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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
胃gydF4y2Ba
苹果多酚提取物在体外对人胃上皮细胞和在体内对大鼠胃黏膜均有损伤作用gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. G GrazianigydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  2. G D 'ArgeniogydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  3. C TuccillogydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  4. C LoguerciogydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  5. 一个RitienigydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  6. F莫里斯舞gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  7. ——德尔·维奇奥·布兰科gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  8. V FoglianogydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
  9. M·罗马诺gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2BaDipartimento di Scienza degli Alimenti, Università di Napoli“Federico II”Parco Gussone, Ed 84-80055 Portici (NA)，意大利gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba消化病学，Università费德里科二世，那不勒斯，意大利gydF4y2Ba
  3. 3.gydF4y2Ba大学间食品研究中心，营养和数字仪器研究中心(CIRANAD)和实验内科手术中心，消化病学和第二医院Università意大利那不勒斯gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    罗马诺博士gydF4y2Ba
    实验肠胃病临床实验室，第二部，第三部，钢琴，Via Pansini 5, 80131那不勒斯，意大利;gydF4y2Bamarco.romanounina2.itgydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景:gydF4y2Ba新鲜水果和蔬菜对胃肠粘膜有多种生物学作用。gydF4y2Ba

目的:gydF4y2Ba评价苹果提取物对氧化或吲哚美辛诱导的胃上皮细胞损伤的体外拮抗作用，以及对大鼠胃黏膜的体内拮抗作用。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba苹果提取物是从冷冻干燥的“Annurca”品种的苹果果肉中获得的。用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶或吲哚美辛孵育mkn28细胞，诱导细胞损伤，MTT定量。吲哚美辛35 mg/kg诱导体内胃损伤。用(2,2′-azinobis(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸盐)法测定细胞内抗氧化活性。采用高压液相色谱-荧光法测定脂质过氧化指标丙二醛细胞内浓度。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Ba(1)苹果提取物使黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶或吲哚美辛诱导的胃上皮细胞损伤降低50%;(2)苹果提取物中的主要酚类成分儿茶素或绿原酸与苹果提取物对胃细胞的抗氧化损伤作用相同;(3)苹果提取物(i)使细胞内抗氧化活性提高4倍，(ii)阻止黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶诱导的细胞内抗氧化活性降低，(iii)抵消黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶诱导的脂质过氧化，(iv)减少吲哚美辛对大鼠胃粘膜的损伤40%。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba苹果提取物在体外对人胃上皮细胞和在体内对大鼠胃黏膜均有拮抗作用。这种效果似乎与苹果酚类化合物的抗氧化活性有关。富含苹果抗氧化剂的饮食可能对预防与产生活性氧有关的胃疾病起有益作用。gydF4y2Ba

  • ROS，活性氧gydF4y2Ba
  • 非甾体抗炎药gydF4y2Ba
  • APE，苹果多酚提取物gydF4y2Ba
  • BHT，丁基羟基甲苯gydF4y2Ba
  • HPLC，高压液相色谱法gydF4y2Ba
  • 猫,儿茶素gydF4y2Ba
  • CA，绿原酸gydF4y2Ba
  • ECAT,表儿茶素gydF4y2Ba
  • X,黄嘌呤gydF4y2Ba
  • XO，黄嘌呤氧化酶gydF4y2Ba
  • MTT, 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵gydF4y2Ba
  • LDH，乳酸脱氢酶gydF4y2Ba
  • MDA(丙二醛gydF4y2Ba
  • mkn28个胃细胞gydF4y2Ba
  • 苹果酚类化合物gydF4y2Ba
  • 活性氧gydF4y2Ba
  • 胃粘膜gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2004.046292gydF4y2Ba

数据来自Altmetric.comgydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    胃中大量产生活性氧(ROS)，其浓度比其他组织或血浆高1000倍。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在体外和体内，ROS的产生对胃粘膜产生外源性损伤。gydF4y2Ba2 -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外，ROS在导致胃腺癌发展的多步骤过程中起着重要作用。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba

