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背景和目的:机制转换肠上皮化生巴雷特食管尚未阐明。我们调查的影响各种胆汁酸尾相关同源框基因Cdx2的表达培养食管鳞状上皮细胞。此外,形态和肠道上皮细胞鳞状细胞组织化学的变化进行了研究,以应对胆汁酸诱导Cdx2的表达。
方法:巴雷特食管的大鼠模型是由交织食管空肠,和Cdx2的表达被免疫组织化学研究。同时,响应各种胆汁酸对Cdx2基因表达研究在人类结肠上皮细胞系Caco-2 HT-29,以及培养大鼠食管鳞状上皮细胞使用Cdx2启动子荧光素酶检测。此外,主要培养食管鳞状上皮细胞和Cdx2的表达载体转染及其可能的转换肠胃型上皮细胞进行了研究。
结果:在大鼠食管Oesophagojejunal吻合形成肠道杯状细胞化生标本和化生的上皮细胞Cdx2强烈表达。11种胆汁酸的影响在Cdx2基因表达进行检测时,发现只有胆酸(CA)和dehydrocholic酸剂量依赖性增加Cdx2 Caco-2推广活动和Cdx2蛋白生产和HT-29细胞,和培养大鼠食管的角质细胞。Cdx2启动子突变分析,研究结果表明,两个核因子κB (NFκB)结合位点负责Cdx2的胆汁酸诱导激活启动子。当胆汁酸测定食管refluxate的老鼠实验巴雷特食管的CA的浓度被发现符合实验剂量增强体外Cdx2的表达。此外,转染Cdx2的表达载体在培养大鼠食管的角化细胞诱导肠胃型黏液的分泌,MUC2的表达Cdx2的细胞。
结论:我们发现CA激活Cdx2发起人通过NFκB和Cdx2蛋白在食管的角质化细胞有促进肠胃型黏液的生产。这可能是其中的一个机制上皮化生巴雷特食管。
- GORD gastro-oesophageal返流性疾病
- 柠檬酸,牛磺胆酸
- TDCA, taurodeoxycholic酸
- TCDCA, taurochenodeoxycholic酸
- GCA, glycocholic酸
- GCDCA, glycochenodeoxycholic酸
- DHCA, dehydrocholic酸
- CA,胆酸
- LCA,石胆酸
- GCANa glycocholic酸、钠盐
- DCA,脱氧胆酸
- CDCA,鹅去氧胆酸
- EMSA,电泳迁移率改变分析
- kb,千碱基
- CK,细胞角蛋白
- rt - pcr、逆转录-聚合酶链反应
- κB NFκB、核因素
- Cdx2
- 胆汁酸
- 胆酸
- dehydrocholic酸
- 巴雷特食管
来自Altmetric.com的统计
- GORD gastro-oesophageal返流性疾病
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巴雷特食管是一个收购条件在远端食管鳞状上皮的化生的柱状上皮所代替1这被认为是引起慢性gastro-oesophageal反流病(GORD)。2巴雷特食管主要源于它的兴趣建立协会与食管腺癌,癌症的发病率增加了在过去的十年。3虽然有这个条件的发病机制有着极大的兴趣,关于细胞化生的机制所知甚少或精确的巴雷特的上皮细胞起源。一些临床研究强调慢性duodenogastro-oesophageal回流的角色发展的巴雷特食管。4 -7患者的GORD,胆汁酸的浓度在食管refluxate与食管黏膜损伤的程度。4 -7此外,混合反流患者的胃和十二指肠内容更常见巴雷特食管的比那些简单的GORD。6此外,实验模型由一个oesophagojejunal吻合表明,慢性十二指肠内容回流到食道诱发严重的食管炎,巴雷特食管,最后食管腺癌。8日,9日,10日,11日,12值得注意的是,巴雷特的上皮细胞在这些模型很像人类的巴雷特食管形态学描述的病变和癌症相关基因的表达模式产品,包括p53、原癌基因,环氧酶2。12这些数据表明,回流的十二指肠内容与胆汁酸有助于开发的巴雷特食管。
