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文摘
客观的先进的和复发性疾病的主要原因是死于结肠癌。没有标准的临床前模型解决先进的疾病和自发的原位肿瘤生长转移。在这项研究中,作者报道这种标准化的建立原位结肠癌的小鼠模型及其在评估使用节拍器的topotecan单独或结合标准化疗。
设计人类结肠癌细胞系,转染人类绒毛膜促性腺激素和荧光素酶,是orthotopically注入严重联合免疫缺陷小鼠盲肠的墙,intrasplenically或皮下注射。辅助治疗,盲肠的切除术进行3 - 5周后癌细胞注入。化疗药物测试包括尿嘧啶/喃氟啶,叶酸,铂,topotecan、pazopanib和各种组合。
结果皮下肿瘤表现出夸张的敏感性治疗肿瘤生长延迟(p=0.002)和增加生存(p=0.0064),但是没有转移扩散。Intrasplenic细胞注射导致快速和广泛但出土文物转移没有治疗效果。Intracaecal细胞注射肿瘤以利率为87.5 -100%显示自发转移临床相关的利率。有节奏的topotecan明显继续生存和减少转移。在辅助设置,有节奏的维持疗法(FOLFOX-like感应之后)长期生存与车辆控制(p = 0.0003)相比,控制topotecan紧随其后(p = 0.0161)或FOLFOX-like治疗(p = 0.0003)。
结论精制原位移植技术被证明是转移和治疗的临床相关的模型研究。此外,有节奏的疗法与口服topotecan可能有前途的考虑转移性结肠癌的临床试验和长期辅助维持治疗结肠癌。
- 转移
- 原位移植
- 辅助治疗
- 癌症
- 腹部手术
- 结肠致癌作用
- 结直肠癌
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
局部复发和转移性疾病仍然是结肠癌死亡的主要原因。这可能是治疗结果的差距的一个主要因素,所以经常获得使用本地化,ectopically移植肿瘤模型与观察到的临床调查,明确强调改善临床前模型的必要性。
有节奏的环磷酰胺+尿嘧啶/喃氟啶被证明是非常有效的延长小鼠的生存人类先进的转移性乳腺癌(穆尼奥斯等。癌症Res2006;66年:3386 - 91)。类似与贝伐单抗疗法现在接受随机III期临床试验评价因其功效,因为它的最小的毒性报道在之前的二期临床试验(Dellapasua等。中华肿瘤防治杂志2008;26:4899 - 905http://www.clinicaltrials.gov,NCT01131195。
对结肠癌,节拍器的疗法的概念似乎是高度承诺和两个随机III期试验(CAIRO3和ACT2,http://www.clinicaltrials.gov;NCT 00442637和NCT 01229813)目前正在评估有节奏的维持疗法与口服5 -氟尿嘧啶前体药物卡培他滨,结合分子靶向治疗(贝伐单抗和埃罗替尼),前期标准后最大耐受剂量诱导治疗。
进一步揭示潜在有用的药物或药物组合有节奏的治疗结直肠腺癌因此平移癌症研究的一个重要领域。
本研究的意义
有什么新发现吗?
本研究提出了一种改进的,可再生的、原位和自发转移性结肠癌临床异种移植模型。转染肿瘤细胞的荧光素酶基因和β-human绒毛膜促性腺激素使体内非侵入性监测的主要增长和定期转移。盲肠的切除术,结合成像,使承担辅助治疗研究。
比较新的原位模型与现有的结肠癌临床前模型,结果表明,皮下肿瘤显示夸大了对治疗的敏感性,但没有转移扩散。Intrasplenic细胞注射导致快速和广泛但出土文物转移没有治疗效果。Intracaecal细胞注入显示自发转移临床相关的利率。
在原位模型中,有节奏的topotecan显著延长生存和减少转移性传播主要和辅助治疗协议。
首次显示,有节奏的疗法与口服topotecan可能希望考虑先进的转移性结肠癌的临床试验,并为长期辅助FOLFOX感应后维持治疗。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
使用改良原位intracaecal细胞植入模型可以改善和促进临床治疗结果翻译成适当的临床试验设计和,因此,更成功的结果。
几个可能的二期临床试验测试有节奏的口腔topotecan结肠癌建议。
介绍
结直肠腺癌(CRC)是全球第二个最常见的癌症。1尽管绝大多数(85%)的CRC患者最初在发达国家可以接受治疗局部切除,2死亡的主要原因是局部复发和转移性疾病。因此,辅助治疗和治疗晚期转移性疾病在CRC是两个至关重要的领域的研究。百分之六十的CRC患者转移发生在肝脏,和高达35%的转移只在这个器官。3虽然手术治疗结直肠肝转移发生了巨大的进步在过去的几年中,4非手术方法仍在发展。例如,标准的新辅助,或转换肝切除治疗方案之前,需要建立,辅助治疗后肝切除和最佳的肝脏特异性化疗。
”有节奏的“化疗通常指低(er)对常规化疗剂量管理密切(通常是每天)在长时间间隔没有无毒的间隔。有节奏的疗法的作用机制包括抑制tumour-angiogenesis、抗癌细胞毒性t细胞免疫反应的刺激,抑制低氧诱导因子- 1α,直接肿瘤细胞靶向作用,也许包括癌症干细胞,诱导肿瘤休眠。5 - 8关于儿童权利公约,两个随机III期试验(CAIRO3 ACT2,http://www.clinicaltrials.gov;NCT 00442637, NCT 01229813)目前正在评估有节奏的维持疗法与口服5 -氟尿嘧啶(研究者用)前体药物卡培他滨,结合分子靶向治疗(使用贝伐单抗或埃罗替尼),以下标准最大耐受剂量(MTD)诱导治疗。发现其他潜在的有前景的药物或药物组合CRC节拍器的疗法的平移癌症研究的一个重要领域。