    据报道，新鲜水果和蔬菜因其抗氧化剂含量而对胃肠道粘膜产生多种生物效应。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba特别是，富含蔬菜的饮食与较低的胃癌发病率有关。gydF4y2Ba7，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba还有Eberhardt和他的同事gydF4y2Ba9gydF4y2Ba报道了苹果提取物对体外肿瘤细胞增殖的强烈抑制作用，并提示其抗增殖作用可能是由于植物化学物质(酚酸和类黄酮)的存在，而不是抗坏血酸。因此，膳食抗氧化剂通过抵消活性氧对粘膜的潜在损害作用，在维持胃内稳态方面发挥着至关重要的作用。gydF4y2Ba

    众所周知，膳食抗氧化剂能清除氧和氮自由基，打破脂质链过氧化反应。酚类化合物是膳食抗氧化剂的主要类别之一，特别是苹果酚类化合物占美国消费者膳食中酚类化合物总量的22%。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba除了作为自由基清除剂外，酚类化合物还有一些间接作用;它们可以抑制脂氧合酶，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba减少血小板聚集gydF4y2Ba12gydF4y2Ba降低食品致癌物的生物利用度。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba某些类黄酮或具有类黄酮性质的化合物具有抗溃疡活性，并预防由许多溃疡原引起的胃粘膜损伤。gydF4y2Ba14 -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba苹果酚类化合物是否对氧化应激相关的胃上皮细胞损伤有保护作用尚不清楚。gydF4y2Ba

    因此，本研究设计:(1)评价苹果多酚提取物(APE)在不受胃分泌或全身因素(包括血流量)影响的情况下，是否能在体外防止ROS诱导的人胃上皮细胞损伤;以及(2)确定负责任何此类保护作用的机制。我们决定使用培养的胃上皮细胞作为实验模型，胃上皮内膜是内源性产生的ROS和膳食抗氧化剂在体内发生相互作用的第一个位点。非甾体类抗炎药(NSAIDs)，尤其是消炎痛或阿司匹林对胃粘膜的损伤，部分是由ROS的产生介导的。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba17gydF4y2Ba我们之前研究了吲哚美辛和阿司匹林对小鼠诱导的细胞空泡化的影响gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba在mkn28细胞中发现了类似的结果。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba因此，我们在体外和体内研究APE是否能预防非甾体抗炎药诱导的大鼠胃粘膜损伤，并选择消炎痛作为非甾体抗炎药损伤的例子。gydF4y2Ba

    材料与方法gydF4y2Ba

    苹果提取物的制备gydF4y2Ba

    冷冻干燥的“Annurca”品种的苹果肉(1克)用5毫升含1%丁基羟基甲苯(BHT)的甲醇提取。连续三次提取，在4°C的黑暗中进行1小时。甲醇提取物经Millipore Millex-GN 0.2 μm滤池过滤后，采用高压液相色谱法(HPLC)和质谱法分析。同样的提取物被测定抗氧化活性和测量对培养的胃细胞的保护作用。gydF4y2Ba

    苹果果肉提取物中酚类化合物的鉴定与定量gydF4y2Ba

    酚类化合物采用HPLC (shimadu - class M10)分离，配置LC-10AD泵、SPD-M10A二极管阵列检测器和rhedyne注射器。流动相(流速为1ml /min)由酸化水(0.01 M磷酸，溶剂A)和甲醇(溶剂B)组成。按以下梯度分离:0 min 5% B;10分钟50% B;20分钟70% B;25分钟80% B;30分钟100% B;35分钟50% B;40分钟5% b时，酚类化合物测定为(+)-儿茶素(CAT)，绿原酸(CA)，(−)-表儿茶素(ECAT)，咖啡酸，芦丁和佛利地津。分析分离是在Luna反相C上进行的gydF4y2Ba18gydF4y2Ba(5 μm)柱(25×4.6 mm ID)。所有溶剂均为HPLC级，使用前在室温下用氦脱气。在280nm处检测到CAT、ECAT、泡虫津和芦丁，在325nm处检测到CA和咖啡酸。酚类化合物以mg/100 g鲜重表示。如其他地方所述，通过HPLC-ESI-MS分析鉴定APE中存在的酚类化合物。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba为了得到APE的摩尔浓度，我们考虑了色谱中所有峰的总和，并使用CAT的校准曲线进行量化。因此，APE量以CAT当量表示。gydF4y2Ba

