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文摘gydF4y2Ba
背景:gydF4y2Ba血管紧张素转换酶(ACE) 2是一个最近发现同系物的王牌counterregulate血管紧张素II (Ang)的行为,促进其分解和1 - 7。肾素-血管紧张素系统(RAS)已经与肝硬化的发病机制,但ACE2在肝脏疾病中的作用尚不清楚。gydF4y2Ba
目的:gydF4y2Ba本研究调查了肝损伤对ACE2表达的影响和人类活动在实验性肝纤维化和肝硬化,Ang 1 - 7的影响在肝硬化大鼠主动脉血管张力。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba在虚假的操作和胆管结扎(BDL)老鼠,定量反向transcriptase-polymerase连锁反应被用来评估肝ACE2 mRNA,免疫印迹和免疫组织化学量化本土化ACE2蛋白质。ACE2活动被猝灭荧光底物量化分析。类似的研究在正常的人类肝脏和丙型肝炎肝硬化。gydF4y2Ba
结果:gydF4y2BaACE2 mRNA在鼠肝可检测在低水平,增加BDL(363倍;p < 0.01)。ACE2蛋白质BDL后(增加23.5倍;p < 0.05)和ACE2活动(四倍;p < 0.05)。在人类肝硬化肝脏基因(> 30倍),蛋白表达(97倍),和ACE2活动(2.4折)增加与控制(p < 0.01)。在健康的肝脏,ACE2局限于内皮细胞,偶尔胆管,perivenular肝硬化肝细胞但BDL和人类普遍实质ACE2表达蛋白质。人工培养的肝细胞缺氧导致增加暴露ACE2表达。独自在preconstricted鼠主动脉,Ang 1 - 7并不影响血管的语气,但显著提高乙酰胆碱在肝硬化介导血管舒张血管。gydF4y2Ba
结论:gydF4y2BaACE2表达显著增加在人类和大鼠肝损伤,可能是为了增加肝细胞缺氧,并可能调节RAS活动肝硬化。gydF4y2Ba
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- 非典型肺炎,严重急性呼吸系统综合症gydF4y2Ba
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- 八强,猝灭荧光底物gydF4y2Ba
- PBS,磷酸缓冲盐gydF4y2Ba
- ABC, avidin-biotin复杂gydF4y2Ba
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来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba
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的主要效应肾素血管紧张素系统(RAS),血管紧张素II (Ang),是一个强有力的系统性血管收缩剂,心血管体内平衡中起着重要的作用。然而,有证据表明从研究范围广泛的器官,除了它的系统性影响,本地生产和二世会导致组织损伤和纤维化在许多慢性疾病。大量的研究也提供了证据表明,RAS导致慢性肝病的发病机制。有明显upregulation实验性损伤的肝内拉组件和RAS抑制剂可以抑制肝纤维化动物模型。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外,在先进的肝硬化有激活的系统性RAS肠系膜和系统性血管舒张。虽然血管收缩反应Angⅱ明显受损患者的肝脏疾病结束阶段,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba这个响应的系统性RAS过程中扮演着重要的角色在维持血压和肾脏灌注。gydF4y2Ba5,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba
