条文本
PDF
文摘
背景和目的:激活胰腺星状细胞已经被涉及的生产酒精诱导胰腺纤维化。PSC激活总是与细胞质维生素A(视黄醇)商店的损失。此外,视黄醇和乙醇被相似的代谢途径。我们组和其他人证明乙醇诱导PSC激活介导的有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径但是视黄醇的特定角色及其代谢物all-trans视黄酸(ATRA)和9-cis视黄酸(9-RA)在PSC静止/激活,或其影响乙醇诱导PSC激活是未知的。因此,本研究的目的是(i)研究维生素a的影响,ATRA和9-RA PSC激活;(2)确定视黄醇,ATRA和9-RA影响MAPK信号已经被;和(3)评估补充维生素a的影响已经被激活的乙醇。
方法:培养大鼠已经孵化了视黄醇,ATRA或9-RA不同时间段和评估:(i)扩散;(2)表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),胶原蛋白I,纤连蛋白、层粘连蛋白;和(iii)激活MAPKs(细胞外调节激酶1和2,p38激酶和c-Jun N终端激酶)。视黄醇的效应已经被处理乙醇也检查了孵化细胞与乙醇的存在与否的视黄醇五天,紧随其后的是评估α-SMA,胶原蛋白,纤连蛋白、层粘连蛋白的表达。
结果:视黄醇,ATRA和9-RA显著抑制:(i)细胞增殖,(2)表达α-SMA,胶原蛋白,纤连蛋白、层粘连蛋白,(3)激活MAPKs的所有三个类。此外,视黄醇预防乙醇诱导PSC激活,表示通过抑制乙醇诱导α-SMA增加,胶原蛋白,纤连蛋白、层粘连蛋白的表达。
结论:视黄醇及其代谢物ATRA和9-RA诱导静止在文化激活已经显著减少MAPKs在已经被激活的所有三个类。乙醇诱导PSC激活是由维生素a补充剂预防。
- 抗利尿激素、酒精脱氢酶
- ATRA all-trans视黄酸
- 发射极耦合逻辑,增强化学发光
- ERK1/2,细胞外调节激酶1和2
- 肝星状细胞、肝星状细胞
- IMDM, Iscove修改杜尔贝科的媒介
- 物,c-Jun N终端激酶
- MAPK,有丝分裂原激活蛋白激酶
- MKP-1,有丝分裂原激活磷酸酶1
- 已经,胰腺星状细胞
- RALDH,视黄醛脱氢酶
- RAR,视黄酸受体
- RXR类维生素a X受体
- RolDH,视黄醇脱氢酶
- 高校,视黄醇
- 9-RA, 9-cis视黄酸
- rt - pcr、反向transcriptase-polymerase连锁反应
- α-SMA,α平滑肌肌动蛋白
- SV、钠原钒酸盐
- 胰腺星状细胞
- 维他命A
- 有丝分裂原激活蛋白激酶
- 胰腺纤维化
来自Altmetric.com的统计
- 抗利尿激素、酒精脱氢酶
- ATRA all-trans视黄酸
- 发射极耦合逻辑,增强化学发光
- ERK1/2,细胞外调节激酶1和2
- 肝星状细胞、肝星状细胞
- IMDM, Iscove修改杜尔贝科的媒介
- 物,c-Jun N终端激酶
- MAPK,有丝分裂原激活蛋白激酶
- MKP-1,有丝分裂原激活磷酸酶1
- 已经,胰腺星状细胞
- RALDH,视黄醛脱氢酶
- RAR,视黄酸受体
- RXR类维生素a X受体
- RolDH,视黄醇脱氢酶
- 高校,视黄醇
- 9-RA, 9-cis视黄酸
- rt - pcr、反向transcriptase-polymerase连锁反应
- α-SMA,α平滑肌肌动蛋白
- SV、钠原钒酸盐
胰腺纤维化酒精慢性胰腺炎是一种常见的组织病理学特征。1在胰腺纤维发生涉及到一个特定的细胞类型,即胰腺星状细胞(PSC)。2,3最近的研究表明,已经成为激活(的增殖,增加表达的细胞骨架蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞外基质蛋白的合成)在培养塑料或暴露在乙醇及其氧化代谢产物乙醛或因素已知调节在胰腺损伤如促炎细胞因子、生长因子和氧化压力。2 -4
