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结肠直肠癌gydF4y2Ba
单核细胞化学引诱物蛋白1和巨噬细胞环氧酶2结肠腺瘤中表达gydF4y2Ba
免费的gydF4y2Ba
  1. 年代田中gydF4y2Ba,gydF4y2Ba
  2. 一个TatsuguchigydF4y2Ba,gydF4y2Ba
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  13. C坂本gydF4y2Ba
  1. 医学院第三内科,日本,东京,日本gydF4y2Ba
  1. 通信:gydF4y2Ba
    C教授坂本gydF4y2Ba
    第三内科,日本医学院,1-1-5,Sendagi, Bunkyo-ku,东京,113 - 8603年,日本;gydF4y2Bachoitsu在{}nms.ac.jpgydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

背景和目的:gydF4y2Ba环氧合酶2 (cox - 2)表达在结直肠的牙龈巨噬细胞腺瘤被认为是第一个在一系列的步骤导致结直肠肿瘤发生。我们测试的假设趋化因子释放人类大肠癌腺瘤上皮细胞可能参与cox - 2的表达在固有层的巨噬细胞。gydF4y2Ba

方法:gydF4y2Ba零星的结直肠腺瘤的内镜样品是测试通过为趋化因子参与了酶联免疫吸附测定巨噬细胞趋化作用。本地化的腺瘤巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)和cox - 2免疫组织化学测定。MCP-1的影响,在塞来昔布的存在与否,对cox - 2表达,和前列腺素(PG) EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba和血管内皮生长因子(VEGF)版本,检查在人类巨噬细胞从外周血中分离出来。gydF4y2Ba

结果:gydF4y2BaMCP-1水平显著高于腺瘤与轻中度发育不良(129.7 (19.9)pg /毫克蛋白)和严重发育不良(227.9 (35.4)pg /毫克蛋白)比在正常结肠粘膜(55.8 (4.2)pg /毫克蛋白)。其它趋化因子水平,巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α和MIP-1β,监管和趋化因子激活正常T细胞表达和分泌(咆哮)腺瘤和正常粘膜之间没有显著变化。MCP-1水平腺瘤和正常结肠粘膜组织体外培养后显著增加三个小时。腺瘤上皮MCP-1免疫反应性受到限制,没有反应出现在相邻的正常上皮细胞。MCP-1刺激cox - 2表达和铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和VEGF在人类巨噬细胞释放。塞来昔布,选择性cox - 2抑制剂,抑制MCP-1-induced铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和VEGF在巨噬细胞释放。添加外源铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba逆转这对VEGF释放的抑制作用,表明MCP-1腺瘤上皮细胞可能参与cox - 2表达和随后的巨噬细胞激活。gydF4y2Ba

结论:gydF4y2Ba在结直肠MCP-1腺瘤上皮细胞可能参与了巨噬细胞迁移和cox - 2表达,导致结肠腺瘤的后续发展。gydF4y2Ba

  • cox - 2,环氧酶2gydF4y2Ba
  • MCP-1,巨噬细胞化学引诱物蛋白质gydF4y2Ba
  • PG,前列腺素gydF4y2Ba
  • 血管内皮生长因子VEGFgydF4y2Ba
  • 咆哮,调节激活正常T细胞表达和分泌的gydF4y2Ba
  • ELISA,酶联免疫吸附测定gydF4y2Ba
  • MIP,巨噬细胞炎性蛋白质gydF4y2Ba
  • 非甾体抗炎药,非甾体抗炎药gydF4y2Ba
  • FAP,家族性腺瘤息肉病gydF4y2Ba
  • 他走时,苏木精和伊红gydF4y2Ba
  • PBS,磷酸缓冲盐gydF4y2Ba
  • EDTA(乙二胺四乙酸gydF4y2Ba
  • PMSF, phenylmethylsulfonyl氟化gydF4y2Ba
  • FITC,异硫氰酸荧光素gydF4y2Ba
  • PBMC,外周血单核细胞gydF4y2Ba
  • FCS,胎牛血清gydF4y2Ba
  • 有限合伙人,脂多糖gydF4y2Ba
  • 家伙,3 - [(3 cholamidopropyl) -dimethylammonio] -l-propane-sulfonategydF4y2Ba
  • 环氧合酶gydF4y2Ba
  • 巨噬细胞化学引诱物蛋白质gydF4y2Ba
  • 腺瘤gydF4y2Ba
  • 巨噬细胞gydF4y2Ba