血管紧张素转换酶(ACE) dipeptidyl羧肽酶,是一个关键酶在RAS和转换和我强有力的血管收缩剂和二世。gydF4y2Ba7gydF4y2BaACE2的王牌是最近确定的同系物gydF4y2Ba8日,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba与ACE,只有一个活跃的酶,降解和二世和1 - 7,劈开一个残留物从和我来生成血管紧张素1 - 9。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba和1 - 9没有已知的影响但转化为Ang 1 - 7 ACE(图1)。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba有证据表明,Ang 1 - 7可能调节RAS激活通过几种机制的影响,包括抑制ACE, AT1受体的封锁,由其直接对血管张力的影响。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba因此ACE2 RAS counterregulatory可能发挥重要作用,保护组织免受Angⅱ介导的损伤退化和二世和抑制其生产,并通过增加生产和1 - 7。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba
肾素血管紧张素系统(RAS)的示意图显示血管紧张素II (Ang)产生的主要途径和我通过血管紧张素转换酶(ACE),以及ACE2的作用降解和我和1 - 9,和二和血管舒张药和1 - 7。gydF4y2Ba
ACE2的内皮中描述的心脏,肾脏和睾丸,也发现在正常和小肠。gydF4y2Ba13gydF4y2BaACE2的生物作用的证据是由研究ACE2基因敲除小鼠。这些动物受损心脏的收缩性和upregulation缺氧诱导相关基因在心脏受损和退化二世,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba表明ACE2心脏功能的重要调节器和ACE2之间可能的联系和组织氧合。在高血压和糖尿病实验模型,肾脏的表达这种酶是降低,这可能导致Angⅱ介导的组织损伤。gydF4y2Ba14日,gydF4y2Ba15gydF4y2BaACE2也是一个功能受体的严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒,这表明它可能在SARS感染中发挥作用。gydF4y2Ba16日,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba
尽管ACE2在正常的人类肝脏组织的表达很低,gydF4y2Ba9gydF4y2BaACE2调制在肝脏疾病的可能性没有被探索。这项研究检查肝ACE2表达在正常大鼠和胆管结扎(BDL)大鼠肝纤维化模型,以及在正常的人类肝脏和丙型肝炎肝硬化肝脏切除在肝移植。我们也检查了可能的血管的影响在肝硬化Ang1-7研究preconstricted Ang 1 - 7的影响从健康和肝硬化大鼠主动脉环。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
实验过程是动物和人类的研究伦理委员会批准的奥斯汀澳大利亚卫生和执行根据NHMRC动物实验指南和赫尔辛基宣言的原则。Sprague-Dawley老鼠(200 - 250 g)被安置在一个十二12 h光暗周期,随意食品含有0.4 - -0.6%氯化钠(泄洪道,Lismore,新南威尔士、澳大利亚)和水。gydF4y2Ba
动物模型gydF4y2Ba
双重胆管结扎和横断面进行了大鼠(n = 9),如前所述。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba虚假的操作(控制)老鼠做过同样的手术,但是胆管结扎(n = 9)。在21天,动物被切除的肝脏牺牲后致命的麻醉。肝组织在4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,免疫组织化学研究。组织冻结定量反向transcriptase-polymerase连锁反应(存在)分析、免疫印迹和测量ACE2活动。gydF4y2Ba
在第二组实验中,老鼠牺牲7点14日和21天邮报BDL和虚假的操作之后21天每组(n = 4)为了确定ACE2的位置通过免疫组织化学方法蛋白表达在肝损伤的演化过程及其与细胞缺氧的关系,作为评估这种组织化学染色加合物。这些实验,这种盐酸(Hypoxyprobe-1)从Chemicon获得澳大利亚企业有限公司(部分没有90201年,维多利亚,澳大利亚)的形式包含1.0克盐酸这种密封的瓶。牺牲之前,老鼠犀牛的腹腔内注射pentobarbitone(戊巴比妥钠)、钠和盐酸注入丸这种(80毫克/公斤)溶解在0.9%无菌生理盐水注入颈静脉。注射后一个小时,老鼠又曝露,肝脏切除,固定在4%多聚甲醛磷酸缓冲盐(PBS)的解决方案,然后嵌入石蜡。gydF4y2Ba
