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条文本gydF4y2Ba

菜单条gydF4y2Ba
炎症gydF4y2Ba
糖蛋白(gp) 96表达式:诱导分化期间肠巨噬细胞,但在克罗恩病受损gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. K SchreitergydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  2. 米豪斯曼gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  3. T SpoettlgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  4. U G斯特拉赫gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  5. F借gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  6. J SchoelmerichgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  7. H HerfarthgydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  8. W福尔克gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  9. G RoglergydF4y2Ba1gydF4y2Ba
  1. 1gydF4y2Ba内科,雷根斯堡,德国雷根斯堡大学gydF4y2Ba
  2. 2gydF4y2Ba雷根斯堡大学病理学系,雷根斯堡,德国gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    G Rogler博士gydF4y2Ba
    雷根斯堡大学内科我93042雷根斯堡,德国;gydF4y2Bagerhard.roglerklinik.uni-regensburg.degydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景:gydF4y2Ba糖蛋白(gp) 96链接与先天免疫系统的适应性。它是一个女伴,绑定域名肽产生的蛋白酶体降解。在细胞压力、肽加载gp96可以释放,呈现给T细胞抗原呈递细胞(apc)。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba第四从体外分化的巨噬细胞信使rna (mac)和正常肠巨噬细胞(imac)被减去杂交相比,Affymetrix GeneChip分析。gp96的分化诱导表达研究的多细胞球体(MCS)模型gydF4y2Ba。gydF4y2Ba体内gp96蛋白表达检测到双标签人类结肠和CD4免疫组织化学gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD62LgydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞转移小鼠模型。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2Ba五减去杂交获得的76年克隆gp96显示> 99%序列同源性。Affymetrix GeneChip分析证实了感应gp96的imac。imac的Gp96信使rna检测正常和肠粘膜肠疾病。观察诱导gp96蛋白质后七天的MCS的IMAC分化模式。免疫组织化学证实gp96蛋白质的存在在imac在正常粘膜和粘膜溃疡性结肠炎患者和憩室炎。粘膜的克罗恩病(CD)的病人,gp96蛋白质没有检测到。在CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD62LgydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞转移小鼠模型,在非活性imac gp96是可验证的。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2BaGp96期间诱导分化正常的imac但尚未检测到在imac CD粘膜。gp96被描述为拥有一个角色在宽容感应,这可能是有关损失的宽容对腔的细菌在CD患者中找到。gydF4y2Ba

  • PBMNC,外周血单核细胞gydF4y2Ba
  • TLR, toll样受体gydF4y2Ba
  • APC,抗原呈递细胞gydF4y2Ba
  • BDHC,联苯胺盐酸盐gydF4y2Ba
  • CD,克罗恩病gydF4y2Ba
  • DAPI 4′, 6-diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba
  • DNase,脱氧核糖核酸酶gydF4y2Ba
  • 呃,内质网gydF4y2Ba
  • 医生、糖蛋白gydF4y2Ba
  • HSP,热休克蛋白gydF4y2Ba
  • 炎症性肠病、肠肠病gydF4y2Ba
  • 第四mac,体外分化的巨噬细胞gydF4y2Ba
  • imac,肠巨噬细胞gydF4y2Ba
  • LPMNCs,固有层单核细胞gydF4y2Ba
  • MCS,多细胞球状体gydF4y2Ba
  • 主要组织相容性复合体MHCgydF4y2Ba
  • PBS,磷酸缓冲盐gydF4y2Ba
  • rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应gydF4y2Ba
  • 加州大学,溃疡性结肠炎gydF4y2Ba
  • 克罗恩氏病gydF4y2Ba
  • 热休克蛋白gydF4y2Ba
  • 肠巨噬细胞gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2004.053116gydF4y2Ba

来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    肠道粘膜形成的主要障碍对多种细菌在肠道内腔。入侵细菌的直接和有效识别产品的粘膜是杰出的重要的防御细菌感染和维护健康。除了适应性免疫机制涉及抗原表达和T和B细胞反应,先天机制需要立即响应。另一方面,从共生的细菌营养抗原和抗原不能导致免疫激活和炎症但必须容忍由先天和适应性免疫系统。gydF4y2Ba

    一个分子,能够调节先天和适应性免疫系统,糖蛋白96 (gp96、GRP94 Erp99, endoplasmin)。Gp96的内质网(ER)居民non-polymorphic热休克蛋白(HSP)和高度系统守恒的。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在人类中,只有一个真正的基因位点被映射,名叫tra-1。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba基因产品gp96的一个主要肽受体ERgydF4y2Ba3gydF4y2Ba与受体和交互,包括CD91(α2-macroglobulin受体)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和toll-like-receptors (TLR) 2和4专业表面抗原呈递细胞(apc)。在BALB / c小鼠,gp96被发现与肿瘤引起免疫力挑战gp96最初纯化。gydF4y2Ba5 -gydF4y2Ba7gydF4y2BaGp96可以结合多肽和肽绑定属性负责感应的免疫力。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba人们普遍认为,gp96-peptide复合物中释放到细胞外室压力和坏死的细胞,然后绑定到CD91装甲运兵车。这个绑定导致掩饰的gp96-peptide复杂。gydF4y2Ba4,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba然后由肽主要组织相容性复合体(MHC)类我T细胞和免疫,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba或宽容诱导调节性T细胞的发生。gydF4y2Ba11日,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba

    肠道粘膜暴露于一个常数高的抗原。宽容的差别是通过对这些表面蛋白参与炎症的接收或传输信号适当的细胞。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba在肠巨噬细胞(imac)这是指CD14,gydF4y2Ba14gydF4y2BaTLR-2地,gydF4y2Ba15gydF4y2BaHLA-DR,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba和整合蛋白CD11b / CD18和CD11c / CD18。gydF4y2Ba17日,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba此外,T细胞costimulatory CD80分子(B7-1)和CD86 (B7-2)正常胃粘膜中表达下调,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba表明低imac调节免疫反应的能力。功能数据(例如,减少氧化爆发活动gydF4y2Ba16日,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)支持imac的概念是“脱敏”分化。然而填充粘膜发炎的imac充分响应细菌抗原。gydF4y2Ba15gydF4y2BaT细胞的表达costimulatory分子CD80和CD86此外表明imac能够诱导免疫反应。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba

    的体外模型的单核细胞分化的imac coculture HT-29球状体。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba在这个模型中单核细胞被播种到HT-29细胞球状体和入侵,后跟一个分化过程导致表型类似于正常肠粘膜imac缺乏CD14、CD16 CD11b, CD11c表面表达。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba

    通过减法杂交我们发现gp96 imac从正常粘膜中表达,但不是在体外分化的巨噬细胞(iv mac)。因此,我们进一步调查gp96表达在正常和粘膜发炎。MCS模型被用来研究gp96表达式在imac的分化。最后,我们研究了监管的gp96表达式在炎症条件下在结肠炎动物模型。gydF4y2Ba

    材料和方法gydF4y2Ba

    病人gydF4y2Ba

    组织样本取自患者肠粘膜14克罗恩病(CD),五个溃疡性结肠炎(UC)患者,三个憩室炎患者,14控制没有肠道炎症患者接受手术因其他原因(例如,结肠癌)。炎症的程度分级显微镜下了决心炎性浸润的中性粒细胞,嗜酸性粒细胞、淋巴细胞:0 =没有渗透,1 =低程度的渗透,2 =严重渗透。所有控制标本负炎性浸润和CD,加州大学,憩室炎标本都有中度到重度炎症浸润。gydF4y2Ba

    这项研究是雷根斯堡大学的伦理委员会批准。gydF4y2Ba

    孤立的人类固有层单核细胞(LPMNCs)gydF4y2Ba

    手术标本和正常粘膜发炎被手术了。标本来自患者的结肠CD和加州大学在收到知情同意。控制标本取自病人手术因其他原因(结肠癌)。平均而言,标本约20厘米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba我们得到1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Baimac。LPMNCs孤立如前所述。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba总之,粘膜孵化的钙和镁免费汉克的平衡盐溶液1更易与l乙二胺四乙酸15分钟37°C清除肠道上皮细胞。肠上皮细胞耗尽标本30分钟孵化2毫升磷酸缓冲盐(PBS)和1毫克/毫升胶原酶I型(= 336 U /毫升),0.3毫克/毫升脱氧核糖核酸酶(DNase我;德国勃林格,曼海姆),0.2毫克/毫升无胎牛血清透明质酸酶在37°C。细胞被穿过70µm过滤器过滤,在PBS洗,最后提交给聚蔗糖密度梯度离心法在2000 rpm(≈690 20分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba没有刹车),贺利氏离心机分离单核细胞。间期与PBS仔细地删除和清洗。gydF4y2Ba

    imac的分离和纯化gydF4y2Ba

    imac在孤立LPMNCs贴上了immunomagnetic微,手持CD33的抗体,分离和纯化的帮助下两次类型LS列(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国),最近所描述。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba

    代的体外分化的巨噬细胞gydF4y2Ba

    leucapheresis之后,1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba单核细胞被播种在聚四氟乙烯袋和培养37°C公司为7%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。添加2%人类AB血清七天,巨噬细胞是单核细胞的生成。在4°C孵化后,细胞脱离聚四氟乙烯包。gydF4y2Ba

    减法杂交gydF4y2Ba

    执行减法杂交,减去cDNA iv mac从正常使用Clontech imac PCR-Select cDNA减法工具包(Clontech,帕洛阿尔托,加州,美国),如前所述。gydF4y2Ba16日,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba两个杂交。首先,过度cDNA iv mac添加。单链分子从正常imac大大丰富了差异表达序列。整个人口的分子受到聚合酶链反应(PCR)扩增所需的差异表达序列。只有分子两种不同的适配器被成倍放大。二次使用嵌套引物进行PCR扩增,从而进一步减少任何背景差异表达序列PCR产品和丰富。gydF4y2Ba