嘧啶类似物研究者用和topoisomerase-inhibitor伊立替康是两个批准药物用于传统的CRC MTD治疗。虽然两个研究者用口服高活性化合物(尿嘧啶/喃氟啶(UFT)和卡培他滨)是CRC的批准MTD治疗,静脉注射伊立替康是管理,因此不适合频繁的节拍器的管理。然而,口头的可用性topoisomerase-inhibitor topotecan,9还有两个非常鼓励研究结合有节奏的topotecan pazopanib在晚期卵巢癌的临床前模型,10,11建议口服topotecan可能是一个理想的候选人有节奏的CRC的疗法。
临床前CRC治疗对小鼠的研究大多使用本地化执行,ectopically植入(皮下)原发性肿瘤。12 - 14研究转移性疾病,研究人员经常使用所谓的实验性转移模型通过注入CRC细胞intraveneously intrasplenically或直接进入二级网站(如肝脏、腹膜)。15 - 17日之间的主要差异经常观察到鼓励和随后的临床治疗结果,更令人印象深刻的还是消极的临床试验结果。18只有很少的调查人员使用原位肿瘤细胞注射到盲肠的墙。19到24很可能的一个原因失败的大多数其他调查人员定期使用intracaecal肿瘤细胞注射是许多技术障碍可以妥协的成功建立一个原位模型。目前迫切需要开发一种改进的,可靠的方法来增加这些模型在临床前研究的常规使用。18,25
在这项研究中,我们提出一个详细描述的技术建立原位intracaecal注入CRC细胞一起,第一次彻底cross-comparison与现有三个人类CRC的异种移植模型。然后,我们使用原位模型评估的有效性有节奏的UFT, topotecan,,因为靶向治疗(例如,使用贝伐单抗、西妥昔单抗)的单克隆抗体是标准治疗转移性CRC的一部分,26口服抗血管生成目标代理,pazopanib。Pazopanib目标血管内皮生长因子(VEGF)受体,血小板源生长因子受体(PDGFR)和c - kit。27,28UFT的结合,口服topotecan和pazopanib使我们能够评估一个节拍器的多重regimen-composed完全的口头具有生物可利用性药物。据我们所知,这是第一次这样一项研究进行了功能型原位和辅助设置。我们表明,有节奏的topotecan显著延长生存和减少转移。此外,这个方案可以继续每日不间断28周无明显毒性的迹象。
方法
细胞系
人类结肠癌细胞系HT29最初请提供Laferte博士(萨斯喀彻温省大学),HCT116请提供了福格斯坦博士(约翰霍普金斯大学)。细胞被维护在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)和10%胎牛血清(Hyclone)。细胞系转染了萤火虫荧光素酶向量和hCG。皮雷向量描述。29日,30.六个克隆,高度表达的标记,都是汇集每个细胞株和用于实验。
动物
女性CB17重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠(查尔斯河,魁北克,加拿大),6周岁。程序依法进行指导新宁研究所动物保护委员会(动物协议10 - 268)认可的加拿大委员会动物保健。
体内监测
β-Human绒毛膜促性腺激素(β-hCG)水平在鼠标尿液评估每周如前所述。30.,31日生物荧光成像,小鼠腹腔注射150毫克/公斤的荧光素(卡尺生命科学,MA),并且按照制造商的建议与成像相机使用IVIS200面临的肿瘤(卡尺生命科学)。
肿瘤移植
细胞分离胰蛋白酶,洗一次血清DMEM和在无血清DMEM两次,并在DMEM re-suspended到所需的浓度。所有的动物接受肿瘤细胞注射注射相同数量的肿瘤细胞(050万;皮下,intrasplenic或intracaecal)。
皮下异位移植的肿瘤细胞
肿瘤细胞编号5×105(100μl)皮下注入SCID小鼠。肿瘤尺寸用游标卡尺测量肿瘤体积计算宽度2×长度/ 2。端点是1700毫米3。
原位(intracaecal)植入肿瘤碎片
供体小鼠的皮下肿瘤细胞植入。当肿瘤大小达到100毫米3无菌取出,转移到冰冷的DMEM,切成1毫米3份碎片。在受体小鼠腹部访问通过一个1厘米下腹部的皮肤和腹膜壁incison中线。盲肠轻轻地将器官由腹取出。肿瘤碎片被缝合到盲肠的墙。盲肠是返回到腹腔、腹膜和皮肤封闭运行缝合线和伤口剪辑。
原位(intra-caecal)注入肿瘤细胞
注入技术首次建立了注射台盼蓝到盲肠的墙(图1一个)。进入盲肠是如上所述。盲肠放在手术刀持有人,夷为平地,稳定钳(图1 b)。这个策略是至关重要的防止泄漏的肿瘤细胞进入盲肠的腔或腹腔。一卷5μl (5×105细胞)注入到盲肠的墙下4×放大,使用10μl汉密尔顿注射器和30 g针。盲肠是返回到腹膜腔;腹膜和皮肤如上所述。
(一)注射技术建立了注射台盼蓝进入盲肠的墙(切除部分显示在培养皿)。(B)接触盲肠的原位注射;成功intra-caecal细胞注入,盲肠被手术刀夹,钳夷为平地,稳定。(C)体内监控:量化生物发光,(D)ß-human绒毛膜促性腺激素(ß-hCG)分泌尿液中。(E)皮下肿瘤大小。(F)的生存曲线。cc,盲肠的细胞植入;cc-t,盲肠的细胞植入+治疗;ct、盲肠的组织移植;ct-t,盲肠的组织植入+治疗; is, intrasplenic cell implantation; is-t, intrasplenic cell implantation plus treatment.