已经在他们的静态(非活性)状态存储视黄醇细胞质的脂质滴。激活已经总是与包含水滴从细胞质的视黄醇的损失。5,6研究在其他细胞系统建立了视黄醇是一个复合细胞生物学基本正常。7特别是,视黄醇的代谢物,all-trans视黄酸(ATRA)和9-cis视黄酸(9-RA),已被证明调解细胞功能,包括增殖、分化、和蛋白质合成。8视黄醇的新陈代谢最好在肝脏进行研究。它已被证实在肝星状细胞(hsc)视黄醇进入细胞细胞视黄醇结合蛋白。9然后要么酯化视黄基为存储或转换为视黄醛酯视黄醇脱氢酶(RolDH)和随后的视黄酸视黄醛脱氢酶(RALDH)。10两种形式的视黄酸,ATRA 9-RA,作为两个家庭的核受体的配体:视黄酸受体(RARα、β和γ)和类维生素a X受体(RXRα、β和γ)。8rar绑定到ATRA高亲和力而9-RA双官能团的配体,可以绑定并激活rar和rxr。11配体结合后,这些化合物与DNA顺式作用序列称为视黄酸反应元素在目标基因的启动子区域,从而调节基因表达。8感兴趣的是,与肝星状细胞的研究已经证明在接触激活因素,视黄酸和其受体的表达水平降低。12此外,维护静止表型的肝星状细胞已被证明是依赖于足够的视黄酸的水平及其受体在细胞。12最近的一项研究由佳斯特和他的同事们13在已经报告了增殖和胶原合成减少接触ATRA。然而,没有全面的研究在文献中研究视黄醇的影响和其代谢物(ATRA和9-RA)的PSC的功能。
大量的观测表明乙醇和视黄醇代谢之间的联系。乙醇及其氧化代谢产物乙醛是已经激活的最主要因素。3乙醛氧化乙醇是由酶乙醇脱氢酶(ADH)。10然后进一步氧化乙醛醋酸通过醛脱氢酶。10它已经建立了视黄醇新陈代谢酶RolDH和RALDH属于同一家族的一些酒精和乙醛脱氢酶的代谢,分别。10有趣的是,研究表明,大鼠长期暴露于乙醇显示显著降低视黄酸含量在肝脏。14这被认为是由于竞争性抑制乙醇的视黄醇RolDH和ADH代谢,这些酶可以利用乙醇和视黄醇基质。15日,16因此视黄酸损耗可能是一个重要机制,乙醇促进肝星状细胞活化。
在最近的研究中,我们和其他人发现了有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路作为主要的细胞信号通路调节乙醇诱导和生长因子诱导PSC激活。17 -19MAPKs(包括细胞外调节激酶1和2 (ERK1/2), N末端c-Jun激酶(物),和p38激酶)发挥重要作用在调节哺乳动物细胞内蛋白质的合成。20.21MAPKs调节活动的一系列下游转录因子和蛋白激酶磷酸化,从而控制基因表达和细胞的行为。21激活MAPKs是一个可逆过程;他们被一群灭活蛋白质磷酸酶称为MAP激酶磷酸酶(MKPs)。22这些都是双特异性磷酸酶已证明能发挥他们的作用,脱去磷酸酪氨酸和MAPKs苏氨酸残基,从而导致其失活。22MAPK磷酸酶1 (MKP-1), MKP家族的一员,最近被证明MAPKs灭活所有三个类。23日,24有趣的是,最近的研究表明,MKP-1表达式是在暴露于视黄酸增加从而导致MAPK活性下降。25然而,视黄醇是否影响MAPK信号通路或MKP-1表达式在星状细胞(无论是从胰腺或肝)尚不清楚。
因此,本研究的目的是:(i)检查视黄醇的影响及其代谢物ATRA和9-RA PSC激活,(2)确定视黄醇影响MAPK信号已经被MKP-1表达式,和(3)评估视黄醇乙醇的影响已经被处理。
方法
细胞培养试剂、蛋白酶类型十四,all-trans视黄醇,ATRA和9-RA从σ化学公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。引物对RolDH II, RARαRXRα,RXRβ从σGenosys获得澳大利亚企业有限公司的抗体来源如下:α-SMA,纤连蛋白,和laminin-Sigma;phospho-ERK1/2和总ERK1/2,总p38激酶和总JNK-Cell信号技术(美国马萨诸塞州贝弗利);phospho-p38激酶和phospho-JNK-Promega(澳大利亚悉尼);MKP-1、RARαRXRα,RXRβ-Santa克鲁斯生物技术(美国加州Santa Cruz);胶原蛋白类型I-Rockland免疫化学(美国宾夕法尼亚州Gilbertsville);和二级山羊antirabbit antibody-Dako(澳大利亚悉尼)。
已经被隔离和文化
老鼠已经被密度梯度离心法分离,详细。5(这种技术已经被纯粹的准备,结果就是明证积极为星状细胞选择性标记和负染法染色可能的污染物如内皮细胞和巨噬细胞。-200万年的产量已经是1.5每鼠胰腺细胞。)在Iscove修改杜尔贝科的培养基培养细胞(IMDM)补充10%胎牛血清在37°C在空气湿润95% / 5%股份有限公司2的气氛。所有实验进行文化激活细胞(通道1 - 3)除了实验评估视黄醇在新鲜分离的效果(静止)细胞。
视黄醇脱氢酶的表达和使用rt - pcr RAR和RXR受体信使rna
信使rna的表达RolDH II和视黄酸受体RARαRXRα,RXRβ使用反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)检测。引物序列如下:
