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文摘
背景:转铁蛋白受体2 (TfR2)是一个关键分子参与铁稳态的调节。突变在人类导致老鼠类型3 haemochromatosis和有针对性的突变会导致铁过载拥有相似的表型。我们之前已经生成一个完整的描述TfR2击倒(KO)鼠标。
目的:本研究的目的是确定表现型和肝脏中分析铁相关分子的表达,十二指肠,纯合子的脾脏TfR2ko、杂合的和野生型老鼠。
方法:在10周血清和组织铁含量测定老雄性老鼠。表达式相关的铁mRNA转录分析在肝脏,十二指肠,使用实时聚合酶链反应和脾脏。铁相关蛋白的表达在肝脏被免疫印迹和免疫组织化学分析。
结果:纯合子的TfR2ko小鼠没有TfR2蛋白表达和发展重要的铁过载的典型TfR2haemochromatosis有关。在肝脏的TfR2ko小鼠没有upregulationhepcidin信使rna或prohepcidin蛋白响应铁负荷。
结论:我们的研究结果表明,TfR2需要铁hepcidin的规范表达和参与途径相关Hfe hemojuvelin。
- DcytB,十二指肠细胞色素B
- DMT1、二价金属转运体1
- 运铁蛋白质Fpn1,
- Hjv, hemojuvelin
- KO,淘汰赛
- TfR1,转铁蛋白受体1
- TfR2,转铁蛋白受体2
- PCR,聚合酶链反应
- PBS,磷酸缓冲盐
- 转铁蛋白受体2
- hepcidin
- haemochromatosis
- 铁代谢
- 基因敲除小鼠
来自Altmetric.com的统计
- DcytB,十二指肠细胞色素B
- DMT1、二价金属转运体1
- 运铁蛋白质Fpn1,
- Hjv, hemojuvelin
- KO,淘汰赛
- TfR1,转铁蛋白受体1
- TfR2,转铁蛋白受体2
- PCR,聚合酶链反应
- PBS,磷酸缓冲盐
转铁蛋白受体2 (TfR2)是一种同系物的转铁蛋白受体1 (TfR1),主要负责转铁蛋白结合铁的吸收分子进入细胞。1与无所不在地表示TfR1, TfR2被认为是表达几乎只在肝脏和红色的细胞。1TfR2信使rna不含铁的反应元素和似乎没有受铁。2TfR2可以绑定转铁蛋白,但更减少了亲和力与TfR1相比。3,4TfR2在铁代谢的具体角色是未知的虽然很明显,但它起着重要的作用在维护铁稳态的突变TfR2在人类基因导致haemochromatosis。5,6老鼠的有针对性的突变TfR2(同源人类Y250X Y245X)开发相似的表型患者铁过载TfR2haemochromatosis有关。7
Hepcidin,最初被描述为一个抗菌肽,已被证明是一个铁稳态的关键调节器。8日,9日,10Hepcidin肝脏中产生并分泌到血液循环中炎症反应或增加铁商店。10日,11Hepcidin是铁的吸收和铁的负调节释放细胞。老鼠有两个hepcidin基因位于染色体上相互毗邻7。10这不同于人类和老鼠只有一个基因。突变的hepcidin人类和基因敲除小鼠haemochromatosis导致严重的形式。12日,13监管hepcidin似乎在遗传haemochromatosis受损。患者的HFEhaemochromatosis和相关Hfe基因敲除小鼠,有损失的监管hepcidin信使rna表达,导致hepcidin水平仍然很低,尽管增加铁商店。14日,15因此,看来HFE参与hepcidin的铁诱导路径表达式。一项研究表明,HFE也参与炎症诱导的途径,16但是这是有争议的,和其他组织表明,诱导炎症通路HFE无关17日,18这个途径也TfR2独立的。18最近发现在青少年haemochromatosis分子突变,hemojuvelin (Hjv),也被认为是一个关键球员的规定hepcidin表达式。19然而,Hjv的位置在hepcidin监管途径尚不清楚。