异位(intrasplenic)注入肿瘤细胞和脾切除术
腹部通过左肋下访问了皮肤和腹膜壁切口。脾脏是轻轻地将器官由腹取出。肿瘤细胞编号5×105(5μl) 10μl汉密尔顿注射器和注射30 g针。针慢慢收回,注射部位与湿棉签压以防止泄漏。脾脏是返回到腹膜腔;腹膜和皮肤如上所述。
在一些动物,脾切除术后进行1分钟intrasplenic注入。门血管的结扎了4/0合成吸收性缝线和脾脏摘除使用烧灼(细科学工具,福斯特城,CA)。
肿瘤切除术
为辅助模型,主要的肿瘤切除术进行3 - 7周后肿瘤细胞注入。的盲肠结扎与合成吸收性缝线和切除(见4/0图2)。解剖网站与碘擦洗。
辅助治疗模式。(A)生物荧光监测作为非侵入性的证明成功完成肿瘤得到尊重。(B)的盲肠切除:盲肠结扎与4/0合成吸收性缝线和切除。完成肿瘤切除(C))染色显示肿瘤的切除盲肠包括(*)。(D)量化生物发光。(E)ß-human绒毛膜促性腺激素的水平。(F)尸体剖检:肿瘤细胞植入9周后,局部复发导致肠道阻塞(*)和多发性肝转移被发现。
药物和治疗计划
Topotecan pazopanib从葛兰素史克。UFT得到Taiho制药有限公司(日本东京)。Pazopanib, topotecan和UFT填喂法每日150毫克/公斤,1毫克/公斤,15毫克/公斤,分别。叶酸和铂从机构药房购买。UFT、叶酸和铂从今以后会提到“FOLFOX-like”。动物用这种疗法治疗收到每日15毫克/公斤UFT填喂法和4毫克/公斤叶酸和腹腔内注射10毫克/公斤每隔一周铂。铂后停止三个注射防止主机毒性。控制动物收到填喂法hydroxypropylmethyl纤维素和0.1%的注射生理盐水。端点标准体重20%,肠阻塞或腹水的发展。原发性肿瘤和器官解剖,称重,分析了生物发光和福尔马林固定的。
免疫组织化学
疣状对人类Ki67 formalin-fixed组织使用标准协议进行识别肝和肺微转移部分连续削减100μm间隔。对于微转移的器官,四个或更少的部分检测转移是必要的。器官没有转移的八个部分被定义为被发表。盲肠的部分是他走时染色验证完成肿瘤切除的辅助模型。部分分析了100×放大在亮场条件下用蔡司Axioplan 2显微镜。照片是用蔡司Axiocam相机连接到显微镜使用AxioVision V.3.0软件。肺和肝转移的程度和规模评估每大功率领域转移覆盖组织的比例使用ImageJ64软件(100×放大)。
统计分析
报告结果的均值和SE的意思。统计学意义是由方差分析评估(方差分析)。生成的kaplan - meier生存曲线和意义的日志等级评估测试。统计数据生成使用GraphPad Prism 4.00 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。水平的意义p < 0.05。
实验设计
(1)五个老鼠注射台盼蓝溶液进入盲肠的墙,以确定最优技术和注射体积。(2)32老鼠intracaecally植入HT29.hCG。卢克,HCT116.hCG。卢克,SW620.hCG。luc or CaCo2.hCG.Luc (n=8) to determine tumour take rate and metastatic potential. (3) Forty mice received HT29.hCG.Luc cells/tumour fragments (n=10): (i) subcutaneous injection, (ii) intrasplenic injection, (iii) intracaecal injection and (iv) orthotopic tumour fragment implantation. Seven days after tumour injection, drug-treatment with UFT, folinic acid and oxaliplatin, or vehicle treatment was initiated (n=5/group respectively). Abbreviations are as follows: sc = subcutaneous cell implantation, sc-t = subcutaneous cell implantation plus treatment, cc = caecal cell implantation, cc-t = caecal cell implantation plus treatment, ct = caecal tissue implantation, ct-t = caecal tissue implantation plus treatment, is = intrasplenic cell implantation, is-t = intrasplenic cell implantation plus treatment. (4) To determine whether selecting hCG/luciferase positive clones had an influence on tumour growth and metastasis, and to evaluate the impact of splenectomy after intrasplenic injection of tumour cells, 20 mice were injected with parental HT29 colon cancer cells as follows (n=5): (i) orthotopic intracaecal injection, (ii) orthotopic implantation of a tumour fragment, (iii) intrasplenic injection and (iv) intrasplenic injection followed by splenectomy. (5) Eighteen mice were injected intracaecally with HT29.hCG.Luc cells. The primary