老鼠RolDH二世
正向引物:5′ACC TGG猫CTT ATC TGA AA 3′
反向引物:5′AGT CGA GTC AGC CTT GAG助教3′26
老鼠RARα
正向引物:5′CCC AGC CAC猫TGA广汽3′
反向引物:5′TAC ACC ATG TTC TTC TGG ATG C 3′27
老鼠RXRα
正向引物:5′ATG亚美大陆煤层气有限公司CGG棉酚AGC TGT G 3′
反向引物:5′猫GTT TGC CTC CAC GTA TG 3′27
老鼠RXRβ
正向引物:5′柠檬酸法CCA CAG TGT公司治理文化TC 3′
反向引物:5′TAA ACC CCA标签TGC TTG CC 3′27
治疗试验因素
治疗已经被视黄醇和视黄酸
文化已经被激活(通道1 - 3)暴露在视黄醇(10μM), ATRA(10μM),或9-RA(10μM)不同时间的。每48小时中被改变。所有操作都在暗光。细胞培养与等量的培养基vehicle-DMSO 0.1% (ATRA和9-RA实验)或0.025% DMSO + 8毫米乙醇(视黄醇实验)服务控制。细胞生存能力被台盼蓝排斥实验评估。
治疗已经被乙醇和视黄醇
确定视黄醇已经受到酒精的影响,细胞孵育10μM视黄醇50 mM乙醇的存在与否的五天。媒介是改变每24小时。潜伏期结束时,细胞溶解产物收集和表达α-SMA,胶原蛋白,纤连蛋白、层粘连蛋白被西方墨点法评估。细胞生存能力评估如前所述。
PSC的评估函数
细胞增殖
PSC扩散是通过测量评估公司的3H]胸苷细胞DNA,如前所述。28此外,使用一个血球计进行细胞计数。结果被表示为一个百分比的控制。
α-Smooth肌肉肌动蛋白和细胞外基质蛋白表达
α-SMA水平,胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白在已经被西方墨点法测定细胞溶解产物,详细之前,使用单克隆鼠标anti-α-SMA (1:200)3或者我多克隆兔anticollagen (1:1000), antifibronectin(1:1000)和antilaminin(1:1000)抗体。29日,30.一只山羊antimouse抗体(1:20 00)或一只山羊antirabbit抗体(1:20 00)作为二级抗体。表达α-SMA,胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白被增强化学发光检测(ECL)技术使用Amersham的增强的ECL工具包,并量化使用微(BioRad GelDoc图像一个软件)。
检测MAPK激活
ERK1/2 p38激酶,激活文化激活物已经被暴露在视黄醇(10μM), ATRA(10μM),或9-RA(10μM) 4, 24日,48小时内评估细胞溶解产物蛋白免疫印迹,如前所述。17日,28确认总MAPK治疗水平持平,整除上述细胞溶解产物受到使用兔多克隆抗体免疫印迹分析ERK1/2, p38激酶,或物(1:1000),既认识到酶的磷酸化和non-phosphorylated形式;这些墨迹被测密度术,然后分析。
评估已经被的RAR和RXR蛋白表达
RAR和RXR表达已经被接受10µM ATRA或10µM 9-RA 4, 24日,48小时内被西方墨点法评估使用RARα兔多克隆抗体,RXRα或RXRβ(1:200)。
MKP-1表达的检测
与视黄醇MKP-1表达已经被孵化,ATRA或9-RA 3, 6, 24小时被西方墨点法评估使用兔子anti-MKP-1多克隆抗体(1:1000)。确定的角色MKP-1 MAPKs ATRA的作用在调节,我们检查是否观察到抑制的MAPKs ATRA可以预防的蛋白质磷酸酶抑制剂钠原钒酸盐(SV)、蛋白酪氨酸磷酸酶的有效抑制剂,包括MKP-1。31日,32这对PSC抑制剂的影响函数(细胞增殖和细胞外基质蛋白表达)也被评估。已经是10µM ATRA处理1的存在与否µM SV 48小时。潜伏期结束时,使用血球计进行细胞计数和细胞溶解产物收集评估MAPK的激活和细胞外基质蛋白表达蛋白免疫印迹,如上所述。
治疗新鲜与视黄醇已经被隔离
视黄醇是否可以防止/妨碍新孤立的过渡(静止)已经被激活的表型,新鲜孤立的细胞被孵化IMDM补充10%胎牛血清的存在与否10µM视黄醇了五天。媒介是改变每24小时。在潜伏期细胞溶解产物收集并评估了α-SMA、纤粘连蛋白的表达情况如上所述。
统计数据
