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结肠直肠癌
激活中性粒细胞诱导一个hMSH2-dependent G2 / M检查站逮捕和复制错误(CA) 13-repeat在结肠上皮细胞
  1. C Campregher,
  2. mg Luciani,
  3. C Gasche
  1. 维也纳医科大学内科三世,胃肠病学和肝脏病学和基督教多普勒实验室分子癌症化学预防,奥地利的维也纳
  1. 教授Christoph Gasche维也纳总医院维恩,胃肠病学和肝脏病学,分工Wahringer Gurtel 18 - 1090维也纳,奥地利;christoph.gasche在{}meduniwien.ac.at

文摘

摘要目的:慢性炎症在溃疡性结肠炎与结直肠癌的风险增加相关。癌症的分子途径发展是知之甚少。我们调查的角色neutrophil-derived细胞体外模型的应力中性粒细胞感受器和结肠上皮细胞的目标,和检测细胞周期分布的变化和复制的出现错误。

设计:结肠上皮细胞与不同的错配修复表型被激活中性粒细胞培养。靶细胞细胞周期分布进行分析,通过流式细胞术复制错误。错配修复核和DNA-bound水平的变化,与检查点相关的蛋白质免疫印迹分析。

结果:激活中性粒细胞引起靶细胞的积累在G2 / M,符合安装dna损伤检查点。细胞不表达hMSH2, p53、p21waf1 / cip1未能接受G2 / M被捕。磷酸化site Ser15 p53和Chk1 Ser317, p21的积累waf1 / cip1在日到24日,观察h。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶无法克服这种G2 / M被捕,可能表明嗜中性粒细胞产品除了过氧化物或h2O2参与细胞反应。最后,暴露在激活中性粒细胞增加复制错误的数量。

结论:通过使用一个体外共培养模型,模拟肠道炎症溃疡性结肠炎,我们提供了分子证据的hMSH2-dependent G2 / M检查站逮捕和复制错误的存在。

http://dx.doi.org/10.1136/gut.2007.141556

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    慢性炎症会导致肿瘤的发展。1溃疡性结肠炎的发展与风险增加结直肠癌(CRC)。溃疡性结肠炎的关键特性之一就是隐窝脓肿,积累的多形核细胞(中性粒细胞)结肠隐窝内。23有人建议,活性氧(ROS)发布的中性粒细胞是结肠致癌作用的主要因素之一。1氧化应激可以改变细胞成分包括蛋白质,信使rna和DNA。4- - - - - -6然而,目前尚不清楚是否氧化应激的可能导致细胞突变。78不仅激活中性粒细胞产生活性氧,还分泌乳铁蛋白9包括一些细胞因子和其他蛋白质。1011因此,先前的体外研究,集中在H2O2全身的诱变812只是部分反映了结肠致癌作用的病理生理条件。

    错配修复(MMR)系统中起着重要的作用在促进DNA复制遗传稳定性的纠正错误。同系物的细菌傻瓜和MutL MMR在真核生物蛋白质形式在MMR-related过程与离散形成的作用。发现的人类癌症之间的联系和MMR缺陷导致增加真核MMR的兴趣。13短串联重复序列显示不稳定的移码突变的序列(微卫星不稳定性(MSI))和代表MMR缺乏人类癌症的一个特点。1415由于MSI可以检测到在结肠炎组织没有发育不良,失活的MMR系统必须是一个早期事件在溃疡性结肠炎结肠致癌作用。然而,inflammation-induced微卫星基因突变的本质仍然是模糊的。MMR联合系统可以激活DNA复制后修复错误。证据表明,细胞增殖核抗原(PCNA)是MMR招聘所需DNA修复合成之前,16导致复制和MMR的假设可能是耦合的,复制叉为维修提供链歧视信号。17