Cdx1和Cdx2尾相关同源框基因家族的成员,根据他们的尾基因序列的同源性黑腹果蝇。13日,14他们是肠特定转录因子是重要的早期肠道上皮细胞的分化和维护胃肠道中发展。15Cdx2报道是许多肠道的直接转录激活特定基因,包括MUC2 sucrase-isomaltase, lactase-phlorizin水解酶、胰高血糖素,guanylyl环化酶C。16 -20.迫使IEC6 Cdx2的表达细胞,一个未分化的大鼠肠上皮细胞株,不表达Cdx蛋白质,可以诱导细胞分化的特点是多细胞结构包含一个完整的柱状层两极分化的细胞。21当表示在胃里,Cdx2可以诱导分化肠胃型胃上皮细胞的细胞,这表明它可能产生肠上皮化生中发挥基础性作用。22日,23此外,Cdx2蛋白已经被报道在巴雷特食管炎的上皮和食管上皮细胞。24日,25
在目前的研究中,我们调查了假说,胆汁酸刺激食管角质细胞对Cdx2的表达的影响。我们也决定哪些胆汁酸Cdx2基因表达的主要监管机构主要培养大鼠食管的角质细胞。此外,我们研究了肠中特定基因表达培养食管的角化细胞通过overexpressing Cdx2基因。
材料和方法
巴雷特食管的大鼠模型
7个月大的雄性Wistar鼠被用于实验。诱导巴雷特食管,我们与少量修改Levrat的模型使用。26中线进行剖腹手术,gastro-oesophageal结被切断和食管端分离。那时的远端食管reimplanted 2厘米的韧带之外Treiz一边塑造成一个循环结束的空肠和近端胃是年底的结扎。六个月后形成的oesophagojejunal吻合、老鼠都牺牲了,每个食管切除,食管refluxate收集。胆汁酸的浓度,除了dehydrocholic酸(DHCA),通过高效液相色谱法(HPLC)测定的浓度DHCA决心使用气相色谱/质谱分析。实验研究方案是机构批准的动物保健和实验岛大学的委员会。
细胞系和文化
四个细胞系,会阴,猴肾细胞系(常见的转染宿主),TT(人工食管鳞状细胞癌),HT-29(人类结肠癌癌)和Caco-2(结肠癌癌),被用于这项研究。调查胆汁酸Cdx2诱导启动子的激活,三个细胞系,会阴,TT, HT-29,被用来调查可能的器官胆汁酸的具体影响。进行分析的直接影响胆汁酸Cdx2的表达,Caco-2 HT-29被用作这些细胞系是众所周知的内生Cdx2的表达。27
报告基因分析的载体建设
建筑的记者向量Cdx2的启动子,加入没有U00454使用。位置+ 1指的是主要Cdx2基因的转录起始点确定28日,29日;1014个基点的Cdx2启动子(888−+ 125)被聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆到KpnI和BglII网站的pGL3-basic荧光素酶向量(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)来生成pCdx2/1014-Luc。
启动子的不同长度pCdx2/1014-Luc放大了PCR和subcloned KpnI pGL3-basic BglII网站,产生pCdx2/425-Luc (−299 + 125), pCdx2/307-Luc (−181 + 125), pCdx2/198-Luc(−72 + 125),和pCdx2/74-Luc (+ 52 + 125)。经测序克隆启动子序列。
功能缺陷的两个假定的核因子κB pCdx2/1014-Luc (NFκB)结合位点(1:103−−82;2:22−−1)(pM1-Luc、pM2-Luc pM1 + 2-Luc)被插入突变诱导工具包使用快换定点突变技术(美国加州拉霍亚,Stratagene)。产生突变Cdx2子构造,pM1-Luc和pM2-Luc 5′gcg agc创新艺人经纪公司有条件现金援助gcg gcg空中交通管制ca一个caa公司治理文化ctc tac agc tta ctg三大′,5′gag gca gga cgg gg插科打诨在一个c一个g caaggg gg cag亚美大陆煤层气有限公司ctc tgc-3′,分别(核苷酸替换以粗体显示)。产生突变pM1 + 2-Luc,变异的寡核苷酸是用来取代野生的启动子序列。正确的启动子序列的突变被测序证实。作为内部控制的双荧光素酶测定,pRL-TATA -Renilla卢克也表示构造Renilla荧光素酶在最小的塔塔子。30.