    克隆得到,进行相似性搜索gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.htmlgydF4y2Ba。爆炸计划是用于执行DNA数据库搜索序列相似性。gydF4y2Ba

    Affymetrix寡核苷酸阵列分析gydF4y2Ba

    Affymetrix GeneChip分析的帮助下Kompetenzzentrum毛皮fluoreszente Bioanatytik (KFB)在雷根斯堡(德国)。信使rna分离从imac non-inflamed粘膜和iv mac使用polyT磁珠(Dynal,奥斯陆,挪威)。在每种情况下,RNA从三个病人集中,避免个体差异负责变异。gydF4y2Ba

    双链cDNA由上标2合成装备(生活技术,卡尔斯鲁厄,德国)使用T7-oligo (dT)作为底漆。生物素标记cRNA是由体外转录反应使用恩佐BioArray HighYield RNA转录标签工具包(Affymetrix, 900182 P / N)基于制造商的协议。生物素标记cRNA纯化,支离破碎,除了控制寡核苷酸B2 (3 nM)和20×真核杂交控制(bioB bioC, bioD, cre)杂交,Affymetrix HG-U133A GeneChips(美国加州圣克拉拉,Affymetrix), Affymetrix数组扫描仪扫描,执行和数据分析使用Affymetrix统计数据分析软件,Affymetrix微阵列套件(版本5.0)。gydF4y2Ba

    gp96逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)gydF4y2Ba

    保利(A) rna被polyT磁珠隔离(Dynal) CD33gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞根据制造商的协议。寡核苷酸的gp96 PCR基因选择英国国际贸易局使用软件工具lite(1.0.0.1版)。对PCR引物如下:使用gp96上游,5′GGG TGT GGT GGA CTC AGA TG 3′;gp96下游5′GTT GCC AGA CCA GTA移行细胞癌CT 3′。测试表征和全长基因的互补,rt - pcr和5′β-actin, 3′β-actin, GAPDH 6 k网格蛋白和2 k网格蛋白基因的引物组检查器工具(表达载体、韭菜、荷兰)使用。gydF4y2Ba

    一代的多细胞球状体(MCS)gydF4y2Ba

    MCS根据液体覆盖文化生成技术gydF4y2Ba21gydF4y2Ba:4×10gydF4y2Ba3gydF4y2Ba细胞悬浮在0.2毫升的介质/被播种在琼脂糖涂井的96孔板,在静态条件下培养,所述。经过七天的文化、MCS形成和被用于实验。gydF4y2Ba20.gydF4y2BaMCS上层清液(0.1毫升)取而代之的是新鲜分离单核细胞在0.1毫升的人类AB血清中补充2%。Cocultures MCS的单核细胞收获24小时后,3天,7天进行免疫组织化学分析。gydF4y2Ba

    抗体gydF4y2Ba

    下面的抗体被用于免疫组织化学鉴定gp96:老鼠anti-grp94单克隆抗体(克隆9 g10, IgG2a;Stressgen生物技术、加拿大)、兔anti-grp94多克隆抗体(Stressgen生物技术)和生物素共轭兔子antirat山羊antirabbit二级抗体(σ,Deisenhofen,德国)。gydF4y2Ba

    下面的单克隆抗体被用于巨噬细胞的免疫组织化学鉴定:鼠标反人类的巨噬细胞CD68(克隆KP1;Dako、德国汉堡)和生物素共轭山羊antimouse二级抗体(单克隆免疫球蛋白;σ)检测小鼠巨噬细胞;和生物素化的老鼠anti-mac-3 (IgG1κ单克隆;加拿大Cederlane)和生物素化的老鼠anti-F4/80 (IgG2a;Serotec,德国)。单克隆抗体鼠标反人类的巨噬细胞CD33的微磁(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)用于隔离的巨噬细胞。gydF4y2Ba

    对免疫荧光抗体后被用作二次抗体:Alexa萤石488鸡antimouse免疫球蛋白(H + L)(分子探针欧洲BV、荷兰)和Alexa萤石594共轭山羊antirat免疫球蛋白(分子探针欧洲BV)。gydF4y2Ba

    免疫组织化学和免疫荧光gydF4y2Ba

    过氧化物酶染色法,冻结部分被削减(5µm),空气干燥,在丙酮和固定。幻灯片与PBS (pH值7.4)患者和孵化30分钟0.3% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在PBS淬火内源性过氧化物酶。幻灯片是用PBS和孵化为60分钟1%牛血清白蛋白(Biomol,汉堡,德国)PBS(阻塞)的缓冲区山羊血清(稀释1:10 0;Dako、丹麦)CD68染色和兔免疫球蛋白比例(0.2毫克/毫升总蛋白浓度;Dako) gp96染色。gydF4y2Ba