    真核细胞的接触代理商,改变DNA结构导致瞬态逮捕通过细胞周期进程。共济失调毛细血管扩张突变激酶(ATM)作为传感器的氧化损伤,与细胞周期检查点协调应激反应控制和修复的损伤。18细胞周期检查点使细胞有机会修复DNA损伤或凋亡。特别是,G2 / M检查点允许细胞进入有丝分裂前克服复制错误,从而确保基因组的完整性。除了自动取款机,G2 / M细胞周期检查点的关键组件包括ATM-and-Rad3-related激酶(ATR),下游检查点激酶Chk1和相关的1920.和肿瘤抑制基因p53蛋白,21稳定的磷酸化在ATM和ATR网站。2223磷酸化的p53与增强转录p21的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂waf1 / cip1。2425DNA-alkylating代理诱导磷酸化和激活p53、p21的表达增加waf1 / cip1。细胞系MMR缺乏抵抗这些烷基化剂和绕过细胞周期阻滞,表明在复制后检查点MMR有作用。2627然而,一氧化氮(NO)和H2O2能够逮捕hMLH1突变细胞G2 / M。428任何信息存在于hMSH2的作用在调节细胞周期阻滞。

    在这项工作中,我们假定,肠道粘膜的慢性接触激活中性粒细胞导致DNA损伤,这可能激活检查点激酶和启动MMR,或者如果这是低效的,可能驱动结肠致癌作用。为了模拟溃疡性结肠炎的致癌环境,我们建立了体外培养系统与主要中性粒细胞效应细胞和各种结肠癌细胞系作为目标。我们的结果表明,接触结肠癌细胞激活中性粒细胞安装G2 / M细胞周期检查点,表明DNA损伤,通过一个机制,不需要hMLH1,而是p53 / p21和hMSH2。这G2 / M逮捕与复制错误的增加有关。

    材料和方法

    细胞系

    人结直肠癌细胞系HCT116/ hMLH1−−及其衍生物HCT116 + chr3hMLH1 + /−,26HCT116 + chr3 A3.1 HCT116 + chr3 A3.7,29日HCT116-mlh1-2hMLH1 + /−,HCT116p53 /−−,HCT116p21 /−−30.和lovos/ hMSH2−−及其衍生物lovos + chr2hMSH2 + /−lovos (DT40.2) 4 - 1/ hMSH2−−,31日以及人类子宫内膜腺癌细胞系HEC59/ hMSH2−−和HEC59 + chr2hMSH2 + /−32是生长在IMDM (Gibco /表达载体、爱情、奥地利)含10%胎牛血清(的边后卫;Biochrom,柏林,德国)。媒介HCT116 + chr3包含400μg /毫升和HEC59 + chr2 lovos + chr2细胞700μg /毫升G418 (Gibco),分别。HCT116-mlh1-2细胞的培养基33包含100μg /毫升潮霉素B(表达载体)。克隆HCT116 + chr3 A3.1和HCT116 + chr3 A3.7种植了150μg /毫升潮霉素B和400μg /毫升G418。早幼粒细胞白血病HL60细胞行(写明ATCC ccl - 240)分部在RPMI培养(Gibco /表达载体)补充10%的边后卫。

    隔离和多形核的细胞的激活

    中性粒细胞是刚从heparinised分离血液健康志愿者的右旋糖酐T500(法玛西亚,乌普萨拉,瑞典)沉积之后通过密度梯度离心法Ficoll-Paque (Amersham,乌普萨拉,瑞典)或HL60细胞衍生granulocyte-like中性粒细胞的分化如前所述;34红血球细胞溶解于生理盐水(0.2%),其次是生理盐水(1.6%)和细胞被洗在Ca / Mg-free汉克斯平衡盐溶液(hbs) (Gibco)。CD66b马伯(BD 55572)是用来证实分离中性粒细胞通过流式细胞术的纯洁性。35中性粒细胞激活在哈佛商学院包含50 ng / ml佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA);σ,圣路易斯,密苏里州,美国)37°C和5%的公司230分钟。PMA被洗了中性粒细胞与哈佛商学院的两倍。生产·O2−是由所述lucigenin-enhanced化学发光。3637超氧化物歧化酶(SOD, 1000 U /毫升)(σ)和过氧化氢酶(猫,1000 U /毫升)(σ)被用作·O拾荒者2−和H2O2,分别。

    培养和细胞周期分析

    靶细胞的浓度7×104被播种到6-well盘子。24小时后,中性粒细胞被添加到上院Transwell 0.45μm微孔插入预防细胞间接触。中性粒细胞和目标细胞培养在效应:目标比率0:1 100:1长达24 h。目标细胞收获使用accutase (PAA实验室、林茨、奥地利),固定和分析细胞周期分布描述。36