    细胞培养gydF4y2Ba

    mkn28细胞来源于人分化良好的胃管腺癌，并表现为胃型分化。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中单层培养，培养基中添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液(Life Technologies Inc.， Gaithersburg, Maryland, USA)，温度37℃，湿度5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在空气中。细胞毒性实验采用无血清培养基(不添加抗生素-抗真菌液)进行。gydF4y2Ba

    诱导氧化应激gydF4y2Ba

    通过将MKN 28细胞与黄嘌呤氧化酶(XO 10-100 mU/ml)在其底物黄嘌呤(X 1 mM)的存在下孵育3小时诱导氧化应激。在培养中暴露于X-XO的胃细胞会导致显著的细胞损伤，这已被证明是由于ROS的产生，特别是H产生的OHgydF4y2Ba2gydF4y2Ba0gydF4y2Ba2gydF4y2Ba通过铁催化芬顿反应。gydF4y2Ba21，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba

    细胞生存能力gydF4y2Ba

    用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵)法测定细胞活力。简单地说，在每个孔中加入10 μl MTT (5 mg/ml生理盐水)，样品在37°C下孵育90分钟，离心(300gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟)。吸除上清液后，加入含异丙醇的0.04 N HCl 100 μl溶解细胞。使用Microplate Reader在590 nm处分析每个样品的吸光度。细胞活力(%)的计算方法为:用试验药物培养的细胞获得的样品的吸光度除以仅用组织培养基培养的细胞(对照)获得的样品的吸光度，并将该比率乘以100。数据以重复进行的三次实验的平均值(SD)表示。此外，如Hiraishi及其同事先前描述的那样，测定细胞的细胞质乳酸脱氢酶(LDH)的释放作为细胞毒性的标志。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba由于氧化剂的存在可能会干扰乳酸脱氢酶释放量的测量，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba与X和XO细胞孵育后，轻洗两次，在培养条件下在无血清培养基中进一步培养5小时。上清液(100 μl)在Beckman微型离心机中以10000转/分钟的速度离心1分钟，上清液保存于−20℃，待测定。用Sigma试剂盒在340 nm分光光度法测定乳酸脱氢酶。用0.2% Triton X-100培养孔测定总乳酸脱氢酶含量，取平均值为总乳酸脱氢酶。LDH的特异性释放表达为gydF4y2Ba

    (a - b) / (cb)×100gydF4y2Ba

    其中A代表暴露于X-XO后释放的LDH, B代表自发释放的LDH(即对照未处理细胞的LDH释放)，C代表总LDH释放。在孵育5小时后，乳酸脱氢酶自发释放约占总乳酸脱氢酶的10%。gydF4y2Ba

    mkn28细胞中酚类化合物的定量gydF4y2Ba

    用磷酸盐缓冲生理盐水大量清洗球团(60万个细胞/ml)，用300 μl甲醇(0.01% BHT)在4℃超声浴中提取30分钟。最后的提取物在13000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba上清液在与苹果果肉提取物相同的条件下进行HPLC分析。在这种情况下，酚类化合物以ng/10表示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

    抗氧化活性测定gydF4y2Ba

    如Pellegrini及其同事所述，采用ABTS法测定甲醇提取物的抗氧化活性，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba使用用于HPLC分析的相同提取物。总抗氧化活性测定是氧化应激的一种间接测量方法，可作为氧化应激/抗氧化平衡的指标应用于生物物质。简单地说，100 μl的1:80稀释提取物溶解于CHgydF4y2Ba3.gydF4y2BaOH进行了测试。抗氧化活性以μM trolox/100 g鲜重表示。在每次处理后，还测量了细胞球的抗氧化活性;抗氧化活性以μM trolox/10表示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

    脂质过氧化测定gydF4y2Ba

    脂质过氧化通过测定细胞丙二醛(MDA)测定。采用高效液相色谱-荧光法，参照Bergamo及其同事的方法测定细胞丙二醛。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba加入10%冷TCA 250 μl后，用250 μl milliq水在超声波浴中提取细胞微球30分钟。样品大力混合(3分钟)和离心(5分钟，10000gydF4y2BaggydF4y2Ba)．上清液加入硫代巴比妥酸制备的700 μl硫代巴比妥酸，置于2 M醋酸缓冲液中，pH值为3，真空泵脱气(5分钟)，氮气冲洗10分钟。将混合物脱气，然后在90°C下孵育30分钟。在孵育期结束时，样品冷却，离心(5分钟，10000gydF4y2BaggydF4y2Ba)去除颗粒物质，最后用高效液相色谱法分析样品的等分量(20 μl)。MDA的定量是通过注射增加量的标准MDA构建的校准曲线来获得的。MDA浓度为μg/10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

