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摘要
客观的角蛋白(K)19是一种胆道/肝祖细胞(HPC)标志物，在预后不良的肝细胞癌(HCC)的一个亚群中表达。驱动k19阳性HCC表型的潜在机制仍不明确。
设计在一项包括242例不同病因的连续高加索患者(167例手术标本，75例穿刺活检)的队列研究中，将K19的临床病理价值与EpCAM和α胎蛋白进行了比较。利用微阵列和microRNA分析，确定了k19阳性hcc的分子表型。临床原发性肝癌样本进行体外侵袭试验和侧群分析。用合成的sirna转染肝癌细胞株KRT19并进行了侵袭和细胞毒性试验。
结果在手术标本队列中，K19表达与肿瘤大小增加(p<0.01)、肿瘤分化降低(p<0.001)、转移(p<0.05)和微血管侵犯(p<0.001)的相关性最强。一组75例穿刺活检也证实了K19的预后价值。分析显示，k19阳性hcc高度表达侵袭相关/转移相关标志物(如:VASP，TACSTD2，LAMB1，LAMC2, PDGFRA)、胆道/HPC标志物(例如:CD133，问题，NOTCH2，JAG1)和miRNA家族成员200(如miR-141, miR-200c)。在体外，原发性人类k19阳性肿瘤细胞表现出增加的侵袭性，并驻留在耐药侧人群中。功能、K19 /KRT19敲除可减少入侵，减少无创畸形形成，降低对阿霉素、5-氟尿嘧啶和索拉非尼的耐药性。
结论鉴于其独特的侵袭性、不同的分子特征和不良的预后结果，k19阳性hcc应被视为hcc的一个独立实体。
- 肝细胞癌
- 分子病理学
- 细胞角蛋白
- 细胞迁移
这是一篇开放获取文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 3.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
角蛋白(K)19是一种胆道/肝祖细胞(HPC)标志物，在预后不良的肝细胞癌(HCC)的一个亚群中表达，被认为反映了细胞的起源。
近年来，许多东方研究主要针对HBV感染患者，将K19的发生与转移、肿瘤分化差、切除和射频消融术后肿瘤复发以及总生存期差等临床病理特征联系起来。
2006年，我们的小组首次描述了K19在白种人系列hcc中的临床病理和预后相关性，因为它与移植后的高复发率有关。
新的发现是什么?
在这个包含242个连续hcc的前瞻性高加索系列中，与EPCAM和α胎蛋白相比，K19表达与临床病理参数相关性最强，包括肿瘤大小增加，肿瘤分化减少，转移和微血管侵袭。
彻底的分子分析(包括mRNA和microRNA阵列)揭示了一个与K19表达相关的新的调控网络，该网络反过来又与控制细胞骨架动力学和细胞运动性的途径交叉。microRNA过表达证实了几种新的候选microRNA(如miR-141, miR-200c)在调节k19相关基因中的作用。
我们在体外进一步证明，使用原发性人类HCC样本，K19表达赋予了一种侵袭性表型。K19的表达也与耐药有关，这是通过侧群细胞分离技术和细胞毒性试验证明的。
我们的发现证明了K19表达的功能后果，因为KRT19敲低显著降低了肝细胞癌的体外侵袭能力，并阻碍了非浸润畸形的形成。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的数据揭示了K19表型不良预后的机制，并有力地支持了K19阳性HCC应作为HCC的独立实体进行诊断和治疗的观点。
简介
角蛋白(K)19是胆管细胞、肝祖细胞(HPCs)和早期肝母细胞的标志物，其表达与诊断为肝细胞癌(HCC)患者的不良预后有关。1近年来，许多东方研究主要针对hbv感染患者，将K19的发生与转移、肿瘤分化差、切除和射频消融后肿瘤复发以及总生存期差等临床病理特征联系起来。2 - 62006年，我们的小组首次描述了K19在白种人系列hcc中的临床病理和预后相关性，因为它与移植后的高复发率有关。7随后，我们对高加索地区242例不同病因的连续HCC样本进行了前瞻性研究，并对K19的临床病理相关性进行了详细评估。