荧光素酶检测
Cdx2的胆汁酸对转录激活的影响进行评估。会阴、TT和HT-29培养在24孔板(5×104/)和细胞转染有0.5个人μg发起人μg pRL-TATA——Cdx2-Luc和0.02Renilla卢克在每个良好,LipifectAMINE +(英杰公司公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)。11种胆汁酸,包括牛磺胆酸(柠檬酸),taurodeoxycholic酸(TDCA) taurochenodeoxycholic酸(TCDCA) glycocholic酸(GCA) glycochenodeoxycholic酸(GCDCA), DHCA,胆酸(CA),石胆酸(LCA), glycocholic酸、钠盐(GCANa)、脱氧胆酸(DCA)和鹅去氧胆酸(CDCA),被用作兴奋剂。胆汁酸都从西格玛化工有限公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。十二小时后荧光素酶载体的转染细胞与不同浓度的胆汁酸刺激或车辆(0.1%乙醇)仅12小时和细胞溶解产物被用于测量使用PicaGene双荧光素酶活性荧光素酶工具包(Toyoinki有限公司、东京、日本),如前所述。30.数据表示为具有多个荧光素酶活性的增加胆汁酸刺激样本在车辆的刺激样本。
电泳迁移率改变分析(EMSA)
核内蛋白提取和EMSA根据先前所描述的程序进行。31日双链寡核苷酸探针NFκB共识(Promega)与[γ-标签32使用T4多核苷酸激酶P] ATP。竞争实验由添加100倍摩尔过剩的未标记的寡核苷酸。
直接胆汁酸对Cdx2基因表达的影响
检查直接影响DHCA Cdx2的表达,Caco-2 HT-29细胞。与DHCA 24小时孵化后,蛋白质被隔绝Caco-2 HT-29细胞测量Cdx2的表达的免疫印迹分析。
大鼠食管角质细胞的主要文化
主要文化食管的角化细胞从正常鼠oesophagi建立了。食管上皮细胞样本来自7个月大的雄性Wistar鼠,被切割后的肌肉和黏膜下层大鼠食管,切成1 - 2毫米。镀trypsinisation后,细胞在胶原蛋白I型涂层塑料组织培养菜肴在0.03毫米的钙角化细胞生长介质,补充以10%胎牛血清胰岛素5μg /毫升、1×10−9三碘甲状腺氨酸,25μg /毫升牛脑垂体提取物、10 ng / ml表皮生长因子,1.8×10−4M腺嘌呤、50μg /毫升氢化可的松和抗生素。细胞用于实验后第二通道。
与DHCA 12小时孵化后,总RNA分离培养的角质细胞测量Cdx2基因表达的北部污点分析。后24小时孵化与DHCA或钙、蛋白质提取主要培养的角质细胞测量Cdx2的表达,免疫印迹分析。24小时后孵化DHCA或CA,细胞Cdx2的本地化是调查Cdx2免疫荧光细胞化学。
北部污点分析
总RNA提取和北部污点分析进行如前所述。32岁的33探针用于北方污点分析0.33千碱基(kb)互补脱氧核糖核酸的老鼠Cdx2(632 - 964年NCBI数据库;AJ278466)和0.76 kb cDNA老鼠β-actin。32岁的33
蛋白质的提取和免疫印迹分析
蛋白分离和免疫印迹分析进行如前所述。32岁的33膜是孵化anti-Cdx2抗体(1:50;圣拉蒙BioGenex,美国加州)或anti-β-actin抗体(1:3000;σ),然后孵化与辣根过氧化物酶共轭antirabbit免疫球蛋白(Dako Corp . Carpinteria,加利福尼亚,美国)。
免疫组织化学
每个标本(5μm厚部分)是沾染了haematoxylin-eosin光显微镜检查。识别Cdx2的表达细胞,组织部分与anti-Cdx2孵化抗体,其次是孵化与二级生物素化的antimouse免疫球蛋白(Dako)。绑定使用avidin-biotin过氧化物酶抗体检测方法(ABC精英设备;向量的实验室,伯林盖姆,加州,美国)。部分与苏木精复染色。
免疫荧光细胞化学
