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背景和目的:趋化因子是小的多肽,主要功能是淋巴细胞招聘和贩卖。本研究的目的是评估的参与遗传变异在CCR2, CCR5,配体咆哮在确定疾病结果丙型肝炎病毒(HCV)感染者。
方法:共有283名妇女,所有接触到HCV基因型1 b从单一捐赠者,和包括那些自发清除病毒与慢性感染,在CCR2基因分型,CCR5,咆哮多态性。这些多态性的频率和严重程度与疾病活动。
结果:CCR5、CCR2和咆哮基因型比较与丙肝病毒聚合酶链反应(PCR)状态,丙氨酸转氨酶水平和肝脏组织学。没有明显关系CCR2咆哮多态性与疾病的结果或严重性。然而,CCR5Δ32杂合子更有可能比那些没有自发清除病毒的突变(PCR - 42%v- 28.3%;p = 0.044,优势比为1.83(95%置信区间1.1 - -3.6))。子群的DRB1 * 03011 -个人,以前发现与更严重的炎症,组织学炎症评分的差异(CCR5WT / WT = 4.9vCCR5Δ32 / WT = 3.53;p = 0.043)是重要的。
结论:CCR5Δ32杂合性是与自发的丙型肝炎病毒相关显著间隙和子组得分显著降低肝脏炎症在这个队列。人口控制和丙肝病毒有相似的杂合性频率。
- 丙肝病毒、丙型肝炎病毒
- MIP-1α,巨噬细胞炎症蛋白1α
- 英国石油(bp)碱基对
- 干扰素,干扰素
- ,白介素
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
- ALT,丙氨酸转氨酶
- 海,组织学活动指数
- 艾滋病毒、人类免疫缺陷病毒
- 丙型肝炎病毒
- 趋化因子受体5
- 病毒清除
- 激昂的演说
- 肝脏炎症
来自Altmetric.com的统计
- 丙肝病毒、丙型肝炎病毒
- MIP-1α,巨噬细胞炎症蛋白1α
- 英国石油(bp)碱基对
- 干扰素,干扰素
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- 艾滋病毒、人类免疫缺陷病毒
慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的流行全世界大约2%。1多达70%的人接触丙肝病毒慢性感染。对丙肝病毒的许多方面知之甚少,包括疾病严重程度差异很大的原因和自发的间隙和慢性感染。在接触病毒基因型、年龄,饮酒是已知的疾病严重程度的决定因素,但遗传易感性慢性感染的作用仍不清楚。组成的人口在这项研究中,283名妇女被污染anti-D感染免疫球蛋白在1977年,代表一个独特的机会来评估一个大丙肝病毒人口以最小的混淆问题。2anti-D免疫球蛋白是污染从单一来源,因此所有女性感染了相同的基因型(即基因型1 b),最小化不同基因型可能影响研究。
趋化因子是小的多肽与一个重要的角色在白细胞招聘和贩卖。白细胞炎症期间招聘需要细胞间浸润白细胞之间的通信,内皮细胞和薄壁组织的细胞,由早期响应趋化因子。迁移调节T细胞的体外和体内与趋化因子通过调节。3CCR5的受体促炎趋化因子巨噬细胞炎性蛋白- 1α(MIP-1α)MIP-1β,和咆哮,宿主对病毒的反应中的关键角色在人类和小鼠的疾病。432碱基对(bp)删除在CCR5结果的蛋白质在细胞表面无法察觉。纯合性缺失是发现在1%的白种人和已被证明是预防人类免疫缺陷病毒(HIV)感染,而杂合子的状态,这是发现在10%的白种人,导致疾病进展缓慢。它的作用在其他病毒感染仍有待确定。