尽管各种出版物描述了K19在hcc中的预后相关性，但尚不清楚为什么这些特定肿瘤表现得更积极。一种假说可以从细胞的起源中找到解释。8大约80%的hcc出现在长期慢性肝病的背景下，其中HPC隔室有广泛的激活。双潜能HPCs具有分化为肝细胞或胆管细胞以促进肝脏再生的能力，但它们的激活和增殖也为癌变提供了潜在的来源。在人类中，具有混合肝细胞/胆管细胞特征的原发性肝癌和显示祖细胞/干性特征的hcc的描述至少支持了一些原发性肝癌起源于HPCs的观点。9HPCs被认为是有弹性的，能够在慢性病变的肝脏中存活，这是一个充满炎症、氧化应激和坏死的环境，因为它们高表达atp结合盒(ABC)转运蛋白。10ABC转运蛋白通过在细胞膜上积极运输各种底物(包括异种生物)来保护细胞，在这一过程中使用ATP，但也有助于多药耐药，使肿瘤细胞对全身治疗产生耐药性。11据报道，这些ABC转运蛋白中有几个与K19在hcc中的表达共定位，这表明K19阳性的hcc和hpc具有相似的保护机制。10
在本研究中，我们评估了高加索242个连续HCC样本中K19的临床病理相关性，并与其他胆道/HPC标记物、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和α胎蛋白(AFP)进行比较，我们还使用微阵列和microRNA (miRNA/miR)分析，揭示了K19阳性HCC的潜在分子表型。这些miRNAs中的几个被证明有助于k19阳性表型。为了进一步避免这些肿瘤更具侵袭性的行为，临床人类HCC样本被提交到体外侵袭试验和侧群(SP)细胞分离，这是一种基于ABC转运蛋白流出Hoechst33342的能力用于分离耐药亚群的技术。最后，评估了K19的功能作用及其对相关基因的影响与细胞毒性药物的侵袭和抗性的关系。
方法
病人的选择
HCC的诊断基于WHO标准。本研究共纳入了2003年至2008年间在鲁汶大学医院接受治疗的242例连续HCC患者的242例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肝活检。242个样本被分为两组，包括167个手术标本和75个针活检。如果每个患者有多个结节(如移植肝内的卫星结节)，则选择最大的HCC结节作为该患者的代表性样本。对于手术标本，在取出标本后，在宏观上测量肿瘤大小;肿瘤分化和微血管侵犯的分级基于组织病理学评估。对肿瘤及肿瘤周围组织的微血管侵犯情况进行评分。通过组织病理学评估和/或现有临床数据(167例中126例)确定转移阳性。针活检用于诊断目的或在手术前(如射频消融)进行，并对与手术标本相似的微血管侵犯和分化程度进行评分。转移分析仅基于现有的临床数据(75例中有17例)。 Tumour size for the needle biopsies was not established.
在连续的FFPE切片上用免疫组化方法半定量评估K19、EPCAM和AFP的表达。如前所述，使用5%免疫组化阳性的临界值来排除假阳性，当看到表达时，样本被认为是标记物阳性。7使用STATVIEW 5.0.1软件(SAS研究所，Cary, North Carolina, USA)进行了Fisher精确检验和未配对t检验的权变分析。这项研究得到了鲁汶大学医院伦理委员会的批准。
免疫组化和原位杂交
242例肝癌样本中K19染色(1/25;Dako, Glostrup，丹麦)，EPCAM (1/50;Dako)和AFP (1/500;Dako)，选择一个子集(k19阳性和-阴性n=12 /组)作为一些选定靶点的验证集:层粘连蛋白(1/50;Novocastra，纽卡斯尔，英国)，VASP (1/100;Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)，PDGFRA (1/50;Abcam，剑桥，英国)和TACSTD2 (1/20;Abcam)。如前所述，进行免疫组织化学/免疫细胞化学。10，12用digg标记的探针对hsa-miR-141和hsa-miR-200c进行原位杂交(Exiqon, Vedbaek, Denmark)。13
微阵列分析
对139例HCC样本(GSE1898和GSE4024)进行微阵列分析。14，15基因表达谱由先进技术中心(美国国家癌症研究所)生成。对基因表达进行数据转换和归一化。与临床病理特征和统计分析的联系描述在在线补充文件1。采用基因集富集分析对基因的重叠进行统计分析KRT19与先前发表的基因表达特征相关的基因(见在线补充文件2和3)。16，17此外，还进行了STRING分析，以预测可能的相互作用，无论是直接的(物理)联系还是间接的(功能)联系。18
