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背景和目的纤维化和慢性胰腺炎是一个不可逆转的损伤,可以破坏胰腺外分泌和内分泌功能。目前,还没有批准治疗这种疾病。我们先前表明,siRNA反对collagen-specific gp46伴护蛋白质,维生素耦合封装在脂质体(VA-lip-siRNAgp46),解决了肝硬化的肝纤维化模型中。这种治疗是追究胰腺纤维化引起dibutyltin二氯化(DBTC)和cerulein老鼠。
方法特定吸收VA-lip-siRNAgp46共轭,6′-carboxyfluorescein (FAM)激活胰腺星状细胞(aPSCs),分析了荧光激活细胞分类(流式细胞仪)。细胞内的分布VA-lip-siRNAgp46-FAM被荧光显微镜检查。抑制gp46表达式的VA-lip-siRNAgp46被免疫印迹评估。胶原蛋白合成aPSCs被染色法化验。具体交付VA-lip-siRNAgp46 aPSCs DBTC老鼠是静脉注射VA-lip-siRNA-FAM和后验证3H-VA-lip-siRNAgp46。VA-lip-siRNA在胰腺组织学的影响DBTC——和cerulein-treated老鼠是由Azan-Mallory染色和羟脯氨酸含量。
结果流式细胞仪分析显示特定吸收VA-lip-siRNAgp46-FAM通过视黄醇结合蛋白受体aPSCs体外。免疫印迹和胶原蛋白试验验证gp46击倒,抑制胶原蛋白的分泌,分别由aPSCs VA-lip-siRNAgp46转导后。具体交付VA-lip-siRNAgp46 aPSCs纤维化地区DBTC老鼠证实了荧光和放射性最后注射后24小时。10系统性VA-lip-siRNAgp46治疗解决胰腺纤维化,抑制组织羟脯氨酸含量DBTC cerulein-treated老鼠。
结论这些数据表明目前的治疗潜力的方法扭转胰腺纤维化。
- 纤维化
- 慢性胰腺炎
- 胰腺纤维化
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
胰腺纤维化是一个不可逆转的损伤,可以破坏胰腺功能;没有批准的治疗。
纤维组织的累积结果持续激活胰腺星状细胞(已经)。
的特点已经被认为与肝星状细胞(hsc)。
之前我们已经成功地解决了在肝硬化大鼠肝纤维化模型,针对肝星状细胞与维生素A的脂质体对胶原蛋白进行核特定gp46伴护蛋白质。
有什么新发现吗?
老鼠已经被激活占用维生素耦合脂质体(VA-lip-siRNAgp46) protein-mediated视黄醇绑定的方式,类似于激活肝星状细胞。
转导的siRNAgp46激活已经引起抑制胶原蛋白的分泌。
激活已经明确了siRNAgp46封装在维生素A的胰脏脂质体dibutyltin二氯化(DBTC)治疗大鼠。
VA-lip-siRNAgp46治疗解决胰腺纤维化,抑制组织羟脯氨酸含量DBTC cerulein-treated老鼠。
这是第一个演示成功的针对antifibrotic药物的细胞和分子负责胰腺纤维化。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
结果表明本方法的治疗潜力扭转胰腺纤维化。
介绍
慢性胰腺炎的特点是炎症和替换的实质细胞和纤维组织导致功能性改变,偶尔如衰弱外分泌和内分泌机能不全。纤维组织的累积结果持续激活胰腺星状细胞(已经)增殖和分泌胶原蛋白以响应刺激的细胞因子,生长因子,炎症细胞活性氧,受损的胰腺组织。1,2各种方法抑制已经被激活,根除已经被激活(aPSCs)探索预防和治疗与慢性胰腺炎相关的纤维化。3 - 5然而,到目前为止还没有开发,临床适用代理主要是因为aPSCs特定药物输送的能力。
我们以前演示了完整解决肝硬化大鼠模型中使用的维生素耦合脂质体对collagen-specific伴侣蛋白,专门提供核gp46 (VA-lip-siRNAgp46),肝星状细胞(hsc)通过循环受体视黄醇结合蛋白(RBP)。6已经的特点,包括胶原蛋白合成、储存维生素A, gp46,等等,像肝星状细胞。7因此,在目前的研究中,我们研究了我们之前的肝硬化的治疗方法是否可以成功地应用于胰腺纤维化的治疗。
材料和方法
制备siRNAgp46和它的共轭6′-carboxyfluorescein
小干扰rna针对gp46的配方,一只老鼠人类HSP47同系物,购买从北海道系统科学(日本札幌)。的感觉和反义链siRNAs前面已经详细描述。6荧光激活细胞分类(流式细胞仪)分析和体内跟踪gp46siRNA, gp46 siRNA 6′-carboxyfluorescein (6-FAM)耦合的5′末端使用有义链。
加入配方siRNA针对HSP47(基因库。50454)是购买从北海道系统科学。的感觉和反义链siRNAs: HSP47, 5′-ggacaggccucuacaacuaTT-3′(意义);5′-uaguuguagaggccuguccTT-3′(反义)。