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2004.059824gydF4y2Ba

来自Altmetric.com的统计gydF4y2Ba

    请求的权限gydF4y2Ba

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    流行病学研究表明,受试者的阿司匹林或其他非甾体抗炎药(非甾体抗炎药)被抑制环氧合酶(COX)活性降低患结肠癌的风险。gydF4y2Ba1 -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba此外,最近的临床随机试验表明阿司匹林的治疗价值的预防大肠癌gydF4y2Ba5,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和它的复发。gydF4y2Ba7,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba研究也表明,非甾体抗炎药减少患者的息肉的大小和数目家族性腺瘤息肉病(FAP)。gydF4y2Ba9日,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba发现cox - 2表达不仅在人类大肠癌浸润间质细胞腺瘤和癌组织而且在肿瘤细胞本身。gydF4y2Ba11gydF4y2Ba然而,最近的研究表明,在结肠肿瘤发生的发病,cox - 2表达仅限于巨噬细胞局部下方的息肉上皮细胞APC716基因敲除小鼠,人类FAP的动物模型,在轻度发育不良的subepithelium人类腺瘤。gydF4y2Ba12 -gydF4y2Ba15gydF4y2Ba同时,gydF4y2Bacox - 2gydF4y2Ba基因敲除或选择性cox - 2抑制剂已被证明的政府减少的数量和大小在APC716小鼠肠息肉。gydF4y2Ba14日,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba这些数据表明,cox - 2表达的巨噬细胞腺瘤增长中扮演着关键角色及其发展为结肠癌。最近的研究也显示强烈vascularisation间隙区域填充cox - 2阳性巨噬细胞,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba建议一个可能的功能巨噬细胞cox - 2的表达与血管生成之间的关系。然而,巨噬细胞的机制渗透的固有层上皮边境,和表达cox - 2,尚未确定腺瘤的结肠。gydF4y2Ba

    巨噬细胞密度高的结肠肿瘤被认为是主要由循环单核细胞的招募。大多数cc趋化因子家族的成员,包括巨噬细胞化学引诱物蛋白(MCP) 1,巨噬细胞炎性蛋白质(MIP) 1α和MIP-1β,监管和趋化因子激活正常T细胞表达和分泌(咆哮),有巨噬细胞化学引诱物的属性,gydF4y2Ba17gydF4y2BaMCP-1是其中一个最强大的巨噬细胞招聘人员。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba此外,研究表明,MCP-1表达结肠上皮细胞在调节免疫反应中发挥作用在结肠粘膜发炎。gydF4y2Ba19gydF4y2Ba

    因此我们提出,cc趋化因子释放在结肠上皮细胞腺瘤可能参与了巨噬细胞的迁移,在这些移民巨噬细胞和cox - 2的表达,因此,进化的结肠肿瘤发生腺瘤。在这项研究中,我们调查了各种巨噬细胞趋化因子的表达在人类结直肠腺瘤和检查MCP-1对cox - 2表达的影响,前列腺素(PG) EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba释放,血管内皮生长因子(VEGF)生产人类巨噬细胞。gydF4y2Ba

    材料和方法gydF4y2Ba

    病人和组织标本gydF4y2Ba

    组织样本取自156例(51 105男性,女性;平均年龄69.84岁;年龄40 - 88)接受结肠镜检查由于排便习惯改变或腹痛,内科,日本医学院,东京,日本。我们收集一个结肠经内视镜息肉切除术腺瘤样本和一个相邻的正常结肠粘膜活检样本每个病人。腺瘤和正常粘膜的炎症性肠病或FAP患者被排除在本研究之外。腺瘤组织样本在10%福尔马林固定石蜡和嵌入。部分准备,苏木精和伊红染色()),并分析了免疫组织化学。标本诊断和发育不良等级分类根据世界卫生组织的分类由专家病理学家。标本不诊断为腺瘤被排除在外。最后,我们10腺瘤样本用于轻中度或重度异生腺瘤和10个正常结肠粘膜样本地区毗邻这些腺瘤类型/ MCP-1趋化因子分析,咆哮,MIP-1α,MIP-1β。 We also used 10 additional adenoma samples for short term tissue cultivation. Before examination, the protocol was fully explained to all subjects and written informed consent was obtained.

    趋化因子分析gydF4y2Ba

    腺瘤组织样本单一化与磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH值7.4包含2 l更易与乙二胺四乙酸(EDTA), 1更易/ l抑肽素(西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国),和1更易与l phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)(西格玛化工有限公司)。样本在000离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟在4°C和上层清液用于随后的趋化因子分析。简而言之,200年μl整除的上层清液添加了酶联免疫吸附测定(ELISA)板涂有MCP-1抗体(研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)和孵化在室温下了两个小时,然后一个额外的30分钟对MCP-1二级抗体。显色后,我们测量吸光度MCP-1 450海里。对于每个腺瘤息肉和正常粘膜,咆哮,MIP-1α,MIP-1β浓度也量化按指令在各自的ELISA试剂盒(MIP-1αMIP-1β,咆哮;研发系统)。总蛋白浓度也评估使用蛋白质分析系统(美国加州Bio-Rad实验室、大力神)。牛血清白蛋白(Seikagaku Kogyo、东京、日本)作为标准。趋化因子浓度表示为pg /毫克的蛋白质。每个年级的腺瘤发育不良,我们比较腺瘤趋化因子水平与正常粘膜从相同的病人。gydF4y2Ba