实时定量PCR (qPCR)
对比利时鲁汶大学医院诊断的12例冷冻HCC切除术标本进行qPCR检测，k19阳性(n=6)或阴性(n=6)。RNA提取、cDNA合成和qPCR分析如前所述。12定制设计引物序列概述可在在线补充文件4中找到。
入侵试验和SP分析
从2008年至2011年鲁汶大学医院诊断为HCC的患者(k19阳性n=6，阴性n=6)的组织样本在手术后冷冻保存并进行组织病理鉴定。使用LiberaseBlendzyme3 (Roche, Basel, Switzerland;0.8温施单位/mL, 1.5 h, 37°C)。过滤和梯度离心后，将细胞重悬在添加l -谷氨酰胺的高级Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium中(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)，并进行QCM ECMatrix细胞侵袭试验(Millipore, Billerica, Massachusetts, USA;8μm)。用胎牛血清(Invitrogen)作为趋化剂。48 h后，用结晶紫染色法检测入侵细胞，并在560nm光密度下定量。与此同时，K19 48小时后对侵袭细胞进行免疫染色，如上所述。
为了评估活跃外排和SP表型，分离的HCC细胞与转运阻滞剂维拉帕米(100 μM;Sigma-Aldrich)，在Hoechst33342孵育前(5µg/mL;Sigma-Aldrich)。碘化丙啶(2µg/mL;加入Sigma-Aldrich)以排除死亡细胞。使用FACSAriaII (BDBiosciences)分析细胞悬液。关于解离协议和SP方法的详细描述可以在联机补充文件4中找到。
体外瞬态敲除KRT19/ K19
使用ON-TARGETplus siRNA转染人HCC细胞系HepG2, Huh-7D12, PLC/PRF/5 (ECACC, Salisbury, UK)KRT19或最终浓度为25 nM的ON-TARGETplus非靶向siRNA (Dharmacon, Lafayette, Colorado, USA)，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)。24小时后，转染细胞进行QCM ECMatrix细胞侵袭试验和MTT细胞生长试验(Millipore) 48小时。入侵试验的比色读数在od560nm;使用630 nm的参考点在OD570 nm进行MTT测定。侵袭结果归一化为增殖结果。同时转染72 h后收获细胞，提取总mRNA并进行qPCR分析。
体外稳定敲除KRT19/ K19
使用SMARTvector 2.0人类慢病毒shRNA颗粒转导Huh-7D12细胞KRT19， hCMV-TurboGFP或SMARTvector 2.0空病媒控制颗粒，根据供应商协议(Dharmacon)。根据供应商的协议，将细胞提交给QCM明胶非侵染绿法(Millipore)。24小时后，细胞在丙酮中固定10分钟，细胞角蛋白广谱筛选(DAKO)染色60分钟，然后用Alexa Fluor 568山羊抗兔(1/100,Invitrogen)孵育30分钟，用DAPI (Invitrogen)反染色。
此外，Huh-7D12细胞具有稳定KRT19用阿霉素(1µM)、5-氟尿嘧啶(1 mM)和索拉非尼(5µM) (Selleckchem, Texas, USA)处理抑菌或控制载体，补充到培养基中72 h，并与未处理细胞进行MTT试验。
MicroRNA分析和体外调制
全基因组RT2miRNA PCR阵列(384孔为基础;SABiosciences, Frederick, Maryland, USA)根据供应商的方案对冷冻HCC肝活检(n=12)进行了检查。用RT对人HCC细胞系进行了鉴定2miRNA qPCR引物分析(SABiosciences)。对周期阈值数据进行归一化，参考小RNA (U6, SNORD44, 47和48)，根据2(−ΔΔCt)方法。根据供应商的协议，用miRIDIAN Dharmacon microRNA Mimics (miR-141, miR-200c，阴性对照)转染PLC/PRF/5细胞系(n=3)，最终浓度为2 nM，使用DharmaFECT4转染试剂(Dharmacon)。在总mRNA提取前48小时收集细胞。