    诱导胃粘膜损伤gydF4y2Ba

    体重180-220克的雄性Wistar大鼠被随机分为四组，每组8只，并被关在有金属底的笼子里，免费提供水和标准的实验室大鼠食物。动物来自意大利莫里尼(Morini)，在22±1°C的受控温度条件下饲养，并进行12小时的明暗循环。大鼠在实验前20小时禁食，并允许自由饮水。这些实验得到了大学伦理委员会的批准。16只动物(每个研究组8只)接受APE 10治疗gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM组或对照组(对照组)10天，以饮用饮料的方式给药，然后给予吲哚美辛35 mg/kg皮下注射。另一组16只大鼠(每个研究组8只)接受APE 10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM (2 ml)或对照(对照)在消炎痛前1小时灌胃。麻醉下给药4小时后处死动物。取出胃，沿着大弯曲切开，用冷盐水冲洗，检查宏观损伤。然后，在方形网格(x10)解剖显微镜下测量体粘膜出血病变的面积，每个胃求和，作为病变评分。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba取组织学样本。测量病变(GD)的研究人员不知道给予动物的治疗。gydF4y2Ba

    组织学gydF4y2Ba

    用于光镜检查的样品取自位于沿胃大弯曲将前胃与腺上皮分开的极限脊下2毫米处的胃腺上皮区域。取下与胃长轴成直角的块。一个光镜下尺寸为1 mm×10 mm的样品被移除。在第一个采样区远端约0.5 cm处对第二个样本进行相同的处理。gydF4y2Ba28gydF4y2Ba因此，取出两个光镜块，固定在福尔马林中，并对每个组织进行处理。使用苏木精和伊红染色的石蜡包埋切片，定量粘膜损伤程度。通过对幻灯片进行盲法检查，使检查者不熟悉实验规程。只有在检查完成后，它们才被解码。使用分级千分尺目镜，在每个胃的每个组织块对中测量组织切片的总长度，并确定相应的粘膜表面损伤长度百分比。如果出现以下一项或多项标准:表面不连续、腺体扩张、出血或浅表细胞损伤，则认为粘膜损伤。gydF4y2Ba

    统计分析gydF4y2Ba

    数据以均值(SD)表示。差异的显著性通过单向方差分析(ANOVA)和(当F值显著时)Tukey-Krammer检验进行多重比较或由学生进行gydF4y2BatgydF4y2Ba检验两个平均数之间的比较。gydF4y2Ba29gydF4y2Bap<0.05为差异显著。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    苹果酚类化合物的鉴定与浓度gydF4y2Ba

    表1列出了苹果果肉提取物中存在的酚类化合物及其浓度。绿原酸的浓度最高，其次是CAT、ECAT和phoridizin。这与之前文献报道的数据一致。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba31gydF4y2Ba咖啡酸和其他酚酸只存在于低浓度。gydF4y2Ba

    查看该表:gydF4y2Ba
    表1gydF4y2Ba

    苹果果肉中主要酚类物质的质定量分析gydF4y2Ba

    氧化应激对mkn28细胞活力的影响gydF4y2Ba

    我们首先试图研究mkn28细胞是否易受氧化应激诱导的损伤。用XO (10-100 mU/ml)在底物X (1 mM)的存在下孵育上皮细胞单层长达3小时，诱导氧化应激。gydF4y2Ba21，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba两个小时孵化与X(1毫米)和XO(10 - 100亩/毫升)导致剂量依赖性和显著(p < 0.05)减少细胞生存能力,MTT试验评估(图1)。对于以下实验浓度的X(1毫米)和XO(50亩/毫升)选择导致细胞生存能力下降接近60%(图1),我们使用LDH测定获得类似的结果(数据未显示),因此在接下来的实验细胞生存能力只有通过MTT试验确定。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)剂量依赖性损伤mkn28细胞。细胞用XO (10-100 mU/ml)在X 1mm或无血清培养基(对照)中孵育2小时。来自三个独立实验的均值(SD)。*与对照组相比p<0.05。gydF4y2Ba