    腺瘤组织培养gydF4y2Ba

    验证腺瘤组织综合了趋化因子,10个腺瘤和10个正常结肠粘膜组织样本与PBS内窥镜息肉切除术后立即洗两次,然后培养rpmi - 1640年(Nikken,京都,日本)三个小时在37°C。残余组织样本是固定的,沾着他走时,免疫组织化学分析。经过三个小时的培养、组织样本单一化和上层清液用于趋化因子分析,如上所述。gydF4y2Ba

    免疫荧光分析人类零星的结肠的腺瘤gydF4y2Ba

    双重免疫荧光分析和共焦激光扫描显微镜是用来评估colocalisation cox - 2(1:5稀释;IBL、群马县、日本)和MCP-1(1:10稀释;PePro科技,落基山,新泽西,美国)。一夜之间,部分被孵化在4°C两个主要抗体的混合物。抗体对cox - 2被允许与二次抗体反应(山羊antirabbit免疫球蛋白;稀释1:10 0;向量的实验室,伯林盖姆,美国加州)标签与德克萨斯红。抗体对MCP-1获准与二次抗体反应(马antimouse免疫球蛋白;稀释1:10 0;向量)标签与异硫氰酸荧光素(FITC; Sigma Chemical Co.), followed by nuclear counterstaining with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (Sigma Chemical Co.) for 15 minutes to facilitate identification of morphological features.

    部分也孵化与反人类的cox - 2和anti-CD68 (Dako,京都,日本)抗体(PBS稀释1:25)和紧随其后的孵化与德克萨斯红共轭马antimouse免疫球蛋白G(免疫球蛋白;CD68;向量)和FITC共轭山羊antirabbit免疫球蛋白(cox - 2;在室温下向量)60分钟。免疫荧光分析了激光扫描共焦荧光显微镜下(徕卡TCS-4D DMIRBE,海德堡,德国),配备氩和argon-krypton激光源。gydF4y2Ba

    隔离人体血液的单核细胞gydF4y2Ba

    从志愿献血者外周血收集。外周血单核细胞(PBMC)是独立于人类的血液样本Ficoll-Paque (Phamacia生物技术,乌普萨拉,瑞典)离心。PBMCs (2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/毫升)被播种到六孔板,rpmi - 1640年孵化与非必需氨基酸,补充2 l更易与丙酮酸钠,2更易/ l谷酰胺,NaHCO 0.1%gydF4y2Ba3gydF4y2Ba、链霉素50µg /毫升(美国Gibco-BRL,马里兰州),50 U /毫升青霉素(Gibco-BRL),和2%胎牛血清(FCS;跟踪实验室、腭、伊利诺斯州,美国)一夜之间,和贴壁细胞可以分化成巨噬细胞。单核细胞占85%以上的这些细胞,如图所示CD68染色,和生存能力> 90%,表明通过台盼蓝染料排除测试。这些细胞被刺激10 ng / ml MCP-1 24小时在FCS的存在,然后收获和储存在免疫印迹分析−70°C。浮在表面的收获了铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和VEGF的测量。gydF4y2Ba

    PBMC准备采用免疫分析gydF4y2Ba

    人类巨噬细胞(2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba/毫升)镀上两个好Laboratory-Tek室幻灯片(Nalge Nunc Intl,内伯威尔市,伊利诺斯州,美国)。孵化24小时之后,有或没有10 ng / ml MCP-1,细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟,然后用甲醇permeabilised 20分钟在4°C。细胞培养与anti-CD68 (Novocastra实验室、纽卡斯尔、英国)和anti-COX-2抗体,和双重免疫荧光分析如上所述。gydF4y2Ba