tumour was resected at different time-points. Animals were monitored for completeness of resection and scored for primary tumour regrowth and metastasis. (6) Twelve mice were intracaecally implanted with HT29.hCG.Luc cells. After 1 week, treatment with control vehicle, topotecan or topotecan + pazopanib was begun (n=4). Animals were sacrificed after 10 weeks and analysed for primary tumour weight and metastatic spread. (7) Forty-two mice were intracaecally implanted with HT29.hCG.Luc cells. After 1 week, treatment with (i) control vehicle, (ii) UFT, (iii) topotecan, (iv) pazopanib, (v) UFT plus topotecan, (vi) UFT plus pazopanib, (vii) topotecan plus pazopanib or (viii) UFT plus topotecan plus pazopanib (n=5–6) was started. Animals were sacrificed when they reached endpoint criteria. (8) Thirty-one mice were intracaecally implanted with HCT116.hCG.Luc cells. After 2 weeks, treatment with (i) control vehicle, (ii) FOLFOX-like, (iii) topotecan, (iv) topotecan plus pazopanib, (v) FOLFOX-like plus topotecan, (vi) FOLFOX-like plus pazopanib and (vii) FOLFOX-like plus topotecan plus pazopanib (n=4-5) was started. Animals were sacrificed when they reached endpoint criteria. (9) Twenty-eight mice were intracaecally implanted with HT29.hCG.Luc cells. Primary tumours were removed when bioluminescence levels reached 0.5×106光子/ s。1周后,小鼠收到控制车辆或FOLFOX-like治疗3周(n = 14)。然后,老鼠被随机在各自组继续前面的治疗或者切换到有节奏的口腔topotecan维持治疗。因此,组织如下:(i) control-control, (ii) control-topotecan, (iii) FOLFOX-like-FOLFOX-like和(iv) FOLFOX-like-topotecan (n = 7)。
结果
建立一个intracaecal CRC的原位模型
最初,注入技术建立了使用注射台盼蓝(图1一个)。注射太深时,染料稀释了肠内容。太肤浅的注入导致腹膜泄漏。注入量超过5μl增加泄漏的风险。当小心翼翼地将微型注射器插入夷为平地,稳定盲肠的墙使用显微镜,起泡盲肠的墙内可以观察到作为质量控制的注射技术。(图1 b)。肿瘤采取率在87.5 - -100%可再生的细胞系。自发转移淋巴结、肝、肺和腹膜后16周内注入。
肿瘤生长的比较,对治疗的反应和生存
生物发光和β-hCG量化方法监测肿瘤负担。这些代理肿瘤标记物的相对水平与肿瘤负担。32,33生物荧光成像每周进行。在线补充图1显示了两个动物每隔一周每组的代表。量化生物发光和β-hCG所示图1 c, D卡尺测量皮下肿瘤图1 e。治疗耐受良好的模型,而且没有出现明显的中毒的迹象,也没有减肥。
皮下肿瘤细胞注射后,荧光素信号保持局部注射部位。周4和9我们观察到显著的增长在药物治疗而延误vehicle-treated小鼠(p = 0.002和0.018,图1 e)。
intracaecal细胞注射后,动物表现出明显缓慢增加生物荧光相比其他组(p<0.05,图1 c)。明显的抗肿瘤治疗疗效非常明显显著减少(p=0.0021)比vehicle-treated动物生物发光。分析β-hCG水平证实了这些发现图1 d)。然而,由于高SEsβ-hCG结果,观察到的治疗效果并不显著(p=0.2659)。
原位移植后肿瘤碎片,没有治疗效果可以通过生物荧光显示或β-hCG分析。相比之下,有一天intrasplenic注射后,荧光信号明显在左上象限(脾的位置),在右上象限(肝脏的位置)。这样一个快速本地化embolisation肝脏只能解释,而不是一个真正的自发转移的过程。没有观察到显著的治疗效果。
生存曲线所示图1 f。Therapy-treated动物皮下肿瘤(sc)显示一个更长的生存比vehicle-treated控件(sc 54天,正中皮下肿瘤(sc-t) +治疗74天,p=0.0064)。其他组没有表现出显著的治疗效益对生存(cc vs cc-t p=0.1945,ct vs cc-t p=0.489,是vs是t p=0.8188)。小鼠盲肠的细胞植入生活大大延长(平均86.5天)比皮下细胞植入(平均54天,p=0.0049),intrasplenic细胞植入(平均43天,p=0.0045),或原位肿瘤片段植入(平均57天,p=0.0047)。
转移能力的评估