    APE对X-XO诱导细胞损伤的影响gydF4y2Ba

    然后我们检查了APE预处理是否抵消了X-XO对mkn28细胞的损伤。APE在不改变细胞活力的浓度下使用，以剂量依赖的方式防止X-XO诱导的细胞损伤(图2)。特别是，用APE 10预处理gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba与仅暴露于X-XO的细胞相比，X-XO前3小时的M引起细胞活力显著增加(即70%)gydF4y2BavgydF4y2Ba分别为40%;p < 0.05)。此外，APE的时间进程gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM的保护效果在3小时时显示出最大的保护效果，随着时间的推移而下降，在20小时时几乎可以忽略不计(表2)。gydF4y2Ba

    查看该表:gydF4y2Ba
    表2gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)诱导的细胞损伤的保护作用时间进程gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)诱导的mkn28细胞损伤具有剂量依赖性。mkn28细胞与APE 10孵育gydF4y2Ba−7gydF4y2Ba到10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM或用无血清培养基(对照)浸泡3小时，清洗后用X (1 mM)-XO (50 mU/ml)或无血清培养基浸泡2小时。来自三个独立实验的均值(SD)。*与对照组相比p<0.05;†p<0.05相对于X-XO。gydF4y2Ba

    APE组分对X-XO致细胞损伤的影响gydF4y2Ba

    我们测试了APE的主要酚类成分CAT或CA是否能防止X-XO对mkn28细胞的损伤。CAT 10预处理3小时gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM或CA 10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM本身不影响细胞活力，但对X-XO损伤具有与APE 10相当的保护作用gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba特别是，CA似乎比CAT更有效(70%)gydF4y2BavgydF4y2Ba细胞存活率分别为60%)，尽管这在统计上没有差异。因此，单纯的CAT或CA在预防X-XO对mkn28细胞的损伤方面与APE一样有效。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)、儿茶素(CAT)或绿原酸(CA)对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)诱导细胞损伤的保护作用细胞用无血清培养基(对照)或APE (10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)，猫(10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)，或CA(10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)浸泡3小时，清洗后用X (1 mM)-XO (50 mU/ml)或无血清培养基(对照)浸泡2小时。来自三个独立实验的均值(SD)。*与对照组相比p<0.05;†p<0.05相对于X-XO。gydF4y2Ba

    X-XO或APE对mkn28细胞中酚类化合物浓度的影响gydF4y2Ba

    为了阐明APE发挥保护作用的机制，我们通过测量APE 10孵卵后主要苹果酚类化合物(即CAT、CA和ECAT)的细胞内浓度来确定苹果酚类化合物是否能够进入MKN 28细胞gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM. CAT、CA或ECAT在未处理的(对照组)mkn28细胞中未检测到(数据未显示)。与APE孵卵后，CAT、CA和ECAT的细胞内浓度显著增加(表2)，从而表明这些化合物能够穿透细胞膜。在APE预处理后，将细胞暴露在X-XO中2小时，APE诱导的CAT、CA或ECAT浓度的增加显著减少(表3)。这表明，苹果酚类化合物被消耗以抵消X-XO产生的ROS诱导的氧化应激。另一种可能性是，随着细胞变得不那么有活力，这些化合物可能会由于细胞渗透性的增加而被挤出。为了排除这一可能性，我们测定了APE预处理的细胞培养液中酚类化合物的浓度，然后暴露于X-X0或无血清培养液(对照)，发现没有显著差异(数据未显示)。gydF4y2Ba

    查看该表:gydF4y2Ba
    表3gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)或APE加黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)对苹果主要酚类化合物胞内浓度的影响gydF4y2Ba