维生素耦合制备脂质体携带siRNAgp46
维生素耦合脂质体携带siRNAgp46 (VA-lip-siRNAgp46)准备如前所述。6
动物
男性刘易斯老鼠(查尔斯河、东京、日本),重150 - 200克,和雄性Wistar鼠(Charles River),重250 - 300克,被用于二氯化dibutyltin (DBTC)和cerulein实验,分别。所有动物程序批准的札幌医科大学制度动物保健和使用委员会。
分离和培养大鼠已经
老鼠已经被密度梯度离心法分离,详细。8所有实验进行culture-activated细胞(aPSCs、通道1 - 3)。
人类已经被隔离和栽培
人类胰腺慢性胰腺炎的手术期间获得。所有这些患者都在札幌医科大学。从每个病人知情同意以书面形式得到。人类已经被孤立的产物,利用外植体技术从胰腺如前所述。1在这项研究中,实验进行激活α-smooth肌肉肌动蛋白(SMA)阳性细胞之间的第一个和第三个串行通道使用。
流式细胞仪分析VA-lip-siRNAgp46-FAM
老鼠aPSCs培养了VA-lip-siRNAgp46-FAM (50 nM的siRNA) 30分钟。阻断试验,1×104细胞治疗老鼠anti-RBP抗体(10μg /毫升,BD Pharmingen,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)添加VA-lip-siRNAgp46-FAM之前30分钟。VA-lip-siRNAgp46-FAM-treated细胞的平均荧光强度评估与CellQuest FACScalibur软件(美国加州圣何塞,正欲)。
VA-lip-siRNAgp46-FAM细胞内分布的分析
分布在aPSCs VA-lip-siRNAgp46-FAM转导分析如前所述。6
免疫印迹分析
蛋白质提取的细胞和胰腺标本解决4/20 dodecylsulphate-polyacrylamide钠凝胶,转移到硝化纤维膜,探讨了抗体HSP47 (gp46) (Stressgen生物技术、维多利亚、BC、加拿大)或β-actin(细胞信号,贝弗利,马萨诸塞州,美国),然后探索peroxidase-coupled抗体作为第二抗体(癌基因研究产品,波士顿,马萨诸塞州,美国)。最后,这些细胞被形象化与发射极耦合逻辑(Amersham生命科学,阿灵顿高地,伊利诺斯州,美国)。西方的屁股量化使用ImageJ 1.43 u (NIH的贝塞斯达,马里兰州,美国)。
定量rt - pcr
总RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。总RNA(1μg)是用于逆转录上标二世(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国)加上RNaseOUT(英杰公司)使用随机引物(英杰公司)根据制造商的指示。所有TaqMan引物和探针(GAPDH Rn 99999916 _s1;MMP2, Rn 02532334 _s1;COL1A1 Rn00801649_g1;TIMP-1, Rn 00587558 _m1;Gp46, Rn 00367777 _m1;TGFβ,Rn01475963_m1)购买的应用生物系统公司(美国加州福斯特城)。TaqMan反应进行使用7300快速实时PCR系统(应用生物系统公司)。结果表示为产品的副本的数量比管家基因的基因副本的数量(GAPDH)从同一RNA(各自cDNA)和PCR运行示例。
由DBTC诱导胰腺癌和肝纤维化
在几个胰腺纤维化的模型,10 - 18我们选择的DBTC模型胆总管阻塞的插头与坏死胆胰导管上皮细胞形成,因为程序是相对简单的执行与其他模型相比,和不可逆转的胰腺炎可以由一个注入DBTC诱导。DBTC(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)第一次被溶解在乙醇(1份),然后与甘油混合(两部分)和二甲亚砜(两部分)。10DBTC的政府,我们选择正确的颈静脉途径,以避免任何可能的损害造成的尾静脉尾静脉途径VA-lip-siRNAgp46的后续应用。10在初步实验中,我们发现致命的剂量率8.0,7.0和5.0毫克/公斤体重是4/4(100%),7/16(44%)和5/27(19%),分别为。因此,我们选择的用量为5.0毫克/公斤的主要实验(见在线补充图S1)。
纤维化,正如Azan-Mallory染色所显示的,是明显的第43天29和胰腺和肝脏标本DBTC注入(参见图S1A-C在线补充)。
由cerulein诱导胰腺纤维化
雄性Wistar鼠腹腔内注射了两份50μg /公斤cerulein(σ)1 h分开每个星期6周,所描述的Ishibashi(参见图S2A在线补充,B)。18
胶原酶活性在胰腺匀浆
胶原酶活性(胶原蛋白I型)在胰腺匀浆测定如前所述。19