    免疫印迹分析

    细胞溶解产物和DNA-bound分数得到描述。36西方墨点法,50 - 150μg溶解产物被用于以下抗体:兔多克隆抗体(帕布)anti-phospho-p53 Ser15(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国);帕布anti-cleaved caspase-7(细胞信号);马伯anti-p21waf1 / cip1(细胞信号);马伯anti-hMSH2(美国加州圣何塞,正欲),mAb anti-hMHS6(正),mAb anti-hPMS2(正),mAb anti-hMre11 (becton dickinson)和马伯anti-hMLH1(正);马伯anti-tubulin (Abcam);马伯anti-actin(σ);帕布anti-phospho-Chk1 Ser317(细胞信号)。

    复制错误的分析

    五千荧光HCT116 +甲基细胞,轴承增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pIREShyg2-EGFP / CA13(克隆A3.1,一个质粒复制,A3.7两个质粒拷贝)29日排序在FACSVantage SE使用CloneCyt +排序技术(Immunocytometry正欲系统),和中性粒细胞激活PMA如上所述。细胞培养在100:1比率24 h和中性粒细胞被移除。靶细胞生长了一个额外的7天。EGFP-positive人口荧光强度较低的被认为是“暂时性的突变分数”(M1),荧光强度高的,作为“永久突变分数”(M2)。29日

    统计分析

    实验进行了至少一式三份,重复两次。数据被表示为与SD意味着利用学生t测试和比较。假定值< 0.05被认为是具有统计学意义。

    结果

    建立一种体外培养系统

    溃疡性结肠炎的致癌环境模拟,我们建立了体外培养系统中,中性粒细胞被各种结肠上皮细胞培养半透膜隔开。活化的中性粒细胞PMA是紧随其后的是氧化破裂。38一个强大和可持续的·O2−观察发布至少2 h后PMA删除(图1)。表达式或缺乏MMR组件,p53、p21测试(图1 b在这项工作中使用的各种细胞系。

    图1 描述和分析结肠上皮细胞系和·O2−释放激活多形核细胞(中性粒细胞)。(A)新鲜分离中性粒细胞激活了50 ng / ml佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) 30分钟。细胞被洗两次,·O2−释放被lucigenin-amplified化学发光测量。强烈感应·O2−在激活中性粒细胞释放观察(实线),持续了超过2 h。数据给出了相对光单位每1×10 (rlu)6细胞。非活性细胞(虚线)受到相同的程序(隔离和洗涤)和作为控制。稍微增加·O的水平2−释放非活性细胞观察。每个数据点提出了三个独立的意思(SD)测量。(B)的免疫印迹hMLH1 hMSH2, p21waf1 / cip1和p53表达目标细胞系。免疫印迹证实预期损失或重新安装这些细胞表达蛋白的表达(HCT116/ hMLH1−−HCT116 + chr3hMLH1 + /−,lovos/ hMSH2−−lovos + chr2hMSH2 + /−,HEC59/ hMSH2−−HEC59 + chr2hMSH2 + /−,HCT116p21 /−−,HCT116p53 /−−和HCT116-mlh1-2)。

    多形核细胞激活导致hMHS2-dependent G2 / M逮捕在结肠上皮细胞

    氧化应激诱导细胞检查站,导致有丝分裂细胞周期阻滞和预防缺陷的细胞DNA复制。39激活中性粒细胞被HCT116培养,HCT116 + chr3 lovos还是lovos + chr2细胞24 h。所有的细胞系,除了lovos,显示G2 / M的增加人口在24 h 20:1比率(aPMN:靶细胞)(图2),与MMR组件hMSH2一致,但不是hMLH1,参与G2 / M被捕。使用非活性中性粒细胞时没有这样的效果观察。剂量效应观察当HCT116在不同的效应:培养目标比率(图3 b)。一个类似的实验与HEC59细胞或HEC59 + chr2,显示只在细胞G2 / M逮捕,引入了额外的2号染色体,因此表达hMSH2 (无花果2和1 b)。相同的结果观察与二甲亚砜(DMSO)区分中性粒细胞(d HL60)源自HL60细胞(图2 b)。总的来说,这些结果表明,激活中性粒细胞诱导G2 / M逮捕,独立于hMLH1表达式但依赖hMSH2表达式。此外,培养lovos (DT40 + 2) 4 - 1细胞(lovos + chr2-derived细胞系缺乏hMSH2表达式31日)和中性粒细胞激活显示没有逮捕G2 / M(类似于lovos HEC59细胞;图2),符合假设观察到G2 / M逮捕hMSH2依赖。