CCR5和其它趋化因子T细胞分化中扮演重要角色。CD4 + T细胞可以分化成Th1、Th2细胞根据其趋化因子。CCR5表达Th细胞和记忆和激活T细胞。抗原致敏T细胞的迁移是由CCR5促成的。5当人类T细胞克隆分析,CCR5似乎表达了上级Th1细胞,而许多Th2克隆没有CCR5的表达。Sallusto等证明了CCR5表达取决于T细胞的活化状态,其表达式是调节- 2。6已经提出,在丙肝病毒,主要有Th1反应在肝脏。7,8的确,进步在丙肝病毒与肝脏损伤的upregulation Th1细胞因子(干扰素(IFN)和白介素(IL) 2),由那不勒斯如图所示等,增加IFN-γ和- 2的表达与纤维化和门户炎症组织学得分。7
CCR5连同CCR2六两个集群的趋化因子受体p21基因映射到3。CCR2编码一个轻微的艾滋病毒受体,G编码序列多态性导致缬氨酸异亮氨酸替换,指定CCR264I被描述。看来CCR2WT与CCR5完全连锁不平衡吗?32,10 kb。因此在3000年的一项研究个人,史密斯和他的同事们9证明了Δ32突变是从未见过的单体型CCR264I突变。CCR2和CCR5在细胞和组织的分布非常相似。CCR2信号也促进Th1发展感染模型和使用CCR2基因敲除小鼠的研究表明这些小鼠淋巴细胞减少46%招聘网站的感染和炎症和一个本地CD4 + T细胞减少80%。10咆哮,CCR5配体,对淋巴细胞的招募也很重要,因为它吸引了记忆和激活T细胞。咆哮的G突变被描述在403−位置,导致额外的GATA转录因子结合位点,与突变子有一个高出8倍比野生型本构转录活动。11
在正常肝脏、咆哮表达仅限于几个分散的肝细胞。然而,在HCV感染的肝脏表达显著升高,特别是在门静脉周的和小叶地区有淋巴细胞浸润。12针对这一点,我们假定CCR5受体或遗传变异的趋化因子结合这种受体可能对结果产生影响的丙型肝炎感染。这种变化可能难以检测的影响在人群中有异质性的种族,病毒基因型,和剂量的感染源。因此我们进行的一项研究的基因影响CCR5Δ32突变和咆哮位置−403突变的结果基因同质人口感染丙型肝炎感染通过单一来源。
患者和方法
研究人群
283名女性的研究人群招募从门诊病人肝脏病学单位在圣詹姆斯,圣文森,板牙Misericordiae医院在都柏林。所有的妇女参加这些单位曾暴露于丙肝病毒通过受污染的anti-D免疫球蛋白在1977年被邀请参加。该集团包括那些慢性感染、持续丙肝病毒RNA阳性由逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),和那些清除病毒RNA(即保持丙肝病毒抗体阳性,但消极的)。参与者都没有任何其他收购病毒性肝炎的危险因素(例如,输血或静脉注射吸毒传播的历史)。所有的酒精消费不到14 U /星期和其他形式的慢性肝脏疾病在所有情况下都被排除在外。283年最初接触到污染anti-D免疫球蛋白,196年仍然是慢性感染(也就是说,RT - PCR (RNA)积极),87人anti-HCV抗体阳性但持续RNA阴性(也就是说,他们已经扫清了丙肝病毒感染)。RNA阴性个体平均六个rt - pcr反应在不同时间点进行确认自发的病毒清除。大多数的这些课程已经为一级和二级HLA多态性的基因,和一个重要的协会之间被发现病毒慢性和DRB1 * 03011的存在和DQB1 * 0201。13所有科目给知情同意参与这项研究之前,接受伦理研究和伦理委员会批准所有三个机构。
控制
估计CCR5Δ32等位基因的频率在爱尔兰人口,对照组120人没有选择健康志愿者基因分型无关。这些都是卫生保健工作者和爱尔兰血统。
丙肝病毒感染的诊断
丙肝病毒抗体
第三代酶免疫测定(ELISA;雅培诊断,德国)被用来测试所有对象针对丙肝病毒抗体和第三代重组免疫印迹试验(瑞芭3;凯龙星Corp .)、维尔,美国加州)被用作证实试验。