结果表示为意味着(SEM);n代表个人PSC的数量准备。数据分析使用重复测量方差分析。33费雪的保护有显著差异被用于比较的个人团体提供的方差齐性检验是很有意义的。33岁的34分析使用Statview II统计软件包。
结果
视黄醇脱氢酶的表达已经被二世和视黄酸受体
使用rt - pcr、RolDH II RARα,RXRα,RXRβ表达式是在已经被观察到(图1 a、1 b, n = 3单独的细胞制剂)。PCR产品398个基点,195个基点,165个基点和175个基点,分别,与之前的报道相一致。26日,27
(A, B)的表达视黄醇脱氢酶II (RolDH II),视黄酸受体(RAR)和类维生素A X受体(RXR)在胰腺星状细胞(已经)。(A)从三个独立的细胞提取的总RNA表达RolDH II的准备和分析了反向transcriptase-polymerase连锁反应(rt - pcr)。RNA梯运行巷1 (Std)的大小来确定观察PCR产品。巷2包含了鼠肝cDNA积极控制。巷3包含一个PCR产品从老鼠已经被RolDH II。控制器,控制。(B) RARα、RXRαRXRβ表达式分析了来自三个独立的细胞总RNA通过rt - pcr准备。巷1包含一个RNA梯(Std)的大小来确定观察PCR产品。通道2、3和4中为RARαPCR产品,RXRα,RXRβ老鼠已经被。
视黄醇及其代谢物ATRA和9-RA诱导PSC静止
细胞增殖
视黄醇,ATRA和9-RA减少文化的扩散激活已经被(n = 4单独的细胞制剂),作为评估胸苷并入细胞DNA以及通过直接细胞计数。有显著减少后72小时的孵化与视黄醇,这种效应持续超过96小时(图2)。扩散也显著降低ATRA和9-RA(图2)。值得注意的是,这种减少是观察到比这更早的时间点(48小时)由视黄醇,这种效应持续超过96小时。我们证实,观察到的减少PSC扩散并不是由于细胞毒性的视黄醇,ATRA或9-RA评价相衬显微镜和台盼蓝排斥研究(结果未显示)。
视黄醇的影响及其对胰腺星状细胞的代谢物(PSC)扩散。(一)3H]胸腺嘧啶核苷掺入研究和(B)细胞计数数据证明已经被孵化的视黄醇(高校)PSC扩散显著降低与控制(续)后72小时相比,这种效应持续超过96小时。All-trans视黄酸(ATRA)和9-cis视黄酸(9-RA)也显著减少PSC扩散后48小时内与控制相比,这种效应持续超过96小时(n = 3分离细胞的准备;* * * * * p < 0.01, p < 0.001)。
α-SMA表达式
静止后已经被孵化的视黄醇(n = 3单独的细胞制剂)也证明了显著降低α-SMA表达72小时后,一个持续的效应超过96小时(图3)。与ATRA和9-RA也获得了类似的结果(图3)。ATRA也与减少α-SMA 48小时的表达式在更早的时间点。
视黄醇的影响及其代谢产物α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达在胰腺星状细胞(已经)。(一)代表西方墨迹显示α-SMA表达已经被孵化与培养基(续),视黄醇(高校),all-trans视黄酸(ATRA),或9-cis视黄酸(9-RA) 48岁,72年,96个小时。(B)微密度分析所有西方印迹显示明显降低在α-SMA表达在72和96小时已经被接受的方式和在48,72,和96小时已经ATRA处理与控制(n = 3分离细胞的准备;* * * p < 0.02, p < 0.03, * * * p < 0.01)。
细胞外基质蛋白表达
细胞外基质蛋白表达显著降低在已经被暴露在视黄醇或其代谢物(n = 3分离细胞的准备;图4 a - c)。经过48小时的潜伏期,视黄醇显著减少胶原蛋白I,纤连蛋白、层粘连蛋白的表达,这种效应持续超过72小时。ATRA和9-RA也获得了类似的结果。
视黄醇(a - c)的效果及其代谢产物在细胞外基质蛋白表达在文化激活胰腺星状细胞(已经)。代表西方印迹和微分析显示(a)胶原蛋白的表达明显下降,纤连蛋白(B)和(C)层粘连蛋白与视黄醇(高校),治疗后all-trans视黄酸(ATRA),或9-cis视黄酸(9-RA) 48和72小时与控制(续)。(n = 3分离细胞的准备;胶原蛋白我* * p < 0.005;纤连蛋白组合p < 0.001;‡p < 0.004,‡‡p < 0.005,‡‡‡p < 0.003,‡‡‡‡层粘连蛋白p < 0.001)。
视黄醇及其代谢物ATRA和9-RA影响MAPK在已经被激活
ERK1/2激活