统计分析
使用Graphpad Prism 5.02 (Graphpad Software, La Jolla, California, USA)，采用非参数Kruskal-Wallis和Man-Whitney U检验对qPCR、MTT测定和入侵测定进行统计分析。所有分析均为双尾分析。在所有情况下，p<0.05被认为是显著的。
结果
HCC预后标志物的发生和临床病理相关性
在我们之前的回顾性研究证明了K19表达与移植后HCC复发之间的关联之后，我们开始了一项前瞻性研究，以进一步研究HCC中的“干性”特征和K19的作用。7胆道/HPC标志物K19、EPCAM和AFP与242例连续患者的临床病理特征进行了比较，包括167例手术标本和75例针活检。167份手术标本中K19免疫阳性11.38% (n=19)， EPCAM阳性14.97% (n=25)， AFP阳性10.78% (n=18) (图1A).只有2.99% (n=5)的人同时对三种标志物呈阳性。总的来说，62.87%的hcc三种标志物均为阴性(n=105)。免疫组化，K19显示亚膜性，EPCAM为膜性定位，而AFP显示弥漫性细胞质信号(图1罪犯)。K19表达与肿瘤大小增加(p<0.01)、肿瘤分化降低(p<0.001)、转移(p<0.05)和微血管侵犯(p<0.001)显著相关((表1)．AFP表达与肿瘤分化降低(p<0.001)和微血管侵犯显著相关(p<0.001)，而EPCAM仅与微血管侵犯相关(p<0.05)。在75个针活检队列中，K19表达的临床病理相关性也很显著(表1)．在20%的样本(n=15)中可见K19表达，并与肿瘤分化降低(p<0.001)、转移(p<0.05)和微血管侵犯(p<0.01)显著相关。
K19、EPCAM和α胎蛋白(AFP)在肝细胞癌(HCCs)中的发生及临床病理相关性(A) 167例HCC手术标本中，K19阳性11.38% (n=19)， EPCAM阳性14.97% (n=25)， AFP阳性10.78% (n=18)。3种标志物同时阳性的仅有2.99% (n=5)。(B - D)肝癌样本免疫组化K19阳性(B)， EPCAM阳性(C)， AFP阳性(D)。K19呈亚膜性阳性，EPCAM呈膜性阳性，而AFP呈弥漫性细胞质阳性。比例尺为250微米。
k19阳性hcc的分子表型
为了揭示k19阳性HCC的分子/转录组背景，并发现k19相关通路，我们使用了139个HCC样本的微阵列数据库。与K19蛋白表达相似，KRT19mRNA表达与临床病理参数显著相关，是肿瘤复发的独立预测因子(Log秩检验，p=0.007;HR 1.70)(见在线补充文件1)。
在微阵列定量的21 329个基因中，132个基因正相关，203个基因负相关KRT19(见在线补充文件2).基因集富集分析与KRT19显示出与其他几个癌症相关数据集的强相关性，包括“低存活率HCC亚型”，“增殖HCC亚型”，“亚型S1签名与异常Wnt激活”(见在线补充文件3)。16基因负相关KRT19在恶性HCC亚型中与肝/肝细胞特异性基因和下调基因有显著重叠(见在线补充文件3)。此外，通过STRING分析预测与K19表达正相关的基因之间的蛋白-蛋白相互作用，以深入了解K19阳性HCC侵袭性的分子机制。18K19明显与基因周围的一个节点相连vasodilator-stimulated磷蛋白质(VASP)和参与细胞外基质(ECM)的基因(例如，VCL，LAMB1，LAMC2，ITGA3，ITGB6)(见在线补充文件3)KRT19-相关基因和选定的候选基因，证实了k19阳性hcc表达高水平的其他胆道/HPCs细胞标志物(例如，KRT7，CD133，问题)除了KRT19，与k19阴性hcc相比(图2A)。此外，我们观察到Notch信号通路的成员(如:NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3，JAG1，JAG2)，肝细胞特异性基因表达减少(如:HNF4A，ABCC2)和诱导侵袭相关/转移相关标志物(如:CTBP2，S100A6，VASP，FAM57A，TACSTD2，ANXA3，RAB25，RAB27B)．相比之下，转移抑制因子MTSS1表达下调。我们还观察到编码细胞骨架调节因子的mrna的改变(蛋白的上调IQGAP1以及对IQGAP2)和ECM组分(上调LAMB1而且LAMC2)用于k19阳性肿瘤。