    MCP-1 PBMC的刺激和测量PGE2和VEGFgydF4y2Ba

    PBMC被播种到每一个六孔板或到10厘米菜2×10的密度gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/µl 1%或10% FCS培养基。细胞被孵化24小时用20 ng / ml脂多糖(LPS)或10 ng / ml MCP-1(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,加利福尼亚,美国)在1%或10% FCS的存在。此后,文化上层清液被用来测量铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba根据指令和VEGF浓度在商用设备(PGE2:试验设计公司,安阿伯市密歇根,美国;美国加州VEGF: Biosource,贝),为我们展示了最近在人类胃成纤维细胞。gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba与COX抑制剂实验,要么200 nmol / l SC560(法玛西亚,纽瓦克,新泽西州,美国)或10μmol / l塞来昔布(法玛西亚),选择性COX-1和COX - 2抑制剂,分别添加一个小时之前MCP-1刺激铂族元素的存在与否gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。先前的研究已经表明,在100 - 300 nmol / l SC560减少铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba根据剂量释放,在不影响cox - 2相关的铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba生产。gydF4y2Ba21gydF4y2Ba因此我们使用SC560在本研究200 nmol / l。塞来昔布10μmol / l可以抑制cox - 2相关的铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba> 90%的生产在不影响细胞的生存能力。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba

    免疫印迹分析COX-1和cox - 2蛋白在人类巨噬细胞gydF4y2Ba

    考克斯在人类巨噬细胞中的蛋白质部分纯化,之前报道的美津浓和同事。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba巨噬细胞在50更易与单一化/ l盐酸三(pH值8.0),0.5 mol / l蔗糖含有1.0更易与l PMSF 1.0更易与l抑肽素和2.0更易与l EDTA。家伙(3 - [(3 cholamidopropyl) -dimethylammonio] -l-propane-sulfonate)化学(σ)添加到1% (wt /卷),和混合搅拌了两个小时在4°C。10分钟后离心的15 000gydF4y2BaggydF4y2Ba,装上一个浮在表面的阴离子交换柱平衡25更易与l盐酸三(pH值8.0)+ 0.4%的家伙。分数筛选了500 l更易与氯化钠集中初始体积的40%。样本由钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到Hybond-P硝化纤维素膜(Amersham生命科学,白金汉郡,英国)和探测与anti-COX-1或anti-COX-2抗体(稀释1:50,1:10 0)。结合抗体检测与辣根过氧化物酶共轭antirabbit免疫球蛋白(稀释1:20 00)使用增强化学发光检测系统(Amersham生物科学)。蛋白质浓度测定和分析试剂。gydF4y2Ba

    统计分析gydF4y2Ba

    数据意味着(SEM)。的配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试是用于比较的趋化因子化验正常结肠粘膜和腺瘤在同一病人。铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和VEGF水平释放人类巨噬细胞分析的非参数Mann-Whitney测试。软件程序Statview是用于数据分析。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

    结果gydF4y2Ba

    趋化因子水平在人类零星结肠腺瘤gydF4y2Ba

    我们测量水平的MCP-1,咆哮,MIP-1α和MIP-1β趋化因子可能参与了巨噬细胞的迁移到结肠的subepithelium腺瘤。病理检查后,每个趋化因子水平测量20腺瘤标本,10每个对轻中度腺瘤或严重发育不良。每个腺瘤样例与相应正常结肠粘膜样本,从相同的病人,和趋化因子水平相比。腺瘤的MCP-1水平显著高于正常结肠粘膜(55.8 (4.2)pg /毫克蛋白),结肠的样本中有更高水平的腺瘤严重发育不良(227.9 (35.4)pg /毫克蛋白)比那些轻中度发育不良(129.7 (19.9)pg /毫克蛋白)(图1)。然而,在趋化因子没有显著差异水平咆哮,MIP-1α或MIP-1β所有组测试罪犯(图1)。gydF4y2Ba

    图1gydF4y2Ba

    趋化因子浓度在人类结肠癌的零星的腺瘤。腺瘤标本病理检查后讲程度的发育不良。十个样品每个轻中度或严重发育不良被随机分配每个趋化因子的测量:(A)巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1);(B)调节激活正常T细胞表达和分泌(咆哮);(C)巨噬细胞炎性蛋白(MIP) 1α;和(D) MIP-1β。单杠表示平均值。每个趋化因子的数量与正常结肠粘膜取自相同的主题。* * * p < 0.05, p < 0.005gydF4y2Ba

    MCP-1合成在腺瘤组织体外培养gydF4y2Ba

    验证MCP-1水平升高是来源于腺瘤本身,而不是从末梢循环,我们培养的腺瘤组织短暂和MCP-1水平相比之前和之后的种植。gydF4y2Ba

    在这个实验中,除了一个组织样本被确认为轻度至中度发育不良,后续他走时残余组织样本的分析。因此9轻度至中度发育异常样本用于目前的分析。MCP-1水平腺瘤和正常结肠粘膜显著增加在三个小时的培养。这些增加的比例基础水平的每个组织类型,这表明MCP-1不是来源于末梢循环,但实际上由结肠腺瘤自己合成(图2)。gydF4y2Ba