孵化的已经被视黄醇(n = 4单独的细胞制剂)引起显著减少ERK1/2激活4小时;这种减少是持续超过48小时(图5)。同样,ERK1/2激活在ATRA和减少9-RA(图5)。西方墨点法的控制和治疗细胞溶解产物总ERK表明总ERK表达被视黄醇不变,ATRA和9-RA治疗。控制(微数据表示为百分数(意味着(SEM)): 4 h视黄醇100.5 (5.8),ATRA 99.6 (4.6);9-RA 93.7 (3.6);在24 h视黄醇96.7 (9.2),ATRA 92.0 (8.9);9-RA 102.7 (5.1);在48 h视黄醇107.75 (10.6),ATRA 111.5 (6.5);9-RA 105.0 (7.2))。因此,这些化合物对ERK1/2磷酸化似乎有一个特定的影响。
视黄醇的影响及其代谢物激活细胞外调节激酶1和2 (ERK1/2)文化激活胰腺星状细胞(已经)。(一)代表西方墨迹显示ERK1/2激活(p-ERK1/2)和总ERK1/2表达已经被孵化与视黄醇(高校),all-trans视黄酸(ATRA),或9-cis视黄酸(9-RA) 4、24、48小时。控制器,控制。(B)微密度分析所有西方墨迹显示显著降低ERK1/2激活已经接受Ro), ATRA或9-RA 4、24、48小时与控件(n = 4分离细胞的准备;* * * p < 0.04, p < 0.02, * * * p < 0.001)。高校、ATRA或9-RA治疗总已经ERK1/2水平上没有显著的影响。
p38激酶激活
视黄醇显著降低p38激酶激活后48小时的潜伏期(n = 4分离细胞的准备;图6)。ATRA和9-RA也显著降低p38激酶激活。然而,这种减少早些时候观察到时间点4和24小时,持续超过48小时(图6)。总p38激酶表达被治疗不变。控制(微数据表示为百分数(意味着(SEM)): 4 h视黄醇102.8 (3.9),ATRA 94.2 (3.96);9-RA 90.57 (4.8);在24 h视黄醇93.07 (2.8),ATRA 98.6 (0.48);9-RA 99.2 (2.8);在48 h视黄醇90.55 (4.86),ATRA 95.4 (3.0);9-RA 102.6 (5.8))。
视黄醇的影响及其代谢物在p38激酶激活文化激活胰腺星状细胞(已经)。(一)代表西方墨迹显示p38激酶激活与视黄醇(高校)已经被孵化,all-trans视黄酸(ATRA),或9-cis视黄酸(9-RA) 4、24、48小时。控制器,控制。(B)微密度分析所有西方印迹显示明显降低在p38激酶激活在48小时后已经被接受的方式与控制。ATRA治疗或9-RA也导致显著降低p38激酶激活后4小时,持续48小时后与控件(n = 4分离细胞的准备;* * * p < 0.02, p < 0.01)。高校、ATRA或9-RA治疗没有显著影响总已经p38激酶的水平。
物激活
相比之下影响ERK和p38激酶激活,孵化与视黄醇或9-RA已经没有影响物2(意味着)激活(n = 4分离细胞的准备;图7)。然而,ATRA显著减少物2(意味着)激活后4小时,这种减少是持续超过48小时(图7)。总物表达不受视黄醇,ATRA或9-RA治疗。控制(微数据表示为百分数(意味着(SEM)): 4 h视黄醇95.4 (10.0),ATRA 89.3 (8.7);9-RA 103.7 (6.9);在24 h视黄醇123.8 (11.5),ATRA 89.7 (11.8);9-RA 100.6 (9.9);在48 h视黄醇117.3 (13.4),ATRA 96.5 (2.8);9-RA 98.1 (3.3))。
视黄醇的影响及其代谢物c-Jun N终端激酶(物)激活文化激活胰腺星状细胞(已经)。(一)代表西方墨迹显示物激活与视黄醇(高校)已经被孵化,all-trans视黄酸(ATRA),或9-cis视黄酸(9-RA) 4、24、48小时。控制器,控制。(B)微密度分析所有西方印迹显示明显降低在物2(意味着)激活后4、24、48小时ATRA治疗与控制(n = 3分离细胞的准备;* * * p < 0.01, p < 0.005)。高校和9-RA没有影响物2(意味着)激活。总物2高校水平持平,ATRA或9-RA治疗。
视黄醇的影响,ATRA和9-RA MKP-1表达式
ATRA显著增加MKP-1表达已经被(n = 3单独的细胞制剂)在6小时,这种增长是持续24小时以上(图8)。相比之下,视黄醇MKP-1表达式和9-RA没有影响(结果未显示)。