原发性食管的角化细胞生长在有房间的玻璃幻灯片(BD生物科学、东京、日本),在4%多聚甲醛固定,然后用0.2% permeabilised Triton x - 100。细胞被贴上了anti-pan-cytokeratin (CK) (1:50 0;σ),anti-CK 4 (1:10;Progen Biotechnik GmbH是一家现代化、海德堡、德国),anti-CK 14 (1:10 0;美国加利佛尼亚Chemicon International Inc .,泰梅库拉),anti-Cdx2(1:50),和anti-MUC2 (1:10 0;圣克鲁斯生物技术公司,美国加州圣克鲁斯)抗体。绑定的主要抗体被发现FITC共轭antimouse, antirabbit, antigoat免疫球蛋白(Dako),或由罗丹明共轭antimouse免疫球蛋白(Dako)。
表达质粒和瞬时转染
互补编码完整鼠Cdx2被使用引物PCR扩增5′agc ttt cag行动20呕吐有条件现金援助cag颈- 3′,5′gtt gga ccc agc tgg gca aga aat三大′(NCBI数据库U00454)。放大DNA样本被克隆到pcDNA5 / FRT V5-His-TOPO向量表达载体和质粒克隆测序确认结构。主要培养大鼠食管的角化细胞转染和表达载体,利用FuGENE 6转染试剂(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。向量没有Cdx2 DNA序列作为消极的控制。
逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),
DNase我治疗后,rt - pcr进行如前所述。34PCR进行重复实验,证实了正确的放大放大DNA测序。标准化的数量和质量的总RNA,相同的样本分析MUC2和β-actin。感和反义引物5′-gtg gct gtg tgc cta gtc ct-3′, 5′gag ctg标签tgt ggg gyg ct-3′(NCBI数据库RNU68172) MUC2(319个基点),和5′cac ggc att gta acc aac tg-3′, 5′acc ctc ata手枪ggg cac ag-3′(NCBI数据库V01217)β-actin(288个基点)。RNA提取大鼠回肠标本被用作积极控制和角化细胞的RNA样品没有经过RT用作负控制。
统计分析
所有数据都表示为(SEM)。多个比较用方差分析Dunnet测试紧随其后。一个p值小于0.05的被认为是具有统计学意义。
结果
免疫组织化学的老鼠巴雷特食管
六个月后oesophagojejunal吻合形成,oesophagi老鼠扩张和明显增厚。老鼠都出现严重的食管炎,侵蚀和浅表溃疡主要分布在食管越低,由基底细胞增生和组织学特征扩展的乳头状突起,溃疡和hyperkeratinisation。柱状内衬上皮oesophagojejunostomy观察到30%以上的老鼠。混合柱状和鳞状上皮细胞和杯状细胞形成附近观察吻合网站。在一些老鼠,岛屿周围的柱状上皮鳞状上皮被发现在遥远食管粘膜吻合术和接近返流性食管炎的网站。免疫组织化学结果显示Cdx2与核染色阳性细胞柱状上皮oesophagojejunostomy之上。细胞具有强烈Cdx2核染色发现典型的柱状上皮之间的边界和混合的地区毗邻的鳞状上皮柱状和鳞状上皮细胞(图1)。
巴雷特食管的实验老鼠。(一)混合柱状和鳞状上皮细胞。杯状细胞被毗邻的吻合(haematoxylin-eosin污点)。(B)免疫组织化学Cdx2在混合柱状和鳞状上皮细胞。Cdx2阳性细胞主要是观察到柱状上皮。(C)免疫组织化学领域Cdx2的混合柱状(白色箭头)和鳞状上皮细胞(黑色箭头)。Cdx2 (D)免疫组织化学。Cdx2阳性细胞在边境地区的柱状上皮及邻近的鳞状上皮的柱状和鳞状上皮细胞。
胆汁酸浓度在老鼠的refluxate巴雷特食管
胆汁酸浓度大鼠食管refluxate样本测量。浓度的柠檬酸、TDCA TCDCA、DCA和CA是37.4(- 13.1)毫米,2.1(- 0.9)毫米,171.7(171.7)μM, 4.9(3.6)μM,分别和265.0(180.2)μM(意味着(SEM)的三只老鼠)。甘氨胆酸等胆汁酸、GCDCA CDCA, LCA, DHCA,没有检测到。
胆汁酸对Cdx2启动子活性的影响