转移的频率在每个模型评估了三种方法:验尸,生物荧光成像的各个器官和免疫组织化学(图3)。皮下注射癌细胞后,主要生长在所有动物,但没有观察到宏观或微观转移明显(图3一)。端点肿瘤重量无显著差异(p=0.1457)治疗与对照组(在线补充图2)。
后期的评估。(一)生物荧光的评价转移。治疗转移性传播intracaecal肿瘤细胞注射后减少。(B)代表照片后盲肠的肿瘤片段植入后,(C) intrasplenic细胞注入。(D)转移的微观量化Ki67 /苏木精染色后,100×放大。肺和肝脏转移筛查。没有发现转移小鼠皮下肿瘤。盲肠的细胞植入后,100%的肝和肺转移发生率在vehicle-treated动物而被发现只有50%的FOLFOX-like对待动物显示肺转移。盲肠的肿瘤片段植入后,肝和肺转移没有治疗效果的检测。intrasplenic注射后,大规模的观察和难治性“转移”。 Characteristic pictures are shown in (E) (untreated animals). (F) (treated animals). Refer to图1和文本细节的缩写。
intracaecal肿瘤细胞注射后,尸体剖检和生物荧光分析显示更少的药物治疗动物转移而vehicle-treated动物(图3一)。微观分析显示肺内微少在对待动物而vehicle-treated动物(图3 d-f)。各治疗肝内微观察,vehicle-treated老鼠。然而,肺和肝转移人数较少(p=0.028和0.038),肝转移规模较小(p=0.017)与vehicle-treated动物相比,药物治疗(在线补充图2 a, B, C)。
肿瘤片段植入后,尸体剖检和生物荧光分析显示更少的药物治疗小鼠转移而vehicle-treated老鼠(图3一)。代表解剖和生物发光图像所示图3 b。无明显影响治疗的肝或肺的大小或结果(图3和在线补充图2 a, B, D)。
intrasplenic模型,广泛的肝和肺转移和腹水观察,并没有治疗效果观察转移的数量或大小(图3和在线补充图2 a, B, E)。肝转移的数量不能评估在这个模型中,因为转移往往是普遍的在整个器官。脾肿瘤重量大大超过脾脏的老鼠在其他模型(p<0.01,数据未显示)。由于广泛的肝转移、肝脏重量高于所有其他模型(p < 0.05,数据未显示)。代表图像和生物荧光所示图3 c。
选择和脾切除术的影响
与HT29.hCG观察。luc-injected animals, mice receiving intracaecal cell implantations of parental HT29 cells lived significantly longer (median 80 days) than animals receiving caecal tumour fragment implantation, intrasplenic tumour cell injection or intrasplenic injection followed by splenectomy (median 60, 45, and 58 days, p<0.003,看到在线补充图3 a, B)。相对所有组的生存与HT29.hCG类似于观察。Luc细胞。重要的是,动物的生存收到脾切除术没有明显不同于intrasplenic注入标记(p=0.1268)或未加标签的(p=0.2764)肿瘤细胞没有脾切除术。
宏观和微观分析表明,肝和肺转移发生在相同的频率与HT29.hCG观察。Luc细胞。动物接受脾切除术显示出了相似的分布模式和肿瘤转移的负担与小鼠相比没有经历了脾切除术(数据没有显示)。
建立一个可切除的CRC模型辅助治疗研究
盲肠的切除术进行3 - 7周后原位intracaecal HT29.hCG注入。Luc细胞。周3和5之间的手术导致完整切除术的主要肿瘤(即发表手术部位边缘肿瘤细胞切除和生物发光和β-hCG信号的损失)。相比之下,在之后的时间点行不完整。执行一个完整的切除的可行性与相对生物荧光数据。肿瘤的生物发光阅读5×106光子/秒或更少可能完全切除。相对β-hCG水平在肿瘤生长的早期阶段太低可靠作为生物标志物手术的最佳时机。一个代表性的例子所示图2。9周后肿瘤细胞植入,这种动物显示局部复发造成肠阻塞和广泛的肝转移(图2 f)。基于这些发现,九个小白鼠注射orthotopically HT29.hCG。luc cells, and the primary tumours were resected when the bioluminescence signal reached 4.5×106光子/ s。三个老鼠(33%)开发metachronous肝脏和肺转移,五个老鼠发达腹膜和淋巴结转移(56%)和六个老鼠(67%)开发本地回春术。三个老鼠(33%)被删除的主要肿瘤治愈。
短期评价topotecan topotecan + pazopanib
十二个老鼠intracaecally植入HT29.hCG。luc and treated with control vehicle, topotecan or combined topotecan plus pazopanib (n=4). Animals were sacrificed after 10 weeks. Both topotecan and the topotecan plus pazopanib combination produced significantly smaller primary tumours than vehicle-treated controls (p=0.0276 and 0.0022,图4一)。联合治疗显示了肿瘤生长与topotecan单药治疗相比,但这尚不具备统计学意义(p = 0.1467)。尸体剖检和生物荧光分析显示,三四个控制老鼠广泛肝转移(图4 b),而没有发现肝转移的治疗的动物。此外,淋巴结和腹膜转移治疗动物的减少。
评价口服有节奏的topotecan(威尼斯平底渔船)。十二个老鼠orthotopically注射HT29人类结肠癌细胞和治疗控制车辆,topotecan或者topotecan + pazopanib (pazo) (n = 4)。10周后小鼠牺牲。主要的肿瘤重量转移扩散(A)和(B)被topotecan mono -或联合治疗显著降低。绿色箭头表示肝转移