人类的肝脏组织gydF4y2Ba
移植肝组织从经历了肝移植的患者丙型肝炎诱发肝硬化(n = 9)当时获得实时的移植和冷冻中存在分析、免疫印迹,ACE2活动的测量。控制肝脏包括一个供肝,一个外植体从病人移植血胆甾醇过多,和大肠癌转移的一个标本从切除肿瘤边缘。所有三个肝组织学上正常样本和存储在相同的方式作为肝硬化组织。丙型肝炎肝硬化肝脏组织从三个和三个正常肝脏缓冲福尔马林固定在10%免疫组织化学和原位杂交研究。gydF4y2Ba
隔离的总RNA和互补脱氧核糖核酸的合成gydF4y2Ba
从肝组织总RNA分离悬浮液通过均衡的一个Ultra-Turrax (Janke和Kunkel IKA, Labortechnik,德国)在试剂盒(生命表达载体技术,墨尔本,维多利亚,澳大利亚)。gydF4y2Ba15日,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸与逆转录酶合成反应进行了使用标准技术(上标第一链合成系统中存在;生命技术公司)与随机五个一,核苷酸,总RNA提取控制和病变的肝脏。一个整除的单一链cDNA用于实时PCR(存在)的实验中,如下所述。评估基因组DNA污染,控制没有逆转录酶是包括在内。gydF4y2Ba
实时定量rt - pcr(存在)gydF4y2Ba
存在是一个完全定量确定数量的信使rna的方法。短暂,特定基因5′核苷酸序列对应于人类的ACE (5′TGC CTA太极拳TTC CTA答CAG苑AA), ACE 3′寡核苷酸引物(5′ttg太极拳AAA ATC TAC CCC ACA答C),和ACE探针(FAM 5′atg有条件现金援助CCC TGC柠檬酸TTT GCT TGG T-TAMRA)鼠ACE2基因特定的5′寡核苷酸(5′GCC gg AGA TGA 20棉酚A),一个ACE2 3′寡核苷酸引物(5′ctg亚美大陆煤层气有限公司TCT CCA TGT CCC AGA TC),和ACE2探针(FAM5′ttg TCT GCC ACC CCA CA-MGBNFQ)使用软件程序设计,底漆表达(PE应用生物系统公司,福斯特城,加州,美国。gydF4y2Ba
代的扩增子期间定义的点骑自行车当扩增的PCR产品被检测到。存在反应发生500 nmol / l的正向和反向引物和50 nM FAM / TAMRA ACE / ACE2探针和维克/ TAMRA 18 s核糖体探针,在1×Taqman普遍PCR反应混合液(PE生物系统)。每个样本重复运行和分析。虚假的肝脏样本被用作校准器与给定值1和BDL组相比,这校准器。gydF4y2Ba15日,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba
西方墨点法gydF4y2Ba
西方墨点法ACE2的表现如前所述。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba从大鼠肝组织和人体组织是剁碎,resuspended缓冲区包含10毫米玫瑰,150毫米氯化钠,MgCl 1毫米EGTA, 5毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,0.02%的南gydF4y2Ba3gydF4y2Ba5% Triton×100, pH值7.4,0.5μg /毫升抑肽素,0.25毫克/毫升亮抑酶肽(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),0.1毫克/毫升苯甲脒、杆菌肽被添加和0.1毫克/毫升、和单一化13 000 rpm Ultra-Turrax (Janke和Kunkel IKA)和离心机在4°C 1000 g 30分钟。最后得到的上层清液被收集并存储在整除−80°C。样本(100µg蛋白质)加载并运行在10%的钠十二烷基硫酸变性凝胶在硝化纤维过滤器系统和transblotted (Hybond P, Amersham-Pharmacia生物技术,白金汉郡,英国)使用转运柜15 V 30分钟。最终转让、过滤器堵塞了三羟甲基氨基甲烷缓冲液脱脂脱脂奶粉10%生理盐水和0.1%渐变(TBS /渐变)在室温下一个小时。主ACE2抗体稀释浓度的1/5000,10%脱脂奶粉在TBS /渐变是孵化在室温下过夜。膜被彻底清洗三次清洗解决方案(TBS /渐变)。积极的乐队是利用免疫印迹分析系统开发(Amersham-Pharmacia生物技术,白金汉郡,英国),辣根过氧化物酶标记二次羊antirabbit抗体(Chemicon泰梅库拉,加州,美国)在1/2000稀释,在室温下孵化一小时。暴露出以下的影片乐队代表ACE2蛋白量化在自动成像系统(成像研究公司,圣凯瑟琳,安大略省,加拿大)。gydF4y2Ba
