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摘要
客观的炎症性肠病(IBD)与放松调控的细胞因子网络有内在联系，但迫切需要新的治疗原则。在这里，我们确定白细胞介素(IL)-33及其受体ST2是小鼠结肠伤口愈合和渗透性的关键负调节因子。
设计采用qRT-PCR、ELISA、免疫组化和western-blot检测IL-33和ST2的表达。野生型和St2−−/小鼠用于伤口愈合实验和2种由2,4,6-三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸钠(DSS)引发的IBD实验模型。通过使用特定的阻断抗体来中和ST2。
结果肌成纤维细胞和肠细胞中IL-33的核定位和表达增强与疾病受累独立于炎症有关，而ST2的表达主要局限于结肠上皮。在两个IBD实验模型中，ST2的遗传消融显著改善了结肠炎的症状，而在dss治疗中观察到细胞保护因子连接蛋白-43的持续上皮表达St2有缺陷的老鼠。出乎意料的是，非造血细胞中缺乏ST2足以预防结肠炎。一致地，用中和抗体治疗内源性st2介导信号的特异性抑制改善了dss诱导的结肠炎。此外，IL-33治疗在体内和体外都损害了上皮屏障的通透性，而缺乏ST2则增强了结肠急性机械损伤的伤口愈合反应。
结论我们的研究揭示了IL-33在上皮屏障功能和伤口愈合中的一种新的非造血功能。因此，阻断IL-33/ST2轴可能是IBD的有效治疗方法。
- 实验性结肠炎
- 上皮屏障
- 细胞因子
- 抗体靶向治疗
- 上皮通透性
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本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
炎症性肠病(IBD)与放松调控的炎症细胞因子网络有内在联系。
最近发现IL-33在人类IBD中表达上调。
IL-33在大鼠伤口愈合过程中表达增强。
与对照组相比，右旋糖酐硫酸钠处理的il -33缺陷小鼠肠道炎症减轻。
新的发现是什么?
IL-33受体(ST2)的遗传消融在两种不同的炎症性肠病实验模型中保护小鼠。
ST2阻断抗体显著减少小鼠损伤后结肠炎的迹象。
IL-33增强损伤后肠道炎症。
非造血细胞已被确定为IL33的关键细胞靶点，其促进损伤后结肠炎的严重程度。
IL-33在体内和体外均可增强肠道通透性。
IL-33/ST2通路在小鼠结肠中负向调节伤口愈合。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
因此，IL-33/ST2轴的中和可能是炎症性肠病的有效治疗靶点。
简介
炎症性肠病(IBD)的特征是溃疡性结肠炎(UC)中局限于结肠和/或直肠的复发-缓解上皮屏障功能障碍，或克罗恩病(CD)中可能影响胃肠道的任何部分。1迫切需要新的治疗原则来治疗和/或预防IBD的自然史，IBD影响着全球多达600万人。然而，IBD的潜在发病机制尚不清楚。最近的实验和临床研究表明，上皮细胞的慢性应激反应可能导致上皮再生受损，1为了增强炎症信号的分泌，2包括白细胞介素-33。3 - 7
IL-33，以前被称为IL1F11或来自高内皮小静脉的核因子，是最近发现的IL-1细胞因子家族成员。8，9全长的IL-33具有生物活性，并通过蛋白水解裂解被凋亡的caspases灭活。10，11IL-33在体内通过与染色质的结合在细胞核内发挥作用。12IL-33结合到IL-33受体复合物的ST2链(也称为IL-33R或IL-1R4)，赋予配体特异性。8ST2在T(H)2细胞上是一种稳定的细胞表面标记物，但近年来人们逐渐认识到ST2在上皮细胞上也有功能性表达。13有趣的是，IL-33已被证明在肠道蠕虫感染后，由2型先天淋巴样细胞产生极高数量的T(H)2细胞因子IL-5和IL-1314，15或者肺部感染流感病毒16，17更重要的是，ST2的表达是由T(H)2细胞因子驱动的，13这表明IL-33可能触发了一个参与免疫稳态的关键调节放大环。