rt - pcr检测
rt - pcr分析(Amplicor;罗氏诊断系统,新泽西,美国)被用来检测HCV RNA在所有科目。
DNA提取
盐析的技术被用来从全血中提取DNA。14DNA也使用QLAmp中提取DNA midiprep装备,(试剂盒有限公司,克劳利,英国)。在这个过程中,所有的RNA被孵化的消化准备1.5µl核糖核酸酶A(勃林格曼海姆英国有限公司东萨塞克斯郡,英国)每400µl核溶解产物,根据制造商的指示。
CCR5-Δ32基因分型
PCR反应组成的PCR 1×缓冲区(由厂家提供),25μM MgCl2200μM deoxynucleotide三磷酸腺苷,0.5μM正向和反向引物,15 ng中提取DNA, DNA聚合酶试剂盒Taq 1单位,14.3μl H20用于主题和对照组基因型。CCR5-32突变引物侧翼的(感觉5′caa AAA棉酚GGT CTT猫TAC ACC-3′;反义5′有条件现金援助GTG有条件现金援助CTT CTT CTC ATT TCG-3′)被用来放大189个基点(野生型)和157年英国石油公司bp删除(32)CCR5基因的片段,分别。放大后的碎片视觉效果在3%琼脂糖凝胶。
CCR264I基因分型
基因分型是由限制消化电泳后的扩增片段如下:PCR反应的正向引物5′TTG GTT TTG TGG GCA ACA TGA TGG-3′和反向引物5′猫TGC ATT CCC AAA广汽CCA CTC-3′进行扩增子173个基点。这是然后用酶消化Bsa BI(美国马萨诸塞州新英格兰生物学实验室,贝弗利)产量限制149 24 bp的碎片。野生型序列存在时,碎片仍未雕琢的,这样就给一群173个基点。
咆哮的基因
应用生物系统公司有限公司(美国加州福斯特城)设计了一个5′核酸外切酶测定使用的试验设计服务TaqMan分析基因型咆哮403多态性。正向引物5′GAG广汽有条件现金援助有条件现金援助CAA TAA AAC行动TTA TAA 3′,反向引物5′法GAG TCT柠檬酸亚美大陆煤层气有限公司TTC CTG CTT-3′和探针维克猫TAC AGA TCT TAC CTC CTT T和家猫TAC AGA TCT答CTC CTT T。作为质量控制措施,10%的样本重复所有上述基因分型和一致性。上述所有被一位读者读他失明的识别基础样本,直到所有竣工记录。
组织学评价
所有196 rt - pcr阳性妇女经历了肝脏活检作为最初的临床评估的一部分(即开始前任何治疗)和17至20年后感染。肝活检在每个中心都由一个histopathologist得分,失明的CCR5基因型个体。活检是得分根据修改后的组织学活动指数(0 - 6海0-18炎症、纤维化)。丙肝病毒RNA -科目没有肝脏活检。
统计分析
Mann-Whitney U测试是用来比较组织学、炎症、纤维化评分,和丙氨酸转氨酶(ALT)水平,不同子群之间的分类根据患者的基因型。病毒清除和多态性之间的关系由χ评估2和确切概率法。0.05 p值被认为是对所有上述测试的重要意义。比值比(或)为每个不同的多态性和疾病协会被Epi-Info计算。15先前的结果也分析了HLA DR,多用于DQ基因座。所有数据都输入到统计软件包SPSS (SPSS . n:行情)、芝加哥,伊利诺斯州,美国)和Epi-Info。
结果
三个不同的多态性的基因分型的结果比较与丙肝病毒PCR状态(表1),组织学得分,ALT水平。
基因型与病毒清除
杂合子CCR5Δ32突变的频率一般人群相似的丙肝病毒研究小组(17.9%和17.6%,等位基因频率0.193和0.186,分别)。