    图2gydF4y2Ba

    巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)合成在正常结肠粘膜腺瘤组织和体外培养。MCP-1浓度之间相比,腺瘤组织和正常粘膜从同一病人之前和之后的3个小时的组织培养。(一)在种植之前正常粘膜;(B)正常粘膜经过三小时的培养;(C)前腺瘤组织培养;和(D)腺瘤组织经过三小时的培养。MCP-1水平腺瘤和正常结肠粘膜显著增加在三个小时的培养。每一列表示的意思是(SEM) 10组织样本。* p < 0.05。gydF4y2Ba

    免疫荧光分析MCP-1和cox - 2在人类零星结肠腺瘤gydF4y2Ba

    接下来,我们检查了immunohistological本地化MCP-1和cox - 2的结肠腺瘤和正常黏膜。cox - 2和MCP-1免疫反应性被认为在正常结肠粘膜(图3 d)。相比之下,MCP-1反应检测上皮细胞的细胞质在轻度至中度和重度异生腺瘤,而发现cox - 2的活性基质细胞在固有层的上缘,下方的结肠上皮腺瘤(图3 a - c)。图3显示了一个代表免疫荧光分析与轻度至中度不典型增生腺瘤。虽然本地化MCP-1和cox - 2表达之间没有显著差异轻中度和严重发育不良腺瘤,只有微弱的cox - 2表达在上皮细胞的后者(数据未显示)。gydF4y2Ba

    图3gydF4y2Ba

    免疫荧光染色对巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)和环氧合酶2 (cox - 2)表达在人类零星的腺瘤。五个腺瘤组织样本都有轻度至中度发育不良或严重发育不良是用于免疫荧光分析。每个面板显示了一个典型腺瘤组织有轻度至中度的异常增生。相同的部分是彩色MCP-1 (A)和cox - 2 (B),合并图像染色(C)所示。合并图像正常结肠黏膜染色MCP-1和cox - 2 (D)所示。gydF4y2Ba

    Immunohistological colocalisation CD68和cox - 2在人类零星结肠腺瘤gydF4y2Ba

    检查的可能性,在结肠腺瘤,巨噬细胞表达cox - 2在subepithelium,我们执行双重免疫组织化学分析cox - 2和CD68在巨噬细胞表达。单在腺瘤免疫荧光轻度至中度发育异常显示许多间隙CD68阳性细胞(图4)和小数量的间隙cox - 2阳性细胞(图4 b)。双重荧光分析显示cox - 2蛋白表达主要限于小组CD68阳性巨噬细胞(图4 c - d)。gydF4y2Ba

    图4gydF4y2Ba

    Colocalisation环氧酶2 (cox - 2)和CD68在人类零星的结直肠腺瘤免疫荧光双重标签。五腺瘤组织样本与轻度至中度发育不良或严重发育不良是用于免疫荧光分析。每个面板显示了一个典型腺瘤组织有轻度至中度的异常增生。(一)大量COX-2-positive间质细胞。(B) CD68阳性巨噬细胞。(C) Colocalisation cox - 2和CD68使用双波长过滤器。(D) 4′, 6-diamidino-2-phenylindole染色强调本地化cox - 2和CD68双重染色细胞。gydF4y2Ba

    COX-1和cox - 2表达MCP-1刺激人类的巨噬细胞gydF4y2Ba

    然后我们检查MCP-1 COX-1和cox - 2表达的影响在人类巨噬细胞准备从PBMC中描述的材料和方法。MCP-1 1和10 ng / ml刺激巨噬细胞cox - 2蛋白表达根据剂量,而不影响COX-1表达式(图5)。cox - 2表达水平刺激10 ng / ml MCP-1 24小时平行的cox - 2表达由20 ng / ml LPS刺激。cox - 2和COX-1抑制剂对cox - 2表达水平有任何影响10 ng / ml MCP-1刺激。gydF4y2Ba

    图5gydF4y2Ba

    免疫印迹分析显示环氧酶2 (cox - 2)的表达在人类巨噬细胞刺激巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)。上下面板指示COX-1和cox - 2表达,分别。巨噬细胞是孵化24小时:(A)无刺激;与1 ng / ml MCP-1 (B);与10 ng / ml MCP-1 (C);(D)与10 ng / ml MCP-1,后一小时10μmol / l塞来昔布预处理;与10 ng / ml MCP-1 (E),一个小时后200 nmol / l SC560预处理;(F)和20 ng / ml脂多糖作为一种积极的控制。此后,巨噬细胞被单一化和免疫印迹分析中描述的材料和方法。gydF4y2Ba