重要的是，IL-33和ST2与几种重要的炎症性疾病有关，包括哮喘、类风湿关节炎和动脉粥样硬化。18在这些不同的炎症条件下，值得注意的是，IL-33具有双重病理生理作用，可能取决于潜在疾病发病机制的特定免疫机制。18然而，尽管IL-33/ST2轴被认为与IBD有关，3 - 7它对疾病发病机制的贡献尚不清楚。19在这里，我们结合体内和体外方法揭示了IL-33/ST2轴在两个IBD实验模型中是肠道稳态的关键调节因子。更重要的是，对IL-33的非造血反应促进损伤后的肠道炎症。最后但并非最不重要的是，IL-33通过负向调节结肠中的伤口愈合来独立于肠道炎症控制结肠上皮的通透性。总的来说，这些数据确定IL-33/ST2轴是IBD的潜在治疗靶点。
结果
IL-33/ST2在人IBD和IBD实验模型中的表达
最近发现IL-33在人类IBD中表达上调。3 - 6在乳糜泻患者的结肠活检中，在IL-33周围发现了炎症聚集物+细胞，而后者经常在UC溃疡区域下方形成“盾状”簇(图1A).此外，某些IL-33+在部分IBD患者中，细胞位于肌层内(图1A)。与未受病患者活检或非IBD对照的结肠组织表达相比，从活动性IBD患者收集的切除标本的炎症黏膜中IL-33表达上调(图1A和联机补充表S1和S2)。同样，与未受累结肠区域相比，在缓解期间受累结肠黏膜内IL-33转录水平的增强独立于Mayo评分(图1A、B和在线补充表S3)。与在人类IBD中观察到的相似(图1A,B)，我们发现，在两种已建立的小鼠结肠炎急性模型(三硝基苯磺酸(TNBS))小鼠损伤结肠中，IL-33的mRNA和蛋白水平均显著升高- (图1C,E)和右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导(图1D, F)结肠炎。结肠提取物的Western-blot分析进一步证实了这些发现，显示在暴露于DSS后疾病严重程度高峰时，结肠中活跃的、全长形式的IL-33上调(图1G)。10，20.同样，在DSS治疗的第7天，IL-33已经在粘膜下结缔组织成纤维细胞中检测到，而在naive小鼠中几乎检测不到(图1H)。
IL-33在人类炎症性肠病(IBD)和结肠炎的两个实验模型中的作用。(A)免疫组化分析IL-33在非IBD对照组以及缓解期或活动性IBD患者受累和未受累黏膜区域的表达。插入表示框内区域的放大。尺寸棒材，100 μm。(B)相对IL-33溃疡性结肠炎缓解期患者mRNA表达情况(n=5)。(C)相对IL-33mRNA在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎中的表达(n=5)。(D)相对IL-33右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导结肠炎的mRNA表达。C57BL/6J小鼠不处理(n=4)，或在饮用水中给予2% DSS 6天(n=9)，或7天，然后在接下来的10天恢复正常饮用水(n=7)。(E) tnbs诱导的结肠炎中IL-33蛋白水平(n=5)。(F) IL-33蛋白在dss诱导的结肠炎中的表达。C57BL/6小鼠在饮用水中给予3% DSS (n=4)或不给予DSS (n=5)，持续7天。(G)使用特异性抗体对对照或dss处理的结肠匀浆进行Western-blot分析。肺组织显示为对照。(H)免疫组化分析dss诱导的结肠炎中IL-33的表达。尺寸棒材，50 μm。(I-K) dss诱导的结肠炎中IL-33(红色)和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)或CD31(绿色)的免疫荧光染色。 DNA was counterstained with DAPI (blue). Representative images of IL-33 staining in colonic epithelium (I), CD31+内皮(J)和a-SMA+myofibroblasts (K)。