体内的本地化VA-lip-siRNArandom-FAM鼠胰腺
DBTC政府从43天,老鼠注射静脉注射1μl / g体重VA-lip-siRNArandom-FAM或Lip-siRNArandom-FAM(0.75毫克/公斤siRNA)在交替的日子里的三倍。在去年注射后24小时,老鼠被盐水灌注牺牲。胰腺组织立即被嵌入在10月化合物(樱花Finetechnical、东京、日本)分段中、低温。五彩缤纷的部分及其分析的荧光染色法进行了如前所述。6
放射性标记VA-lip-siRNArandom的组织分布
3H-VA-lip-siRNArandom(200μCi),准备如前所述,通过尾静脉接种在正常压力DBTC-treated老鼠(43天)或正常的老鼠。24小时后,老鼠牺牲在麻醉下,和每个组织的放射性化验如前所述。6
治疗DBTC老鼠和老鼠cerulein VA-lip-siRNAgp46和羟脯氨酸含量的测量
三组大鼠每组(n = 10)被用于组织学评价。从43天DBTC或cerulein政府Lip-siRNAgp46, VA-lip-siRNAgp46(0.75毫克/公斤siRNA)或磷酸缓冲盐(PBS;每周3次每隔一天)注入总共10倍通过尾静脉在正常压力下的体积1μl / g体重。6胰腺中羟脯氨酸含量测定(如前所述)。20.
免疫组织化学染色对α-SMA
胰腺和10%多聚甲醛固定。然后,免疫组织化学染色α-SMA是由葡聚糖聚合物方法使用单克隆抗体抗α-SMA(σ1:1000)和一个设想工具包(Dako),其次是色彩与3、3 ' -diaminobenzidine (DAB)和核与吉尔的苏木精染色方案。准确量化区域沾α-SMA、幻灯片从六个随机选择的低功耗领域(×100)/胰腺部分从每个老鼠都被显微镜(Axioplan 2;卡尔蔡司)和区域的百分比沾α-SMA量化如前所述。6
体外细胞凋亡检测
老鼠和人类aPSCs下会沾一个原位细胞凋亡细胞死亡检测设备(罗氏)根据制造商的协议。幻灯片用PBS,暴露于延长黄金不变色试剂和4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(分子探针)染色细胞核。终端数量的原位脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞(绿色)在aPSCs数10个随机大功率领域(×800)使用荧光显微镜(日本基恩士,bz - 8000)为每个样本。
胰腺的双重染色标本TUNEL和α-SMA
双TUNEL染色和α-SMA进行和TUNEL-positive凋亡细胞在纤维乐队决定使用一个方法修改Iredale描述et al。19简单,第一次染色标本原位细胞死亡检测设备(罗氏)根据制造商的协议,其次是疣状为α-SMA(σ),与一个碱性phosphatase-conjugated anti-mouse第二抗体(美国KPL,马里兰州)使用一个向量红色碱性磷酸酶底物装备1(向量实验室,彼得伯勒、英国)。TUNEL-positive细胞的数量(布朗)α-SMA-positive区域(红色),但没有实质的区域,被数10个随机大功率领域(×800)。
伦理批准
本研究遵循赫尔辛基宣言》的原则和规定,动物保健和机构审查委员会批准的札幌医科大学。
统计数据
结果给出了每个样本平均数±标准差。多个比较对照组和其他团体进行Dunnet的测试。
结果
特定的RBP绑定由鼠aPSCs VA-lip-siRNAgp46吸收
老鼠aPSCs,α-SMA呈阳性(图1),与VA-lip-siRNAgp46-FAM孵化或Lip-siRNAgp46-FAM 10%胎牛血清的存在,和荧光显微镜下观察。VA-lip-siRNAgp46-FAM aPSCs处理,荧光作为一种细粒度的模式出现在细胞质中30分钟和密集的细粒度的模式在细胞核周围的区域在2 h (图1B)。相比之下,在Lip-siRNAgp46-FAM aPSCs治疗,在30分钟没有看到绿色荧光,细胞核周围的荧光在2 h很微弱(图1B)的荧光强度VA-lip-siRNAgp46-FAM aPSCs所揭示的流式细胞仪被RBP明显抑制抗体水平几乎一样Lip-siRNAgp46-FAM aPSCs (图1C)。