    免疫荧光分析anti-CD68和cox - 2在人类巨噬细胞抗体gydF4y2Ba

    虽然我们人类周围巨噬细胞是高纯度的准备,其他单核细胞污染的出现在PBMC无法避免。我们因此检查是否cox - 2蛋白诱导仅限于MCP-1刺激巨噬细胞,用免疫荧光染色和anti-COX-2 anti-CD68抗体。刺激巨噬细胞制备时10 ng / ml MCP-1 24小时,没有变化的号码和CD68阳性细胞的形状,尽管cox - 2阳性染色增加到包括∼培养细胞的90%。双免疫染色清晰显示所有CD68阳性细胞表达cox - 2蛋白(图6),这表明培养巨噬细胞cox - 2蛋白表达MCP-1刺激。gydF4y2Ba

    图6gydF4y2Ba

    免疫荧光染色的外周血单核细胞(PBMCs)培养的巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)。CD68染色的PBMCs 24小时后的文化没有(A)和(D) 10 ng / ml MCP-1刺激,以及环氧酶2 (cox - 2)染色没有(B)或(E) MCP-1刺激。合并的图像(A)和(B) (C)所示。合并的图像(D)和(E)所示(F)。4′, 6-diamidino-2-phenylindole染色是在(C)和(F)。gydF4y2Ba

    铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba从人类MCP-1——刺激巨噬细胞释放gydF4y2Ba

    接下来,我们测量了铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba从巨噬细胞释放隔绝PMBC回应MCP-1酶免疫分析法。巨噬细胞刺激了10 ng / ml MCP-1 FCS的1%或10%,铂族元素的地方gydF4y2Ba2gydF4y2Ba释放增加,FCS浓度即使没有MCP-1 (48.3 (10.4)gydF4y2BavgydF4y2Ba150.0 (10.0)pg / ml;p < 0.05)。然而,MCP-1 10 ng / ml进一步刺激了铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba释放甚至在10% FCS (150.0 (10.0)gydF4y2BavgydF4y2Ba193.3 (11.5)pg / ml;p < 0.05)。塞来昔布μmol 10点/ l显著抑制铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba释放到水平低于单独诱导1% FCS(图7)。这些结果表明,MCP-1或FCS刺激了铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba发布是依赖cox - 2。gydF4y2Ba

    图7gydF4y2Ba

    前列腺素EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba上层清液浓度的巨噬细胞分离外周血单核细胞(PBMCs)。PBMCs培养在1%胎牛血清(FCS)或10% FCS为24小时。铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba水平:(A)文化上层清液PBMCs无刺激;(B)与10 ng / ml巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)刺激;(C)与10 ng / ml MCP-1刺激后一小时10μmol / l塞来昔布预处理。结果显示为代表的意思(SEM)三个独立的实验。误差棒表示的标准误差计算一式三份样本代表性的实验。* p < 0.05。gydF4y2Ba

    VEGF在人类MCP-1-stimulated巨噬细胞释放gydF4y2Ba

    然后测量VEGF水平在这些培养媒体通过ELISA。MCP-1 10 ng / ml显著刺激VEGF释放人类培养的巨噬细胞(1119.3 (38.4)gydF4y2BavgydF4y2Ba1301.0 (22.7)pg / ml;p < 0.05)。塞来昔布显著抑制MCP-1-stimulated VEGF发布(1017.6 (76.7)pg / ml;p < 0.05),铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba扭转这种抑制效应根据剂量(1559.3 (56.1)pg / ml,铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在一个集中的100µmol / l;p < 0.05)(图8)。塞来昔布并不影响MCP-1-stimulated cox - 2表达(图5)和铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba逆转塞来昔布对VEGF释放的抑制作用,表明塞来昔布在当前研究的抑制作用不是由于对巨噬细胞的毒性作用。因此,我们的结果表明多米诺效应由MCP-1刺激培养的巨噬细胞cox - 2的表达情况,进而刺激铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2BaVEGF版本中,高潮。gydF4y2Ba

    图8gydF4y2Ba

    血管内皮生长因子(VEGF)水平在上层清液的巨噬细胞分离外周血单核细胞(PBMCs)。PBMCs孵化有或没有巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)刺激10%胎牛血清的存在为24小时。每一列显示VEGF水平文化PBMC上层清液没有刺激(A),与10 ng / ml MCP-1刺激(B),并与10 ng / ml MCP-1刺激,预处理后一小时10μmol / l塞来昔布(C)。此外,前列腺素(PG) EgydF4y2Ba2gydF4y2Ba浓度1μmol / l (D), 10μmol / l (E),和100年μmol / l (F)根据剂量逆转塞来昔布的抑制效果。VEGF水平刺激20 ng / ml脂多糖(LPS)作为一个积极的控制(G)。结果表达的意思(SEM)的代表三个独立的实验。误差棒表示的标准误差计算一式三份样本代表性的实验。* p < 0.05。gydF4y2Ba