    APE或X-XO对mkn28细胞内抗氧化活性的影响gydF4y2Ba

    为了进一步阐明APE对氧化应激诱导的细胞损伤的保护作用机制，我们首先研究了X-XO是否降低了MKN 28细胞的细胞内抗氧化活性，以及APE是否能够抵消这种作用。猿10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM使细胞内抗氧化活性增加了约4.0倍，而X-XO与未处理(对照)细胞相比，细胞内抗氧化活性降低了约2.0倍(图4A)。猿10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM完全且显著地抵消了X-XO诱导的细胞内抗氧化活性下降(图4A)。纯CAT或CA也可获得类似的细胞内抗氧化活性增加(数据未显示)。这表明APE的保护作用至少部分与它的抗氧化活性有关。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)对mkn28细胞总抗氧化活性和脂质过氧化的影响(A) APE阻止了黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)诱导的mkn28细胞总抗氧化活性的降低。细胞用无血清培养基(对照)或APE处理(10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)孵育3小时，然后用无血清培养基或X (1 mM)-XO (50 mU/ml)孵育2小时。重复进行三个独立实验的平均值(SD)。*与对照组相比p<0.05;†p<0.05相对于X-XO。(B) APE阻止了X-XO诱导的mkn28细胞MDA的升高。细胞用无血清培养基(对照)或APE处理(10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)孵育3小时，然后用无血清培养基或X (1 mM)-XO (50 mU/ml)孵育2小时。来自三个独立实验的均值(SD)。*与对照组相比p<0.05;†p<0.05相对于X-XO。gydF4y2Ba

    APE对X-XO诱导的mkn28细胞脂质过氧化的影响gydF4y2Ba

    ROS诱导的细胞损伤与脂质过氧化引起的细胞膜破坏有关。因此，我们假设APE可能阻止X-XO产生的ROS带来的脂质过氧化。为了解决这个问题，我们评估了X-XO是否增加了细胞MDA(脂质过氧化的标志)，以及APE预处理是否能够抵消这种影响。与未处理的对照细胞相比，暴露于X-XO的mkn28细胞导致细胞MDA浓度增加两倍(图4B)。此外，预处理用APE 10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM可显著抑制X-XO诱导的细胞MDA升高。这说明APE的保护作用可能与抑制ROS诱导的脂质过氧化有关。gydF4y2Ba

    APE对吲哚美辛致胃粘膜细胞损伤的影响gydF4y2Ba

    非甾体抗炎药对胃粘膜的损伤可部分归因于ROS的产生。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba17gydF4y2Ba因此，我们评估APE是否能保护培养的胃细胞免受吲哚美辛造成的损伤。吲哚美辛2.5 mM或5 mM对MKN 28细胞造成剂量依赖性损伤，细胞活力分别降低到80%和20%(图5)gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM可显著抑制吲哚美辛诱导的损伤(图5)，其中APE可完全抑制吲哚美辛2.5 mM的损伤作用，显著降低吲哚美辛5 mM诱导的细胞损伤程度(图5)，使细胞活力从20%提高到50%。gydF4y2Ba

    图5gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)对吲哚美辛诱导的mkn28细胞损伤具有抑制作用。细胞用无血清培养基(对照)或APE处理(10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM)静置3小时，然后用无血清培养基或吲哚美辛2.5 mM或5 mM静置3小时。来自三个独立实验的均值(SD)。*与对照组相比p<0.05;†p<0.05相对于吲哚美辛。gydF4y2Ba