猝灭荧光底物测定ACE2活动gydF4y2Ba
肝匀浆(10µl)是对一个具体的猝灭荧光ACE2孵化基质(八强:(7-methoxycoumarin-4-yl) -acetyl-Ala-Pro-Lys (2, 4-dintirophenyl));Auspep, Parkville,维多利亚,澳大利亚),如前所述,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba一式两份。化验microtitre板块表现96年黑色好了200年最后一卷50µM八强µl每口井ACE2分析缓冲区(100毫米三,1 M氯化钠,pH值6.5)。最后DMSO溶液的浓度(用于溶解八强)为0.7%。在37°C反应进行30分钟内恒温器gydF4y2BafgydF4y2Ba最大荧光标仪(美国加州分子器件、桑尼维尔),阅读之前解放荧光(λex = 320海里,λem = 420海里)。乳沟的八强被归因于ACE2的使用一个特定抑制剂(S, S) 2 - (1-carboxy-2 - [3 - (3, 5-dichloro-benzyl) 3 h-imidazol-4-yl] -ethylamino) 4-methyl-pentanoic酸(mln - 4760;慷慨的礼物从娜塔莉·戴尔斯博士,千禧制药,剑桥,麻萨诸塞州,美国)1µM最终浓度。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba作为八强可以通过prolyl裂解肽链内切酶,这种酶的特定抑制剂,Z-Pro-prolinal(10µM),是包含在所有的井。具体活动的准备工作表示为单位的荧光/ mg膜蛋白/ h。gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
进行了免疫组织化学研究ACE2µm 4日如前所述的部分肝(人类和老鼠)石蜡包埋组织安装在硅烷涂层幻灯片。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba幻灯片在histolene脱蜡、水化分级乙醇,和内源性过氧化物酶活性被治疗部分3%过氧化氢在PBS为20分钟。ACE2的主要抗体(由博士捐赠阿克顿,千禧制药,剑桥,波士顿,麻萨诸塞州,美国)在室温下申请一个小时的幻灯片gydF4y2Ba15gydF4y2Ba稀释的1:50 0大鼠部分和1:800人类的部分。特殊染色在人类部分检测使用标准的ABC (avidin-biotin复杂)的方法。幻灯片是孵化20分钟二次抗体(生物素共轭山羊antirabbit免疫球蛋白;Dako,哥本哈根,丹麦)浓度的1/250。的avidin-biotin Vectastain ABC系统(向量实验室,伯林盖姆,加利福尼亚,美国)是申请20分钟。大鼠部分,具体染色检测使用酶SuperPicTure聚合物检测设备。幻灯片是孵化antirabbit辣根过氧化物酶聚合物15分钟。所有幻灯片的最后检测步骤进行了使用3、3′-diaminobenzidine(σ)作为发色体。部分与苏木精复染色。三种类型的控制进行测试来确定抗体的特异性。 Firstly, control sections were incubated with anti-ACE2 antibody solutions which had been preabsorbed with the synthetic peptide to which the antibody was raised (peptide sequence: NTNITEENVQNMNNAGDKW aa 51–69); secondly, sections were incubated with rabbit non-immune serum; and thirdly, sections were incubated with PBS without the primary antibodies. These control sections did not reveal any staining (see fig 4A).