    确定细胞表达gp96顺序双抗原的免疫组织化学程序本地化应用。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba首先,幻灯片是两种鼠anti-gp96孵化(最后5μg /毫升浓度阻止缓冲区)或鼠标反人类的巨噬细胞CD68(0.33µg / ml)主要抗血清阻断缓冲区为60分钟。其次,幻灯片和1:50 0稀释30分钟孵化生物素共轭antirat或antimouse免疫球蛋白二级抗体阻断缓冲区。洗后,组织孵化刚做好的解决方案的矢量束射功率管(美国加州向量,伯林盖姆)含0.01%过氧化氢。幻灯片孵化30分钟0.3%过氧化氢在PBS缓冲和孵化的主要和次要的第二抗体染色。部分是preincubated八分钟0.01%联苯胺盐酸盐(BDHC;σ)与0.03%硝普酸钠(σ)。其次是孵化的反应介质(过氧化氢BDHC 0.01%, 0.005%, 0.03%硝普酸钠)对蓝染色。染色用水被打断。gydF4y2Ba

    免疫荧光组织标本都是固定在4%缓冲福尔马林和嵌入在石蜡。标本是脱蜡和预处理在70°C水浴40分钟在0.1%柠檬酸钠,阻塞了20分钟20%山羊血清在室温下,然后两个主要抗体孵育一夜之间在4°C(抗体稀释1:10 0)。幻灯片在PBS和进一步孵化洗一小时在37°C和二次抗体(稀释1:200)共轭与异硫氰酸荧光素或德克萨斯红在黑暗中。幻灯片是清洗和安装在Vectashield安装介质与1.5µg /毫升4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;向量的实验室)。显微镜是用Leitz则DMRXE显微镜,主要有400×放大。图中给出详细信息放大传说。gydF4y2Ba

    CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD62LgydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞转移的结肠炎模型gydF4y2Ba

    脾脏CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD62LgydF4y2Ba+gydF4y2Ba从BALB / c小鼠T细胞分离与前面描述的轻微的修改。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba总之,CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在健康小鼠的脾脏单核细胞纯化负损耗的细胞群使用anti-CD8 anti-MHC-II, anti-B220, anti-CD11b抗体(美国加州圣地亚哥从Pharmingen购买)其次是antirat免疫球蛋白immunomagnetic微(Miltenyi生物技术,Bergisch格拉德巴赫,德国)。CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞被immunomagnetic珠子到CD62L进一步分离gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD62LgydF4y2Ba−gydF4y2BaT细胞。前的细胞(纯度> 95%)显示高表达CD45RB通过流式细胞仪分析。CD62LgydF4y2Ba+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞(0.25×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)在200年resuspendedµl无菌PBS和腹腔内注入受体CB-17 SCID小鼠。结肠炎活动监测体重变化和组织学分析,如下指定。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    减法杂交、rt - pcr和Affymetrix GeneChip分析gydF4y2Ba

    分析特定的蛋白质是否诱导分化期间imac,减法杂交的mRNA iv mac和imac从正常粘膜进行如上所述。进化从这个筛选克隆代表基因表达的imac但不是在第四mac。gydF4y2Ba

    总的来说,76个不同的克隆。所有cDNA片段克隆和测序。一些基因测序克隆得到几倍的不同部分包含相同的基因。作为基因获得几次被认为更有可能真正调节我们关注这些克隆。搜索表达序列标签数据库显示,76年5减去产品> 99%同源mRNA的gp96(参考序列在NCBI: X15187)。我们获得两种不同的碎片gp96(核苷酸598 - 1271和2105 - 2713年)从哪一个发生三个,另两次(图1)。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    由于相似性搜索、5减去杂交获得的76个克隆肠巨噬细胞和巨噬细胞在体外分化被确认为糖蛋白96 (gp96)。因此,两个不同部分的cDNA被确定。核苷酸,598 - 1271年三次获得和核苷酸2105 - 2713两次。gydF4y2Ba

    确认减法杂交数据,我们使用了Affymetrix GeneChip分析。信使rna从三个控制病人和三个捐助者iv mac汇集。信使rna在每种情况下杂交到两个芯片。为探针集gp96明显高于mRNA表达被发现在第四imac比mac。我们平均每个探针集两个芯片。一个探针组近三倍高,“碳足迹”和其他11倍gp96 mRNA表达相比,imac iv mac被发现(图2)。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    Affymetrix数据证实了减法杂交的结果。原始的信号强度数据显示探头套肠巨噬细胞(imac)和体外分化的巨噬细胞(iv mac)。每个数据点代表原始信号强度在芯片上。平均形成两个数据点的imac和iv mac,探针组200598 _at 11-fold感应和2000599 _at,三倍感应被观察到。的统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba测试使用。平均而言,感应糖蛋白96 mRNA表达的imac从正常粘膜与iv mac是Affymetrix分析的7倍。gydF4y2Ba