在健康的结肠黏膜中，IL-33的核染色主要局限于内皮细胞，而在受累性粘膜内，IL-33的核免疫反应主要在结肠上皮细胞中，最常发生在UC缓解或复发期间，而不是在CD中(图1A).接下来我们进一步研究了IL-33的细胞来源。因此，我们对dss处理的小鼠结肠切片进行了特异性双免疫荧光染色。在疾病最严重的第7天和第8天，在少数肠细胞中检测到核IL-33 (图1I)和表达内皮细胞同源标记物(CD31) (图1J)或肌成纤维细胞(α-平滑肌肌动蛋白，αSMA) (图1K)。我们接下来的目标是确定损伤后结肠黏膜内的IL-33靶向哪些细胞。我们的筛选方法显示ST2主要由两种小鼠的结肠腺细胞表达(图2A)和人类(图2B)，而其表达在白细胞中几乎检测不到固有层如果任何。复发或缓解型IBD患者的上皮下浸润均含有大量st2阳性细胞(图2B)，以及IBD的实验模型(图2C)，进一步支持IL-33/ST2轴在IBD发病机制中的关键作用。
ST2在人类炎症性肠病和结肠炎实验模型中的作用。(A)相对鼠ST2通过qRT-PCR分析不同类型细胞的mRNA表达，并将其归一化Actb(n = 4)。(B)对照组、活动性克罗恩病、活动性溃疡性结肠炎(UC)和缓解期UC患者中人ST2表达的免疫组化分析。条形尺寸，100 μm。(C) dss诱导结肠炎第5天和第8天小鼠ST2表达的免疫组化分析。插入表示框内区域的放大。大面板下沿长度为689 μm，镶片长度为143 μm。数据显示均值±SEM。另一项独立实验也得出了类似的结果。
在两个IBD实验模型中，ST2缺乏导致疾病严重程度降低
为了正式评估IL-33/ST2通路在肠道稳态中的作用，我们询问了在急性溃疡/肠道炎症的两个实验模型中，IL-33介导的信号通路的缺失是否会减轻疾病的严重程度。缺乏或不缺乏IL-33受体的小鼠(St2- / -)首次通过直肠内途径接触TNBS。在此实验条件下，St2根据组织学评分评估，-缺陷小鼠的炎症较少(图3A,B)和冒号长度(图3C)与WT窝友相比。一致的，结肠粘膜St2-缺陷小鼠的KC分泌量降低(图3D)与野生型窝仔相比。接下来，我们确定st2介导的信号通路缺失是否可能在另一种由DSS诱导的结肠炎模型中起到保护作用。老鼠亏不亏St2随意接触DSS 7天。疾病活动指数(DAI)每日评估为体重下降的平均值以及直肠出血和腹泻的迹象。dss处理组没有发现体重减轻St2- / -而dss治疗的WT小鼠随着时间的推移体重显著进行性减轻;在接触DSS的第7天达到初始体重的16% (图4A).始终如一的dss处理St2- / -与类似dss处理的WT动物相比，小鼠在疾病过程中发病迹象减少(图4A).尸检时，dss处理St2−−/小鼠结肠出现明显的上皮溃疡、中性粒细胞和淋巴细胞浸润(图4B)与IL-6分泌减少同时发生(图4C)和KC (图4D).一致地，在St2- / -损伤小鼠与对照动物比较(图4E).因此，我们在两个IBD实验模型中证明了ST2通路的参与有助于结肠炎的加重，这表明ST2的药物抑制可能代表了IBD的一种新的治疗原则。因此，我们评估了在DSS攻毒后第1、3、5和7天腹腔注射特定单克隆抗体来中和ST2是否能保护小鼠免受结肠炎的影响。与我们之前的发现一致，与接受同型对照的dss治疗的小鼠相比，接受阻断抗st2抗体治疗的WT小鼠显示出明显减少的疾病迹象(图4F).一致，组织学评分(图4G)和IL-6的分泌(图4H)与安慰剂相比，ST2阻断抗体治疗后改善。此外，缺乏IL-33的小鼠显示组织学评分降低(图4I)和缩短结肠(图4J)在DSS挑战时，与类似处理的对照动物进行比较。总的来说，我们提供了实验证据，证明IL-33/ST2轴的治疗中和可能是治疗IBD的一种新的有效治疗原则。
ST2基因消融在半抗原介导的急性溃疡/肠道炎症模型中减少了结肠炎症。(A-D)三硝基苯磺酸所致结肠炎。每组6只动物的平均值±SEM。图示有代表性的May-Grünwald & Giemsa染色(A)和结肠组织学评分(B)、结肠长度(C)和KC表达(D)。
在化学诱导的急性结肠炎模型中，IL-33/ST2轴的遗传和/或药物抑制减轻了结肠炎症。(A)疾病活性指数(DAI)， (B)组织学评分，(C)结肠匀浆IL-6和(D) KC ELISA， (E)右旋糖酐硫酸钠(DSS)处理野生型和结肠长度St2−−/动物。给出了四个独立实验的DAI±SEM的平均值。(F) DAI (G)组织学评分，(H) IL-6 ELISA，来自dss处理的小鼠结肠匀浆，在第1、3、5和7天腹腔注射50µG中和抗st2抗体(大鼠IgG1)或同型对照。(I) dss处理野生型和il -33缺陷型小鼠的组织学评分和(J)结肠长度。每组4只动物的平均值±SEM。
