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背景:结肠炎和癌症的小鼠模型是不可或缺的,我们对这些疾病的发病机制的理解。在过去,老鼠不得不牺牲为了分析结肠炎活性和肿瘤的发展。我们已经开发出一种安全的方法,为高分辨率内镜监测老鼠的生活。
方法:小鼠结肠炎、结肠肿瘤发展被内镜所使用avertine和反复检查。小说miniendoscope(1.9毫米外径),表示Coloview,介绍了通过肛门和冒号之前仔细地吹进一个气泵对结肠粘膜的分析。额外工作通道允许活检钳或注射针头的引入以及表面与亚甲蓝染色以想象的表面隐窝和坑模式架构。
结果:内窥镜图像获得高质量和被允许疾病监控和分级。得分的结肠炎活动以及肿瘤大小和增长是可能的。此外,坑模式分析使用chromoendoscopy允许歧视炎症与肿瘤之间的变化。活检取得足够的组织分子和组织病理学分析。
结论:总之,老鼠chromoendoscopy允许监控的发展与高分辨率结肠炎和结肠癌。操作,如当地注入试剂或活检可以很容易。
- DSS,葡聚糖硫酸钠
- 急性中耳炎,azoxymethane
- FITC,异硫氰酸荧光素
- 肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子
- MEICS,小鼠内窥镜结肠炎严重程度评分
- ACF,异常的地穴疫源地
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
- 内窥镜检查
- chromoendoscopy
- 鼠标
- 癌症
- 结肠炎
来自Altmetric.com的统计
- DSS,葡聚糖硫酸钠
- 急性中耳炎,azoxymethane
- FITC,异硫氰酸荧光素
- 肿瘤坏死因子,肿瘤坏死因子
- MEICS,小鼠内窥镜结肠炎严重程度评分
- ACF,异常的地穴疫源地
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
许多炎症性肠病的小鼠模型和结肠癌已经发展在过去(综合评论看到Wirtz和纽赖特1和斯和他的同事们2)。这些模型大大有助于理解这些疾病的发病机制,但也被用作模型系统的粘膜免疫反应调查不同免疫细胞的相互作用。过去已经不可能调查粘膜表面或在活的动物肿瘤的发展在很长一段时间,动物必须牺牲为了想象结肠粘膜。因此评估疾病的状态,只有间接参数,比如动物的重量,食物和水吸收,或者可以使用血液在粪便的存在。相比之下,复发性结肠内窥镜检查是至关重要的炎性肠道疾病的诊断和分期,在人类结肠癌。最近试图执行与柔性或刚性内窥镜检查老鼠有前途。3,4然而,据我们所知没有这样的尝试导致一代的高分辨率图片,使结肠粘膜的详细分析,有必要检查结肠粘膜表面病理的方方面面。
在目前的研究中,我们已经开发出一种高分辨率chromoendoscopic系统,允许重复监测的结肠癌发病机理和操纵单个鼠标在很长一段时间。作为实验模型我们使用azoxymethane +葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎和相关肿瘤的形成,如前所述。5 -7我们开发了内窥镜分数允许分级结肠病理常规鼠标内窥镜检查。最后,技术收集活检,注入试剂体内,或与亚甲蓝染色结肠隐窝是发达,给调查员的工具来评估疾病进展和操纵体内。
方法
动物
特定病原体免费FVB / N小鼠(8周)从我们的中央动物设施(ZVTE,美因茨大学,德国)。动物实验都是按照指导方针的执行机构。结肠炎结肠肿瘤是引起的如前所述紧随其后。6简言之,小鼠腹腔注射单剂量(7.4毫克/公斤)诱变剂azoxymethane(急性中耳炎),其次是三个周期的3% DSS饮用水中一周和正常饮用水两周。
内镜手术
连续监测结肠炎和肿瘤发生,一个高分辨率的老鼠视频内窥镜系统的开发。avertine老鼠所使用腹腔内注射(σ化学有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。实验检查设置,表示“Coloview系统”,由一个微型内窥镜(1.9毫米外径范围),一个氙气光源,三重芯片相机,和一个气泵(所有从卡尔Storz、Tuttlingen德国)实现管理通货膨胀的鼠标结肠。内窥镜手术被彩色显示器上和数字记录在磁带(DSR-20MDP;索尼(Sony)、德国科隆)。这部小说技术结合整个结肠chromoendoscopic与亚甲蓝染色,想象地穴模式和检测体内异常的地穴疫源地。因此,1%的结肠癌刷新了500年µl亚甲蓝溶液使用注射器安装在鲁尔接口锁定锥考试鞘的内窥镜。在活鼠体内肿瘤采样是由使用一个灵活的活检钳取活检直径3 Fr。活检cryosections要么立即在液态氮冷冻,福尔马林的石蜡切片,或放入裂解缓冲RNeasy微工具包(试剂盒、希尔登,德国)随后的RNA隔离。在一个实验中针(G) 26日装在一个小的管是通过引入的鞘和20µl异硫氰酸荧光素(FITC)解决方案被直接注射到肿瘤。