以前的研究已经表明有针对性的突变和基因敲除小鼠的基因并不总是产生完全相同的表型,像一些突变体蛋白可以保留部分功能。例如,老鼠的淘汰赛Hfe基因与目标发展比老鼠更严重的铁过载Hfe-C282Y突变的主要原因HFEhaemochromatosis有关人类),这表明C282Y突变可能不是完全废除HFE的功能。20.因此,补充研究老鼠的目标TfR2-Y245X突变,我们已经生成并研究了老鼠的淘汰赛TfR2基因。我们使用Cre重组酶:loxP策略删除外显子2 - 6的老鼠TfR2基因。21这些老鼠完全缺乏TfR2蛋白表达,由免疫印迹,TfR2抗体提高了对氨基末端胞质域和羧基末端细胞外的领域。我们使用这些老鼠调查铁过载的分子基础和研究铁相关分子的表达在肝脏,十二指肠,脾。
方法
老鼠
老鼠的删除外显子2 - 6TfR2基因生成使用Cre重组酶:loxP系统,如前所述。21杂合的TfR2击倒(KO)在混合129 / C57BL6小鼠/ J应变背景intercrossed生产纯合子,杂合的,野生型老鼠。从每组10或11雄性老鼠牺牲在10周的年龄和组织和血液进行进一步分析。所有实验都使用同窝出生的,以避免任何应变执行背景效果。所有老鼠都保持在标准实验室chow(泄洪道Stockfeeds, Lismore南部,澳大利亚)。动物收到人道关怀和研究协议被批准的昆士兰医学研究所的动物伦理委员会。
抗体
Anti-TfR1抗体酶买来实验室(美国加州旧金山),antiferritin抗体的结合位点(英国),并从Sigma-Aldrich antiactin抗体(城堡山、澳大利亚)。抗体mTfR2生成在兔子使用重组蛋白的氨基端81个氨基酸组成鼠标TfR2胞质域。Antiprohepcidin抗体生成使用重组GST-mouse prohepcidin对应氨基酸19 - 83。22
测量铁指数
转铁蛋白饱和度测量使用铁和铁绑定工具包(Sigma-Aldrich)能力。肝脏铁浓度测量使用托兰斯的方法和博思韦尔。23波尔斯的普鲁士蓝染色法用于检测铁在肝脏的部分。
实时聚合酶链反应(PCR) mRNA的量化
RNA是独立于肝脏、十二指肠和脾使用RNeasy迷你包(试剂盒,克利夫顿山,澳大利亚)根据制造商的指示。任何污染基因组DNA被治疗RQ1核糖核酸酶免费DNaseI (Promega、半亩园、澳大利亚)。RNA(1 - 2μg)反向转录使用上标III(表达载体,Mulgrave,澳大利亚)根据制造商的指示。实时反应混合包含2μl cDNA(1:10稀释或1:20),每个引物(表1)的200海里,和SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)。反应进行Rotorgene RG3000 (Corbett研究,布里斯班,澳大利亚)使用下列条件:两分钟变性在95°C紧随其后50周期95°C的30秒,30秒55°C, 72°C,持续30秒。由于SYBR荧光绿色绑定在扩展双链DNA测定步骤。融化曲线分析经常执行监控引物二聚体的水平通过提高温度从50°C到99°C 1°C /分钟而不断监测荧光。所有的实验都是在重复执行,一批cDNA用于所有基因分析。每个运行的执行标准曲线由池cDNA序列稀释,以确保结果的完整性。所有目标基因的表达是由各自的β-actin水平正常化。
西方墨点法
肝匀浆(100μg)电泳上10% Tris-glycine钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶或4 - 12% Novex Bis-Tris梯度凝胶与MES缓冲系统(表达载体,Mulgrave,澳大利亚),转移到Hybond-C +或PVDF膜,阻止了10%的脱脂奶粉和0.5%的渐变20在磷酸缓冲盐(PBS)(阻断缓冲区)一夜之间在4°C。Anti-TfR2(1μg /毫升),anti-TfR1(1μg /毫升),antiferritin (1:200) antiprohepcidin(2μg /毫升)或antiactin(1:400)稀释在阻断缓冲区并应用于墨迹一小时在室温下。印迹洗广泛0.1%渐变20在PBS然后孵化antirabbit, antimouse或antisheep辣根过氧化物酶在室温下一个小时。屁股都洗和西方Supersignal Pico化学发光底物(皮尔斯化工有限公司罗克福德,伊利诺斯州,美国)是应用于污点和暴露于电影。蛋白表达是由微量化和β-actin水平正常化。