在非造血细胞中缺乏st2介导的信号可以预防dss诱导的结肠炎
为了进一步区分st2介导的信号通路如何在损伤时驱动肠道炎症，进行了骨髓嵌合体实验。致命辐照野生型和St2−−/用野生型或野生型的骨髓细胞重建小鼠St2−−/老鼠。3个月后，给嵌合动物注射3%的DSS 7天。与先前的研究结果一致，减少了结肠炎症St2−−/dss处理后的小鼠结肠缩短St2−−/用骨髓细胞重建的小鼠St2−−/(KO→KO)小鼠与对照组(WT→WT)小鼠(图5A).结肠中MPO酶活性水平(图5B)和组织学评分(图5C)在突变(KO→KO)嵌合小鼠中也相对于对照组减少。更重要的是，突变动物对dss介导的结肠炎的抗性增强也在St2−−/用野生型(WT→KO)捐赠者的骨髓细胞重建的受者。相比之下，用骨髓细胞重建的辐照野生型小鼠的疾病严重程度St2−−/(KO→WT)组与对照组(WT→WT)组比较相似。考虑到IL-33和ST2在损伤后肠上皮中都有高表达，因此我们假设在损伤后肠上皮中对结肠炎的保护作用St2−−/小鼠可能反映持续的肠屏障功能。为了响应上皮细胞的损伤，肠细胞需要迁移，这一过程依赖于通过连接蛋白43 (Cx43)参与的间隙连接细胞间通信。21，22重要的是，Cx43的表达在dss处理的WT小鼠中几乎完全消失，但在类似处理的WT小鼠中却没有St2−−/老鼠(图5D).此外，值得注意的是，结肠上皮St2−−/小鼠(但不是野生型动物)的IL-33从未呈阳性(图5E).总的来说，我们证明了在非造血细胞中缺乏st2介导的信号通路保护小鼠免受dss介导的结肠炎，并维持间隙连接。
在抗辐射室中对IL-33的反应性丧失足以保护小鼠免受右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎。(A)结肠长度(B) MPO水平和(C) dss处理的嵌合动物解剖时的组织学评分。取平均值±SEM(每组n=4)。(D, E)用特异性抗体双免疫荧光染色分析内源性Cx43和IL-33的表达。条形尺寸，50 μm。
IL-33损害上皮屏障功能，加剧dss诱导的结肠炎
为了进一步评估IL-33在肠道炎症中的作用，重组IL-33于dss处理的WT小鼠第1、3和5天腹腔注射，并随时间随访DAI。重要的是，IL-33治疗显著增加了DSS诱导的结肠炎的发病率，正如更严重的DAI所判断的那样，但在未受到DSS刺激的小鼠中没有这种情况(图6A).鉴于IL-33在结肠中的促炎作用，我们假设IL-33可能直接影响肠通透性本身，从而增强损伤后结肠黏膜的炎症反应。我们首先评估了IL-33是否损害了表达ST2的人结肠上皮Caco-2细胞系的极化单层的完整性(图6B).通过对极化Caco2单分子层的上皮电阻测量，发现外源性IL-33负向调节上皮完整性(图6C).为了进一步证实我们的体外研究结果，我们接下来评估了未受到DSS刺激但接受或未接受外源性IL-33治疗的小鼠组的肠道通透性。值得注意的是，与安慰剂相比，在全身IL-33治疗独立于结肠炎的情况下，观察到fitc -右旋糖酐的肠易位增强(图6D).外源性给药IL-33未观察到Cx43表达的变化，表明dss处理后Cx43持续表达St2−−/小鼠是上述动物对结肠炎抵抗力增强的替代标记物(图6E).总的来说，我们的研究结果支持了IL-33/ST2轴在独立于结肠炎症环境控制上皮屏障完整性和通透性方面发挥关键作用的假设。
IL-33负向调节结肠上皮屏障功能。(A)描述了3%右旋糖酐硫酸钠处理的小鼠在第1、3和5天腹腔注射0.5µg重组IL-33的疾病活动指数。取平均值±SEM(每组n=4)。(B) Caco-2细胞上ST2的表达。(C)在指定时间点，用指定剂量的重组IL-33处理Caco-2单层细胞的上皮电阻。所示为三个独立实验的汇总数据，柱状表示均值±标准差。(D)在给药4小时后，通过测量血清fitc -右旋糖酐水平来评估安慰剂和rmil -33治疗小鼠的肠道通透性。数据以均数±SEM表示，每组n=4。这是两个独立实验的一个代表。*p<0.05，未配对t检验。 (E) Colonic expression of endogenousCx43 and IL-33 is shown in (E) untreated and (F) IL-33-treated mice.