探讨可能的胆汁酸对Cdx2基因表达的影响,Cdx2启动子(pCdx2/1014-Luc)活动在会阴与胆汁酸刺激评估之后,TT, HT-29细胞使用报告基因分析。胆汁酸,DHCA显示Cdx2子活动最强烈的刺激效应,增加了四倍的转录激活。CA也显著刺激Cdx2子活动,如图所示的三倍增加(图2),Cdx2启动子转录活性下降到< 50%的控制当细胞接受DCA和CDCA 50岁,100年和200年μM。因此,我们还研究了DCA和CDCA的影响在低浓度(1、10和20μM),这没有显示抑制对Cdx2启动子的影响。胆汁酸的影响在TT Cdx2子活动,HT-29,会阴细胞几乎是相同的。会阴的转染效率更高,可再生的。因此,会阴细胞用于以下实验。DHCA和CA明显激活Cdx2发起人以剂量依赖的方式而其他胆汁酸没有这样的刺激效应(无花果3、4)。
胆汁酸对Cdx2启动子的激活的影响进行评估使用会阴,TT, HT-29细胞。兴奋剂,我们使用100μM牛磺胆酸(柠檬酸),taurodeoxycholic酸(TDCA) taurochenodeoxycholic酸(TCDCA) glycocholic酸(GCA) glycochenodeoxycholic酸(GCDCA)、脱氧胆酸(DCA) dehydrocholic酸(DHCA),鹅去氧胆酸(CDCA),胆酸(CA),石胆酸(LCA),和glycocholic酸、钠盐(GCANa)。与各种类型的细胞被刺激胆汁酸或车辆仅12小时和细胞溶解产物被用于测量荧光素酶的活动。数据表示为具有多个荧光素酶活性增加胆汁酸刺激在车辆处理样品,样品。结果表达的意思(SEM)四个实验。* p < 0.05与控制。
影响dehydrocholic酸(DHCA) (A)和胆酸(CA) (B)使用会阴Cdx2评估细胞的转录激活。细胞被刺激与不同浓度的胆汁酸或车辆仅12小时和细胞溶解产物被用于测量荧光素酶的活动。数据表示为具有多个荧光素酶活性增加胆汁酸刺激在车辆处理样品,样品。结果表达的意思(SEM)四个实验。* p < 0.05与控制。
各种影响胆汁酸浓度(1 - 200μM)转录激活Cdx2的评估使用会阴细胞。细胞被刺激与不同浓度的胆汁酸(牛磺胆酸(柠檬酸),taurodeoxycholic酸(TDCA) taurochenodeoxycholic酸(TCDCA) glycocholic酸(GCA) glycochenodeoxycholic酸(GCDCA)、脱氧胆酸(DCA),鹅去氧胆酸(CDCA),石胆酸(LCA),和glycocholic酸钠盐(GCANa))或车辆仅12小时和细胞溶解产物被用于测量荧光素酶的活动。数据表示为具有多个荧光素酶活性增加胆汁酸刺激在车辆处理样品,样品。结果表达的意思(SEM)四个实验。
我们建造一系列的记者Cdx2启动子的质粒含有不同长度。转录活性分析了这些构造与100年μM DHCA在会阴细胞。质粒,pCdx2/405-Luc pCdx2/307-Luc与启动子序列从181−−299 + 125,+ 125,分别表现出一定程度的激活,DHCA类似激活显示完整Cdx2-Luc记者(pCdx2/1014-Luc)。然而,质粒,pCdx2/198-Luc启动子序列从72−+ 125,显示激活水平低于pCdx2-Luc完整的长度。序列的质粒pCdx2/74-Luc + 125 + 52,和没有Cdx2 PGL3-basic启动子,显示没有激活DHCA刺激的反应。这些结果显示,DHCA诱导激活Cdx2-promoter是由网站位于−181−72−72 + 52(图5)。
报告基因分析Cdx2启动子缺失在会阴细胞结构和变异结构。(一)细胞被刺激dehydrocholic酸(DHCA)(100μM)或车辆仅12小时和细胞溶解产物被用于测量荧光素酶的活动。(B)细胞被刺激与胆酸(CA)(100μM)或车辆仅12小时和细胞溶解产物被用于测量荧光素酶的活动。数据表示为具有多个荧光素酶活性增加胆汁酸刺激在车辆处理样品,样品。结果表示为平均(SEM)四个实验。* p < 0.05和pCdx2/640-Luc;†p < 0.05和pCdx2/198 /卢克、pM1和pM2。
以前的报告表明存在两个假定的NFκB Cdx2基因的结合位点上游序列(1:103−−82;2:22−−1)。29日因此,调查的角色NFκB网站DHCA诱导刺激Cdx2的表达,这些假定的NFκB结合位点突变的每个元素。第一或第二NFκB结合位点的突变部分切除DHCA的刺激效应,而突变在完全废除DHCA Cdx2的诱导激活启动子(图5)。这些结果表明,DHCA诱导Cdx2转录激活是通过这两个监管NFκB结合位点。接下来,我们研究了CA诱导Cdx2转录激活是否也通过这两个监管NFκB结合位点。突变第一或第二NFκB结合位点的部分删除了CA的刺激效果Cdx2的激活启动子突变在Cdx2的完全废除了CA诱导激活启动子(图5 b)。这些结果表明,CA诱导Cdx2转录监管活动也是通过两个NFκB Cdx2启动子序列的结合位点。