    Polymorphonuclear cells (PMNs) cause a G2/M arrest in hMSH2-expressing colon epithelial cells without affecting the expression levels or DNA binding activity of mismatch repair (MMR) proteins. (A) HCT116, HCT116+chr3, HCT116-mlh1-2, Lovo, Lovo+chr2, Lovo(DT40+2)-4-1, HEC59 and HEC59+chr2 cells were co-cultured at a ratio of 20:1 with non-activated or activated PMNs for 24 h and cell cycle distribution was analysed by flow cytometry. A significant increase of the G2/M population was observed in all cell lines upon co-culture with activated PMNs except for Lovo, Lovo(DT40+2)-4-1 and HEC59 (cells lacking wild-type hMSH2). Each column presents the mean (SD) of at least three experiments. (B) HCT116 and HCT116+chr3 cells were co-cultured at 20:1 ratios with non-differentiated (nd) or dimethyl sulfoxide (DMSO)-differentiated (d) HL60 cells, both treated with 100 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). A significant increase of the G2/M population was observed with DMSO-differentiated HL60 cells. Each column presents the mean (SD) of at least three experiments. (C) HCT116+chr3 and Lovo+chr2 cells were co-cultured in the presence of activated PMNs for 24 h and changes in the total protein levels of MMR proteins (hMre11, hMLH1, hPMS2, hMSH2 and hMSH6) were analysed by western blotting. None of the investigated proteins showed a change in expression levels under these conditions; α-tubulin served as a loading control.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2 多形核的细胞(中性粒细胞)导致hMSH2-expressing G2 / M逮捕结肠上皮细胞而不影响表达水平或错配修复(MMR) DNA结合活性的蛋白质。(一)HCT116、HCT116 + chr3 HCT116-mlh1-2, lovos, lovos + chr2 lovos (DT40 + 2) 4 - 1, HEC59和HEC59 + chr2细胞培养的比20:1与非活性或激活中性粒细胞24 h和被流式细胞术分析细胞周期分布。G2 / M显著增加的人口在所有细胞系培养与激活中性粒细胞除了lovos lovos (DT40 + 2) 4 - 1和HEC59(细胞缺乏野生型hMSH2)。每一列提出了均值(SD)的至少三个实验。(B) HCT116和HCT116 + chr3细胞培养与non-differentiated 20:1比率(nd)或二甲亚砜(DMSO)分化(d) HL60细胞,同时处理100 ng / ml佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)。显著增加的G2 / M人口观察DMSO-differentiated HL60细胞。每一列提出了均值(SD)的至少三个实验。(C) HCT116 + chr3和lovos + chr2细胞培养在激活中性粒细胞24 h和总蛋白质含量的变化MMR蛋白质(hMre11、hMLH1 hPMS2, hMSH2和hMSH6)被免疫印迹分析。所有的调查显示的蛋白质表达水平的变化在这些条件下;α-tubulin作为加载控制。
    图3 多形核细胞(中性粒细胞)激活诱导结肠癌细胞激活检查点组件存在剂量依赖的相关性。(一)HCT116、HCT116 + chr3 HCT116-mlh1-2, lovos和lovos + chr2细胞培养的比20:1 8 h;细胞收获和细胞溶解产物进行分析的总水平和检查点蛋白质的磷酸化状态。增加在Ser317 Chk1和p53的磷酸化Ser15中检测出HCT116 + chr3 HCT116-mlh1-2和lovos + chr2细胞和p21的积累waf1 / cip1在HCT116 HCT116 + chr3细胞。紫外线的强度25μJ / m2作为积极的控制。α-tubulin担任加载控制。(B) HCT116细胞培养在从1:1比例10:1非活性或激活中性粒细胞24 h和通过流式细胞仪测定细胞周期分布。G2 / M被捕的增加存在剂量依赖的相关性与激活中性粒细胞在共培养观察。(C)总溶解产物的细胞暴露于激活中性粒细胞(1:1的比例10:1)24小时被免疫印迹分析。p53磷酸化的增加存在剂量依赖的相关性网站Ser15 p21和总水平waf1 / cip1在培养检测到。培养与非活性中性粒细胞表示与激活中性粒细胞(−)和共培养和(+)表示。H2O2(200μmol / l)是作为积极的控制。微管蛋白被用作加载控制。