IL-33延缓受伤结肠上皮的愈合
最近，研究发现IL-33可调节notch介导的信号通路23这与伤口愈合有关。为了评估IL-33/ST2轴是否影响结肠损伤后的再上皮化，在降结肠活检损伤后监测黏膜再生St2缺陷和控制动物。在对照组野生型动物中，远端结肠粘膜椭圆形病变在损伤后3天和7天分别恢复了49%和70%。相比之下，平均表面病变面积的再生明显加速St2-缺陷小鼠(图7A、B)。一致地，在没有St2的情况下，结肠伤口的组织学方面似乎不那么严重。图7C).因此，我们认为IL-33-ST2轴通过延缓小鼠伤口愈合促进结肠黏膜渗漏。
缺乏ST2可促进结肠伤口愈合。在活检引起的降结肠损伤后评估粘膜再生St2-缺陷(n=9)和对照(n=6)动物，使用直型刚性微型内窥镜和3-French活检钳。(A)代表性内窥镜照片。(B)在活检后第0、3和7天评估伤口直径。(C)损伤后第4天多聚甲醛固定组织H&E染色的代表性照片。尺寸棒材，50 μm。(D) IL-33/ST2轴在肠道稳态中的生理作用概述示意图。
讨论
IL-33的功能受潜在疾病状况的影响。18值得注意的是，IL-33的抗感染特性鞭虫缪里斯感染与T(H)2型细胞因子表达增强以及T(H)1和T(H)17细胞因子分泌减少有关。24IL-33还通过增加感染部位的中性粒细胞招募和细菌清除，在败血症小鼠模型中提供保护。25据我们所知，我们的数据首次揭示了IL-33在结肠中的非造血介导机制，该机制将IBD中的上皮通透性与伤口愈合联系起来。我们的数据表明，IL-33损害肠屏障功能独立于炎症，提供了一个工作模型，即增强的IL-33可能有利于微生物易位，使结肠炎症的恶性循环永久化。26此外，我们报道了IL-33/ST2轴在两个IBD实验模型中的关键致病作用。与之前的研究结果一致IL-33−−/老鼠26包括我们的，我们证明了这一点St2−−/小鼠损伤后的临床症状和炎症病变减少，这与参与间隙连接细胞间通信的分子的持续表达相吻合。一致地，通过一种非常特异性的抗st2阻断抗体，中和对IL-33的任何亚型的反应，改善了dss诱导的结肠炎的病程。此外，外源性重组IL-33通过增加肠通透性而损害肠屏障功能，并增强dss诱导的结肠炎的严重程度，这强烈表明生物活性IL-33在损伤后局部释放。更重要的是，在小鼠和人类IBD结肠粘膜的相关区域观察到IL-33的分泌上调，这与炎症无关。我们的免疫荧光和Western blot分析表明，在小鼠和人类IBD的受累性结肠区域内发现了IL-33的全长生物活性形式，并且在病变结肠的粘膜下和上皮区显示IL-33核表达的细胞数量增加。值得注意的是，由于ST2主要由UC患者的肠上皮表达，IL-33可能在损伤时直接作用于上皮屏障功能。根据我们的假设，在非造血细胞中缺乏st2介导的信号通路足以保护动物免受dss诱导的结肠炎，这是由骨髓嵌合体实验确定的。总的来说，我们认为IL-33/ST2轴在对上皮细胞损伤作出反应时起着结肠警报的作用。目前尚不清楚对IL-33的非造血反应如何通过研究TGFβ等几种机制来调节上皮屏障功能和伤口愈合效果。27值得注意的是，它可能会干扰先天免疫系统的激活，26并可能通过促进伤口愈合来限制微生物的迁移。增强伤口愈合是维持缓解的一种有前途的治疗方法，因此我们提出中和IL-33/ST2途径将是IBD的一种新的双管齐下的方法。
材料与方法
病人
CD或UC的临床诊断是基于既定的临床、内镜和组织学标准。分析了来自耐药活动性CD或UC患者的受累区和未受累区结肠切除样本的石蜡包埋块(见在线补充表S1和S2)以及来自缓解期UC患者的活组织检查样本(见在线补充表S3)。本研究包括20名CD患者和19名UC患者的组织。6例患者的正常结肠要么是来自肿瘤活检切除边缘的健康组织(n=4)，要么是来自健康监测研究的诊断性活检(n=2)，在组织学水平上表现为健康。KM和GC实验已获得巴塞尔伦理委员会的批准(EKBB: 264/11 ' Die Rolle von Interleukin-33 in chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen ')。缓解期UC患者队列的信息报告给国家信息委员会Libertés (no.1404720)，该委员会负责监督有关数据处理、数据文件和个人自由的法案的实施，该法案于1978年1月6日生效，2004年8月6日修订，以保护个人的个人数据。
老鼠
缺乏St2的小鼠(St2- / -）28至于IL-33 (Il33−−/）26在C57BL/6J遗传背景上进行了8次回交，并在我们转基因研究所(CNRS, TAAM，奥尔良，法国)的无特定病原动物设施中与野生型小鼠进行了繁殖。