    讨论gydF4y2Ba

    在目前的研究中,我们首次证明MCP-1刺激cox - 2的表达在人类巨噬细胞从外周血分离和体外培养。此外,MCP-1刺激VEGF通过cox - 2 /铂族元素释放gydF4y2Ba2gydF4y2Ba在这些孤立的巨噬细胞自分泌/旁分泌途径。此外,我们发现MCP-1腺瘤的表达水平高于正常结肠粘膜和有限的专门腺瘤上皮细胞。MCP-1表达水平与程度的增加在腺瘤发育不良:即使是上皮细胞表现出轻度异生表示MCP-1水平高于正常结肠上皮细胞在相同的病人。相比之下,立即发现cox - 2表达只在巨噬细胞在上皮细胞腺瘤的表达MCP-1,符合先前的研究。gydF4y2Ba12日,gydF4y2Ba13日,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba因此,这些结果有趣的可能性,提高内生MCP-1释放腺瘤上皮细胞cox - 2诱导和随后的铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和巨噬细胞浸润腺瘤VEGF释放。一些证据表明cox - 2表达的巨噬细胞浸润固有层可能起到至关重要的作用在结直肠腺瘤的生长和发展。首先,巨噬细胞迁移到固有层下肠道息肉的老鼠轴承gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba基因突变表明cox - 2表达,gydF4y2Bacox - 2gydF4y2Ba基因打靶在这些老鼠大大减少息肉大小和数量。gydF4y2Ba14gydF4y2Ba其次,肿瘤细胞移植到野生型老鼠比移植到更快速增长gydF4y2Bacox - 2gydF4y2Ba基因敲除小鼠,这表明间质细胞表达cox - 2在肿瘤细胞的边缘为癌症细胞生长至关重要。gydF4y2Ba25gydF4y2Ba第三,cox - 2的表达在巨噬细胞被发现后迁移到固有层结肠腺的人类,在人类FAP,塞来昔布,选择性cox - 2抑制剂,可以防止大肠癌腺瘤进展为腺癌。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba因此,理解每一步进化的腺瘤为结肠癌的癌,必须首先清楚地理解腺瘤上皮和间质细胞细胞相互作用。gydF4y2Ba

    然而,到目前为止,巨噬细胞的确切机制首先被刺激到迁移成腺瘤的固有层,诱导表达cox - 2,仍然未知。最近,一个可能的候选人作为一个巨噬细胞cox - 2诱导物是隔绝的媒体在结肠癌细胞系。研究表明,在肿瘤微环境中,结肠癌细胞产生的黏蛋白参与cox - 2的初始感应。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba然而,目前尚不清楚上皮细胞腺瘤的分泌黏蛋白等。因此这项研究并不一定解释为什么巨噬细胞迁移到结肠的固有层腺瘤表达cox - 2。然而,在目前的研究中,我们发现,在已知趋化因子单核细胞化学引诱物活动,包括MCP-1 MIP-1α,MIP-1β,咆哮,MCP-1仅显示腺瘤上皮细胞中的表达水平高于正常的上皮细胞,在同一病人。此外,当我们培养这些组织样本,我们发现,在这里,MCP-1合成更高浓度比在正常结肠粘膜腺瘤。MCP-1被称为最有效的化学引诱物参与巨噬细胞迁移。gydF4y2Ba18gydF4y2Ba从这些数据我们可以推测MCP-1,不仅在巨噬细胞迁移到固有层相邻上皮细胞腺瘤,但也cox - 2的感应。gydF4y2Ba

    尽管cox - 2促进肿瘤发生的确切机制仍然未知,越来越多的证据表明cox - 2参与促进血管生成在不同的肿瘤:大量的生长因子,包括血管生成生长因子如碱性纤维母细胞生长因子VEGF,gydF4y2Ba28 -gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba已被证明被释放从结肠癌细胞通过cox - 2相关的通路。此外,巨噬细胞浸润和微脉管密度之间的密切联系已被证明在许多肿瘤,如在黑色素瘤,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba神经胶质瘤,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba子宫颈癌,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba胃癌,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba食道癌,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba和乳腺癌,gydF4y2Ba37gydF4y2Ba表明cox - 2和巨噬细胞可能是重要的促进血管生成和肿瘤生长。此外,铂族元素已被证明诱导U937细胞VEGF生产人类巨噬细胞模型。gydF4y2Ba38gydF4y2Ba