视黄醇结合蛋白receptor-dependent吸收的维生素耦合脂质体(VA-lip-siRNAgp46) -carboxyfluorescein (FAM)激活胰腺星状细胞(aPSCs)和抑制siRNAgp46 gp46表达式和胶原蛋白合成的影响。(一)代表鼠aPSCs的荧光图像。相差显微镜的图像aPSCs(左面板)和immunofluorescent染色的aPSCs Cy3-conjugated anti-α-SMA抗体(红色)和核复染色与DAPI(蓝色)(右面板)。酒吧= 100μm。(B)代表FAM-labelled siRNA细胞内分布的荧光图像。老鼠aPSCs VA-lip-siRNAgp46-FAM或Lip-siRNAgp46-FAM处理。在30分钟,介质代替新鲜培养基。当时表示,细胞被固定和荧光显微镜分析确定的相对细胞内分布siRNA-FAM(绿色)。酒吧= 100μm。的五个代表图像显示。 (C) Representative fluorescence activated cell sorting patterns of rat PSCs treated with vitamin A-free liposomes carrying siRNAgp46-FAM (Lip-siRNAgp46-FAM) or VA-lip-siRNAgp46-FAM with or without anti-RBP antibody. Mean fluorescence intensity is indicated. Five independent experiments were carried out in each set of aPSCs and the results were essentially the same. (D) Western blotting was used to analyse the expression of gp46 and β-actin (normalisation control) in aPSCs transfected with Lip-siRNAgp46,VA-lip-siRNA random or VA-lip-siRNAgp46. Dose-dependent inhibition of gp46 expression by siRNAgp46 was observed. (E) Duration of suppressive effect of siRNAgp46 on gp46 expression in aPSCs. Rat aPSCs were treated with VA-lip-siRNAgp46 or VA-lip-siRNA random. At 30 min, the medium was replaced with fresh medium. At the time indicated, the expression of gp46 and β-actin (normalisation control) was analysed by western blotting. Similar results were obtained in three independent experiments. (F) Collagen deposition on tissue culture plates was assayed by the dye-binding method 72 h after transduction in rat aPSCs treated with VA-lip-siRNAgp46 or with VA-lip-siRNArandom. Data are expressed as mean±SD calculated from five transductions and as a percentage of untreated control. *p<0.05 vs VA-lip-siRNAgp46. NS, not significant.
抑制gp46表达式和胶原蛋白的分泌鼠aPSCs VA-lip-siRNAgp46
治疗的aPSCs VA-lip-siRNAgp46带来与几乎完全抑制剂量依赖性抑制gp46 50 nM,持续了至少72 h (图1D, E),治疗VA-lip-siRNA随机或Lip-siRNAgp46没有造成任何抑制。的培养板VA-lip-siRNAgp46-treated aPSCs,大大减少胶原蛋白比VA-lip-siRNA random-treated或摘要aPSCs被发现(图1F)。
交付VA-lip-siRNArandom-FAM aPSCs体内
的具体交付VA-lip-siRNArandom-FAM aPSCs在胰腺纤维化检测荧光发射后24 h三注射(图2标本准备从头(A)。图2B, D)和身体部分(图2胰腺的C, E)。两部分,荧光VA-lip-siRNArandom-FAM(绿色)主要被发现在参差不齐的地区,只有α-SMA染色阳性(aPSCs)(红色),导致合并后的黄颜色(图2B, C)。相比之下,在老鼠Lip-siRNArandom-FAM对待,α-SMA积极地区的黄色区域是微不足道的(图2D, E)。