结肠炎的实验模型
以8 ~ 10周龄雄性动物为实验动物，诱导急性溃疡/肠道炎症模型St2- / -，Il33−−/而且St2+/+通过直肠内给药TNBS (TNBS, 150 mg/Kg，如前所述29)及/或以可自由支配的方式发放3%的发展资助(发展资助;MW: 30000 - 40000, TdB Consultancy AB)在饮用水中放置7天。年龄和性别相匹配的动物每个笼子养5只，在FELASA建议的半天光照周期照射和温度控制的无特定病原体环境中免费获得标准的实验室饲料。所有动物实验均经当地调查审查委员会批准，并根据政府指南N°86/609/CEE在两家认可的机构进行。每日通过结合前文所述体重减轻、直肠出血和大便一致性的平均评分来测定DAI。29
骨髓移植实验
如之前报道的那样，受体小鼠接受了致死的全身照射。30.放射24小时后，小鼠接受2×106新鲜骨髓细胞。定期在含有edta的管子中采集血液，并使用Technikon H1E分析仪测定血液参数。骨髓移植两个月后，嵌合小鼠再次接受3% DSS的刺激。
尸检和显微分析
CO处死小鼠2在第7天或第8天，切除结肠并调整大小。然后用生理盐水冲洗结肠，进行组织病理学分析(立即保存在10%的甲醛中)，并使用细胞因子剂量。组织用福尔马林固定(如上所述)，石蜡包埋，切片，H&E染色，May-Grünwald & Giemsa染色或周期性酸-希夫染色。两名独立的研究者分别对组织病理变化进行评分。每只小鼠分别对每个参数进行评分，包括炎症细胞浸润(评分0-5)、组织损伤(评分0-5)和受累百分比(评分0-4)。偶尔出现的和增加的炎症细胞固有层分别为0分和1分，而透壁浸润延伸为5分。对于组织损伤，没有粘膜损伤被评分为0，淋巴上皮病变被评分为1 - 5，广泛的粘膜损伤并延伸到肠壁更深的结构。疾病受累程度从0到4分，分别对应0%、1-25%、26-50%、51-75%和76-100%。30.浸润白细胞评分通过计算结肠肠系膜边界每高倍场(40×)的白细胞数进行。
鼠标内窥镜检查
粘膜损伤使用直型刚性微型内窥镜和3-French活检钳。使用colview高分辨率小鼠内窥镜系统(Karl-Storz)监测结肠内溃疡的存在。
免疫印迹和FACS分析
对在RIPA缓冲液中裂解的组织匀浆进行免疫印迹，该缓冲液中补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒组II (Merck4Biosciences)。山羊抗小鼠IL-33多克隆抗体(1/1000;研发系统)，驴抗山羊，HRP偶联(1/10 000;克隆AC-15 (1/3000;Sigma)和山羊抗小鼠，酶标(1/10 000;使用了Promega)。用ECL +试剂(ECL Western Blotting Detection reagent, Amersham)观察免疫反应蛋白。对于FACS分析，使用来自研发系统的pe标记的抗st2抗体(clone97203)和匹配的同型对照分析co2细胞。
组织学、免疫组织化学和免疫荧光染色
将人切片(10 mm)在BondMax系统(Leica, Mannheim, Germany)中Bond表位提取液2 (ph9.0)中在95°C下孵育30分钟，然后对IL-33使用山羊抗人IL-33 IgG (R&D系统，AF3625)以1:400稀释，或对ST2使用兔多克隆抗ST2 (SigmaAldrich, PRS3363)以1:400稀释。从安乐死动物中分离出来的结肠被嵌入OCT化合物(Cellpath)中并快速冷冻。或者，结肠切片在Accustain (Sigma)中4°固定4小时，然后用石蜡包埋。5 μm石蜡包埋切片在history -clear (National Diagnostics)中脱蜡，在分级酒精系列中再水化。6 μm冷冻切片后固定于4%的PFA中10 min。在标准条件下用H&E (Sigma)染色。然后将载玻片脱水并安装在Safemount安装介质中(法国Labonord)。为了进行免疫荧光或免疫组化染色，将再水化的石蜡切片在柠檬酸钠缓冲液(10 mM pH 6, 20分钟)中置于微波炉中煮沸以获取表位。石蜡或冷冻切片在PBS中平衡，用MAXblock (Active Motif)封闭溶液在室温下孵育1小时。将多克隆山羊抗鼠IL-33 (R&D Systems)、大鼠抗cd31 (Pharmingen)和兔抗connexin43 (Zymed)分别稀释为1/200、1/100和1/100在PBS中，MAXblock 20%，在4℃下孵育过夜。 