肿瘤得分
两个分数。肿瘤内镜期间观察到计算获得肿瘤的总体数量。此外,肿瘤大小的肿瘤在给定的鼠标都是得分产生肿瘤的分数。肿瘤大小分级如下:1级(非常小的但可检测肿瘤),2级(肿瘤掩盖结肠周长的八分之一),三年级(肿瘤掩盖结肠周长的四分之一),4级(肿瘤掩盖结肠周长的一半),和五年级(覆盖超过一半的结肠肿瘤围)。
隔离mRNA和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),
总RNA分离用活检使用RNeasy微工具包(试剂盒)根据制造商的建议。收益率通常是1 - 2µg每活检的RNA。反转录成cDNA执行使用上标二世逆转录酶(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)根据制造商的建议。使用以下引物PCR进行:小鼠β-actin, 5′tga CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC猫CTA-3′, 5′cta棉酚GCA TTT GCG GTG广汽手枪GGA GGG-3′;和小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)5′aac TGG CAG亚美大陆煤层气有限公司gg CAC TC-3′, 5′TTG GGC AGA TTG ACC柠檬酸GC-3′。PCR产品1%琼脂糖凝胶上进行分析。
组织学分析结肠横截面
在内镜活检被从老鼠,立即嵌入石蜡。部分是由与haematoxylin-eosin染色。发育不良的程度在结肠的微观横截面由一位经验丰富的病理学家(HAL)评分。
免疫组织化学
免疫荧光法是使用TSA Cy3执行系统(珀金埃尔默,海德堡,德国)和荧光显微镜(美国纽约奥林巴斯,梅尔维尔)如前所述。8总之,cryosections被固定在冰冷的丙酮10分钟与甲醇,其次是顺序孵化亲和素、生物素(向量实验室,伯林盖姆,加州,美国),和蛋白质阻塞试剂(Dako、威斯巴登、德国)消除非特定的染色。幻灯片在一夜之间被孵化与主要抗体特定TNF-α(美国加州Santa Cruz)。随后,幻灯片是孵化30分钟在室温下与生物素化的二次抗体(Dianova,达姆施塔特,德国)。所有样品终于接受streptavidin-horseradish过氧化物酶和沾Tyramide (Cy3)根据制造商的指示(珀金埃尔默)。在考试之前,核复染色与赫斯特3342(分子探针,尤金,俄亥俄州,美国)。
结果
我们开发了一种新的高分辨率内窥镜系统,表示Coloview,组成的一个简单的霍普金斯望远镜(1.9毫米直径),氙冷光喷泉加上一个气泵,允许通胀结肠,朋友三芯片相机(图1)。内窥镜过程监控标准PAL彩色监控和记录数字录音(索尼数码录像机和磁带)。内窥镜调查结肠炎和结肠炎结肠肿瘤有关,FVB / N小鼠腹腔内注射一剂诱变剂的急性中耳炎紧随其后3周期的3% DSS饮用水中一周和正常饮用水两周(图1 b)。老鼠使用内窥镜检查在天0,20、40、60和80年。0天,小鼠健康、光滑,闪亮的,薄(半透明)粘膜表面和正常血管结构(图2)。与亚甲蓝染色的结肠显示普通地下室的模式。
实验装置的Coloview miniendoscopic系统。(一)内窥镜设置的原理图。内窥镜工具用于鼠标考试:简单的望远镜,考试鞘,操纵鞘,活检钳,注入管。(B)实验过程用于诱导结肠癌FVB老鼠致癌作用。小鼠腹腔注射单剂量(7.4毫克/公斤)诱变剂azoxymethane(急性中耳炎)其次是三个周期的葡聚糖硫酸钠(DSS)饮用水中一周和正常饮用水两周。E =内窥镜检查。
治疗组小鼠的体内高分辨率内镜和chromoendoscopy azoxymethane和葡聚糖硫酸钠。老鼠犀牛avertine腹腔注射。结肠粘膜与亚甲蓝染色地穴的可视化模式。(一)代表内窥镜显示结肠健康老鼠的照片。注意光滑透明的粘膜,正常血管模式,和常规亚甲蓝染色结肠隐窝的模式。(B)代表内窥镜图像显示出严重的炎症的迹象。注意出血的近距离照片粘膜,改变血管模式,透明的粘膜和纤维蛋白。(C)内窥镜结肠炎得分基于观察炎症的迹象。修改后的小鼠内窥镜结肠炎严重程度指数(MEICS)由五个参数,表示。(D)亚甲蓝染色结肠粘膜的内镜在20天。 Shown are representative pictures of chromoendoscopic signs of inflammation and early neoplasias (aberrant crypt foci (ACF)).