    进一步说明减法杂交的可靠性和Affymetrix GeneChip分析,我们进行rt - pcr的gp96 CD-IMACs mrna, UC-IMACs,第四control-IMACs单核细胞和mac。巨噬细胞从CD,加州大学,和non-inflamed粘膜,但不是从血液单核细胞,gp96 cDNA放大。同时,几乎没有第四gp96 cDNA放大在mac(图3)。信使rna的完整性验证了基因检查器工具(图3,只有GAPDH如图所示)。此外,我们执行实时PCR (TaqMan) gp96的RNA七单核细胞分解动作,三种文化第四mac,五UC患者,6 CD患者,患者和5没有肠道炎症。如图3所示b, mRNA水平没有显著差异来自UC患者,CD,没有肠道炎症。然而,有更高的mRNA水平从单核细胞和iv mac(单核细胞gydF4y2BavgydF4y2Ba加州大学,p < 0.002;单核细胞gydF4y2BavgydF4y2BaCD, p < 0.005;单核细胞gydF4y2BavgydF4y2Ba没有肠道炎症,NS;第四macgydF4y2BavgydF4y2Ba加州大学,p < 0.05;第四macgydF4y2BavgydF4y2BaCD, p < 0.02;第四macgydF4y2BavgydF4y2Ba没有肠道炎症,NS;gydF4y2BatgydF4y2Ba测试)。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    糖蛋白96 (gp96) mRNA表达在体外分化的巨噬细胞(iv mac)、单核细胞(mono)和肠巨噬细胞(imac)溃疡性结肠炎(UC)患者,克罗恩病(CD)和non-inflamed粘膜(NI)。(一)逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr) gp96 GAPDH,表示。Gp96中检测出从加州大学imac, CD,第四和倪粘膜,但不是在mac或单核细胞。这个数字是代表11倪患者粘膜,九CD患者,6 UC患者,四个捐助者为iv mac, 11单核细胞捐献者。(B)真正time-PCR gp96 (TaqMan)。mRNA水平更高的患者巨噬细胞从CD,加州大学,倪粘膜比单核细胞和iv mac(单核细胞gydF4y2BavgydF4y2Ba加州大学,p < 0.002;单核细胞gydF4y2BavgydF4y2BaCD, p < 0.005;单核细胞gydF4y2BavgydF4y2Ba倪,NS;第四macgydF4y2BavgydF4y2Ba加州大学,p < 0.05;第四macgydF4y2BavgydF4y2BaCD, p < 0.02;第四macgydF4y2BavgydF4y2Ba倪,NS)。gydF4y2Ba

    免疫组织化学分析MCS的gp96表达式gydF4y2Ba

    基于mRNA表达的结果,我们认为诱导分化期间gp96 imac。因此,我们使用了MCS的imac分化模式gydF4y2Ba21gydF4y2Ba调查是否gp96差异化具体在imac。gydF4y2Ba

    二十四小时和coculture HT-29细胞与单核细胞的三天后,没有检测到MCS gp96(图4 a、B)。经过七天的coculture, gp96中检测出大量在MCS模式典型的入侵单核细胞/巨噬细胞(图4 c, D)。这证实了感应gp96的IMAC分化。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    表达的糖蛋白96 (gp96) HT-29球状体后24小时内,3天,7天coculture单核细胞。抗原表达是由免疫组织化学,材料和方法来描述。没有检测到gp96表达式24小时后三天(A)或(B) coculture。Gp96表达检测七天后coculture (C, D)。(eg)同形像控制,B, C和D,分别。原来放大×200。gydF4y2Ba

    Gp96蛋白表达在人类肠道粘膜gydF4y2Ba

    双标记免疫组织化学与标本9名患者没有肠道炎症患者和7个CD了。如图5所示,发现gp96 imac的病人没有肠道炎症(图5)而不是从CD患者巨噬细胞(图5 b)。排除的可能性的表位肽片段必将gp96面具单克隆anti-gp96抗体,额外多克隆抗体进行免疫组织化学,显示相同的结果(图6)。gydF4y2Ba

    图5gydF4y2Ba

    检测糖蛋白96 (gp96)表达在肠道粘膜肠巨噬细胞的单克隆抗体。冻结部分被削减和固定丙酮过氧化物酶染色法。Gp96是免疫组织化学检测在第一步矢量束射功率管(红色)。在第二步细胞巨噬细胞的标志(CD68)检测联苯胺盐酸盐(BDHC)(深蓝、颗粒)。Gp96表达检测在non-inflamed粘膜肠巨噬细胞(A)。没有发现Gp96表达式在克罗恩病肠巨噬细胞(B),没有束射功率管反应产物检测使用老鼠IgG2a同形像抗体染色的第一步。没有检测到BDHC反应产品使用鼠标同形像控制在第二染色步骤(C, D),虚线表示墓穴边境。原来放大×400。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    检测糖蛋白96 (gp96)巨噬细胞表达的肠道粘膜多克隆抗体。冻结部分被削减和固定丙酮过氧化物酶染色法。Gp96是免疫组织化学检测在第一步矢量束射功率管(红色)。在第二步细胞巨噬细胞的标志(CD68)检测联苯胺盐酸盐(BDHC)(深蓝、颗粒)。Gp96表达检测在non-inflamed粘膜肠巨噬细胞(A)。没有Gp96的表情中发现肠巨噬细胞在CD (B)。没有束射功率管反应产物检测使用兔子immunglobulins染色的第一步。没有检测到BDHC反应产品使用鼠标同形像控制在第二染色步骤(C, D),虚线表示墓穴边境。原来放大×400。gydF4y2Ba