EMSA
确定的影响DHCA NFκB DNA结合活性,EMSA执行使用Caco-2和HT-29细胞。绑定活动核提取物NFκB网站分析使用一个寡核苷酸编码NFκB绑定。Caco-2和HT-29细胞培养介质中含有100μM DHCA 12小时,之后NFκB DNA结合活动显然是刺激,而核提取物的刺激绑定NFκB网站是专门抑制通过添加未标记的NFκB探测反应混合物(图6)。
(一)电泳迁移率改变分析(EMSA)分析使用Caco-2和HT-29细胞。细胞与100年孵化μM dehydrocholic酸(DHCA)或车辆单独和核提取受到EMSA。绑定活动核提取核因子κB (NFκB)结合位点分析使用寡核苷酸编码NFκB绑定。竞争分析进行100倍超额的未标记的寡核苷酸。数据显示是代表三个独立的实验。(B)的影响DHCA在结肠癌细胞Cdx2蛋白的生产。与不同浓度的孵化后DHCA(100,或200μM) 24小时,蛋白(30μg)提取并进行免疫印迹分析。墨迹是代表四个不同的实验。光密度分析Cdx2蛋白在β-actin蛋白质。结果表达的意思(SEM)四个实验。 *p<0.05 versus control.
直接影响DHCA Cdx2的表达在结肠癌细胞
确定DHCA增强Cdx2蛋白表达,我们调查的直接影响DHCA使用Caco-2 Cdx2的表达和HT-29细胞。我们发现DHCA增强Cdx2蛋白表达以剂量依赖的方式在两个细胞系(图6 b)。
建立大鼠主要角质细胞
确定DHCA和CA激活Cdx2的表达在食管的角化细胞,我们建立了一个主要的文化系统的大鼠食管的角化细胞(图7)。正常大鼠食管的角化细胞附着在塑料支持细胞培养开始后3 - 5天。从文化融合了7 - 10天,汇合的细胞可能是亚文化六通道和维护不断在文化至少两个月。此外,细胞被冻结和解冻几次在DMSO包含冷冻剂,没有损害他们的电镀或亚文化效率。
建立大鼠食管角质细胞的主要文化。(一)相衬显微镜视图主要培养食管角质细胞的融合。免疫荧光细胞化学使用:anti-pan-cytokeratin抗体(B);anti-cytokeratin 14抗体(C);anti-cytokeratin 4抗体(D);anti-β1-integrin抗体(E)。
表达CK物种变化过程中由食管角质细胞分化。35在基底和epibasal层,与CK 14细胞染色阳性,而只有epibasal细胞可以在免疫组织化学染色CK 4化验。在目前的实验中,CK 14强烈和统一表现在培养大鼠食管粘膜细胞而CK 4表达被发现只有少量的培养细胞(图7 c, D)。调查是否这些培养细胞干细胞数量,β1-integrin进行免疫荧光细胞化学。如图7所示,许多较小的大小的细胞阳性β1-integrin干细胞的特点。
确定DHCA激活Cdx2的表达在食管的角化细胞,主要培养食管的角化细胞和DHCA孵化。Cdx2基因表达被添加100μM DHCA增强,如图8所示。当检查通过免疫印迹分析,Cdx2蛋白的生产也以剂量依赖的方式增强了DHCA(图8)。此外,免疫荧光细胞化学结果阐明,DHCA增强免疫反应性的核染色Cdx2(图8 b)。当CA Cdx2的表达的影响研究在这些食管角质细胞,发现增加Cdx2的表达方式一样DHCA(图9)。
影响dehydrocholic酸(DHCA)在Cdx2的表达主要培养大鼠食管的角质细胞。(一)北部污点分析。与100年孵化后μM DHCA 12小时,提取总RNA(10μg)和北部遭受污点分析Cdx2和β-actin cDNA探针。墨迹是代表四个不同的实验。Cdx2 (B)免疫荧光细胞化学。与100年孵化后μM DHCA 24小时,主要培养细胞受到Cdx2免疫荧光细胞化学。(C)免疫印迹分析。孵化后DHCA(100或200μM) 24小时,蛋白质(30μg)提取和Cdx2和β-actin进行免疫印迹分析。墨迹是代表四个不同的实验。结果表达的意思(SEM) 4实验。 *p<0.05 versus control.