具体交付的维生素耦合脂质体(VA-lip-siRNA) random-carboxyfluorescein (FAM)激活胰腺星状细胞(aPSCs)二氯化dibutyltin (DBTC)治疗大鼠。(一)安排与DBTC-induced VA-lip-siRNArandom-FAM注入大鼠胰腺纤维化。样品(B, D;胰腺头,C, E;胰腺体)获得DBTC-treated老鼠注射了三个VA-lip-siRNArandom-FAM或Lip-siRNArandom-FAM (siRNA剂量为0.75毫克/公斤,3次每隔一天)每组(n = 6)。代表荧光图像的呈现α-SMA Cy3-conjugated anti-α-SMA抗体(红色),核与DAPI复染色(蓝色)和核random-FAM(绿色)在胰腺标本获得24 h后注入。照片是在原始放大(×200)。荧光蛋白的siRNA random-FAM(绿色)被确认在胰腺中,主要是在该地区α-SMA引起染色阳性区域合并的黄色。
黄色区域的6个随机选择大功率(×200)字段从每个标本占领α-SMA 32.1±10.5%的彩色。α-SMA-positive地区相比之下,黄色区域是微不足道的(2.0±1.5%)大鼠注射lip-siRNAgp46-FAM。
为了进一步阐明器官分布,3H-labelled VA-lip-siRNArandom是管理与胰腺炎DBTC-treated老鼠(43)和正常大鼠(表1)。放射性的胰腺DBTC-treated老鼠(大约5倍)明显高于正常大鼠。在肝脏、放射性DBTC组(大约四倍)也高于正常大鼠。其他器官,包括肺、脾和肠子,没有显示出放射性增加DBTC-treated老鼠,相对于正常的老鼠。
持续时间在aPSCs gp46抑制胰腺的DBTC老鼠VA-lip-siRNAgp46处理
检查效果的持续时间的siRNAgp46 gp46表达式,DBTC老鼠(n = 15)静脉注射了VA-lip-siRNAgp46 43天(参见图S3A在线补充)。的表达gp46大鼠胰腺的牺牲在43天,44岁,45岁,46和47名每组(n = 3),由免疫印迹分析。每个老鼠每组的结果基本上是一样的。代表免疫印迹乐队的三只老鼠在每个时间点和密度测量值显示在图S3B在线补充,C。抑制gp46表达式开始24小时后开始治疗,持续了至少3天。
解决胰腺纤维化的VA-lip-siRNAgp46 DBTC-treated老鼠
与VA-lip-siRNAgp46 10治疗后(图3),一个明显的减少和显著减少分析的计算机成像纤维化由Azan-Mallory正面面积确认(图3B, C)。结果符合数据显示大幅抑制羟脯氨酸水平(图3D)。
静脉注射维生素耦合的影响脂质体(VA-lip-siRNAgp46)二氯化dibutyltin (DBTC)全身的胰腺纤维化。(一)计划与DBTC-induced VA-lip-siRNAgp46治疗大鼠胰腺纤维化。样本来自DBTC-treated老鼠收到10注射VA-lip-siRNAgp46 Lip-siRNA gp46 (siRNA剂量为0.75毫克/公斤,3次每隔一天),或独自PBS每组(n = 10)。显微照片(B)代表Azan-Mallory彩色胰腺部分。照片是在原始放大(×100)。放大图像对应区域包含在框表示。(C) Azan-Mallory阳性染色区域的计算机图像分析评估。数据是来自六个随机选择的字段的10大鼠四组和代表均值±SD。(D)胰腺中羟脯氨酸含量。均值±10 SD大鼠每组。 (E) Representative immunohistochemical staining images of activated pancreatic stellate cells stained with anti-α-SMA antibody (brown). Pictures were taken at original magnification (×200). Results from each group of 10 rats were essentially similar. (F) α-SMA- - - - - -阳性染色区域的计算机图像分析评估。数据是来自六个随机选择的字段的10大鼠三组,代表均值±SD。* p < 0.05;* * p < 0.01 vs VA-lip-siRNAgp46治疗——DBTC老鼠。
治疗后消失,aPSCs VA-lip-siRNAgp46
阐明aPSCs失踪的治疗后,执行α-SMA疣状。远远小于区域被染色相比,老鼠接受VA-lip-siRNAgp46α-SMA染色区域的老鼠接受Lip-siRNAgp46或PBS (图3E、F)。
VA-lip-siRNAgp46治疗效果在DBTC-treated大鼠胰腺炎症
因为众所周知,已经发挥作用不仅在纤维化的炎症反应,也21我们探索的影响VA-lip-siRNAgp46治疗胰腺的炎症DBTC-treated老鼠。炎症的程度,评估细胞渗透,脂肪变性,管状复杂的形成和巨噬细胞和T细胞的渗透与VA-lip-siRNAgp46减少治疗后(请参见图S4在线补充和表S1)。
解决肝纤维化的VA-lip-siRNAgp46 DBTC-treated老鼠