    多形核细胞激活不改变错配修复蛋白的表达

    之前认为氧化应激放松MMR联合系统,减少hMSH6。4041作为安装hMSH2是一个潜在的候选人的G2 / M逮捕在接触激活中性粒细胞,我们测试了MMR蛋白质表达水平的变化的靶细胞。然而,没有检测到MMR蛋白质水平变化在这些条件下(图2 c)。

    激活的ATM / ATR目标Chk1和p53与PMN-induced G2 / M被捕

    有人先前建立ATM和ATR需要激活p53, Chk1-dependent G2逮捕在DNA损伤。428 h与激活中性粒细胞共培养后,磷酸化在Ser317 Chk1和p53在Ser15是所有细胞中发现但HCT116 p21和lovos而的积累只有HCT116和HCT116 + chr3细胞(图3)。然而,在24 h,磷酸化存在剂量依赖的相关性的Ser15和p53的表达p53-downstream CDK-inhibitor p21waf1 / cip1HCT116细胞中观察到,这不是增加G2 / M逮捕(图3 b, C)。这些结果表明激活结肠细胞的dna损伤检查点hMLH1独立的。控制传输的额外基因可能的作用通过染色体3我们还测试了HCT116细胞被转染hMLH1构造(HCT116-mlh1-2),表达野生型hMLH1和显示MMR水平。33当培养在激活中性粒细胞的存在,他们表现出G2 / M的增加,父母的细胞系(所描述的相似图2)。西方墨点法HCT116-mlh1-2溶解产物的细胞,激活中性粒细胞培养,也显示出类似的激活p21 Chk1和p53和积累waf1 / cip1(图3)。总的来说,这些结果表明,存在hMLH1加速一个检查站的激活反应,但不是必要的实现等。

    PMN-induced G2 / M逮捕取决于p53、p21的表达

    一些报告表明p53、p21的重要作用waf1 / cip1安装的G2 / M检查站。30.43事实上,细胞p53、p21已经中断未能在G2射线电离辐射后被捕。30.事实上我们的实验表明p53磷酸化Ser15 (ATM机和ATR目标站点)和p21积累(图3 a, C)。为了研究p53、p21的重要性在我们的系统中,同基因的细胞株HCT116p53 /−−和HCT116p21 /−−,p53、p21waf1 / cip1基因被破坏,30.培养如上所述。两个细胞系未能接受G2 / M逮捕(图4),这表明G2 / M逮捕引起中性粒细胞激活取决于p53和p21的表达waf1 / cip1。

    图4 G2 / M逮捕由多形核细胞(中性粒细胞)是依赖于p53、p21的表达waf1 / cip1。HCT116、HCT116p21 /−−和HCT116p53 /−−细胞系培养了激活中性粒细胞的年代比20:1 24 h,流式细胞术分析细胞周期分布。HCT116p21 /−−和HCT116p53 /−−细胞未能接受G2 / M逮捕在这些条件下。每一列表示均值(SD)的三个独立的实验。

    超氧化物歧化酶和过氧化氢酶不抑制磷酸化p53 Ser15和p21水平的提高waf1 / cip1

    SOD触媒作用减少·O2−氧气和H2O2,而过氧化氢酶(CAT)催化作用降低H2O2水和氧气。·阿2−释放激活中性粒细胞是衡量lucigenin-amplified化学发光的SOD, CAT酶。SOD但不是猫显示强·O2−扫气效果(图5)。测试这些酶的作用在G2 / M逮捕,总细胞溶解产物HCT116 + chr3细胞共培养后分析了CAT和SOD的存在。虽然培养期间CAT和SOD的磷酸化激活中性粒细胞减少现场p53 Ser15 p21和积累waf1 / cip1(图5 b),它没有影响G2 / M逮捕(图5度),这表明中性粒细胞产品除了·O2−或H2O2激活p53、p21途径,满足细胞周期阻滞的分期付款。