    通过免疫荧光结果相同。如图7所示a - c(箭头),gp96表达在绝大多数imac在正常non-inflamed粘膜。Gp96负染色细胞积累的牙龈和优先发现接近隐窝。积极染色细胞主要是在固有层的深层。imac在CD患者大多是负面的粘膜gp96(图7 d-f,绿色箭头)。只有少量的imac gp96呈阳性(图7 d-f,白色箭头)。没有gp96蛋白表达在粘膜在其他细胞中发现所有样品(无花果5 - 7)。确定没有gp96 CD-IMAC中找到特定的CD或是否粘膜炎症的附带现象,我们进行了免疫组织化学和免疫荧光憩室炎患者和加州大学的部分。如图8所示,在憩室炎(图8 f)和加州大学(图8 g-l), gp96中检测出大量在imac类似non-inflamed控制(无花果5 - 7,箭头)。分布的gp96积极imac的固有层憩室炎患者是一样的没有炎症的病人gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    免疫荧光的糖蛋白96 (gp96)表达在患者的肠黏膜炎症和克罗恩病(CD)。石蜡包埋的部分被切割和gp96单克隆抗体检测。在第二个步骤中,第二个Alexa萤石594共轭山羊antirat IgG抗体(红色)。CD68也发现单克隆抗体,在第二步Alexa萤石488鸡antimouse免疫球蛋白(H + L)(绿色)。复染色完成4′,6-diamidino-2-phenylindole(蓝色)。non-inflamed粘膜(A - c),大部分肠巨噬细胞(A、绿色箭头)gp96积极(B,红色;C、合并、箭头)。只有很少的肠巨噬细胞(D,绿色)从CD患者gp96积极(E,红色;F,合并,白色箭头)。没有荧光检测使用老鼠IgG2a或鼠标IgG1同形像控制(G, H)。原始放大×200。gydF4y2Ba

    图8gydF4y2Ba

    免疫组织化学检测糖蛋白96 (gp96)石蜡包埋和冻结部分从憩室炎患者(f)和溃疡性结肠炎(UC) (G-L)。(模拟和G-J)石蜡包埋部分被剪掉了,gp96单克隆抗体检测。在第二个步骤中,第二个Alexa萤石594共轭山羊antirat IgG抗体(红色)。CD68也与单克隆抗体检测,并在第二步Alexa萤石488鸡antimouse免疫球蛋白(H + L)(绿色)。复染色完成4′,6-diamidino-2-phenylindole(蓝色)。冻结部分(E, F, K, L)削减和固定在丙酮过氧化物酶染色法。Gp96是免疫组织化学检测在第一步矢量束射功率管(红色)。在第二个步骤中,巨噬细胞的细胞标记(CD68)检测联苯胺盐酸盐(BDHC)(深蓝、颗粒)。憩室炎患者(a e)以及在UC患者(G-K),大多数肠巨噬细胞是gp96积极(箭头)。没有荧光或束射功率管反应产物检测使用老鼠IgG2a染色的第一步。 No fluorescence or BDHC reaction product was detected using mouse isotype control in the second staining step (D, F, J, L). The broken line indicates the crypt border. Original magnification A–D and G–J ×200; E, F, K, L ×400.

    Gp96表达式在转会结肠炎小鼠模型gydF4y2Ba

    作为黏膜耐受gp96的功能和炎症很难研究人类,我们进一步调查是否gp96表达和调控在结肠炎动物模型相似。CD4gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD62LgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞被孤立于BALB / c小鼠和转入SCID小鼠。七周后SCID小鼠结肠炎和冻结部分从七个老鼠的小肠结肠炎和五个健康小鼠没有结肠炎免疫组织化学染色法确定gp96蛋白表达。由于没有典型的小鼠巨噬细胞的生物标志,我们使用两个不同的抗体(Mac-3和F4/80)检测巨噬细胞在肠道粘膜。在粘膜从小鼠结肠炎,gp96 / Mac-3阳性巨噬细胞被发现(图9)。相比之下,没有检测到gp96的粘膜小鼠结肠炎(图9 b, F)。也没有Mac-3积极发现巨噬细胞在小鼠结肠炎黏膜(图9 b)。然而,在Mac-3阳性巨噬细胞,位于小鼠结肠炎的淋巴滤泡,gp96蛋白质表达(图9 c, D)。大多数的imac在健康小鼠-另一个巨噬细胞标记,F4/80,这被认为是表示在成熟和激活巨噬细胞。只有很少F4/80积极imac non-inflamed检测肠道粘膜。这些imac阴性gp96(图9 e)。相比之下,在粘膜发炎大量F4/80积极gp96的巨噬细胞被发现消极(图9)。综合这些数据表明,监管的gp96蛋白质结肠炎模型非常类似于人类发现CD。gydF4y2Ba

