)。
比较基因组杂交
全息实验做肿瘤的三个家庭(号29、30、31)突变阴性组。肿瘤组织索引的病人的家庭没有29显示染色体损失2的时候,4 q, 6 q12-q14 11 q13-q22 18 q,并获得了13问,16 p, q, 20和22 q。肿瘤组织的指数病人的家庭没有30显示染色体18 q和收益损失13 q12-q14 19问,和20问。肿瘤组织索引的病人的家庭没有31显示染色体7,13问,16 p, q, 20和20赛·2-qter,显然没有检测到的损失。
癌症的发生
结肠直肠癌和腺瘤
结直肠癌是最经常观察到肿瘤,141年41结肠直肠癌的家庭。结肠直肠癌的最高数字被发现突变阴性组(78%),其次是家庭删除突变种(70%),然后在MSH2有突变的家庭(50%)。
三个家庭(2号、12日25)然而在突变阳性组显示7日12日和3结肠直肠癌,分别,没有任何光学癌症发生。发作时的年龄家庭中的所有记录的癌症诊断图2所示。发病的平均年龄任何肿瘤疾病的突变积极的家庭是42年相比,突变- 54年家庭(p < 0.001)(表2)。
五十六直肠癌诊断的一种突变阳性组和33 MSH2基因突变阳性组确诊。突变的临床特征积极的家庭无花果所示1和3。
本地化的结肠直肠癌的25个家庭删除突变种或MSH2(家庭号1 - 25)(A)和16个家庭没有突变(家庭号26-41)(B)。
发病的年龄差异在家庭的数量增加肿瘤中观察到家庭和达到最大50年的一个家庭。平均发病年龄为89突变阳性组的结肠直肠癌是43.5年。
同步以及异时结肠直肠癌是9%的突变阳性患者中发现的。指数百分之五十三的结直肠癌肿瘤突变阳性组中被诊断为40岁前只有13%的突变阴性组相比,导致显著的早些时候所有直肠癌发病的年龄(平均41v55年;p⩽0.001)当比较组1和2。有12个syn——或者metachronous突变阳性组的结肠直肠癌,但只有一个同步结直肠癌的突变阴性组(p = 0.017)。
本地化的结肠直肠癌清楚地记录索引的情况下显示出明显的突变积极和变异消极的家庭之间的区别(图3)。在突变积极的家庭中,68%被发现向近端和32%远侧地的脾曲。在突变-家庭,除了3(21%)指数结直肠癌肿瘤近端结肠左曲,都集中在乙状结肠或直肠(p = 0.010)。在53结肠直肠癌,20腺瘤突变阴性组的记录只有15腺瘤但89直肠癌被记录在突变阳性组(p = 0.030)(表2)。
光学纤维的癌症
比例最高的MSH2观察extracolorectal肿瘤相关的突变阳性组:子宫内膜癌(10%),其次是小肠癌(7%)、胃癌(5%),中枢神经系统癌症(3%)、乳腺癌(3%),和皮脂癌症(3%)。其他肿瘤(食管、皮肤、脑、移行细胞等)被发现在19%。在一种突变阳性组,子宫内膜癌(10%),其次是胃癌(5%)、乳腺癌(5%),小肠肿瘤(4%)。其他肿瘤被发现在6%。比较一种癌症的发生和MSH2突变阳性组,子宫内膜肿瘤相似的百分比,胃、小肠,和乳腺癌但不同对另一些人来说,如皮肤,大脑和移行细胞肿瘤更频繁MSH2突变阳性组中。比较一种和MSH2突变阳性组,有一个趋势关于结直肠癌的发生与extracolorectal癌症(p = 0.087)。
突变阴性组中,78%的癌症诊断结肠直肠癌,其次是子宫内膜癌(5%)和胃癌(5%)。发现了一个显著的区别的syn的发生——或者metachronous extracolorectal癌症,有17个syn——或者metachronous extracolorectal癌症突变阳性组相比没有突变阴性组(p < 0.001)。
讨论