    图5 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)不会阻止G2 / M逮捕但减少p53磷酸化和p21waf1 / cip1积累。多形核细胞(中性粒细胞)被激活(A)与佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) (50 ng / ml) 30分钟。PMA洗细胞两次后的汉克斯平衡盐溶液(hbs)·O2−释放是衡量lucigenin-amplified化学发光的存在与否SOD (1000 U /毫升)或猫(1000 U /毫升)。一个强大的·阿2−扫气效果观察SOD的存在,在一个较低的程度上,猫。非常低的·阿2−生产在没有PMA可衡量的。(B) HCT116 + chr3细胞被激活中性粒细胞培养的SOD和CAT (A)和p21的总水平和p53在Ser15磷酸化蛋白免疫印迹分析。SOD和CAT的加入大大减少p53磷酸化和p21的积累waf1 / cip1在8 h .β-Actin作为加载控制。(C) HCT116 + chr3细胞培养在(A)或暴露于200μmol / l H2O2SOD和CAT的存在,通过流式细胞仪测定细胞周期分布。在这种情况下,SOD和CAT阻塞H2O2端依赖,但不是PMN-induced, G2 / M逮捕后24 h。RLU相对光单位。

    多形核细胞激活导致结肠上皮细胞复制错误

    招聘MMR复杂的DNA复制后错误会导致细胞周期阻滞。44我们的实验显示出hMSH2-dependent G2 / M逮捕到目前为止,这可能是增加的结果复制错误在接触激活中性粒细胞(图2)。HCT116 + chr3(克隆A3.1和A3.7)轴承GFP-expressing EGFP的质粒序列逐门外(CA) 13个重复,29日暴露在激活中性粒细胞24 h,然后扩大为7天。荧光分析部分通过流式细胞仪显示的人数显著上升是暂时性的突变(M1)分数而高度的增加荧光人口(M2)不显著(图6)。没有观察到突变分数的变化与非活性中性粒细胞。这个结果可以表明PMN-induced G2 / M逮捕是增加复制错误的结果。当中性粒细胞的数量没有增加永久突变细胞(M2),很可能DNA修复系统功能。

    图6 多形核细胞(中性粒细胞)激活增加复制错误。(一)HCT116 + chr3细胞(克隆A3.1和A3.7窝藏pIREShyg2-EGFP / (CA) 13构造)的比率被激活中性粒细胞培养100:1切除后24 h。中性粒细胞,另一个7天的目标细胞被扩大,流式细胞术分析。激活中性粒细胞显著增加M1突变引起的分数(即瞬态突变(复制错误)可能修复)而不是M2突变分数(即永久传给子细胞和DNA突变可能扩大)克隆。
    图7 多形核的模型(中性粒细胞)全身的G2 / M细胞周期阻滞在结肠上皮细胞。激活中性粒细胞的氧化破裂释放多种基因毒性因素(包括但不限于活性氧(ROS)]导致复制错误(在我们的系统的转移(CA) 13个微卫星]G2 / M细胞周期阻滞。G2 / M检查站阻止细胞有丝分裂开始时DNA损伤的经验。这种路径依赖功能hMSH2的存在是一个重要的组成部分hMutS异质二聚体(还包括hMSH3或hMSH6;橙色中描述)。的hMutS异质二聚体作为传感器的复制错误,可能启动错配修复(通过招募hMutL复杂)。hMSH2能够身体与ATR形成信号交互模块。接下来,检查点激酶Chk1经历ATR-mediated磷酸化。活跃Chk1磷酸化Cdc25c灭活和细胞停止在G2 / M。ATR也介导的磷酸化肿瘤抑制基因p53 site丝氨酸(15)导致积累p21的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和细胞周期阻滞。 The presence of hMSH2, p53 and p21 are essential for the PMN-driven installation of this G2/M checkpoint, a pathway that acts independently of hMLH1 (which is needed for mismatch repair).