    图9gydF4y2Ba

    免疫组织化学检测糖蛋白96 (gp96)从冻结的部分小鼠大肠。冻结部分被削减和固定丙酮过氧化物酶染色法。Gp96是免疫组织化学检测在第一步矢量束射功率管(红色)。在第二个步骤中,巨噬细胞的细胞标记(mac-3或F4/80)检测与联苯胺盐酸盐(BDHC)(深蓝、颗粒)。Gp96 mac-3表达积极的巨噬细胞(A)但没有发现F4/80 non-inflamed粘膜的积极巨噬细胞(E)。Gp96不是表达mac-3 (B)或F4/80 (F)积极的巨噬细胞在小鼠结肠炎黏膜。在淋巴滤泡,gp96 mac-3中发现积极的巨噬细胞(C, D)。没有束射功率管反应产物检测使用老鼠IgG2a染色的第一步。没有检测到BDHC反应产品使用老鼠同形像控制在第二染色步骤(G-J)。虚线表示墓穴边境。原来放大×400。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    在目前的研究中我们证明了感应gp96表达在分化的imac mRNA和蛋白水平。免疫组织化学显示gp96 imac的表达式从正常non-inflamed患者粘膜固有层,憩室炎,加州大学。几乎没有gp96蛋白表达可以发现在CD患者的肠道粘膜,提高的可能性,缺乏gp96参与CD特定的病理生理学。在老鼠身上,gp96被发现mac-3表达积极的imac non-inflamed粘膜但没有成熟F4/80积极imac小鼠结肠炎黏膜发炎,表明监管类似于人类发现。gydF4y2Ba

    以前,gp96表达主要是研究的背景下,恶性疾病,如结肠直肠癌gydF4y2Ba24gydF4y2Ba或恶性间皮瘤。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba在两者中,gp96表达增强在肿瘤组织与正常健康组织相比,这表明gp96演讲,参与抗原肽转移到类MHC i作为gp96的角色在抗原表达和诱导宽容很可能,这种蛋白质的存在在imac是有趣的。我们的数据表明,gp96在特定的分化诱导肠道装甲运兵车。这指向一个特定的角色这种蛋白质的粘膜免疫系统。gydF4y2Ba

    Gp96检测到大量的imac的条件下粘膜宽容和减少在CD,与失去对自己的菌群。gp96在慢性炎症的作用尚未研究;相比之下,Hsp 90表达,gp96的胞质同系物,在CD和UC患者调查。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba没有区别Hsp 90表达发炎和观察non-inflamed粘膜之间。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba然而,路德维希gydF4y2Ba等gydF4y2Ba显示增强的Hsp 70表达上皮细胞在CD和加州大学,独立于炎症的程度。gydF4y2Ba27gydF4y2BaPeetermansgydF4y2Ba等gydF4y2Ba证明增强Hsp 60表达B7积极单核细胞粘膜肠肠病(IBD)患者gydF4y2Ba28gydF4y2Ba和增强Hsp 60染色被报道在UC上皮细胞。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba这些调查没有提供证据,这些热休克的作用在慢性粘膜炎症。gydF4y2Ba

    我们的研究是第一个调查gp96的表达在肠道粘膜IBD的上下文中。相比与其他研究显示保持不变或者增强表达热休克在炎症性肠病中,我们演示了这里gp96 IMAC-CD表达下调或缺失。gp96可能有几个原因消失在活跃的CD。第一种可能性是,gp96蛋白分泌激活imac在大量CD粘膜发炎,正在迅速退化。我们的数据从Affymetrix GeneChip imac的分析表明,健康non-inflamed粘膜,蛋白酶体相关蛋白表达下调与iv mac相比(数据没有显示)。在imac粘膜发炎,这些基因可以调节,因此蛋白质降解增强和gp96退化细胞。在定性PCR在imac从正常粘膜组织发炎,gp96信使rna检测。因为数量少,细胞可用连续净化后和一个低数量的信使rna(检测)的水平下,大量(40)的周期必须在PCR。因此,没有结论信使rna数量。Taqman数据证实减法杂交的结果和Affymetrix GeneChip分析清楚地显示增强的gp96表达式与单核细胞相比,imac和iv mac。gydF4y2Ba

    我们发现gp96在肠巨噬细胞诱导分化的单核细胞为肠道macrophage-like表型在MCS模型中。在炎症,单核细胞侵入肠道粘膜。入侵的单核细胞不表达gp96。在某种程度上,这可以解释为什么没有gp96蛋白质在CD患者被发现。然而,mRNA表达诱导,如演示。此外,在加州大学,单核细胞入侵固有层,最后表达gp96蛋白质。因此,入侵单核细胞并不能充分解释缺乏gp96的蛋白质在CD粘膜。gp96的差别另一种解释为对这些蛋白质在CD肠巨噬细胞可能是转录后的发生或post平移监管。这需要进一步评估。gydF4y2Ba

    imac的gp96差别如前所述,对这些CD粘膜可能发挥作用在宽容与腔的抗原。ChandawarkargydF4y2Ba等gydF4y2Ba发现免疫5-10-fold高于最佳剂量的gp96下调抗肿瘤免疫反应。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba作者最近显示,这种效果是依赖CD4细胞gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞。gydF4y2Ba12gydF4y2Ba这些细胞必须进一步特征但CD25可能gydF4y2Ba+gydF4y2Ba调节性T细胞是gp96时生成大量存在。已经表明,gp96细胞表面表达的转基因老鼠导致lupus-like自身免疫性疾病。没有绑定处理细胞外gp96肽可以作为一个内生APC活化剂。慢性激活gp96可能导致击穿装甲运兵车的宽容。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba一个类似的机制可能是负责维护在肠道炎症CD。gydF4y2Ba