    APE对吲哚美辛致大鼠损伤的影响gydF4y2Ba

    我们的体外实验表明，APE的保护作用至少部分独立于血管、激素和神经因素。然后，我们试图研究APE是否在体内发挥类似的保护作用。吲哚美辛(皮下注射35 mg/kg)诱导出现多处可见胃糜烂，长2 ~ 10mm，宽约1mm(图6A)。猿10gydF4y2Ba−4gydF4y2Ba消炎痛治疗前10天饮用水中M可防止大鼠腺胃宏观损伤(图6B)。图6C-E显示了APE对吲哚美辛诱导的损伤的保护作用的代表性显微照片。正常胃粘膜的典型外观如图6C所示。吲哚美辛广泛损伤浅表上皮，并在胃腺区域引起坏死(图6d)。相反，APE治疗部分阻止了吲哚美辛对大鼠胃的显微损伤，减少了对浅表上皮和腺区损伤的程度(图6E)。定量上，与对照组相比，APE预处理使宏观损伤程度降低了约45% (p<0.05，图7A)，并使微观损伤程度降低了约40% (p<0.05，图7B)。在用APE 10治疗的大鼠中，在宏观和组织学水平上都获得了类似的结果gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM在吲哚美辛注射前1小时内给予(数据未显示)。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    苹果多酚提取物(APE)对吲哚美辛诱导的大鼠胃黏膜损伤有一定的保护作用。用APE 10预处理大鼠gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM在饮用水或车辆中(对照组)，然后皮下注射消炎痛35 mg/kg体重，3小时后处死。(A)对照组大鼠消炎痛治疗后胃黏膜的宏观外观。(B) APE治疗大鼠消炎痛治疗后胃黏膜的宏观外观。(C)正常大鼠胃黏膜。(D)对照组大鼠吲哚美辛治疗后胃黏膜组织学表现为胃腺广泛的浅表上皮损伤和坏死。(E) APE治疗大鼠消炎痛治疗后的大鼠胃黏膜组织学外观显示，腺区浅表上皮损伤和坏死病变的程度均有所减轻。gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    在注射吲哚美辛之前，定量对照组和APE处理大鼠的宏观(A)和微观(B)损伤。每组8只大鼠的平均(SD)。与对照组相比，p<0.05。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    一些研究表明，天然产生的抗氧化剂在一些生物实验系统中发挥保护性生化作用。特别是广泛存在于蔬菜食品中的酚类抗氧化剂，被认为在预防生命系统氧化损伤方面发挥着重要作用。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba由于胃中ROS的产生极大地促进了许多溃疡原的破坏作用，gydF4y2Ba2 -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba我们试图研究在不受酸分泌或全身因素(包括血流量)影响的条件下，APE是否能防止氧化应激诱导的体外培养胃粘膜细胞损伤。gydF4y2Ba

    我们的数据表明，APE可以抵消X-XO产生的ROS对胃上皮细胞的损伤作用，这种保护作用似乎主要归因于APE的主要成分(即CAT和CA)。这种效应与苹果酚类化合物渗透胃细胞有关，似乎是由于它们的抗氧化活性。事实上，细胞暴露于X-XO后，苹果酚类化合物的细胞内浓度显著降低，这表明这些化合物被细胞消耗以抵消X-X0诱导的氧化应激。用X-XO处理后，细胞培养液中酚类化合物的浓度没有增加，这进一步支持了这一假设，这排除了苹果酚类物质细胞内浓度的下降是由于受损细胞膜渗漏增加的可能性。APE显著提高了胃细胞的细胞内抗氧化活性，并防止了细胞暴露于氧化应激引起的细胞内抗氧化活性下降，进一步支持了APE的保护作用与其酚类化合物的抗氧化活性有关的概念。APE能显著抑制X-XO诱导的细胞MDA浓度(脂质过氧化指标)升高。由于非甾体抗炎药对胃粘膜的损伤部分归因于ROS的产生，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba17gydF4y2Ba我们评估APE是否能够保护培养中的胃细胞免受消炎痛的损伤。我们的数据显示，APE预处理可显著防止吲哚美辛对人胃上皮细胞的损伤。gydF4y2Ba

    随后，我们试图研究APE是否可能在体内发挥类似的保护作用，发现慢性或急性APE治疗显著降低了吲哚美辛对大鼠胃粘膜的宏观和微观损伤程度。这些体外和体内观察进一步强化了膳食抗氧化剂可能在预防外源性胃损伤方面发挥潜在有益作用的概念。部分支持这一概念，辛格和同事gydF4y2Ba33gydF4y2Ba报道了褪黑素和β-胡萝卜素对吲哚美辛诱导的大鼠胃损伤有保护作用，这种作用是通过清除氧源性自由基介导的。同样，Alarcon de la Lastra和他的同事gydF4y2Ba14gydF4y2Ba显示富含特级初榨橄榄油的饮食可以预防吲哚美辛引起的大鼠胃损伤。此外，据报道，几种黄酮类化合物具有抗溃疡作用，这与它们抑制脂质过氧化、清除ROS和/或调节白细胞功能的能力有关。gydF4y2Ba34岁,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba基于我们的研究结果，我们可以设想使用苹果酚类化合物来预防非甾体抗炎药胃病。gydF4y2Ba