    讨论

    溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性疾病的大肠与CRC风险增加有关。145溃疡性结肠炎的粘膜损伤的特点是增强transepithelial激活中性粒细胞迁移形成隐窝脓肿。3在这项研究中,我们已经开发出一种体外共培养模型中主要中性粒细胞作为效应器和结肠癌细胞株inflammation-driven致癌作用的目标。在我们的研究中对结肠癌细胞激活中性粒细胞或granulocyte-like HL60细胞的增殖和逮捕放缓的G2 / M期细胞周期(图2 a, B)。这个观察与先前的报道是一致的,暴露的结肠上皮细胞H2O2和巨噬细胞导致G2 / M被捕。428

    细胞损伤诱发反应,使机体消除或应付的损害。DNA损伤反应的反应包括切除受损的DNA和修复DNA结构的连续性;激活一个DNA损伤检查点,逮捕细胞周期进展,以便修复受损或不完全复制的染色体和传输;或凋亡,消除严重受损的细胞。39在大多数的细胞系在这项研究中,分析了接触激活中性粒细胞逮捕引起了细胞周期的G2 / M,符合复制后的激活dna损伤检查点。证据的安装这样一个检查点,46除了逮捕G2 / M (图2),包括磷酸化Chk1 ATM和ATR目标网站Ser317 (图3)和Ser345(数据没有显示);47肿瘤抑制基因p53蛋白的磷酸化网站Ser15 (图3 a, C);48增加p21的表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂waf1 / cip1(图3 a, C);组蛋白的磷酸化同种型γ-H2AX Ser 139(数据未显示)和乳沟caspase-7(数据没有显示)。

    p53至关重要的维护G2 / M逮捕后氧化应激。事实上,p53有助于抑制cdc2、有丝分裂细胞周期蛋白依赖性激酶通过Gadd45 p21waf1 / cip1,14-3-3σ。细胞周期蛋白B1 cdc2活动,需要和镇压的细胞周期蛋白B1基因p53也有助于阻止进入有丝分裂。49中断后p53、p21waf1 / cip1基因,gamma-irradiated细胞发展成有丝分裂,尽管广泛的损害。30.在我们的系统中,p21waf1 / cip1表达与p53磷酸化在接触激活中性粒细胞增加,细胞缺乏p53、p21waf1 / cip1未能接受G2 / M逮捕(图4),这表明p53通路需要响应PMN-induced损害。然而,尽管SOD和CAT清除·O2−和H2O2(图5),完全扭转H2O2全身的G2 / M逮捕(图5度),他们只是部分减少了PMN-induced p53的磷酸化图5 b),都无法扭转引起的细胞周期阻滞中性粒细胞(图5度),这表明激活中性粒细胞释放额外的分子可以诱导G2 / M被捕。中性粒细胞释放的另一个潜在的有害物种氯化剂(包含一个活跃的氯在正式+ 1氧化态,如HOCl)。50然而,HOCl-specific清道夫牛磺酸51没有补偿PMN-induced G2 / M逮捕(数据未显示)。进一步限制模型的提出是结肠癌细胞系的使用而不是原发性结肠上皮细胞以及新鲜分离中性粒细胞不同志愿者,志愿者在他们发布的产品的成分。另一个限制是效应:目标比率和曝光时间的结肠上皮细胞培养系统的中性粒细胞浸润结肠粘膜和炎症的持续时间压力更戏剧性的在溃疡性结肠炎。中性粒细胞的上皮细胞直接接触可能会进一步增加观察效果,但在体外很难标准化。