免疫组织化学
部分肝放在10%缓冲福尔马林了两个小时,转移到70%乙醇,处理,嵌入在石蜡。组织部分(3μm)受到柠檬酸缓冲抗原检索和屏蔽10%山羊血清30分钟。部分与anti-TfR2孵化(10μg /毫升)和antiprohepcidin(10μg /毫升)抗体在4°C在黑暗中过夜。幻灯片和PBS冲洗,孵化与生物素化的山羊antirabbit抗体(Dako / S,丹麦)一个小时,在PBS短暂冲洗,孵化StreptABComplex /辣根过氧化物酶30分钟。与PBS幻灯片冲洗后孵化了σ3快,3′-diaminobenzidine平板电脑在PBS四分钟。幻灯片和哈里斯苏木精复染色,通过酒精脱水系列和二甲苯,安装与DePeX安装介质。图像被使用一个奥林巴斯DPII数码相机。
统计数据
使用两个参数变量组间比较(方差分析和学生的一种方式t测试)和非参数(克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney)使用SPSS软件统计测试。变量之间的相关性进行了使用Microsoft Excel。被认为具有统计显著性p值< 0.05。
结果
铁状态的评估
测量铁指数TfR2ko小鼠显示,他们开发了大量铁过载的10周的年龄。转铁蛋白饱和度显著升高(83.7v36.7%;在纯合子p < 0.001)TfR2ko小鼠与野生型和杂合的老鼠相比(图1)。肝铁浓度大约是在纯合子的五倍高TfR2ko小鼠(1023.6v188.8μg / g;p < 0.001)。没有显著差异转铁蛋白饱和度或肝和脾铁浓度之间的野生型、杂合的老鼠。纯合子的TfR2ko小鼠脾铁显著低于野生型、杂合的老鼠(图1)。
测量铁指数。意味着转铁蛋白饱和度值,肝铁浓度,和脾铁浓度显示10周大野生型、杂合的,纯合子转铁蛋白受体2基因敲除小鼠。误差棒表示SDs。* * p < 0.01。
肝铁加载的模式TfR2ko小鼠被波尔斯评估的肝段染色。铁沉积在肝细胞清晰可见的梯度门静脉周的中心周围的区域(图2),一个模式典型的患者TfR2相关haemochromatosis25并与突变小鼠TfR2。7铁染色还没有检测到野生型、杂合的老鼠。
波尔斯的肝段染色。肝脏部分从10周大野生型(A),杂合的(B),纯合子(C)转铁蛋白受体2基因敲除小鼠沾波尔斯的普鲁士蓝铁。原来放大20×。
铁的表达相关基因在肝脏,十二指肠,脾
铁相关的mrna水平测定肝脏的纯合子TfR2ko、杂合的和野生型小鼠使用实时PCR。TfR2信使rna没有纯合子小鼠的肝脏和水平杂合的老鼠大约一半的野生型小鼠(表2)。TfR1和二价金属转运蛋白1(DMT1)mRNA水平显著降低(分别为8倍和1.5倍)的纯合子小鼠与野生型和杂合的老鼠相比(表2)。Hepcidin 2 mRNA水平明显高于纯合子小鼠(p = 0.016)。然而,总hepcidin和hepcidin 1 mRNA水平各三组相似,这两个之间有密切的相关性(r= 0.92;p = 2.17×10−13)。Hepcidin 2 mRNA水平没有与总Hepcidin或Hepcidin 1 mRNA,表明Hepcidin 1 Hepcidin总额的占大多数,在肝脏产生的主要形式。这同意先前公布的数据在C57BL / 6 j小鼠hepcidin 1被发现的主要形式。26