HT29.hCG的长期治疗。Luc原位肿瘤:in vivo monitoring and survival
42老鼠intracaecally植入HT29.hCG。Luc细胞。一周后,肿瘤负担由生物荧光分析,小鼠随机分成以下组的日常口腔治疗:(1)控制车辆,(2)UFT, (3) topotecan, pazopanib (4), (5) UFT + topotecan, (6) UFT + pazopanib, (7) topotecan + pazopanib,或(8)UFT + topotecan + pazopanib。所有组有5个老鼠,除了组织UFT + topotecan和UFT + pazopanib都有六个老鼠。有节奏的UFT或pazopanib孤单,这两种药物的组合没有延迟的增加生物荧光信号与控制(相比图5)。相比之下,所有组治疗方案包含topotecan显示延迟发光的增加。动物对待topotecan, topotecan加上pazopanib UFT + topotecan + pazopanib显示显著降低信号在第一次治疗12周,与所有其他组(p < 0.05,请参阅图6)。其中三个topotecan-based方案,在生物荧光观察无显著差异。这些结果证实了量化的分泌β-hCG老鼠尿,这是仅在动物topotecan处理,降低topotecan加上pazopanib UFT + topotecan + pazopanib第一次治疗10周期间,与所有其他组(p < 0.05,图6 b)。没有任何方案产生的迹象明显的毒性或减肥(图6 c)。
原位HT29.hCG体内生物发光的监控。Luc肿瘤。所有组处理topotecan mono -或联合治疗显示缓慢增加生物发光信号。pazo pazopanib;威尼斯平底渔船,topotecan;UFT,尿嘧啶/喃氟啶。
原位HT29.hCG体内的监控。Luc肿瘤。生物荧光分析(A) (B)ß-human绒毛膜促性腺激素(ß-hCG)分泌尿液中,(C)体重。生存曲线及其统计分析D和E所示面板包括p值(左下侧)和生存中值(右上角)。灰色框包含结果不被认为是重要的。pazo pazopanib;威尼斯平底渔船,topotecan;UFT,尿嘧啶/喃氟啶。
控制动物的生存中值是77天后肿瘤植入。独自生存显著延长动物对待topotecan(133天,p = 0.0015), topotecan + pazopanib(135天,p = 0.0160)和UFT + topotecan + pazopanib (p = 0.0015, 148天图6 d, E)。无显著差异在生存之间观察到这些治疗方案。动物对待UFT孤独,独自pazopanib, UFT + topotecan UFT + pazopanib,显示与控制相比,生存没有区别。
HT29.hCG的长期治疗。Luc原位肿瘤:postmortem analysis
验尸结果和肝单一器官生物荧光所示图7 a, B。所有控制动物有淋巴结转移,四个,五个老鼠广泛肝、膈腹膜转移。两个控制老鼠还显示肺转移和恶性腹水。所有治疗组接受topotecan (mono -或联合治疗)显示减少转移。这个结果是最为明显的肝转移:21老鼠控制车辆或处理方案缺乏topotecan, 15(= 71%)小鼠肝脏转移。相比之下,治疗的21个鼠topotecan (mono -或联合疗法),只有四只老鼠(= 19%)显示肝转移。肝脏是人类Ki67石蜡包埋和染色。量化的数量每部分的平均直径和肝内微转移所示图7 c, D。控制老鼠的平均6.1±1.1每部分转移。这是动物治疗显著降低topotecan (0.33±0.31, p = 0.0002), UFT (1.9±0.8, p = 0.007), UFT + topotecan (1.75±0.57, p = 0.0016), UFT + pazopanib (1.64±0.73, p = 0.0033), pazopanib + topotecan (2±0.87, p = 0.01),和UFT + pazopanib + topotecan (1.75±0.88, p = 0.01)。老鼠接受pazopanib独自没有显示显著减少肝转移的发生率比对照组(5.09±1.35,p = 0.59)。
死后的尸体剖检和single-organ生物发光分析的转移扩散。Topotecan显著降低转移性传播(A),在肝脏(B)最为显著。微观量化的数量每部分肝转移,转移的平均直径所示面板C和d . pazo pazopanib;威尼斯平底渔船,topotecan;UFT,尿嘧啶/喃氟啶。
所有肝转移经组织学证实,平均大小进行了分析。只老鼠topotecan-containing疗法治疗显示减少与控制。肝转移控制小鼠平均直径为2338±959μm。确认我们的尸体剖检和生物荧光数据,只有一个治疗的五鼠topotecan微转移。这些转移平均直径50±5μm。肝肝转移的规模也减少动物对待UFT + topotecan(314±146μm), pazopanib + topotecan(67±12μm),和UFT + pazopanib + topotecan(50±5μm)。在一些组织中,只有一个动物显示肝转移;因此,统计分析不能确定肝转移的规模。
确认我们的治疗结果在第二个结肠癌细胞系,老鼠intracaecally植入HCT116.hCG。Luc细胞。这里,UFT单一疗法和UFT组合疗法取代UFT-based FOLFOX-like方案(见在线补充结果和补充图4和图5)。
HT29.hCG的术后辅助治疗。Luc原位肿瘤