疣状,这种绑定进行部分(4μm)从福尔马林固定石蜡包埋后肝脏样本制造商的指令(Chemicon国际)。短暂,部分deparaffinised、水化和孵化3%过氧化氢水溶液在室温下五分钟内源性过氧化物酶的灭活。抗原检索链霉蛋白酶消化后40分钟40°C,主单克隆抗体(Hypoxyprobe-1Mab1;Chemicon澳大利亚企业有限公司,90204)这种加合物的稀释1:50应用在室温下了40分钟。Biotin-conjugated F (c)二级山羊antimouse抗体(Sigma-Aldrich Pty Ltd,悉尼,澳大利亚),在1:50 0的稀释,然后申请10分钟之后在室温下通过孵化avidin-biotin Vectastain ABC系统实验室(向量)在室温下10分钟。积极的信号被检测到孵化的组织部分轻拍色原体在室温下10分钟。部分与苏木精复染色15秒和安装。作为一个消极的控制,采用正常山羊血清代替主要抗体。gydF4y2Ba
缺氧对ACE2表达培养肝细胞的影响gydF4y2Ba
人类肝癌细胞株HepG2从写明ATCC获得。细胞培养基和补品是从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。细胞被播种密度约为10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞每10厘米直径在10毫升培养皿MEM补充10%热灭活胎牛血清,100 U /毫升青霉素、链霉素和0.1毫克/毫升、和发展融合在37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的二氧化碳。gydF4y2Ba
文化达到融合时,培养基被删除,取而代之的是新鲜的媒介。细胞培养在一个密封的容器(AnaeroPack、三菱瓦斯化学有限公司、日本)下要么正常(室内空气,n = 5复制实验)或缺氧条件使用AnaeroGen系统(AnaeroGen Oxoid,来自英国)如前所述。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba后2、4或6小时的缺氧(n = 6复制每一组实验),培养基被撤复制文化和细胞单层膜冲洗短暂与PBS之前存储在−70°C为以后分析。gydF4y2Ba
血管反应和1 - 7gydF4y2Ba
这些研究在船舶进行Sprague-Dawley老鼠,4周后发生胆管结扎,在年龄和性别匹配控制使用前面描述的技术。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba简而言之,动物是牺牲和胸主动脉移除和清洁的结缔组织和脂肪。环切成3毫米段和放置在两个金属钩子在一个器官浴室(六环)。钱伯斯是保持在一个常数37°C和carbogen不断沸腾。戒指是留给平衡一小时没有紧张,然后紧张逐步增加到1gydF4y2BaggydF4y2Ba。之后,戒指被允许平衡30分钟,然后最大收缩被孵化获得血管高钾溶液(KgydF4y2Ba+gydF4y2Ba= 124毫米)。收缩后到达了一个高原,血管与柠檬酸漂洗三次(10分钟间隔)和允许休息一个小时。船只被简约与去甲肾上腺素最大的30 - 50%。gydF4y2Ba
在最初的研究中,船只被暴露于浓度增加和1 - 7 (10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)每隔一分钟超过10分钟。在另一项研究中,船舶到达了一个高原后,10gydF4y2Ba−6gydF4y2Ba和(1 - 7)添加到每一秒浴。一分钟后,增加浓度(10gydF4y2Ba−8gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba−5gydF4y2Ba)乙酰胆碱(Ach)被添加到所有浴,在半对数浓度只有每次血管舒张后到达了一个高原。每分放松了通过测量张力的变化从最初的苯肾上腺素收缩。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
所有数据显示为意味着(SEM)除非另有说明。由Mann-Whitney U测试数据进行了分析。一个p值小于0.05的被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
在BDL肝纤维化模型gydF4y2Ba
光学显微镜的苏木精和伊红染色肝部分21天BDL动物显示广泛的纤维化,胆管增生,没有肝硬化结节性转变。gydF4y2Ba
人类的肝脏组织学gydF4y2Ba
肝脏所建立丙型肝炎相关肝硬化不同程度的炎症活动和任何其他慢性肝脏疾病的证据。gydF4y2Ba
在大鼠组织ACE2表达和活动gydF4y2Ba
只有低水平的ACE2 mRNA表达被发现在控制大鼠肝组织但这些BDL后增加363倍(p < 0.01)(图2)。西方分析显示低水平的ACE2蛋白质控制肝脏胆管结扎后增加了23.5倍(p < 0.05)(图2 b 2 c)。ACE2表达的增加与增加四倍ACE2 BDL肝脏中酶活性比对照组(p < 0.05)(图2 d)。gydF4y2Ba
血管紧张素转换酶2 (ACE2)表达和虚假的经营活动控制和胆管结扎(BDL)大鼠肝脏。(A)量化定量反向transcriptase-polymerase ACE2 mRNA的连锁反应,与控制任意标准化值为1。值意味着(SEM),在每一组n = 6;* p < 0.01, BDL与控制。(B)免疫印迹ACE2蛋白质控制和BDL肝脏。(C)西方的屁股的量化。值意味着(SEM);* p < 0.05, BDL与控制。(D)在虚假和BDL ACE2活动。值意味着(SEM), n = 9每组; *p<0.05, BDL versus control.