高吞吐量和敏感技术,如DHPLC更容易识别家庭疑似HNPCC突变。7然而,重要的是要有预选基于家族病史。23日,24阿姆斯特丹的家庭选择的基础上达到一个高的标准率(约60%)的突变检测。我们所有的家庭进行遗传咨询具有丰富的评价他们的家庭的历史。我们分析了MSI,免疫组织化学,和所有指数的一种和MSH2基因病人的家庭实现阿姆斯特丹标准,MSH6基因如果没有发现突变种或MSH2。为病人或家属满足贝塞斯达标准,我们首先进行了微卫星分析和免疫组织化学突变分析紧随其后的MSI或损失的表达在肿瘤组织中。通过这种方式,我们确定了25个家庭疾病导致一种或MSH2删除突变。我们还定义了16个家庭实现阿姆斯特丹标准没有删除在DNA错配修复基因突变,没有MSI在相应的肿瘤至少10这些家庭。这些41家庭形成的基础临床特征的比较这两个分子定义实体。主要的临床发病的年龄差异发现,肿瘤,肿瘤本地化,肿瘤进展。
突变阳性和突变阴性组比较,有显著的早期发病的年龄结直肠肿瘤(平均41v55年;p⩽0.001)和肿瘤(平均43v56年;突变阳性组p = 0.022)。没有区别在结直肠癌发病的年龄被发现之间的一种和MSH2突变阳性组。
突变阳性组的临床特征与已知的突变阳性HNPCC患者。25最常见的类型的癌症诊断结肠直肠癌(63%),其次是子宫内膜癌(10%)、胃癌(5%),小肠(5%)和癌症。其他类型的癌症等典型的DNA错配修复基因突变的中枢神经系统和皮肤癌症也被观察到。突变阴性组中,我们发现78%的直肠癌,除了胃(5%),子宫内膜癌(5%)。其他相关癌症的典型突变阳性HNPCC患者并没有观察到。突变阳性和阴性组一个显著差别的速率相同或metachronous extracolorectal癌症(p < 0.001),突变阴性组中没有观察到。
Wijinen等描述了一种方法根据它的平均发病年龄较低,子宫内膜癌,和阿姆斯特丹的实现标准增加突变的概率识别HNPCC家庭。23这是在协议与我们的结果除了家人号27阿姆斯特丹和41满足标准和频谱显示肿瘤突变阳性的典型家庭。
正面和负面的突变组之间的另一个显著差异是结肠直肠癌的本地化。在突变阳性组,68%的准确记录发现直肠癌近端结肠左曲,代表整个colorectum分布。突变阴性组中,79%的癌症是位于远端脾曲,所有的乙状结肠和直肠。因此,大约有45%的第一个直肠癌近端结肠左曲或46%是否考虑metachronous癌症。其他研究包括阿姆斯特丹积极的家庭和没有突变DNA错配修复基因显示,70%的直肠癌位于近端结肠左曲。25唯一的解释这种差异是选择偏向于更多的阿姆斯特丹积极的家庭没有DNA错配修复基因突变的目的这个特殊的研究。
另一个重要的区别是腺瘤中观察到的数量变异-和突变阳性组。在第二组,除了89结肠直肠癌,12腺瘤(14%)记录,而在突变阴性组53结肠直肠癌和20腺瘤(28%)被发现。爵士乐提倡“激进的腺瘤”理论,腺瘤在HNPCC患者经常出现在一般人群;然而,一旦形成,他们发展成癌比零星的同行更快或更频繁或两者。26爵士乐但是没有区分腺瘤从正突变和变异负HNPCC家庭。本文提供的数据显示,腺瘤在突变阳性患者少,但有一个几乎相同数量的结肠直肠癌。因此,腺瘤癌突变阳性患者进行快速。
有遗传性结直肠癌的家庭没有DNA修复基因的突变,后发病的年龄,和降低频率相关的癌症,似乎代表了一个遗传群体的结肠直肠癌与底层高度渗透在未知基因的种系突变,重叠的散发病例主要由外生的因素和可能造成低渗透突变。然而,他们似乎有染色体不稳定(CIN)通路共同之处。这是高亮显示的全息数据从三个肿瘤突变阴性组显示CIN和非整倍体DNA,典型的零星的肿瘤CIN通路。
在突变阳性组有一个倾向更多的光学纤维癌症MSH2基因突变阳性组中观察到,只有50%的结肠直肠癌和70%的一种突变阳性组。包括所有胃肠道肿瘤如胃、小肠,食道癌,68%的癌症是胃肠道内MSH2和79%的一种突变阳性组,并没有统计学意义。