28老鼠intracaecally植入HT29.hCG。Luc细胞。原发性肿瘤被删除时,生物荧光水平达到0.5×106光子/ s(即肿瘤植入后3 - 5周)。伤口愈合时稳定在切除术后1周,12个动物发展循环生物发光信号和随机接受控制车辆或FOLFOX-like治疗3周(n = 14)。老鼠被随机再次各自组内生物发光信号继续前面的治疗或者切换到口腔有节奏的topotecan维持治疗(在线补充图6)。控制动物的生存中值是46天后肿瘤切除。动物生存显著延长治疗FOLFOX-like治疗topotecan紧随其后(74天,p = 0.0003),也显著长于动物对待有节奏的topotecan之前控制车辆治疗后(56天,p = 0.0073)或持续FOLFOX-like疗法(46天,p = 0.0003,在线补充图6 b)。相比之下,治疗持续FOLFOX-like治疗和控制车辆后面跟着节拍器的topotecan未能达到意义与对照组(p = 0.6381, p = 0.2812)。
再一次,治疗组接受有节奏的topotecan显示减少转移扩散,这个结果是最为明显对肝转移:共14老鼠没有topotecan控制车辆或处理方案,10(= 71%)小鼠肝脏转移。相比之下,只有四个14的老鼠(= 29%)有节奏的处理topotecan-containing治疗显示肝转移(在线补充图6 c)。
讨论
在目前的研究中,我们建立了一个可再生的、标准化和提高结肠癌原位人类异种移植模型。转染肿瘤细胞的荧光素酶基因和β-hCG使体内定期监测原位intracaecal肿瘤细胞注射后,被证明是一个优秀的标记肿瘤切除/ resectability的完整性。在我们的研究的第一部分,我们严格cross-compared精制原位模型使用的更频繁的CRC的临床前模型。皮下(异位)注入人类结肠癌细胞成裸体和SCID小鼠建立方便、肿瘤生长可以通过卡尺测量和监控端点定义为肿瘤大小,达到在一个合理的时间框架。我们显示出重要的肿瘤生长延迟,一个重要的生存利益在药物治疗和vehicle-treated动物皮下肿瘤。相比之下,验尸没有显示意义的差异肿瘤大小或重量。小鼠皮下tumour-bearing没有显示症状恶化,端点在这里定义根据我们的动物保健指南最大肿瘤大小的1700毫米3。控制动物早到达终点,但肿瘤治疗的老鼠最终达到相同的肿瘤大小。皮下细胞注射HT29细胞并没有导致转移,也不引起临床障碍。类似于我们的研究中,许多其他临床前药物检测的研究已经成功地使用这种皮下执行模型。12 - 14然而,许多这些高度令人鼓舞的结果很少产生效益在诊所,当他们这样做,他们往往更令人印象深刻的结果。
Intrasplenic肿瘤细胞注射导致肿瘤细胞的快速定殖在肝脏和肺。生物荧光成像显示,甚至只要一天细胞注射后,明确肝信号可以被探测到,这显然不能将真实的自发转移的发展。老鼠屈服于广泛的肿瘤负担在几周内。也许并不奇怪,没有治疗功效观察转移在这种极其积极的生长条件。
原位肿瘤细胞注射到盲肠的墙是一个更复杂的过程,需要一定的技巧和适当的技术设备。我们这里显示首次intracaecal肿瘤细胞注射可以执行地肿瘤采取率高为87.5 -100%。药物治疗的动物intracaecal肿瘤细胞植入显示显著减少的生物发光和减少转移而vehicle-treated动物。因此,我们认为该模型作为分析的临床相关的治疗方案在接下来的实验。可能是生存的一个关键方面对待动物没有显著不同于vehicle-treated老鼠因为生存受到肠道阻塞。因此,生存分析在这个模型是一个标记为治疗原发性肿瘤的影响,而端点分析是必要的标记为治疗转移性传播的影响。
我们还应用第二个原位CRC模型在皮下肿瘤生长片段是缝合的盲肠的墙。没有观察到显著的治疗效益治疗小鼠相比vehicle-treated老鼠。所示图3 b肿瘤的片段,主要生长在盲肠的墙的外面,进入腹腔。加之较短生存,给肿瘤更少的时间入侵宿主组织和发起转移。然而,这个模型被证明是本地入侵到盲肠的墙和生产转移到遥远的器官如前所述。19,34该模型的进一步分析需要确定其临床意义。
目前,成千上万的患者进入临床三期试验测试新疗法包括使用分子靶向药物治疗的辅助设置。最近宣布的前两个临床三期试验测试结果辅助贝伐单抗的好处是令人失望的(NSABP-C-08和旅行车)。35-37这些结果提出许多问题。这些失败的原因是什么?可以生物标志物识别子组,然而,受益于辅助靶向治疗?在这方面,我们在座的一个潜在的有前途的CRC辅助治疗临床前模型的研究。在我们的模型中,可以执行的主要肿瘤完整切除肿瘤细胞注射后定义的时间内,在定义的范围内的生物发光信号。肿瘤复发和转移性传播可以监测体内。metachronous肝转移的速度被证明是在同一范围的公布价格metachronous CRC患者肝转移。38这些临床相关的发现在后续实验中使我们检查的影响各种有节奏的原发性肿瘤微转移的辅助疗法。
节拍器的疗法的概念可能会非常有前途的CRC患者的辅助治疗和治疗转移性CRC失败后的标准治疗。许多有节奏的化疗方案产生最小的毒性和可长期。39,40另外,有节奏的治疗有时是积极反对chemoresistant肿瘤。41作为第一个翻译有节奏的化疗从基础研究到临床应用的例子,我们最近报道,有节奏的环磷酰胺+ UFT非常有效地延长小鼠的生存人类先进的转移性乳腺癌。42类似的方案与卡培他滨+环磷酰胺联合贝伐单抗现在接受随机III期临床试验评价,因为这种疗法的疗效报道在之前的二期临床试验中,43因为它的最小毒性有关,43和http://www.clinicaltrials.gov,NCT01131195。
临床前研究结肠癌治疗有节奏的伊立替康显示减少结肠癌细胞和内皮细胞体外增殖和减少HT29皮下异种移植的增长。44在第一个药理临床二期试验中,进行预处理和chemoresistant CRC患者接受有节奏的伊立替康,展示出了有前景的结果,包括等离子体浓度显著增加的血管生成抑制剂thrombospondin-I。41有趣的是,梅里特等我们都同时和独立报道优秀的抗肿瘤活性的有节奏的口腔topotecan卵巢癌的临床前模型。10,11此外,口腔有节奏的topotecan表明承诺活动在临床二期研究脑癌复发的童年。45这些结果表明,口腔有节奏的topotecan可能是一个潜在的有前途的治疗方案。在这项研究中,我们首次评估,临床治疗的结果口腔有节奏的topotecan CRC,使用改进的临床前模型我们开发。