    在目前的研究中,我们发现MCP-1刺激cox - 2表达和VEGF在人类巨噬细胞释放。MCP-1刺激VEGF从巨噬细胞释放被抑制在选择性cox - 2抑制剂的存在。逆转的抑制外源性铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba表明,在巨噬细胞,铂族元素gydF4y2Ba2gydF4y2Ba是MCP-1刺激VEGF的近似信号释放。众所周知,VEGF是血管生成的关键因素,导致结肠直肠肿瘤生长。gydF4y2Ba39岁,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba因此,我们的数据暗示MCP-1表示在这些腺瘤上皮细胞可能,至少在某种程度上,参与生产的VEGF通过巨噬细胞吸引到牙龈固有层,从而导致结肠肿瘤生长。然而,我们应该注意到,无论是MCP-1刺激还是塞来昔布抑制VEGF释放从不同水平FCS刺激引起的。因此VEGF释放体内巨噬细胞腺瘤也可能受其他未被识别的因素,除了MCP-1 / cox - 2通路。gydF4y2Ba

    我们在目前的研究中发现,腺瘤组织样本,当培养了三个小时,MCP-1蛋白质合成超过正常结肠粘膜样本,表明MCP-1 mRNA表达及其翻译成MCP-1蛋白也可能更高比在正常结肠粘膜腺瘤。然而,它尚未决定调节MCP-1腺瘤上皮细胞中表达。在小鼠中,gydF4y2BaAPCgydF4y2Ba基因突变诱发肠息肉病gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,cox - 2表达息肉subepithelium巨噬细胞可以看到。gydF4y2Ba24gydF4y2Ba同样,即使是轻度异生腺瘤MCP-1表达水平高于正常结肠粘膜在同一个病人,表明任何参与诱导基因突变腺瘤也可以与MCP-1表达在人类身上。然而,显然需要更多的工作来识别机制MCP-1表达在上皮细胞诱导,并阐明实际互动腺瘤上皮MCP-1,巨噬细胞迁移,cox - 2的表达在人类大肠癌腺瘤。gydF4y2Ba

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      清水TgydF4y2Ba中村,安倍R, H,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba巨噬细胞迁移抑制因子的高表达在人类黑色素瘤细胞及其在肿瘤细胞生长和血管生成中的作用。gydF4y2Ba物化学Biophys Res CommungydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba264年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba751年gydF4y2Ba8。gydF4y2Ba
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      Nishie一gydF4y2Ba,小野M, Shono T,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba巨噬细胞浸润和血红素oxygenase-1表达与人类神经胶质瘤血管生成。gydF4y2Ba中国癌症ResgydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:gydF4y2Ba1107年gydF4y2Ba-13年。gydF4y2Ba
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      戴维森BgydF4y2Ba戈德堡我Gotlieb WH,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba巨噬细胞浸润和血管生成在宫颈鳞状细胞癌临床病理的相关性。gydF4y2Ba学报。Gynecol ScandgydF4y2Ba1999年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba240年gydF4y2Ba4所示。gydF4y2Ba
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      太米gydF4y2Ba田中,Kitadai Y,年代,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba单核细胞化学引诱物蛋白1表达与巨噬细胞浸润和肿瘤血管分布在人类胃癌。gydF4y2BaInt J杂志gydF4y2Ba2003年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba22gydF4y2Ba:gydF4y2Ba773年gydF4y2Ba8。gydF4y2Ba
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      太米gydF4y2Ba田中,Kitadai Y,年代,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba单核细胞化学引诱物蛋白1表达与巨噬细胞浸润和肿瘤血管供应人类食管鳞状细胞癌。gydF4y2BaInt J癌症gydF4y2Ba2002年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba102年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba220年gydF4y2Ba4所示。gydF4y2Ba
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      韭菜RDgydF4y2Ba,刘易斯CE、怀特豪斯R,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba巨噬细胞浸润血管生成和协会乳腺浸润性癌的预后。gydF4y2Ba癌症ResgydF4y2Ba1996年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba56gydF4y2Ba:gydF4y2Ba4625年gydF4y2Ba9。gydF4y2Ba
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      Bamba HgydF4y2BaOta年代,加藤,gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba前列腺素E1对血管内皮生长因子的影响生产由人类巨噬细胞和结肠癌细胞。gydF4y2BaJ Exp癌症ResgydF4y2Ba2000年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba19gydF4y2Ba:gydF4y2Ba219年gydF4y2Ba-23年。gydF4y2Ba
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      大岛渚米gydF4y2Ba北川,大岛渚H, K,gydF4y2Baet al。gydF4y2BaApc杂合性和异常组织的损失在新生小鼠肠道息肉携带截断Apc基因。gydF4y2Ba《美国国家科学院刊gydF4y2Ba1995年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba92年gydF4y2Ba:gydF4y2Ba4482年gydF4y2Ba6。gydF4y2Ba
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    脚注gydF4y2Ba

    • 利益冲突:没有宣布。gydF4y2Ba