胆酸的影响(CA)在Cdx2的表达主要培养大鼠食管的角质细胞。(一)免疫荧光细胞化学Cdx2。与100μM CA孵化后24小时内,主要培养细胞受到Cdx2免疫荧光细胞化学。(B)免疫印迹分析。孵化后CA(100或200μM) 24小时,蛋白质(30μg)提取和Cdx2和β-actin进行免疫印迹分析。墨迹是代表四个不同的实验。结果表达的意思(SEM)四个实验。* p < 0.05与控制。
影响Cdx2在食管角质细胞过度
调查是否Cdx2在oesophagi肠上皮化生的主要监管机构,我们转染Cdx2的表达载体为主要培养食管的角化细胞,观察肠细胞中的特定MUC2的表达。主要培养食管的角化细胞是暂时性的转染Cdx2的表达结构和MUC2表达了转染后48小时。食管的角化细胞转染和Cdx2构造表示MUC2成绩单而转染的控制向量没有显示检测MUC2的表达(图10)。
诱导Cdx2的表达对MUC2表达的影响主要角质细胞。主要培养大鼠食管的角化细胞是暂时性的转染与每个Cdx2没有Cdx2的表达载体或控制向量序列。肠MUC2的特定基因的表达研究在培养的角质细胞转染后48小时。(一)污点分析Cdx2北部和β-actin。转染Cdx2的表达载体在角化细胞培养诱导Cdx2 mRNA的表达。(B)的免疫印迹分析Cdx2β-actin。转染Cdx2的表达载体诱导Cdx2蛋白表达在培养的角质细胞。(C)逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)分析MUC2和β-actin表达式。电泳结果代表四个不同的实验。米,分子标记大小。 NC, negative control (identical volumes of PCR reaction mixtures not subjected to RT). Transfection of the Cdx2 expression vector induced MUC2 mRNA expression in cultured keratinocytes. (D) Immunofluorescence cytochemistry for Cdx2 and MUC2. Cdx2 expression vector transfected cells expressed both Cdx2 and MUC2 proteins.
讨论
在我们的老鼠模型巴雷特的上皮细胞,在柱状和鳞状上皮细胞观察相邻站点oesophagojejunal吻合。这些区域似乎过渡区鳞状上皮被柱状上皮所取代,和这些区域观察到腺在同一地区。Cdx2与核染色阳性细胞主要是观察到柱状细胞在这些领域而他们经常发现在鳞状细胞。这些发现表明,胆汁酸刺激Cdx2的表达在食管鳞状上皮,紧随其后的是替代肠胃型柱状上皮。事实上,胆汁酸也有报告称,通过转录因子调节造血的细胞的细胞分化。36此外,胆汁酸可以增强细胞转换体外和体内胃肠道肿瘤的倡导者。37 -39他们已经发现移植原癌基因表达在食管腺癌细胞系的细胞增殖,提高巴雷特食管的机关文化。40巴雷特食管的食管腺癌的风险显著增加但有证据表明Cdx2扮演一个肿瘤抑制作用,至少在远端结肠。21日,27
巨大差异的生物活性已报告个人胆汁酸分数和胆汁酸结构的细微变化显著改变其生物效应。41因此,我们研究了胆汁酸的分数使用启动子分析刺激Cdx2的表达。胆汁酸的测试,DHCA显示Cdx2转录的最强的活动以剂量依赖的方式,而CA还强烈增强Cdx2的转录。删除Cdx2子透露,胆汁酸的诱导增强Cdx2的表达主要是由元素位于181−−−72 72 + 52。以前的报告,描述感应Cdx2转录的PTEN表明Cdx2基因上游序列包含两个假定的NFκB绑定网站职位103 83和22−−−−1。29日澄清这些NFκB的可能作用在胆汁酸结合位点诱导Cdx2的表达变化,我们检查了Cdx2转录活动使用从每个NFκB结合位点的突变体。如图5所示,Cdx2子活动部分抑制突变的感应到每个NFκB结合位点和完全抑制诱导结合位点的突变。支持这些结果,EMSA透露,DHCA刺激NFκB的DNA结合活性。DCA和已报告CDCA的有力催化剂NFκB在其他几个发起人,包括interleukin-8,咆哮,cyclooxygenase-2。42 -44报告和我们的结果之间的差异可能是由于特定的抑制效应DCA和CDCA Cdx2发起人,与启动子有多个NFκB以外的转录调节因子结合位点。我们还推测,DCA和CDCA的治疗,特别是在高剂量,可能激活其他转录监管机构(s) /抑制(s),这可能最终抑制Cdx2子活动尽管NFκB激活效应。还需要进一步的研究来阐明这种启动子具体的抑制效应。