all-trans效果视黄酸(ATRA)对有丝分裂原激活磷酸酶1 (MKP-1)表达文化激活胰腺星状细胞(已经)。(一)代表免疫印迹显示MKP-1表达已经被孵化与培养基(续)或ATRA 3, 6, 24小时。(B)微密度分析西方墨迹显示一种显著增加MKP-1表达式与ATRA治疗6小时后;这种效应持续超过24小时与控件(n = 3分离细胞的准备;* * p < 0.005)。视黄醇和9-cis视黄酸没有影响MKP-1表达式(数据未显示)。
蛋白质磷酸酶抑制剂原钒酸钠对MAPK表达、细胞增殖和细胞外基质蛋白表达在ATRA已经被处理
确认是否MKP-1在调解过程中发挥作用的影响ATRA对MAPK在已经被激活,细胞治疗蛋白质磷酸酶抑制剂SV (n = 3单独的细胞制剂)。如图9所示,ATRA诱导激活ERK1/2减少,p38激酶,和物2完全被阻止在SV的存在,表明MKP-1可能调解ATRA诱导抑制MAPK激活。SV治疗也已经被阻止了ATRA诱导减少:(i) PSC扩散(数据表示为百分数控制(意味着(SEM)):控制100年,ATRA ATRA 44.74 (8.72) (p < 0.01v控制),SV 85.35 (16.5), ATRA + SV ATRA 98.03 (26.8) (p < 0.01v控制)和(2)胶原蛋白I,纤连蛋白和层粘连蛋白表达(图10),进一步支持这一概念,ATRA对PSC功能的影响可能是通过MAPK通路介导。台盼蓝排斥研究证实细胞生存能力的SV(结果未显示)。
影响原钒酸钠(SV)在有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活all-trans维甲酸(ATRA)治疗细胞。代表西方印迹和微分析显示明显降低在激活MAPK的所有三个类胰腺星状细胞已经被ATRA处理24小时(ERK1/2,细胞外调节激酶1和2;p38激酶;物2,c-Jun N末端激酶2)。这种减少是预防的SV (* * * * p < 0.02, p < 0.001, ATRAv控制(续);†p < 0.02, p < 0.003, ATRA组合vATRA + SV;n = 3单独的细胞制剂)。治疗总MAPK水平持平。
影响原钒酸钠(SV)在all-trans维甲酸(ATRA)诱导的抑制细胞外基质蛋白表达在胰腺星状细胞(已经)。代表西方印迹和微分析显示显著减少胶原蛋白I,纤连蛋白、层粘连蛋白表达已经被ATRA处理48小时和预防这种减少的SV (* * * p < 0.02, p < 0.03 ATRAv控制(续);†p < 0.04, p < 0.02, ATRA组合vATRA + SV;n = 3单独的细胞制剂)。
ATRA和9-RA RAR和RXR蛋白表达
经过4个小时的潜伏期,ATRA和9-RA显著增加RARα蛋白表达在已经被(n = 3单独的细胞制剂),这种效应持续24和48小时(图11)。9-RA也增加了表达RXRα和RXRβ4、24、48小时孵化(图11 b)。
(A, B)的影响all-trans视黄酸(ATRA)和9-cis视黄酸(9-RA)视黄酸受体(RAR)和类维生素A X受体(RXR)受体表达文化激活胰腺星状细胞(已经)。(一)代表西方印迹和微分析显示显著增加RARα蛋白表达与ATRA 4已经被治疗,24和48小时(* * * p < 0.04, p < 0.03, * * * p < 0.02;n = 3单独的细胞制剂)。控制器,控制。(B)代表西方印迹和微分析显示显著增加RXRαRXRβ蛋白质表达已经被处理9-RA 4、24、48小时(* * * p < 0.03, p < 0.02, * * * p < 0.003, p < 0.004, * * * * * * * * * p < 0.005;n = 3单独的细胞制剂)。注意RXRα和RXRβ都由蛋白质条带数目增加强度,表明多个激活亚型的存在。
视黄醇对乙醇诱导PSC激活的影响
α-SMA表达式
为了确定维生素a补充剂可以防止乙醇诱导PSC激活,α-SMA表达式进行评估(n = 3分离细胞的准备;图12)。正如所料,乙醇单独显著增加α-SMA表达式确认我们的以前公布的结果。3,17视黄醇独自显著降低α-SMA表达证实我们的结果在图3中描述。重要的是,视黄醇也显著降低α-SMA表达已经被处理乙醇。特别感兴趣的是发现在乙醇、视黄醇无法充分发挥其抑制作用与视黄醇相比单独(比较的方式和E50 +高校,图12)。