DBTC模型中,肝纤维化发生除了胰腺纤维化因为DBTC造成妨碍的胆总管(参见图S5A在线补充,B)。Azan-Mallory阳性面积显著降低在标本VA-lip-siRNAgp46-treated老鼠相比,在控制标本(参见图S5C在线补充)。
细胞凋亡的siRNAgp46-induced aPSCs
我们检查的可能性可能诱导凋亡的死老鼠aPSCs siRNAgp46治疗体外。TUNEL阳性细胞的数量大于siRNAgp46-transfected aPSCs比控制aPSCs (图4A)。凋亡细胞核比总核siRNAgp46-transfected aPSCs 38.3±8.2%,显著增加相对于控件(图4B)。
激活胰腺星状细胞凋亡(aPSCs)维生素耦合引起的脂质体(VA-lip-siRNA)治疗。显微照片(A)代表鼠aPSCs发生细胞凋亡。核aPSCs VA-lip-siRNAgp46处理或控制代理沾FITC-transferase-mediated脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)(绿色)和DAPI每次治疗后(蓝色)72 h。箭头显示凋亡细胞。在原始照片放大(×200)和放大图像对应区域封闭盒子里的插图。(B)量化的凋亡aPSCs所示图4答:凋亡细胞核(绿色)和总核(绿+蓝)是由荧光显微镜检查和清点随机挑选的10个领域里的每张幻灯片为每个显示治疗;凋亡的比率正常细胞核被表示为百分数。结果代表三个独立实验的平均数±标准差。* p < 0.01 vs VA-lip-siRNAgp46。(C)代表人类aPSCs发生细胞凋亡的显微照片。核aPSCs VA-lip-siRNAHSP47处理或控制代理沾FITC-TUNEL(绿色)和DAPI每次治疗后(蓝色)72 h。箭头显示凋亡细胞。在原始照片放大(×200)和放大图像对应区域封闭盒子里的插图。(D)量化的凋亡aPSCs所示图4c .凋亡细胞核(绿色)和总核(绿+蓝)是由荧光显微镜检查和清点随机挑选的10个领域里的每张幻灯片为每个显示治疗;凋亡的比率正常细胞核被表示为百分数。结果代表三个独立实验的平均数±标准差。* p < 0.01 vs VA-lip-siRNAHSP47。免疫组织化学染色(E)代表胰腺标本dibutyltin二氯化(DBTC)(5毫克/公斤)治疗大鼠(56天)接受六注射VA-lip-siRNAgp46(左面板)或VA-lip-siRNArandom(右面板)(核剂量为0.75毫克/公斤,每隔一天3倍)对TUNEL染色(棕色、箭头)和α-SMA(红色)。放大的图片框显示相应地区TUNEL-positive重叠的细胞的数量α-SMA-positive已经大幅增加了在VA-lip-siRNAgp46标本与VA-lip-siRNArandom标本。照片是在原始放大(×100)。(F)的量化TUNEL-positive已经在胰腺标本VA-lip-siRNAgp46-treated DBTC-rats VA-lip-siRNArandom。TUNEL的数量- - - - - -α-SMA-positive地区阳性细胞数在10随机选择的字段/每个鼠的胰腺部分。* p < 0.01。结果在本质上是相似的在每组三只老鼠。
细胞凋亡的aPSCs siRNAHSP47也检查获得的人类已经从人类胰腺纤维化的产物。TUNEL染色的凋亡细胞核siRNAHSP47-transfected aPSCs高于控制aPSCs (图4C)。凋亡细胞核比总核siRNAHSP47-transfected aPSCs 18.3±4.2%,显著增加相对于控件(图4D)。
此外,细胞凋亡的aPSCs siRNAgp46 DBTC-treated老鼠了。在DBTC胰腺,TUNEL阳性细胞在与aPSCs重叠的区域(α-SMA积极)也增加了治疗后VA-lip-siRNAgp46 (图4E、F)。
解决胰腺纤维化的VA-lip-siRNAgp46 cerulein-treated老鼠
cerulein诱发胰腺炎模型(见图S2和在线补充图5治疗效果的),VA-lip-siRNAgp46也明显对纤维的收缩区(图5B)和抑制羟脯氨酸水平(图5C)。
静脉注射维生素耦合的影响脂质体(VA-lip-siRNAgp46) cerulein-induced胰腺纤维化。(一)安排VA-lip-siRNAgp46治疗大鼠的天蓝色- - - - - -诱导胰腺纤维化。样本来自cerulean-treated老鼠收到10注射VA-lip-siRNAgp46 Lip-siRNA gp46 (siRNA剂量为0.75毫克/公斤,3次每隔一天)或PBS每组(n = 10)。(B)代表Azan-Mallory的显微照片- - - - - -彩色胰腺部分。在原始照片放大(×100)。(C) Azan-Mallory- - - - - -阳性染色区域的计算机图像分析评估。数据是来自六个随机选择的字段的10大鼠三组,代表均值±SD。(D)胰腺中羟脯氨酸含量。均值±10 SD大鼠每组。* p < 0.05;* * p < 0.01 vs VA-lip-siRNAgp46 treated-dibutyltin二氯化老鼠。