    膳食抗氧化剂保护胃粘膜免受损伤的机制尚未完全阐明。酚类化合物已被证明具有直接的抗氧化作用，可作为活性氧清除剂、供氢化合物、单线态氧猝灭剂和金属离子螯合剂。gydF4y2Ba36岁,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba我们的研究表明，抑制脂质过氧化以及增加细胞内抗氧化活性的能力可能是APE发挥保护作用的方式。然而，膳食抗氧化剂也被证明可以显著提高培养大鼠肝细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶活性和总谷胱甘肽含量gydF4y2Ba38gydF4y2Ba在胃上皮中。gydF4y2Ba39gydF4y2Ba这表明APE介导的细胞保护作用也可能是由于增强了谷胱甘肽抗氧化防御系统。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba与此一致，我们之前的研究表明，外源性还原性谷胱甘肽通过防止乙醇诱导的谷胱甘肽及其前体半胱氨酸的粘膜浓度下降，可以显著防止乙醇诱导的人类胃粘膜损伤。gydF4y2Ba40岁,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba

    酚类化合物是否只在细胞系统中发挥抗氧化活性是有争议的。事实上，酚类化合物在一些研究中被发现具有促氧化剂和细胞毒性。gydF4y2Ba42岁的gydF4y2Ba43gydF4y2Ba黄酮类化合物和酚类化合物对培养细胞的促氧化作用可能源于人为产生的氧化应激。酚类化合物确实可以与细胞培养基的其他成分(如金属离子)发生反应，产生具有促氧化作用的细胞毒代谢物。gydF4y2Ba44gydF4y2Ba在我们的研究中，我们测试了用APE或其酚类化合物培养的细胞的存活率，发现与对照组未处理的细胞没有差异。gydF4y2Ba

    H幽门gydF4y2Ba相关的胃粘膜损伤与胃中ROS的产生有关。gydF4y2Ba45岁的gydF4y2Ba46gydF4y2BaROS的生成似乎在代谢过程中起着至关重要的作用gydF4y2BaH幽门gydF4y2Ba相关胃癌发生。gydF4y2Ba47岁的gydF4y2Ba48gydF4y2Ba根据这项研究的结果，我们假设富含多酚化合物(来自苹果或其他食物来源)的饮食，由于其抗氧化活性，可能被建议用于预防胃腺癌。为了部分支持这一假设，塞拉菲尼gydF4y2Ba等gydF4y2Ba证明膳食中抗氧化剂等价物的摄入量与胃癌风险呈负相关。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba

    考虑到大鼠消耗了大约10毫升的APE 10gydF4y2Ba−4gydF4y2BaM/d，每只大鼠每天消耗的酚类物质量约为0.9 mg/kg。这相当于一个体重70公斤的人每天吃两个“Annurca”苹果所摄入的酚类化合物的量(即0.80毫克/公斤)。gydF4y2Ba

    我们的数据必须谨慎解释，因为本研究中使用的细胞来自腺癌，所观察到的影响可能更多地反映肿瘤细胞的生物学特性，而不是正常的非转化细胞。然而，我们之前将mkn28细胞与原代培养的人胃上皮细胞进行了比较，并在体外实验中发现了它们的损伤和保护剂的相似结果。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba此外，酚类化合物在原代培养的非转化大鼠肝细胞中也显示出对氧化应激的保护作用gydF4y2Ba38gydF4y2Ba以及体内研究。gydF4y2Ba33 -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba

    综上所述，(1)mkn28细胞是一种适合于筛选植物抗氧化化合物并阐明其作用机制的体外体系;(2) APE通过渗透细胞膜，增加细胞内抗氧化活性，抑制ROS依赖的脂质过氧化，防止ROS对胃上皮细胞的损伤;(3) APE在体内外均能显著防止吲哚美辛损伤。这些结果表明，富含苹果抗氧化剂的饮食可能对预防与ROS产生相关的胃疾病有有益的作用。gydF4y2Ba

    致谢gydF4y2Ba

    我们感谢Armando Coppola先生和Rosalia Ferracane, BS，出色的技术支持gydF4y2Ba

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      格布哈特RgydF4y2Ba．洋蓟(Cynara scolymus L.)叶提取物对培养大鼠肝细胞过氧化氢诱导氧化应激的抗氧化和保护特性。gydF4y2Ba毒理学应用gydF4y2Ba1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba144gydF4y2Ba：gydF4y2Ba279gydF4y2Ba-86年。gydF4y2Ba
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    脚注gydF4y2Ba

    • 利益冲突:没有声明。gydF4y2Ba

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