For IL-33 staining, sections were washed in PBS for 30 min and incubated with a rabbit antigoat biotin polyclonal antibody (1/200; DAKO) followed by SA-HRP (1/100; Vector) and incubated 1 h and 30 min at room temperature respectively. HRP was revealed with DAB (Sigma). Haematoxylin-counterstained sections were dehydrated and mounted with Coversafe medium (Microm). Immunohistochemistry of DSS-induced colitis for mouse IL-33 and ST2 was performed on 5 μm paraffin sections using a goat antimouse IL-33 polyclonal antibody (R&D systems, AF3626) or a rabbit polyclonal anti-ST2 antibody (Abcam, ab25877, 1 : 500). Alternatively, IL-33 immunofluorescence staining sections were incubated with a bovine antigoat Cy3 secondary antibody (Jackson Immunoresearch; 1/200) 1 h at room temperature. For CD31 and Connexin43 staining, sections were respectively incubated with a rabbit antirat IgG biotin polyclonal antibody (1/200; DAKO) and a Donkey antirabbit biotin polyclonal antibody (1/200; Jackson Immunoresearch) followed by SA-FITC (1/200; Vector) and incubated 1 h and 30 min at room temperature respectively. For α-SMA staining, sections were incubated with a mouse anti-αSMA monoclonal antibody (DAKO; 1/100) followed by a donkey antimouse Cy2 polyclonal antibody diluted 1/200 by using a MOM kit (Vector) according to the manufacturer instructions. Sections were counterstained with DAPI and mounted in Mowiol.
图像采集与处理
在室温下，使用尼康Eclipse TE300倒置显微镜，40X/0.75和100X/ 0.5-1.3物镜进行表观荧光成像，并使用尼康ACT1软件通过DXM 1200数码相机进行拍摄。亮场图像在室温下使用Eclipse 80i尼康显微镜，40X/0.75和100X/1.30物镜进行可视化，并通过Digital Sight DS 5 M L1尼康相机使用DS 5 M L1尼康软件进行捕获。所有图像均使用Adobe Photoshop CS4软件处理。
细胞因子测定和MPO分析
根据制造商说明书(研发系统)，用特异性ELISA法从结肠匀浆上清液中测定IL-33和IL-6蛋白水平。对于qRT-PCR分析，结肠活组织切片立即冷冻并在−80°C的RNA中存储晚些时候(Ambion，应用生物系统公司)。相对St2在原代培养的C57/Bl6J小鼠骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞、腹腔巨噬细胞、外周血单核细胞、粒细胞、结肠肌成纤维细胞以及CD4和CD8淋巴细胞中测定表达。此外，St2在L929、3T3、MC38、Hepa 1.6、P815和H5V等细胞系中分别作为真皮成纤维细胞、胚胎成纤维细胞、结肠子细胞、肝细胞、肥大细胞和结肠内皮细胞的原型进行表达。