fibrosis-related蛋白mRNA表达的变化管理前后VA-lip-siRNAgp46 DBTC-treated老鼠
我们测量mRNA水平的gp46,胶原蛋白,MMP2、TIMP-1, TGFβ胰腺从正常的老鼠和老鼠DBTC-treated匀浆(图6),信使rna比率相对于GAPDH信使rna所示图6b . gp46 mrna,胶原蛋白,MMP2和TGFβ表示在aPSCs增加胰腺纤维化的比正常的胰腺。TIMP-1 mRNA水平没有增加而略有减少,以应对诱导纤维化。然而,与VA-lip-siRNAgp46治疗后,所有的mrna的表达明显减少,大概是因为aPSCs的消失。
影响维生素耦合的脂质体(VA-lip-siRNAgp46)治疗mRNA的表达fibrosis-related胰腺匀浆蛋白质和胶原酶的活动。(A)的时间表与二氯化dibutyltin VA-lip-siRNAgp46治疗大鼠(DBTC)- - - - - -诱导胰腺纤维化。样本来自DBTC-treated老鼠收到三注射VA-lip-siRNAgp46 Lip-siRNA gp46 (siRNA剂量为0.75毫克/公斤,3次每隔一天),或独自PBS每组(n = 3)。(B)的表达gp46,原骨胶原我,MMP-2, TIMP-1,和TGFβmRNA在正常老鼠,老鼠DBTC-treated处理三种注射的PBS, VA-lip-siRNArandom DBTC-treated老鼠注射治疗三个,DBTC-treated老鼠接受三种注射VA-lip-siRNAgp46被实时PCR测定的数量。GAPDH mRNA表达正常化比值,看家基因。* p < 0.01 vs DBTC鼠(day42)。* * p < 0.01 vs PBS (day46)。* * * p < 0.05 vs PBS (day46)。(C)总胶原酶活性从正常大鼠,胰腺匀浆DBTC-treated老鼠(42天),DBTC-treated老鼠(49天),和DBTC老鼠接受三种注射VA-lip-siRNAgp46 (siRNA剂量为0.75毫克/公斤,每隔一天3次,49天)没有或存在MMP抑制剂(1,10-phenanthroline)。结果均值±5 SD大鼠每组。* p < 0.01 vs没有抑制剂。 **p<0.05 vs normal rat.
提升胶原酶的活动pancreasof DBTC-treated老鼠
确认足够的胶原酶活动解决胶原驻留在胰腺纤维化了预存款,我们测量胶原酶活动DBTC-treated老鼠三注射后的胰腺匀浆VA-lip-siRNAgp46(49),发现控制是明显高于正常大鼠治疗后,成为更高VA-lip-siRNA gp46 (图6C)。
在胰腺纤维化组织微血管密度的变化与VA-lip-siRNAgp46之前和之后的治疗
在胰腺DBTC-treated VA-lip-siRNAgp46治疗前,意思是微血管计数39±9.5。VA-lip-siRNAgp46 10注射后,平均微脉管计数显著降低到19±9.2(参见图S6在线补充)。
讨论
已经被已被证明储存维生素A和合成胶原蛋白,他们可以通过炎性细胞因子激活,发挥类似于肝星状细胞的功能。1,2,7然而,它并没有阐明RBP是否参与吸收维生素A。也不清楚HSP47由aPSCs参与胶原蛋白的分泌。因此我们首先澄清aPSCs确实占用维生素一分之一RBP-mediated时尚通过与VA-lip-siRNAgp46-FAM证明,但不是Lip-siRNAgp46-FAM, 30分钟内出现的荧光孵化被anti-RBP抗体,抑制和胶原蛋白VA-lip-siRNAgp46-treated细胞培养板的显著降低(图1C、F)。这些研究结果验证了相似的aPSCs激活肝星状细胞的RBP-mediated维生素A吸收和gp46资助建设胶原蛋白的分泌。
顺便说一下,关于可能的作用等细胞成分myofibroblasts在胰腺纤维化,而很难区别于aPSCs以来已经被激活的时候,他们成为α-SMA积极,这是myofibroblasts的特征。在这种情况下,应该注意的是,静已经被储存维生素A,当他们成为myofibroblasts,虽然没有更多的维生素A水滴在细胞质中观察到,他们仍然可以吸收维生素A所示,使用VA-lip-siRNAgp46体外转染实验。这是对肝星状细胞。这是我们以前的纸仔细讨论。6推测沉积维生素A在静止细胞可能使用或部分排出myofibrobrast转换。