视黄醇对乙醇诱导α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达在胰腺星状细胞(已经)。(A)代表免疫印迹显示α-SMA表达已经被孵化与单独培养基(续)或50 mM乙醇(E50)存在与否的视黄醇(高校)五天。(B)微密度分析西方墨迹显示一种显著增加α-SMA表达已经被当乙醇处理(n = 3分离细胞的准备;* * p < 0.01)与控制。并显著降低基底α-SMA表达式(n = 3分离细胞的准备;†p < 0.02的方式v续)和防止乙醇诱导增加α-SMA表达已经被(n = 3分离细胞的准备;p < 0.01 E50组合vE50 +高校)。
细胞外基质蛋白表达
如图13中所示,视黄醇显著抑制所有三种细胞外基质蛋白质的表达已经被(n = 3单独的细胞制剂),也避免了乙醇诱导增加胶原蛋白,在细胞纤连蛋白、层粘连蛋白的表达。有趣的是,与α-SMA表达式,视黄醇无法充分发挥其抑制作用在胶原蛋白和层粘连蛋白表达的乙醇,而视黄醇。
![Effect of retinol and its metabolites on pancreatic stellate cell (PSC) proliferation. (A) [3H] thymidine incorporation studies and (B) cell count data demonstrating that incubation of PSCs with retinol (Rol) decreased PSC proliferation significantly when compared with controls (Cont) after 72 hours and that this effect was sustained over 96 hours. All-trans retinoic acid (ATRA) and 9-cis retinoic acid (9-RA) also significantly decreased PSC proliferation after 48 hours when compared with controls and this effect was sustained over 96 hours (n = 3 separate cell preparations; **p<0.01, ***p<0.001).](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/55/1/79/F2.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
视黄醇对乙醇诱导细胞外基质的影响胰腺星状细胞中蛋白质合成(已经)。免疫印迹显示胶原蛋白(A)代表我,纤连蛋白、层粘连蛋白表达已经被孵化与单独培养基(续)或50 mM乙醇(E50)存在与否的视黄醇(高校)五天。(B)微密度分析西方墨迹显示一种显著增加胶原蛋白I,纤连蛋白、层粘连蛋白表达已经被乙醇处理与控制(n = 3分离细胞的准备;* * p < 0.005 E50v续)。并显著降低基底胶原蛋白我、纤连蛋白和层粘连蛋白水平(n = 3分离细胞的准备;†p < 0.05的方式v续)和防止乙醇诱导细胞外基质蛋白表达增加(n = 3分离细胞的准备;‡E50 p < 0.05vE50 +高校)。
视黄醇对新鲜的影响已经被孤立
孵化的新鲜孤立与视黄醇已经五天显著降低α-SMA和纤粘连蛋白的表达在细胞与控制(图14 a, B)。
视黄醇对新鲜分离胰腺星状细胞(PSC)激活。代表西方印迹和微分析显示的表达明显下降(a)α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和(B)纤连蛋白在新鲜分离已经接受视黄醇(高校)五天与控制(续)(n = 4分离细胞的准备;* * * p < 0.001)。
讨论
这项研究提供了新的数据表明维生素A(视黄醇)诱导静止在新鲜分离和文化已经被激活。我们还表明,维生素A的代谢产物(ATRA和9-RA)抑制活化的文化已经被激活。值得注意的是,我们发现上述效应显著降低激活MAPKs的所有三个类,这表明维生素a诱导静止是通过MAPK通路介导的。本研究的另一个新发现的与酒精诱导纤维化)是预防乙醇诱导PSC视黄醇激活。我们所知,这方面没有以前研究胰腺或肝星状细胞。
目前的研究也提供了证据表明已经拥有视黄醇转化为其活性代谢产物的能力。我们已经表明,培养已经被表达的酶RolDH II,一种酶对转换至关重要的细胞视黄醇视黄酸。我们的研究结果还表明,存在一个功能已经被视黄酸信号通路。我们已经确定了mRNA的RAR和RXR细胞,此外,发现RAR和RXR蛋白质的表达诱导配体ATRA和9-RA。观察诱导受体蛋白表达的配体在心肌细胞已经被认为与前一个报告的情况相符,表明RAR和RXR ATRA和9-RA转录激活。35