ACE2在人类肝脏蛋白质和活动gydF4y2Ba
在鼠肝、ACE2 mRNA在健康的肝脏可检测在低水平。ACE2 mRNA水平调节34倍在丙型肝炎诱发肝硬化肝组织与控制(p < 0.01)(图3)。这是与97倍增加ACE2蛋白质免疫印迹(p < 0.01)(图3 b, C),而ACE2活动与控制相比增加2.4倍(p < 0.01)(图3 d)。gydF4y2Ba
血管紧张素转换酶2 (ACE2)表达和活动在正常和肝硬化(HepC)人类的肝脏。(A)量化定量反向transcriptase-polymerase ACE2 mRNA的连锁反应,正常的人类(n = 3)和肝硬化肝脏(n = 20)控制任意标准化值为1。值意味着(SEM);* p < 0.01,肝硬化与控制。(B)的免疫印迹ACE2蛋白质在正常和肝硬化肝脏。(C)定量免疫印迹在正常和肝硬化肝脏。值意味着(SEM),每组n = 3和4,分别;* p < 0.01,侦测与正常。(D) ACE2活动在正常和肝硬化肝脏。值意味着(SEM), n = 3, n = 9,分别; *p<0.01, cirrhotics versus normal.
本地化ACE2表达,这种染色gydF4y2Ba
免疫组织化学显示肝脏从虚假的操作控制的老鼠,只有一小部分细胞ACE2表达蛋白质,这是几乎完全局限于perivenular肝细胞(图4 b)。发现在这些肝脏,缺氧的存在这种加合物染色在perivenular模式影响perivenular最后一行的肝细胞,类似于看到ACE2 immunolabelling(图4 c)。从动物肝脏,就读于七天邮报BDL(图4 d), ACE2表达明显增加,涉及30 - 40%的细胞在每一个小叶。然而,最强的标签还在perivenular细胞(图4 d)。在14天邮报BDL ACE2染色有进一步增加。在21天有非常广泛的ACE2表达,与染色确定在80%以上的肝细胞和胆管上皮细胞和内皮细胞(图4 e)。在这些肝脏,这种加合物被发现在大多数肝细胞符合ACE2表达的模式(图4 e, F)。gydF4y2Ba
免疫组织化学染色的血管紧张素转换酶2 (ACE2)蛋白在老鼠和人类肝脏。在大鼠肝脏,这种免疫染色被用作标记的细胞缺氧。正常大鼠肝脏第一行所示(a - c)。没有肝ACE2染色检测后ACE2肽preabsorption (A),确认的特异性抗体用于检测ACE2。在正常肝脏。ACE2 immunolabelling (B)和染色,这种加合物(C,箭头)是限于perivenular肝细胞。胆管结扎(BDL)大鼠肝脏第二行(D-F)所示。在大鼠肝脏后七天BDL (D), ACE2表达异构和普遍比在正常肝脏。在21天邮报BDL,疣状ACE2 (E)和这种加合物(F)中检测出超过80%的肝细胞,与ACE2在胆管细胞和内皮细胞也发现。(胃肠道)人类的肝脏。 In normal liver, ACE2 was detected in hepatocytes surrounding occasional larger central veins (G, arrow). In cirrhotic liver, there was widespread ACE2 expression throughout cirrhotic nodules (H) and in bile duct cells (BD) and endothelial cells lining small blood vessels (BV) (I). Original magnifications ×850, except (4G) and (4H) × 450, and (4I) ×1700.