水平的Hfe,Hjv,ferroportin1(Fpn1)mRNA在肝脏都是相似的组织和使用学生相比没有显著差异t测试。然而,非参数Mann-Whitney测试建议有显著减少Hfe和Hjv信使rna在纯合子的肝脏TfR2ko小鼠与野生型和杂合的老鼠相比(p = 0.035和0.007,分别)。进一步检验我们注意到有一个鼠标水平高得多的Hfe,Hjv,Fpn1纯合子的组。当这个鼠标,或离群值,分析学生的被撤t测试也发表了重要的结果Hfe和Hjv分别(p < 0.001和p = 0.001)Hfe为1.7,Hjv低1.6倍的纯合子组(表2)。Fpn1水平也降低了纯合子组的1.3倍与野生型和杂合的老鼠相比(表2),但这只是略微使用学生的t测试时显著(p = 0.043)和其他不重要当使用统计检验(一维方差分析、克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney)。
铁相关mrna水平各三组小鼠十二指肠相似,这些分子的表达无显著差异(表2)。TfR2信使rna在十二指肠在所有三组几乎检测不到。脾脏的铁相关的mrna水平比较野生型和纯合子小鼠之间(表2)。TfR2信使rna在纯合子的脾脏察觉TfR2ko小鼠。野生型小鼠约少150倍TfR2相比,脾脏和肝脏。脾脏的所有其他mrna水平两组之间的相似,除了有更少TfR1在纯合子小鼠。这接近相比使用学生的意义t测试(p = 0.054)和使用Mann-Whitney测试时显著(p = 0.013)。
肝脏中肝蛋白表达
免疫印迹是用来确定关键铁相关的肝脏中蛋白质的表达。使用TfR2 TfR2蛋白水平测定特定的抗体(图3)和相关的水平TfR2信使rna (r= 0.88,p < 0.001)。代表铁相关的蛋白质免疫印迹的关键是图3 b所示。TfR2蛋白质完全缺席的肝脏TfR2ko小鼠。杂合的老鼠中间水平与野生型小鼠相比。这些结果证实使用抗体引起的细胞外域TfR2并显示任何截短蛋白缺乏不产生外显子2 - 6基因敲除小鼠(数据没有显示)。TfR1蛋白质含量显著下降(3.9倍,p < 0.001),而肝铁蛋白水平明显提高(4.5倍,p < 0.001)相比,纯合子小鼠与野生型和杂合的老鼠(图3),符合肝铁负荷。肝prohepcidin蛋白质水平变化之间的动物,但组间没有显著差异表达的老鼠,尽管铁负荷和转铁蛋白饱和度增加TfR2ko小鼠。prohepcidin抗体检测两个鼠标使用prohepcidin 1和prohepcidin 2(未发表的观察)。肝prohepcidin水平与总蛋白相关hepcidin(r= 0.39,p = 0.031)hepcidin 1信使rna (r= 0.42,p = 0.020),但不是hepcidin 2信使rna,进一步确认hepcidin 1是主要的形式生产的老鼠的肝脏。
量化肝脏蛋白质的水平。(A)免疫印迹分析100μg老鼠的肝脏(巷1)和肾(巷2)匀浆抗体转铁蛋白受体2 (TfR2),转铁蛋白受体1 (TfR1)和高尔基体标记GS28加载控制。抗体是TfR2具体。(B)总肝蛋白质从10周大的老鼠是西方涂抹抗体TfR2, TfR1,铁蛋白,prohepcidin,β-actin。三个老鼠:代表免疫印迹巷1,野生型;巷2、杂合的;巷3,纯合子TfR2击倒(KO)。(C)量化β-actin正常化后的蛋白质水平。意味着(SD)值显示为野生型、杂合的,纯合子TfR2ko小鼠。* p < 0.05;* * p < 0.01。
免疫组织化学的TfR2和prohepcidin肝脏
TfR2和prohepcidin表达肝脏的纯合子TfR2ko、杂合的和野生型老鼠被免疫组织化学分析。三个老鼠从每组选择进行分析。染色是相似的在每个组和典型图像无花果4和5所示。没有检测到TfR2染色纯合子的肝脏TfR2ko小鼠。在杂合的和野生型小鼠,TfR2表达肝细胞和局部的细胞表面,主要在基底外侧表面等离子体膜(图4)的顶端表面观察到微弱的信号。Prohepcidin中检测出所有小鼠的肝脏与免疫印迹结果一致。Prohepcidin染色有点状的“串珠”表达式模式让人想起高尔基体和分泌囊泡(图5)。