我们最初的实验使用节拍器的topotecan显示显著的减少主要肿瘤的大小和转移扩散,口服后节拍器的topotecan管理。这使我们承担两个后续治疗实验使用人类HT29和HCT116模型。HT29细胞原位植入后,topotecan单一疗法和组合topotecan + pazopanib UFT + topotecan + pazopanib明显推迟肿瘤生长,延长生存和减少转移(特别是肝转移)。令人惊讶的是,topotecan结合有节奏的UFT没有显示一个等价的治疗中获益。这些结果可能与室外地滚球戏的研究一致等,有节奏的伊立替康,但不是有节奏的研究者用,或两者的结合药物和有节奏的铂,HT29和内皮细胞在体外的增殖。44我们的结果表明,口腔有节奏的topotecan CRC潜在的强有力的抗肿瘤活性,而且它可以输掉这场活动,再加上某些其它药物。MTD治疗联合疗法是标准的CRC,这凸显了需要彻底的临床前和临床前药理分析测试有节奏的疗法。
在标准MTD(1.5毫克/米2每21天/ d 5天),topotecan表明只有较小的抗肿瘤活性和相当大的毒性CRC的二期临床试验。46-48然而,我们的研究结果表明topotecan的可能性,鉴于稳步,也就是说,在低剂量更频繁,可能导致有效的抗肿瘤和anti-metastatic活动减少毒性。临床应用的有节奏的topotecan,事先确定一个适当的有节奏的剂量是必要的。我第一阶段试验解决这个问题已经完成在复发卵巢癌患者(http://www.clinicaltrials.govNCT00382733)。
肝转移的微观评价显示,所有组处理topotecan (mono -或联合治疗),但也有节奏的UFT独自UFT + pazopanib,减少肝微转移的数量与对照组相比。与肝内微的大小(减少被发现在所有topotecan-containing组,但不是UFT, pazopanib或UFT + pazopanib组),尸体剖检和生物荧光的结果,这表明有节奏的topotecan可能不会阻止转移过程的起始,但可能降低微转移的后续发展。这些结果是高度转化,局部的CRC肝转移可以在30%的情况下成功地切除。4前三期临床试验的结果metronomic-like方案UFT日常管理2年早期非小细胞肺癌和乳腺癌患者临床好处无病生存。39,40我们的研究结果表明类似的好处可能不会达到早期CRC患者。
我们测试了HCT116模型中相同的治疗,也就是说,衍生出来的一个独立CRC细胞系。包含口头topotecan所有组治疗方案,再一次,显示生物荧光显著延迟增加,长期生存,和减少转移。
与我们的结果相比,在卵巢癌其他人获得的结果,10,11co-treatment pazopanib没有增强抗肿瘤活性的有节奏的topotecan。Pazopanib已批准用于治疗晚期肾细胞癌,并承诺在二期临床试验的初步结果显示鼻咽癌,乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、非小细胞肺癌,胶质母细胞瘤和软组织肉瘤。27,49-54到目前为止,没有数据在CRC pazopanib的功效,虽然两个临床一期试验正在进行中(http://www.clinicaltrials.govNCT00387387和NCT00540943)。通过有针对性的生物制剂在CRC包括抗vegf抗体贝伐单抗,和抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)抗体西妥昔单抗和帕尼单抗。26虽然没有已知生物标志物预测成功的贝伐单抗治疗,k - b - raf变异作为生物标志物EGFR抑制情况。在我们的研究中使用的细胞系有k - ras基因突变(HCT116)或b - raf (HT29)。55然而,最近的出版物表明pazopanib充当“pan-Raf-inhibitor”,抑制野生型和k - b - raf乳腺癌细胞突变。56
我们的佐剂的研究显示,有节奏的topotecan维护FOLFOX-like诱导治疗后增加生存与控制车辆治疗相比,topotecan维护控制车辆治疗后或继续FOLFOX-like疗法。Topotecan维护跟踪控制车辆治疗没有任何好处的生存或减少转移扩散,这可能不是奇怪的3周没有药物治疗和总生存切除后56天,令人惊讶的是,Folfox-like单独治疗也没有改善生存。然而,随着网上讨论的补充材料,模仿FOLFOX功能型老鼠很复杂,例如,铂治疗必须停止后只有三个剂量,避免过度的毒性。抑制转移性传播的节拍器的topotecan在我们的辅助模型明显不如在主要原位肿瘤模型中,这可能是与我们的假设一致,那有节奏的topotecan并不阻止微小转移的开始(在这个模型中,在治疗开始前发生),而是可以减少转移的后续发展。如果是这样的话,这将转化为延长总生存期次辅助设置。
总之,我们提供一个可复制的,标准化的原位人类结肠癌的异种移植模型。我们的治疗结果显示,第一次,有节奏的疗法与口服topotecan可能承诺考虑先进的转移性结肠癌的临床试验,并为长期辅助FOLFOX感应后维持治疗。我们建议三种可能的二期临床试验测试有节奏的口头topotecan(1)转移性结肠癌失败之后的多重线标准疗法和最好的支持性护理相比,(2)在维持治疗转移性结肠癌和观察成功后(即稳定的疾病,部分反应,或完全缓解)标准的一线治疗,直到疾病进展和介绍的二线治疗和(3)佐剂在第三阶段CRC患者维持治疗和观察之前标准FOLFOX疗法。
确认
我们感谢程卡桑德拉她优秀的秘书协助。
引用
补充材料
脚注
资金本研究是R S Kerbel赠款支持来自美国国立卫生研究院、美国(ca - 41233),安大略癌症研究所和葛兰素史克公司赞助的研究协议,美国费城。RSK持有一级加拿大研究主席在肿瘤生物学、血管生成和抗血管新生治疗。CH被研究奖学金支持德意志Forschungsgemeinschaft(德国研究基金会)。厘米由安大略研究和创新支持博士后奖学金,妇女在科学研究优秀奖学金(欧莱雅加拿大和加拿大佣金为联合国教科文组织)和2010年的布伦达·M·威廉姆斯年轻调查员奖。
相互竞争的利益RSK Taiho药品顾问,日本、美国和葛兰素史克。他收到资金使用口服topotecan和pazopanib葛兰素史克进行研究。CH、SM、GF,厘米,PX没有利益冲突。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。