只有一个CCR5Δ32 /Δ32个人每组中。CCR5Δ32 / WT(野生型)的存在与自发的病毒相关基因型明显间隙:42.0%的那些CCR5Δ32 / WT丙肝病毒PCR -和只有28.3%的CCR5WT / WT (p = 0.044,单侧确切概率法,或1.9(95%可信区间(CI) 1.1 - -3.6))。只有一个病人是纯合基因的CCR5Δ32 /Δ32和她是丙肝病毒PCR阴性。等位基因频率在哈迪温伯格平衡病人和对照组。CCR5基因型与病毒协会间隙时看着DRB1 * 03011和DQB1 * 0201 -组,没有被发现(分别p = 0.563和0.68)。分析CCR264I (p = 0.327或0.66 (95% CI 0.23 - -1.6))和咆哮(p = 0.441或1.01 (95% CI 0.58 - -1.7))基因型没有透露任何与丙肝病毒间隙的关系。
基因型和组织学严重程度之间的关系
在肝脏炎症得分没有显著差异Δ32突变杂合的,那些没有这种突变(海3.82的副本v4.53;在这群p = 0.098)。此外,DRB1 * 03011阳性组,之前发现与更严重的炎症有关,CCR5Δ32没有进一步添加剂对组织学的影响严重,平均海non-CCR5WT / WT的4.16和3.80对CCR5Δ32杂合子(p = 0.78)。相比之下,在DRB1 * 03011 -组,与更严重的炎症,CCR5Δ32合子有炎症评分明显低于CCR5WT / WT组(3.53炎症评分的平均值v4.91;p = 0.043)(表2)。
基因型和ALT水平之间的关系
ALT水平略高的CCR5和CCR2野生型组与杂合的相比,而相反的咆哮组的观察。然而,这些差异没有达到统计学意义(表3)。
讨论
本研究显示明显高于自发丙肝病毒清除CCR5Δ32 / WT / CCR5WT / WT组(p = 0.044)。本协会不存在的命运的16或Promrat17研究,这两个有几个混杂问题与HCV基因型、性别和种族。具体来说,命运的研究由个人从多个欧洲人口和包含病毒阴性患者的比例较低。丙肝病毒基因型并没有指定在这个研究。此外,感染来自多个来源,建议高度的丙肝病毒遗传异质性。因此一些混淆变量是固有的这些研究可能阻碍的能力来检测病毒间隙的变化。我们的研究人群的相对独特的特性,主要是(我)所有受试者女和爱尔兰血统的白人和(2)都被感染HCV基因型1 b的一剂通过anti-D免疫球蛋白在1977年。2他们没有其他肝脏疾病的风险因素和其他重要的共病的疾病。
CCR5Δ32突变来自32个基点删除导致蛋白质的突变和过早终止框架转变。结果CCR5突变蛋白可能是功能上的惰性,因为它不仅缺乏七的最后三个假定的跨膜区域也参与G蛋白耦合和信号转导域。18事实上,刘等表明,合成蛋白质表面没有检测到细胞通常会表达出来,因此不能作为受体。19然而,CCR5丙肝病毒的突变的作用是不一样的为丙肝病毒的方法获得艾滋病毒进入细胞是未知的,但与艾滋病毒,通常不被认为是与CCR5受体有关。
丙肝病毒的杂合的基因型出现在17.6%的人口和17.9%的控制人口,CCR5Δ32 /Δ32基因型中发现0.32%和0.69%,分别每一组纯合子。这是一个载体率最高的报道任何欧洲人口和与Libert的结果是一致的等研究基因频率在欧洲18个国家,发现北/南梯度,在芬兰的最高频率(16%),最低的撒丁岛(4%)。20.有争议的是,在2002年,Woitas等报道称,CCR5Δ32纯合性三次更频繁地发生在anti-HCV抗体阳性HIV阴性的人。21这个群体依然HIV阴性,尽管多重曝光,建议他们选中的人口,最有可能的基础上CCR5Δ32基因型。因此增加CCR5Δ32纯合性最有可能反映出抗艾滋病毒,而不是增加丙肝病毒感染的风险。