免疫组织化学本地化的转铁蛋白受体2 (TfR2)在肝脏。肝脏部分从10周大野生型(A、B),杂合的(C, D)和纯合子(E, F)TfR2基因敲除小鼠与孵化anti-TfR2抗体(A, C, E)或控制兔免疫球蛋白(B, D, F)。100×原始放大。规模200μm酒吧。
免疫组织化学prohepcidin本地化的肝脏。肝脏部分从10周大野生型(A、B),杂合的(C, D)和纯合子(E, F)转铁蛋白受体2基因敲除小鼠与孵化antiprohepcidin抗体(A, C, E)或控制兔免疫球蛋白(B, D, F)。100×原始放大。规模200μm酒吧。
讨论
在这份报告中,我们描述了相关的表型和表达分析铁分子在肝脏,十二指肠,脾与完整的基因敲除小鼠TfR2基因。这些老鼠发展实质铁过载和特征TfR2haemochromatosis有关。转铁蛋白饱和度的增加,伴随着肝铁负荷和脾缺铁。在这些老鼠没有upregulationhepcidin信使核糖核酸或蛋白表达,预计将在小鼠高铁店,以上的差别,有轻微的对这些Hfe和Hjv信使rna。
TfR2ko小鼠有铁过载表型相似TfR2-Y245X突变小鼠和患者TfR2haemochromatosis有关。纯合子的TfR2ko小鼠与野生型相比增加了转铁蛋白饱和度和杂合的老鼠。在10周的年纪,纯合子小鼠肝脏中有大约5倍更多的铁与野生型、杂合的老鼠。这是一个近似反映在肝铁蛋白水平增加了近五倍。脾脏的TfR2ko小鼠相对铁缺乏。脾缺铁也被观察到TfR2-Y245X老鼠7和Hfeko小鼠,符合患者巨噬细胞室缺铁的世袭haemochromatosis。
的表型TfR2和HFE相关haemochromatosis非常相似,25表明TfR2和HFE函数在同一个通路或并行通路调节铁体内平衡。现在看来,这些分子的最终管理目标是肝肽hepcidin表示。在HFE相关的haemochromatosis和Hfeko小鼠没有upregulation hepcidin尽管增加铁商店。14日,15虽然这手稿是在准备,两项研究也涉及TfR2铁诱导hepcidin通路。27日,28尿hepcidin水平低的患者TfR2相关的haemochromatosis和hepcidin信使rna没有调节的纯合子小鼠TfR2-Y245X突变。Hepcidin函数通过抑制铁释放细胞。最近的一项研究表明,hepcidin达到通过绑定铁出口国1运铁素在细胞表面并诱导其内在化。29日
为了检查TfR2完全缺乏的影响,我们研究了铁相关分子的表达水平在肝脏,十二指肠,脾。而TfR2ko小鼠没有表达TfR2信使核糖核酸或蛋白质在肝脏,杂合的老鼠的中间水平TfR2信使rna和蛋白质。低TfR1和DMT1mRNA水平和铁蛋白水平上升都指向IRP绑定活动减少,肝细胞内铁过载。我们没有看到的增加Fpn1信使rna在TfR2ko小鼠和事实上有轻微减少当局外人被分析。这可能显示的差别转录对这些Fpn1肝脏的TfR2ko小鼠。Fpn1蛋白水平并不是衡量的影响,因此铁过载Fpn1监管IRE-IRP介导的蛋白质无法评估。
我们已经表明,表达hepcidin信使rna在肝脏不符合观察肝铁加载TfR2ko小鼠。总hepcidin和hepcidin 1在纯合子的mRNA水平没有增加TfR2ko小鼠尽管铁负荷。这是符合观察到的损失hepcidin信使rna调控的老鼠TfR2-Y245X突变。28我们看到一个显著增加hepcidin 2信使rna在纯合子TfR2ko小鼠,暗示可能会有一些完整的专门的监管hepcidin 2针对铁负荷。然而,水平的hepcidin 2在肝脏远低于hepcidin 1没有效果的增加hepcidin信使rna或prohepcidin蛋白质。人类只有一个hepcidin基因,因此这一发现的意义在人类的情况还不清楚。另外,另一项研究得出结论,老鼠hepcidin 2不是铁代谢和功能的hepcidin对铁代谢的影响肝脏抗菌多肽介导只有1。30.除了hepcidin信使rna,我们研究通过免疫印迹prohepcidin蛋白的表达。prohepcidin蛋白质水平没有增加TfR2ko小鼠(图3)。这是第一个分析prohepcidin蛋白质含量与有缺陷的小鼠TfR2表达式。