    真核MMR包括两个不同的heterodimeric MutS-related蛋白质复合物:hMutS-α(hMSH2 / hMSH6)和hMutS-β(hMSH2 / hMSH3)。这些配合物有不同的mispair识别属性和能力支持MMR。hMutS-α感官单碱基错配和小insertion-deletion循环,而hMutS-β承认insertion-deletion循环。17我们的研究结果表明,hMutS-α或hMutS-β异质二聚体可能会负责响应引起的氧化应激炎症期间(图2)。事实上,细胞缺乏hMSH2 (lovos结肠癌细胞和HEC59子宫内膜腺癌细胞),但不是几乎同基因的同行,在其中一个额外的2号染色体被重新引入,未能逮捕在G2 / M培养与激活中性粒细胞(图2)。所示图3的磷酸化Chk1和p53在lovos细胞几乎缺席8 h。相比之下,lovos + chr2细胞中性粒细胞诱导压力反应更强。事实上,据报道,hMSH2身体与Chk1和相关的交互,35以及DNA损伤传感器Rad51 Mre11,52,这种交互所需的细胞周期阻滞的安装。然而,我们不能排除这样一种可能性,即hMSH2伙伴hMSH6和hMSH3也安装所需的G2 / M被捕。有趣的是,当H2O2是用于控制实验,G2 / M逮捕也实现了细胞缺乏hMSH2(数据没有显示)。

    诱导的DNA损伤信号激活中性粒细胞,似乎更加明显在HCT116 + chr3细胞(图3)。这里,事实上,p53的磷酸化和Chk1已经可见8 h接触激活中性粒细胞(图3),而HCT116显示非常低的磷酸化水平,增加在24小时(图3 c)。HCT116 + chr3表达野生型hMLH1,还额外染色体上的其他基因存在3。一个交互hMre11 hMHL1和检查点之间的传感器组件40和Nbs153据报道以及co-localisation MMR蛋白质和MRN (Mre11-Rad50-Nbs1)复杂的DNA损伤的焦点。53然而,在我们的研究中,HCT116-mlh1-2细胞,几乎表达野生型hMLH1生理水平,响应更类似于父母比HCT116 + chr3 HCT116细胞,表明边际作用hMLH1结肠细胞的反应激活中性粒细胞。其他一些蛋白质与MMR,包括DNA聚合酶三角洲,长串的蛋白质结合则,增殖细胞核抗原,夹钳装载机复制因子C (RFC)核酸外切酶1 (EXO1)、核酸内切酶FEN1,13ATR;所有这些蛋白质参与合成DNA复制叉和关联。54我们可以推测,加速激活Chk1和p53磷酸化在HCT116 + chr3在共培养观察中性粒细胞激活可能会引入额外的结果野生型基因ATR的副本,这是位于3号染色体。然而,由于暴露在紫外线强烈激活DNA损伤途径在所有调查细胞系(图3)这种效应似乎是一种特别的接触激活中性粒细胞。

    在溃疡性结肠炎,p53和复制错误重复CA序列在早期发生在慢性炎症粘膜发育异常独立的。5556尽管CRC发展溃疡性结肠炎的风险增加,这些突变的高频率(约40%的患者)会导致更多的癌症。一种解释是,这些突变只瞬态性质的。事实上,纵向研究CA重复的染色体5 (D5S346)和17 (D17S250)归复权的突变。57在我们的模型中,中性粒细胞增加复制错误的数量HCT116 + chr3 A3.1 A3.7细胞(图6)。然而,观察到的突变的瞬态特性。增加他们的指纹PMN-induced复制错误,已启动了hMSH2-dependent激活G2 / M的检查点。因此,在当前阶段我们的模型反映了上皮细胞的能力恢复或抵消PMN-induced压力而不是积累突变,这可能最终导致癌症。

    确认

    我们要感谢教授泰德·R·赫普(英国爱丁堡大学)HCT116的礼物p53 /−−和HCT116p21 /−−细胞;Drs里克•博兰Minoru锦鲤和Ajay高尔(,达拉斯贝勒大学医学中心)HCT116 + chr3 lovos + chr2 lovos (DT40.2) 4 - 1和HEC59 + chr2细胞;弗朗索瓦丝博士Praz HCT116-mlh1-2细胞;细胞分类和Drs马丁Willheim Guenther Hofbauer(核心单元Zellsortierung,维也纳医科大学)。此外,我们感谢Paul Grundtner博士,博士Rayko Evstatiev, Stefanie Kulnigg博士博士Agu的情况下和杂志。Sabine格鲁伯(MUW,维也纳)有用的讨论和科妮莉亚·利希滕贝格和曼Nemeth技术支持。

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    脚注

    • 资助:这项研究得到了奥地利科学基金(FWF格兰特P18270)。

    • 利益冲突:一个也没有。