几项研究已经报道MSH2突变携带者子宫内膜癌的风险更高。25日,27日,28在我们的研究中,最常见的光学诊断癌症是子宫内膜癌,10%由于MLH1和MSH2突变阳性组的11%,这表明在子宫内膜癌的风险没有区别两个突变基因。
两个出版物描述临床变异之间的相同点与不同点积极和突变-家庭已经出版。Bisgaard和他的同事们29日发现,家庭没有突变子组可分为两个明显的区别。主要组没有突变的频率明显降低多个结肠直肠癌,以及较低的频率HNPCC相关癌症。此外,更常被诊断为直肠癌发病的年龄往往是晚于突变携带者。小群没有突变通常有相同的特点,确定突变的发现在受影响的人。因为这最后一组内肿瘤显示MSI,作者认为在DNA错配修复基因缺失可能病因。主要的临床特征组患者没有突变的临床特征与阿姆斯特丹阳性突变阴性组。
数据从斯科特和他的同事们30.同意我们的研究结果队列:一个显著发病的年龄后突变阴性组(+ 5年;我们的研究+ 10年)和子宫内膜和胃部的癌症突变阳性组中。然而,在斯科特的研究等,仅达到统计学意义MLH2突变阳性组。30.在这项研究中,发现了不确定病理的错义突变种,MSH2组。没有数据本地化的结肠直肠癌、MSI或免疫组织化学。错义突变可能发病的平均年龄增加由于病理低外显率或失踪。这些错义的致病性相关变异尚未透露。此外,基因缺失不是DGGE探测到,用于突变检测的斯科特和他的同事们。30.
我们的数据表明,家族历史的全面评价,包括突变和微卫星分析以及免疫组织化学结合临床文档,允许阿姆斯特丹积极的家庭分类为两个不同的临床实体。
主要的临床发病的年龄差异后,肿瘤,远端结肠直肠癌的本地化,肿瘤进展放缓突变-家庭。首先,这可能影响监测项目,尤其是间隔,没有证据表明加速肿瘤进展的突变阴性组。其次,癌症在随后的突变阳性组最小通路而肿瘤突变阴性组似乎遵循CIN的途径。寻找高渗透导致癌症的种系突变突变阴性组应该执行CIN的候选基因途径。
确认
这项工作是支持的德国癌症Aid-Mildred Scheel基础。
Y Mueller-Koch和H Vogelsang证实同样的,收集的数据评估数据,和准备手稿,包括遗传和临床咨询。R科普病人咨询,进行数据收集的手术,并且参与了数据的讨论。P Lohse负责微卫星分析路德维希马克西米利安大学。G·凯勒负责微卫星和变异分析巴黎大学。M谋杀不久我和贝克进行了组织准备微卫星分析、免疫组织化学及组织病理学评价肿瘤和腺瘤幻灯片路德维希马克西米利安大学和巴黎大学。维欧斯特负责病理报告以及全息调查。M总值和U Schiemann负责临床咨询、内窥镜、诊断和监测项目。M朔尔茨负责互联网平台和数据库所需的多中心文档。B Kerker, J多姆,和M格拉博夫斯基负责微卫星和突变分析在两个不同的实验室(路德维希马克西米利安大学)。G亨特负责数据收集和数据协调。 E Holinski-Feder was the laboratory supervisor at the Ludwig Maximilian University, in charge of the coordination of the whole working group, and together with Y Mueller-Koch and H. Vogelsang responsible for manuscript preparation.
引用
脚注
第一个2005年6月14日在线发表
↵*Y Mueller-Koch和H Vogelsang同样的贡献。
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