在正常的人类肝脏、ACE2染色是最小的,而且仅限于偶尔的胆管细胞,血管内皮,perivenular肝细胞(图4 g)。相比之下,在人类肝肝硬化,ACE2在肝硬化结节被发现在大多数肝细胞,以及胆管细胞和血管内皮细胞(图4 h,我)。gydF4y2Ba
在肝细胞缺氧对ACE2表达的影响gydF4y2Ba
HepG2细胞培养中ACE2 mRNA的表达在常氧(室内空气)和缺氧的条件下被存在评估。ACE2表达明显高于细胞在缺氧条件下孵化和增加缺氧时间(在两个小时增长了1.69倍,1.81倍在4个小时,6小时和2.61倍(p = 0.01, 0.04,和0.01,分别)。gydF4y2Ba
血管反应和1 - 7gydF4y2Ba
单独添加和1 - 7 preconstricted主动脉环产生对血管张力的影响不显著。空调采暖产生显著血管舒张健康和肝硬化大鼠血管(图5)。然而,尽管盎1 - 7没有影响应对Ach在正常血管,它在肝硬化增强Ach介导血管舒张血管(p < 0.05)。gydF4y2Ba
血管紧张素1 - 7 (Ang)对反应的影响乙酰胆碱(Ach)在主动脉环从正常(Con)和胆管结扎(BDL)老鼠。增加和1 - 7器官浴增强Ach介导的血管舒张血管从BDL老鼠。* * * * * p < 0.01, p < 0.001与控制;†p = 0.043和BDL。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
虽然在正常肝脏组织ACE2表达很低,gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba这项研究的结果显示,在老鼠和人类肝脏疾病有重大upregulation肝ACE2基因和蛋白质含量,伴随着ACE2活动明显增加。这些发现表明,慢性肝损伤原因主要增加肝ACE2表达,提高的可能性,它可能在疾病发病机制中发挥作用。gydF4y2Ba
迄今为止的证据表明在正常生理ACE2表达比王牌,限制,局部的心脏,肾脏,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba睾丸,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba和大小肠。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba使用中存在高度敏感技术,低水平的ACE2 mRNA已发现在正常人类的肝脏gydF4y2Ba13gydF4y2Ba这是符合我们自己的发现控制啮齿动物和人类的肝脏。我们以前所示BDL肝脏血管增生的胆管上皮细胞蛋白质丰富,符合研究确定的肾上皮细胞作为主要站点的ACE和ACE2表达。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba然而,目前的研究表明,ACE2也强烈的表达在慢性肝损伤的肝细胞在这个模型。这些模式的upregulation ACE和ACE2是否特定于BDL模型是未知的,和表达其他实验性肝纤维化模型的RAS值得研究。然而,我们发现在人类丙型肝炎诱发肝硬化肝脏表明普遍ACE2表达增加可能是肝损伤的一个通用特性在老鼠和人类。gydF4y2Ba
到目前为止,很少有报道解决ACE2表达在其他疾病。第一个由CrackowergydF4y2Ba等gydF4y2Ba表明,ACE2 mRNA和蛋白水平表达下调在高血压的大鼠模型。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba此外,在相同的研究中,发现ACE2基因敲除小鼠发达受损心脏功能让人们相信假设这种酶是一个心脏功能的关键调节器。第二项研究表明ACE2基因和蛋白表达减少在实验性糖尿病和肾脏这平行的ACE表达的变化。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba它被假定ACE2可能函数与ACE调节血管紧张素肽的生成和降解,包括和我,和二世,和1 - 9,和1 - 7。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba这是发现,组织支持的Angⅱ水平显著增加在ACE2基因敲除小鼠,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba表明,ACE和ACE2 counterregulatory功能。gydF4y2Ba