负责调节PSC的信号通路激活一直感兴趣的焦点近年来,作为治疗目标相关的信号分子可以使PSC激活抑制和预防纤维发生。我们和其他人的研究表明,所有三个类(ERK1/2、物和p38激酶)的MAPK通路发挥重要作用在接触profibrogenic调解PSC激活因素。17 -19ERK1/2通路已被证明调解PSC扩散通过增加转录因子的活动AP-1。19最近,我们组和其他人已经表明,p38激酶途径中起着重要作用在调解α-SMA表达文化激活和乙醇已经被处理。17日,36Masamune和他的同事们18日,37报道,p38激酶和物都发挥着重要的作用在调节细胞外基质蛋白已经被合成。鉴于以上,这将是合理的推测,PSC激活的抑制维生素A可能是通过抑制MAPK通路介导的。我们的研究结果支持这个概念。我们首次展示了视黄醇,ATRA和9-RA显著减少激活ERK1/2和p38激酶的文化已经被激活后4小时的潜伏期和减少持续超过48小时。此外,ATRA(但不是视黄醇或9-RA)显著降低物2(意味着)激活4、24、48小时。我们的结果与ATRA同意这些报道在人类支气管细胞和肝细胞。25日,38ERK1/2和物MAPKs已知能够调节转录因子的活动AP-1,进而是调节细胞增殖的必不可少的因素。21激活,AP-1绑定到目标基因DNA序列基序,从而调节其表达。39许多在其他细胞类型的研究表明AP-1活动增加在调节细胞增殖至关重要(见审查)。40感兴趣的注意的是,在接触维生素A, AP-1活动是减少在许多不同的细胞类型,这被认为是维生素A的一个机制,抑制细胞增殖。41
MAPK的机制抑制维生素A(失活)尚未确定。而激活MAPK取决于由上游激酶磷酸化的酪氨酸和苏氨酸残基,最近的研究表明,失活的MAPK是次要通过MKPs脱磷酸作用。22MKP-1可以灭活MAPKs的所有三个类。23日,24有趣的是,在其他细胞类型的研究报道,治疗维生素A的表达增加MKP-1进而导致MAPK活性下降。25日,31日,42目前的研究表明,ATRA(但不是视黄醇或9-RA)诱导表达MKP-1已经。这种感应是明显经过6个小时的孵化和持续超过24小时。我们进一步证明蛋白质磷酸酶抑制剂SV(抑制磷酸酶如MKP-1)阻止了抑制MAPK在已经被激活与ATRA治疗。这些发现支持这一概念,增加MKP-1活动可能发挥作用在已经被观察到的激活MAPK减少暴露于ATRA。机制负责视黄醇和9-RA诱导减少MAPK激活尚不清楚(因为这些化合物已经没有增加MKP-1活动。这些化合物可能诱发其他磷酸酶的活性MAPK磷酸酶家族,已经被Palm-Leis和他的同事报道35在心肌细胞。
现在人们普遍认为,乙醇诱导PSC在酒精性胰腺纤维化激活中起着重要作用。3鉴于我们发现视黄醇诱导静止的已经被文化,我们检查了视黄醇对乙醇的影响已经被处理。我们的研究结果表明,视黄醇防止乙醇诱导PSC激活,就是明证α-SMA表达明显下降,更重要的是,显著减少细胞外基质蛋白胶原的表达我,纤连蛋白、层粘连蛋白纤维组织的主要组件。在这些研究的过程中,一个有趣的观察是对的影响视黄醇在PSC激活的存在和缺乏乙醇。在乙醇、视黄醇被发现无法发挥其全部α-SMA抑制作用,胶原蛋白,我和层粘连蛋白表达与视黄醇(参见图12的方式v高校+ E50α-SMA表达和图13的方式v高校+ E50我胶原蛋白和层粘连蛋白的表达)。一个可能的解释是视黄醇的竞争性抑制乙醇代谢,酶RolDH和抗利尿激素可以使用视黄醇和乙醇为底物。26日,43有证据表明,在已经被这两个酶的存在。目前的研究已经证明了RolDH mRNA的表达,而以往的研究,我们小组展示了抗利尿激素酶活性(诱导后接触乙醇)已经被。3视黄醇减少代谢乙醇治疗已经被认为会导致视黄酸水平较低相比,这些细胞已经被视黄醇单独对待。
总之,本研究首次证明,维生素A和/或其代谢物ATRA和9-RA诱导静止在新鲜分离和文化已经被激活。诱导PSC静止与降低激活MAPKs的所有三个类。此外,我们表明,维生素a补充防止乙醇诱导已经被激活。这些研究结果表明,维生素A可能是一个潜在的有用的在慢性胰腺炎antifibrotic代理通过抑制PSC激活的能力,从而减少细胞外基质的合成蛋白质。
确认
这手稿中描述的研究支持由退伍军人事务部澳大利亚和医疗研究基金会悉尼西南。约书亚McCarroll是支持从GlaxoWellcome /胃肠病协会澳大利亚生物医学研究生研究临床学校奖学金和南西悉尼新南威尔士大学研究生研究奖学金。
引用
脚注
利益冲突:没有宣布。