除了hepcidin信使rna和蛋白质的水平,分析了相关的其他铁mRNA的表达在肝脏。仔细的检查Hfe和Hjv信使rna表达,一个小但是显著减少这些分子TfR2ko小鼠被检测到。这种差异观察使用非参数测试和参数测试后删除局外人的分析。目前尚不清楚这是否表达的减少是由于肝脏铁负荷或TfR2损失的直接结果。是否减少Hfe和Hjv在TfR2ko小鼠相关的损失hepcidin监管还不清楚。然而,看来TfR2 Hfe, Hjv铁中所有相关的监管途径导致hepcidin表达式。
有表达的差异非常小的铁相关的mrna的十二指肠和脾脏TfR2ko小鼠。TfR2信使rna在所有老鼠的十二指肠察觉。在十二指肠,信使rna编码铁转运蛋白DMT1和Fpn1和主持人DcytB和hephaestin没有表达下调,尽管铁负荷。与本研究相反,川端康成等观察十二指肠的增加DMT1信使rna水平TfR2-Y245X老鼠,这表明十二指肠铁吸收增加。28这种差异可能是由于老鼠的年龄学习(四个月v10周)。此外,川端康成等具体测量水平的外显子1的一种形式DMT1而在这项研究中DMT1信使rna进行了测量。增加十二指肠铁转运蛋白将不一定会TfR2ko小鼠肝脏hepcidin监管的损失的纯合子TfR2ko小鼠导致hepcidin水平与野生型小鼠相比。即使没有观察到十二指肠铁转运蛋白,增加铁的吸收相对于铁商店仍会增加。在脾脏,水平的TfR2下降了约150倍。这些结果证实TfR2是肝脏的主要位置。在脾脏中,我们观察到的减少TfR1信使rna在纯合子TfR2ko小鼠。这是与预期的相反;低铁水平细胞通常会导致稳定的TfR1信使rna由IRE-IRP介导机制。因此,而不是细胞的铁状态确定表达式的TfR1脾,脾铁浓度较低TfR2ko小鼠的差别可能是由于对这些TfR1。机制的差别导致对这些TfR1这些小鼠的脾不明确,需要进一步研究。
使用免疫组织化学,我们证实TfR2肝脏的缺席TfR2ko小鼠。TfR2本土化主要是肝细胞的细胞表面,主要在基底外侧表面在野生型和杂合的老鼠,也与一些染色检测到顶端表面。的分布在肝细胞的质膜TfR2是符合其拟议的功能。TfR2转铁蛋白可以作为一个取样器,也许传感或转铁蛋白的铁饱和度的diferric转铁蛋白在血液。激活的TfR2转铁蛋白可以导致导致感应的信号级联hepcidin信使rna表达。
prohepcidin在肝脏的免疫组织化学定位是相同的纯合子TfR2ko、杂合的和野生型老鼠。Prohepcidin有“串珠”的表达模式,这让我想起了高尔基体分泌通路,我们以前观察到在其他鼠标菌株。22因此,在TfR2ko小鼠似乎没有upregulation hepcidin回应铁加载和没有hepcidin蛋白质的转录后调控。
总之,我们已经表明,老鼠完全缺乏TfR2 haemochromatosis发展。TfR2需要铁hepcidin的规范表达。的途径可能涉及Hfe和Hjv TfR2功能。虽然我们的研究结果不能明确这些蛋白质在精确的位置在一个通路,他们建议TfR2上游Hfe和Hjv信号级联,导致感应hepcidin表达式。这些结果支持肝脏的概念作为身体的中央监管机构铁体内平衡。
确认
这项工作是支持部分由澳大利亚国家健康与医学研究委员会(953219年)和美国国立卫生研究院、美国(5 r01dk057648-04)。
引用
脚注
利益冲突:没有宣布。