考试前的治疗效果,我们保证具体交付VA-lip-siRNAgp46 aPSCs在胰腺纤维化组织,展示绿色荧光的没入siRNA-FAM封装在维生素A与α-SMA的红色荧光脂质体- - - - - -阳性细胞(aPSCs),和更高的积累3H-VA-lipsiRNA DBTC-treated胰腺的老鼠比正常老鼠。10倍的原因更多的放射性肺和肠可能是由于较高含量的巨噬细胞在这些器官。然而,肝脏和胰腺的150倍区别可能不是简单地归结为巨噬细胞的不同内容,但更有可能增加数量的激活肝星状细胞,因为在这个模型中,不仅胰腺还肝脏发生纤维化,因为胆总管梗阻。
集体这些结果支持这样的观点:aPSCs优先占用siRNAgp46封装在维生素A脂质体体内。我们还研究了体内的动力学影响,治疗效果评估之前,发现gp46表达式的抑制注入VA-lip-siRNAgp46后持续了3天。因此,我们的治疗协议涉及每周注射毒品的三倍。
治疗的治疗效果,即组织学改善和正常化胰腺中羟脯氨酸含量,观察药物管理局10倍。在我们之前的研究中利用肝硬化模型,得到实质性解决纤维组织后只有五个治疗。6在目前的研究中,最初我们也只有五个治疗使用,但改善肝纤维化是令人不满意的。这可能是由于胰腺是相对贫穷的血液供应与肝脏相比,因此在纤维化siRNAgp46位点的用量由五个注射可能并不足以带来胰腺纤维化的有效决议。
顺便说一句,它可能是值得注意的提到我们的治疗带来更少的血管密度,因为它承诺更广泛的影响,如损耗胰腺癌的肿瘤间质。现在在这方面,它是一个广泛接受的概念,形态多血管的正常化微血管减少不成熟与anti-neoangiogenesis抗体,抗体时,而提高化疗的疗效和抗癌药物结合使用。22
关于机制增强microvascularity多血管的纤维组织和减量治疗后,我们假设,在良好的协议与报告Hideshima冈田克也,23,24aPSCs是产生血管生成因子(s)将根除从组织依照凋亡诱导治疗。这种假设是基于我们最近发现老鼠aPSCs的确是表达一些血管生成因素,包括纤维母细胞生长因子(未发表的观察)。
纤维化似乎发生的决议涉及siRNAgp46双重机制,抑制新创分泌胶原蛋白,和组织胶原酶,溶解胶原基质了预存款。这种假设是符合事实,胶原酶活性在胰腺DBTC治疗后42天和49天,当巨大的纤维化发生,高于正常胰腺。VA-lip-siRNAgp46治疗后持续高企的胶原酶活动的原因,尽管抑制MMP2 mRNA,可能是TIMP aPSCs也是由于aPSCs细胞凋亡减少。此外,一个持久的细胞外基质的胶原酶后由细胞分泌,可能占持续胶原酶的活动。25,26激活基质金属蛋白酶(MMPs)来源于炎症细胞通过减少TIMP-1表达式也占差异。
此外,细胞凋亡aPSCs通过转导siRNAgp46体外实验证实,表明类似的机制参与细胞凋亡aHSCs aPSCs。,这是合理的胶原蛋白分泌aHSCs和aPSCs作为生存的信号,这个信号是废除,导致细胞凋亡,因此胶原降解的胶原酶(未发表的观察)。支持这种可能性,我们的研究结果表明,高胶原酶活性维持在胰腺甚至治疗后(图6C)。顺便说一句,诱导细胞凋亡,抑制胶原蛋白分泌是人类已经被证实发生即使在VA-lip-siRNAHSP47处理,表明该方法的适用性在临床设置。
有趣的是,炎症与纤维化在这个模型也减少了这种治疗,可能由于aPSCs,涉及由我们根除治疗,不仅在纤维化的发展还在炎症反应。21
肝纤维化与治疗DBTC-treated老鼠也成功的解决了在目前的研究。然而,因为常见的上皮塞管没有被治疗,增加血清淀粉酶、丙氨酸转氨酶和胆红素持久化(数据没有显示)。DBTC模型中,与先进的人类的慢性胰腺炎,β-cells完好无损,因此,没有观察血糖水平的变化在整个实验周期(数据没有显示)。
进一步评价治疗效果的方式在另一个模型中,我们建立了一个基于重复管理慢性胰腺炎模型cerulein老鼠。12,18在这个模型的结果与DBTC兼容模式,确认的一般形态的功效不同的胰腺纤维化模型。
从- - - - - -通常目标效果和刺激的toll样受体)都是需要解决的关键问题在使用核疗法的应用。因为我们使用相同的核的先前研究肝硬化我们否认了旁观者效应通过展示类似的基因沉默效果和antifibrotic效果与其他两个独立siRNAs对同一个目标,6我们认为它是不太可能。
尽管如此,未来的临床应用,有必要进行认真的探索副作用,脱靶效应和TLR刺激。
总之,目前的数据清楚地表明形态对胰腺纤维化的治疗潜力,并建议其潜在治疗器官纤维化。
引用
补充材料
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补充数据
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在这个数据补充文件:
- 数据补充1——在线补充
脚注
嗨,y和公里同样这项工作。
贡献者嗨,y和公里设计研究,进行实验和写论文。是的,射频,HN, NB, TH, TS,公里,RT,可,SA YK、KH和JK进行实验。YN设计研究、写论文和监督整个项目。所有作者讨论的结果和评论手稿。
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