在解释如何CCR5Δ32多态性可能会改变丙肝病毒清除,我们必须考虑,CCR5杂合性的影响在急性丙肝病毒可能不会发生在慢性丙肝病毒感染的代表。在急性丙肝病毒感染,间隙与一个强大的T细胞反应有关的广泛的丙肝病毒抗原。22相反,缺乏CCR5实际上可能导致T细胞扩张。这是演示了使用一种急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎感染模型在CCR5基因敲除小鼠的抗原特异性T细胞克隆扩张增加,没有减少,CD8 +及CD4 + T细胞。23同样,缺乏CCR5已经增加T细胞IFN-γ的生产,导致CCR5的建议可能是负监管反馈回路的一部分急性T细胞活化。24缺乏CCR5小鼠感染小鼠肝病毒有降低T细胞浸润在第七天,但是白天12 T细胞浸润与野生型相似,这项研究还暗示干扰素生产可能已经增加了CCR5−−/组。25杜氏利什曼虫感染了一个转变,从最初的低到夸张的抗原特异性干扰素反应8周后感染CCR5−−老鼠,这表明也许CCR5的影响改变的过程中感染。26与上述相反,Belnoue的研究等表明,CCR5−−/老鼠脑型疟疾感染有显著降低T细胞脑渗透。27这些对比结果可能反映了CCR5与寄生而不是病毒感染。
这项研究还显示的趋势不太严重的肝脏炎症评分CCR5WTΔ32与CCR5WT / WT个人。在先前的研究中,我们确定了HLA DRB1 * 03011积极性是与减少肝脏炎症在这个队列。我们没有观察到的累加效应CCR5Δ32 DRB1 * 03011积极的个人,暗示这个HLA等位基因的主导作用。然而,我们观察到显著降低肝脏炎症评分CCR5Δ32 / WT组人DRB1 * 03011 - (p = 0.043)。在最近出版的命运等,显著降低门户炎症、坏死炎性组织得分,而不是整体CCR5Δ32杂合的中被发现。16CCR5Δ32与减少循环淋巴细胞迁移MIP-1α等配体的反应19我们也观察到这种体外CCR5Δ32杂合子(数据没有显示)。
在丙肝病毒主要在肝脏Th1反应。CCR5表达Th1细胞和促进迁移的T细胞抗原的首选。尽管丙肝病毒的细胞毒性淋巴细胞的数量在肝脏低感染期间,有许多激活/记忆T细胞,其中大部分CCR5表达。据报道,在丙肝患者中,肝浸润淋巴细胞显示增加的CCR5的表达,28这与组织学严重程度相关。29日同样,动物研究表明CCR5在肝淋巴细胞迁移的关键作用。30.因此减少了CCR5的表达,与CCR5Δ32杂合性,从力学上看可能与肝脏炎症,由于减少了CCR5表达细胞的迁移。
命运和Promrat发现关联的咆哮−403启动子多态性和降低肝脏炎症患者的一组中,并没有发现在这项研究中。可能是民族咆哮多态性和病人数量的变化可以部分解释这些研究之间的区别。
显然有很多的工作要做在这个非常令人兴奋的领域,特别是详细的功能性研究。虽然是一种检测丙肝病毒影响间隙在这项研究中,还需要进一步的研究来确定这些数据是否generalisable更广泛的丙肝病毒感染人群。这样的研究将需要大量的病人和还需要关于民族起源遗传同质性或分层考虑到广泛的多样性这多态性的等位基因频率甚至欧洲高加索人群。这种突变可能对丙肝病毒清除的影响和严重性可能不仅重要与那些只感染了丙肝病毒,但也至关重要的大量合并感染艾滋病毒,特别是anti-CCR5定向药物已经在治疗艾滋病毒的调查。31日,32
确认
赞助的这项研究是由高等教育部门计划第三个层次的研究机构、健康研究委员会和欧盟框架四世。
引用
脚注
网上发布的第一个2005年4月29日
利益冲突:没有宣布。
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