    最近,另一个相关的糖蛋白的免疫调节作用(HC gp39)报道。在体外化验,HC gp39直接免疫反应是能够抑制细胞毒性T细胞反应,表明HC gp39直接免疫反应在健康个体趋向于监管表型。CD4 + T细胞系针对HC gp39 CD25表达,GITR CTLA-4, Foxp3分子和其他能够抑制免疫反应。gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba可以推测,在肠粘膜gp96也有类似的效果。事实上,gp96的自身抗体可以检测到健康的小鼠。gydF4y2Ba32gydF4y2Ba这个有趣的方面需要进一步研究。gydF4y2Ba

    最近,杜迪gydF4y2Ba等gydF4y2Ba证明gp96可以伴侣MHC II抗原表位限制体内表达CD4 + T辅助细胞。CD4 + T细胞增殖但无法表达效应细胞因子如γ干扰素和白介素4。gydF4y2Ba33gydF4y2Ba

    总之,我们已经表明,gp96期间诱导分化的单核细胞进入imac在人类和老鼠。我们建议gp96函数作为一个宽容调停分子。在CD粘膜和小鼠结肠炎,gp96没有检测到。进一步研究的上下文中gp96 CD的功能作用。gydF4y2Ba

    确认gydF4y2Ba

    本研究支持的德意志Forschungsgemeinschaft 585 (SFB)和BMBF Kompetenznetz清洁能源。我们感谢他们手术的外科医生和护士部门良好的合作。此外,我们感谢滨克鲁兹请提供我们洗涤单核细胞。gydF4y2Ba

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      斯特尔米gydF4y2Ba,路德维希D, Fellermann K,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba肠道人类热休克蛋白90的表达在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者。gydF4y2Ba挖说科学gydF4y2Ba1998年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba43gydF4y2Ba:gydF4y2Ba1079年gydF4y2Ba-87年。gydF4y2Ba
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      路德维格维gydF4y2Ba,斯特尔米,易卜拉欣等,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba增强患者的肠热休克蛋白70的表达炎性肠道疾病。gydF4y2Ba挖说科学gydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba44gydF4y2Ba:gydF4y2Ba1440年gydF4y2Ba7所示。gydF4y2Ba
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      Peetermans我们gydF4y2Ba,D 'Haens GR, Ceuppens杰,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba粘膜由60-kilodalton B7-positive细胞热休克蛋白的表达在炎症性肠病。gydF4y2Ba胃肠病学gydF4y2Ba1995年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba108年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba75年gydF4y2Ba-82年。gydF4y2Ba
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      Winrow虚拟现实gydF4y2Ba,赖德SD Mojdehi通用gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba应激蛋白在结直肠粘膜。增强表达在溃疡性结肠炎。gydF4y2Ba挖说科学gydF4y2Ba1993年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba38gydF4y2Ba:gydF4y2Ba1994年gydF4y2Ba-2000年。gydF4y2Ba
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      刘BgydF4y2Ba,戴笠J,郑H,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba细胞表面表达的内质网居民热休克蛋白gp96触发MyD88-dependent系统性自身免疫性疾病。gydF4y2Ba《美国国家科学院刊年代gydF4y2Ba2003年gydF4y2Ba;gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba:gydF4y2Ba15824年gydF4y2Ba9。gydF4y2Ba
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      脚趾RgydF4y2Ba,范Bilsen J,凡·通根于H,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba基于手机免疫调制关节炎。gydF4y2Ba关节炎Res其他gydF4y2Ba2004年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:gydF4y2Ba18gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
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      Menoret一gydF4y2BaChandawarkar变化中,斯利瓦斯塔瓦PK。天然自身抗体对热休克蛋白hsp70和gp96:对使用热休克蛋白的免疫疗法。gydF4y2Ba免疫学gydF4y2Ba2000年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba101年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba364年gydF4y2Ba-70年。gydF4y2Ba
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      杜迪广告gydF4y2BaKovalchin JT Mihalyo马,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba糖蛋白96可以伴侣类MHC I -和类II-restricted体内表达抗原表位,但有选择地质数CD8 + T细胞效应函数。gydF4y2BaJ ImmunolgydF4y2Ba2004年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba172年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba6087年gydF4y2Ba-92年。gydF4y2Ba
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    脚注gydF4y2Ba

    • 利益冲突:没有宣布。gydF4y2Ba