相比之下,老鼠实验检查20天显示标记内镜粘膜炎症的迹象(图2 b)。因此,我们观察到粘膜增厚,出血,有时一个细粒度的粘膜表面,粪便的痕迹,血管结构和纤维蛋白的存在。基于这些内窥镜炎症的迹象,我们开发了一个结肠炎得分,修改后的小鼠内窥镜的结肠炎严重程度(MEICS),范围从0(没有炎症的迹象)15(非常严重的结肠炎)(图2)。与亚甲蓝染色的粘膜局部粘膜侵蚀和多个溃疡(图2 d;左面板)。此外,多个异常的地穴焦点(ACF)被观察到,察觉没有染色(图2 d;右面板)。这些ACF病变可以明显区分从炎性变化,强调使用亚甲蓝检测等在肿瘤发生早期病变。
在大约40天的实验中,肿瘤成为宏观可见的内窥镜检查期间,即使没有亚甲蓝帮助chromoendoscopy。肿瘤然后不断增长,直到实验结束(图3)。为了使用内窥镜级肿瘤发展,两个新的计分系统开发:一个只代表肿瘤数的数量在内镜和第二个分数结合肿瘤的数量和大小根据他们的周长(见方法)。保持内窥镜过程短,这样得分进行分析以前记录磁带。实验过程中,整体肿瘤不断增加治疗的急性中耳炎+ DSS野生型小鼠,达到平均大约有10个肿瘤实验老鼠每天60和80之间(图3 b)。直到80年天肿瘤分数不断增加。
内窥镜得分肿瘤发展的老鼠。(一)代表内窥镜图像显示结肠肿瘤的发展过程中实验。肿瘤大小的分级是表现在材料和方法。(B)病变在每个老鼠的数量统计和比较过程中实验(左面板)。另外,每个肿瘤的大小分级表示时间点和总结为每个鼠标(右面板)。
目前我们有500多名内镜和执行chromoendoscopic考试在老鼠身上,其中大部分是与严重的结肠炎的迹象(n > 200)和肿瘤(n > 200)。内镜检查是在老鼠身上也表现不同的天生的菌株(C57Bl6 FVB / N, Balb / c)和免疫力低下小鼠(SCID, Rag1−−)。此外,一些结肠炎模型进行调查,包括trinitrobenezene磺酸或oxazolone性结肠炎和结肠炎引起的CD62L +细胞的过继转移到Rag1−−老鼠。老鼠通常容忍过程很好,很少有老鼠(少于1%)后死亡内窥镜由于无法从麻醉中恢复过来,因为高疾病活动或戏剧性的减肥结果。然而,考虑到低并发症率,甚至在非常先进的小鼠结肠炎和减肥,内镜仍然可以认为是安全的。没有并发症发生率的差异指出不同品系小鼠或结肠炎模型。最后,没有穿孔在获得肿瘤活检。
为了检查肿瘤不牺牲的动物,在内镜活检被(图4)和快速冷冻免疫荧光和分子分析或浸泡在福尔马林溶液haematoxylin-eosin染色。Haematoxylin-eosin污渍的肿瘤活检得分最多为高级别上皮内瘤病理学家。探讨肿瘤切片的质量是否满足更加复杂的方法的分析,我们进行免疫荧光染色的TNF-α肿瘤活检。如图4所示的面板(右上),肿瘤基质TNF-α呈阳性,表明固有层细胞表达细胞因子在结肠炎结肠肿瘤发生有关。此外,我们测试是否活检可用于基因活性的分子生物学分析。因此,RNA从活检分离并进行rt - pcr分析。乐队的存在为28和18 s rRNA,如图4所示(较低的面板),从肿瘤活检表明,RNA的质量是足够的rt - pcr分析。一致,用rt - pcr基因特定的引物展示了丰富的表达的TNF-α肿瘤活检。β-Actin被用作控制。因此内镜活检产量足够组织广泛的实验方法。 Finally, we examined whether our endoscopic system could be used to locally inject reagents. Therefore, we mounted a 26 G needle on the tip of a small tube connected to a syringe. The needle was endoscopically introduced into a tumour and FITC was carefully injected. As shown in fig 4B, only minimal bleeding was observed after removal of the needle. The tumour was then removed from the mouse and cryosections of this tumour were analysed by immunofluorescence. As shown in fig 2D, FITC was located in the entire tumour mass, implying that this system can be used to locally administer reagents specifically into individual tumours.