ACE2基因敲除小鼠的心的发现海拔Angⅱ水平与upregulation缺氧诱导的基因相关联gydF4y2Ba14gydF4y2BaACE2可能表明一个重要的角色来维持当地的组织灌注和氧合,并减少Angⅱ介导的血管收缩。ACE2的概念可能是调节响应组织缺氧支持我们最近发现ACE2表达增加心肌缺血。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba我们的发现在肝脏也符合这个想法,ACE2表达在正常肝脏是主要局限于perivenular肝细胞,小叶细胞暴露于氧含量最低。之前已经表明,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba这些细胞中存在缺氧证实了这种染色。有相当多的证据表明,肝纤维发生与进步的肝细胞的氧化损伤有关,可能的原因包括正弦capillarisation,肝内分流,血管收缩,正弦流中断。之前已经证明,在我们的研究中有广泛的染色,这种加合物在纤维化的肝脏,指示的发展广泛的肝细胞缺氧,可能刺激增加ACE2的生产。符合这一假设,我们发现在HepG2细胞,ACE2 mRNA表达逐步上升以应对增加的缺氧。使用一个类似的实验方法,CorpechotgydF4y2Ba等gydF4y2Ba演示了一个类似程度的upregulation缺氧诱导生长因子的低氧分离大鼠肝细胞中血管内皮生长因子。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba
然而,在BDL肝、与其他组织损伤的模型,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba有一种普遍的表达增加ACE RAS和其他组件。gydF4y2Ba2gydF4y2BaUpregulation ACE2及其广泛表达在肝脏BDL可能因此代表了更一般的counterregulatory应对增加ACE水平和增加当地Angⅱ生产的多种有害的影响。ACE2 upregulation也可能导致肝硬化的血管舒张退化和二世,这可能有助于解释为什么血管收缩剂反应和二世是受损的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和血管舒张晚期肝脏疾病患者坚持尽管系统性RAS激活。gydF4y2Ba5,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba此外,ACE2生成和1 - 7,这肽可以减少Angⅱ生产通过抑制ACE和减少Angⅱ介导的血管收缩通过阻断AT1受体。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba它也表明,在一些组织,和1 - 7可以作为一个强有力的血管舒张。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba我们的研究证实,在老鼠和人类肝脏ACE2表达和酶活性增加,会促进退化和二世和Ang 1 - 7的形成。我们还发现,在大鼠主动脉和1 - 7对血管张力没有可衡量的影响,它从肝硬化大鼠增强Ach介导的血管舒张血管。可能的机制包括增强前列腺素类释放血管平滑肌细胞和直接刺激一氧化氮的合成。gydF4y2Ba25 -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba这些血管的影响和1 - 7表明进一步机制ACE2可能有助于改变血管张力在肝硬化。gydF4y2Ba
ACE2也是一个功能受体的SARS冠状病毒和SARS感染中起着重要的作用。SARS患者的肝损伤是常见的,它最近表明,SARS冠状病毒引起肝炎的特点是独特的小叶炎症和肝细胞凋亡。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba我们发现非典型肺炎的主要细胞受体存在于肝脏和增加在肝损伤提供了一个潜在的解释发现SARS感染的肝脏。gydF4y2Ba
最近的研究已经指向RAS的重要性在肝纤维化的发展gydF4y2Ba4gydF4y2Ba这个系统和调制的潜在好处通过ACE抑制或盎受体拮抗。gydF4y2Ba2,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba主要的发现upregulation BDL ACE2的老鼠和人类肝硬化肝脏进一步洞察RAS及其监管的复杂性肝损伤。在未来,特定的调节器ACE2活动和功能的发展将有助于确定ACE2的作用在肝脏疾病的病理生理学。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
Paizis博士获得了国家卫生和医学研究委员会(NHMRC)医学研究生研究奖学金。NHMRC研究资助,爱德华·邓洛普爵士基金会澳大利亚啤酒制造商协会和奥斯汀医院医学研究基金会。gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
2005年9月发表前15gydF4y2Ba
利益冲突:没有宣布。gydF4y2Ba