Cdx2据报道是由PTEN表达,肿瘤坏死因子α,丁酸和结肠癌细胞,包括Caco-2和HT-29,28日,29日和我们的结果表明,DHCA刺激Cdx2的表达以剂量依赖的方式在两个细胞系。接下来,我们检查是否DHCA刺激Cdx2的表达主要培养食管的角化细胞,也显示结果类似于结肠癌细胞系。因为很难建立一个适当的食管角质细胞的文化模型,胆汁酸在食管角质细胞的影响尚未充分测试。我们首先建立了一个主要的文化模型大鼠食管的角化细胞,发现的主要人口培养细胞表达CK 14和只有一小部分细胞CK 4。这种模式的CK表达建议的主要培养角质细胞主要是基底和epibasal细胞。虽然明确食管的干细胞的标记没有被确认,β1-integrin被认为是可能的候选人。45当我们检查表达式β1-integrin免疫荧光细胞化学在培养的角质细胞,角质细胞被发现包括β1-integrin阳性细胞的人口众多。从这些观察,培养食管的角化细胞被认为是未分化不成熟的食管鳞状上皮细胞和干细胞可以遵循,体外增殖。从这些结果,我们试图确定DHCA能否刺激Cdx2的表达在这些不成熟的食管的角质细胞。北部和免疫印迹分析表明,与DHCA Cdx2的表达显著增强了治疗。此外,Cdx2 DHCA增强核染色,检测到免疫荧光细胞化学。CA也显著增加Cdx2推广活动,我们检查它是否刺激Cdx2的表达在这些人工食管的角质细胞。结果清楚地表明,CA,像DHCA,增强Cdx2蛋白表达,显示的免疫印迹分析和免疫荧光细胞化学。我们还研究了酸化的影响胆汁酸(pH值4)主要培养细胞。然而,主要培养细胞可能敏感低pH值和感应Cdx2的表达不能检测到免疫印迹分析(数据没有显示)。
已经有相当大的兴趣自由的影响非结合的胆汁酸结合胆汁酸的主要部分是裂解非结合的胆汁酸在小肠。46岁,47在目前的研究中,DHCA和CA,非结合的胆汁酸,有刺激影响Cdx2的表达主要培养细胞。巴雷特食管,患者中最常见的胆汁酸refluxant柠檬酸,GCA, CA,6但DHCA是否存在于小肠或食管refluxate在生理条件下仍不确定。CA时DHCA是主要反应产物氧化位置颈- 3,即和技术。48此外,据报道,细菌生物转化的CA包括地区特定的氧化颈- 3,即技术和羰基合成胆汁酸的形成。49然而,DHCA中没有检测到食管refluxate从实验动物使用GS / MS方法。CA的浓度食管refluxate样本中发现的类似于体外扩增Cdx2的表达的浓度。因此,refluxate CA的主要刺激Cdx2的表达可能是食管的角化细胞患者的GORD。此外,柱状上皮鳞状上皮转化可能导致未分化的角化细胞的增殖和分化异常由于过度Cdx2引起CA曝光。为了证实这一点,我们检查是否感应Cdx2的表达在不成熟的食管的角化细胞可能引发类似的分化转移肠胃型柱状上皮细胞。迫使Cdx2的表达在角化细胞可以诱导分化转移从无差别的食管的角化细胞球形细胞表达MUC2。
总之,Cdx2的表达在柱状上皮及邻近的巴雷特食管的鳞状上皮。我们还发现CA刺激Cdx2的表达在不成熟的食管角质细胞过度Cdx2的不成熟的食管的角化细胞诱导MUC2的表达。因此,CA刺激Cdx2的表达在不成熟的巴雷特食管角质细胞,然后进行转换的肠胃型柱状上皮。
确认
支持部分赠款援助从省教育科学研究,科学,体育,和日本的文化。
引用
脚注
利益冲突:没有宣布。
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