分子调查和操纵肿瘤发展的老鼠。(一)活检取样(上左面板)的肿瘤在常规内镜监测azoxymethane /葡聚糖硫酸钠处理过的动物。肿瘤活检在液氮快速冻结,减少染色。随后haematoxylin-eosin染色(中上面板)展示了高级别上皮内瘤。肿瘤坏死因子α免疫组织化学(TNF-α)面板(右上)的横截面是使用TSA Cy3执行系统。Cryosections在丙酮固定。幻灯片被孵化TNF-α主要抗体特定。在考试之前,核与赫斯特3342年复染色。左下方面板:凝胶电泳图片显示提取高质量的RNA从五个肿瘤活检。肿瘤通常产生1 - 2µg RNA /活检。 Lower right panel: reverse transcription-polymerase chain reaction analysis for TNF-α expressed in tumour biopsies. β-Actin served as a control. (B) Injection of fluorescein isothiocyanate (FITC) into a tumour during endoscopy. A needle mounted onto a thin tube was introduced through the instrument channel of the endoscope and FITC was slowly injected. Tumour samples were then analysed by immunofluorescence. One representative picture of a tumour injected with 20 µl of an FITC solution and a control tumour not injected is shown.
总之,我们已经开发出一种高分辨率的内窥镜系统允许研究者监测病变结肠粘膜表面,获得样品材料不牺牲动物,最后在本地提供试剂。这种新方法可能是至关重要的监测小鼠结肠疾病的发病机理。
讨论
在这项研究中,我们已经描述小说系统高分辨率结肠内镜监测老鼠。这种方法允许迷人的新见解小鼠结肠炎的发病机制和结肠癌的监控和得分结肠炎活动和结肠癌。此外,鼠标结肠镜检查允许获得结肠活检和当地注入可以执行单一的肿瘤。研究者可以分析实验的成功,可以监视体内疾病活动和程度,这种方法也可以帮助限制成本,每个实验的老鼠数量。
小鼠实验模型提供重要工具探讨发病机制和治疗慢性肠道炎症和人类结肠癌。小鼠模型的主要优点是相对容易的繁殖和使用同源的鼠标菌株的可能性。此外,鼠标线转基因或缺乏特定的蛋白质提供了重要的工具来研究这些因素的作用在结肠炎和结肠癌体内。然而,一个障碍的使用小鼠为研究结肠癌发病机理一直是结肠的检查活老鼠。结肠内窥镜检查是最重要的考试在人类结肠疾病的诊断和分级。在过去,几次都是在老鼠身上进行内窥镜检查。3,4然而,小直径的小鼠结肠很难获得高质量照片足以使用内窥镜年级疾病活动。我们内窥镜设置了高分辨率的照片出版质量,允许我们得分结肠炎的程度和肿瘤的发展。内窥镜检查被发现是安全的,可再生的,和快速,通常要求不超过两分钟。
使用亚甲蓝染色结肠隐窝可以检测病灶染色前标准的结肠镜检查过程中不可见。此外,炎症病变可以很容易区分肿瘤出现前的acf。最后,chromoendoscopy允许我们分类acf对根据奖赏他们的坑中模式分类。9因此,在人类,与先前的研究一致10 -12chromoendoscopy成为一个有用的方法来区分肿瘤和炎症小鼠结肠的变化。
总之,chromoendoscopy老鼠是一个安全程序允许研究者反复监测结肠炎活动和结肠癌的发展并获得与高分辨率的照片。这种技术可能在执行至关重要的长期研究小鼠慢性结肠炎和结肠炎结肠癌和帮助研究者确定相关实验在早期的成功。此外,获得在内镜活检提供一个独特的机会分析结肠炎症和致癌作用随着时间的推移被现代免疫学和分子的方法。
引用
脚注
利益冲突:没有宣布。