简单地说，从细胞和结肠标本中提取总RNA使用RNeasy (Qiagen)和反转录用高容量cDNA档案试剂盒(应用生物系统)，根据制造商的说明。使用SYBR Green实时PCR试剂盒扩增得到的cDNA(相当于5 ng总RNA)，并在Stratagene Mx3005P(安捷伦科技)上检测。qRT-PCR使用Primer express软件V.1.0 (Applied Biosystems)设计的正向和反向引物(序列可根据要求提供)进行。PCR扩增完成后，进行DNA融化曲线分析，以确认单个扩增子的存在。β肌动蛋白被用作内参基因，以使转录水平正常化。相对mRNA水平(2-ΔΔCt)通过比较(a)感兴趣基因的PCR周期阈值(Ct)和Actb(ΔCt)和(b)治疗组和对照组的ΔCt值(ΔΔCt)。MPO的测量方法如前所述。31
体外和体内上皮通透性分析
Caco-2人肠结腺癌细胞系(欧洲细胞培养集刊)维持在含有Earle's盐和非必需氨基酸的最低必需培养基中，添加2 mM谷氨酰胺、50 U/ml青霉素- g、50 μg/ml硫酸链霉素和10%胎牛血清(Invitrogen)，并在湿润的空气(95% air-5% CO)中培养2)在37°C。在烧瓶中培养的细胞以70-80%汇合使用。Caco-2细胞在24孔板的转孔上播种(2.5×105/well，直径6.5 mm，孔径3 μm, Corning B.V. Life Sciences)，培养18-21天。使用Millipore伏特欧姆仪(Millipore)监测经上皮电阻(TER)。transwell with TER>250Ω*cm2被使用。测量基线TER后，在根尖和底侧加入重组人IL-33 (R&D系统)72 h，并监测TER。IL-33或pbs处理的小鼠口服600 mg/kg fitc -葡聚糖(以10 ml/kg H2O;σ)。4 h后，终末放血采集血清，用分光光度计测定各样品荧光强度。
重组IL-33和抗st2阻断抗体
dss处理小鼠在第1、3和5天腹腔注射0.5µg重组小鼠IL-33 (LAL法测定aa 109-266， <1.0 EU/μg;或用于体内渗透性测定，每天1 μg/小鼠rmIL-33，持续7天(诺华)。在DSS治疗后第1、3、5和7天，每只小鼠给予50µg抗ST2抗体(来自Dirk Smith博士，Amgen的善意礼物)或同型对照(大鼠IgG1)，以实现ST2中和。
统计分析
采用非参数Kruskal-Wallis检验与Dunn's多重比较检验或参数单因素方差分析与Bonferroni's多重比较检验(GraphPad Software)。所有数据均以均数±标准差表示。*, p < 0.05;* *, p < 0.01;* * *, p < 0.001。
致谢
我们非常感谢Sven Bolliger, Céline Cojean, Marc Le Bert, Giulia Ruzzante, Melanie Sachs, Devika Sanmugalingam, Grazyna Wieczorek和Anne Delanoye-Crespin的出色技术支持。我们感谢马特·巴特勒在实验和手稿方面的专家意见。
参考文献
脚注
MAKS、MP和JRM的贡献相当。
TJ, MC, J-PG和BR共同为高级作者。
调整通知这篇文章在Online First发布后已被更正。第四和第十作者从属关系已经更新。
贡献者分别对MAKS、MP、JRM、BF、NO、SN、KM、MB、LB、EL、TG、MLB、MC进行了实验。所有作者都参与了数据讨论。患者研究涉及LPB、GC和KM。ST KO小鼠由PGF提供。VQ, TJ, MC, JPG, BR设计并监督整个研究。TJ, MC, JPG, BR准备和编辑最终的手稿和图表。
资金这项研究得到了欧洲资助FEDER (M Chamaillard, V Quesniaux, B Ryffel)， Région北/加莱海峡(M Chamaillard)， Région中心和FRM过敏(V Quesniaux, B Ryffel)，法国癌症协会(' Equipe Labellisée Ligue 2009 ' to JP Girard)，癌症研究协会(' Programme ARC 2011 ' to JP Girard)和研究基金会Médicale (' Equipe FRM 2009 ' to M Chamaillard)的支持。
相互竞争的利益JRM, DS和TJ是诺华制药公司的员工。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
伦理批准在小鼠和人类身上进行的研究获得了任何必要的伦理委员会批准。