免疫组化显示，大部分k19阳性hcc表现出丰富的细胞质层粘连蛋白，如在HPCs周围的基底膜和邻近肝硬化组织的单个HPCs中观察到的那样(图2B)。此外，k19阳性hcc表现出VASP强烈的膜下阳性和血小板衍生生长因子受体α (PDGFRA)膜性阳性。肿瘤相关钙信号传感器2 (TACSTD2/TROP2)在一小部分低分化和k19阳性的hcc中显示出膜性反应性。在形态学上，tacstd2阳性肿瘤细胞表现出更像祖细胞的表型，细胞密度高，细胞质稀少。在非肿瘤周围组织中，TACSTD2、VASP和层粘连蛋白主要在HPCs和较小的胆管中表达，而在较大的胆管中，这些蛋白表现为可变的局部阳性。相比之下，PDGFRa在所有胆道上皮细胞和HPCs (图2B、在线补充文件5)。
k19阳性肝细胞癌(HCCs)的分子表型(A)在k19阳性(n=6)和-阴性(n=6)的hcc上选择数量的基因进行qPCR验证。根据Pearson相关系数和/或通路关联选择基因。结果描述为k19阳性与k19阴性样品的折叠调节(n-fold) (**p<0.01;* p < 0.05)。(B)层粘连蛋白、VASP、PDGFRA和TACSTD2免疫组化染色(比例尺100µm)。左图为k19阳性HCC的典型例子，中间图为k19阴性HCC，右图为广泛肝祖细胞(HPC)激活的周围组织(HPC，箭头;胆管，星号)。
K19在侵袭和耐药中的功能作用
鉴于K19表达与微血管侵袭之间的强相关性，以及侵袭相关基因的高表达，我们在体外评估了K19阳性HCC细胞的侵袭潜能。选用K19免疫阳性的分离原发人hcc (图3A). K19阳性首先在FFPE组织样本中进行评估，随后在分离细胞处理的细胞旋中进行评估。k19阳性和阴性的游离肿瘤细胞都进行了ECM细胞侵袭试验。只有侵袭性细胞可以通过ECM层迁移并附着在聚碳酸酯膜的底部。48 h后，人原发性k19阳性hcc细胞的侵袭性高于k19阴性hcc细胞(p<0.01;n = 12)。有趣的是，特别是k19阳性的肿瘤细胞通过免疫染色发现侵入基底膜(图3一个)。
角蛋白19在肿瘤侵袭中的作用。肿瘤细胞入侵的能力是转移表型的标志之一。(A)对人游离性肝细胞癌(HCC)进行细胞外基质(ECM)细胞侵袭试验。48 h后，人原发性k19阳性hcc细胞的侵袭性高于k19阴性hcc细胞(p<0.01;n = 12)。免疫染色显示，与原始肿瘤相比，侵袭后k19阳性肿瘤细胞增加。(B)用免疫细胞化学方法对Huh-7D12、PLC/PRF/5和HepG2 HCC细胞株进行了特征分析(左图，标尺100µm)。72 h后，MTT试验显示两组细胞增殖无显著差异KRT19/K19击倒控制(n=3);敲除仅显著降低hu - 7d12的相对侵袭性(34.7%)。K19的免疫组化显示转染的Huh-7D12细胞表达下降(比例尺100µm)。的effect of the transient knockdown on the expression of KRT19-associated genes was done by qPCR (displayed as relative fold expression) (**p<0.01; *p<0.05). (C) Stably transduced Huh-7D12 cells were submitted to a QCM Gelatin Invadopodia Assay (24 h). The transduced cells were seeded onto green fluorescein-conjugated gelatin substrates and after 24 h visualised with wide-spectrum cytokeratin (red) and DAPI (blue). Gelatin degradation demonstrated that both theKRT19敲除作为阴性对照仍然具有侵袭能力，尽管细胞被转导为对抗结构KRT19对细胞角蛋白广谱筛查显示较低强度阳性(左侧面板，比例尺100µm)。侵袭细胞减少KRT19 / K19与阴性对照(右图，比例尺50µm)相比，表达显示不全畸形的形成减少，细胞形态规则。
为了研究K19的功能作用，我们在三种不同的HCC细胞系中进行了siRNA敲低实验:Huh-7D12细胞系显示100% K19阳性，而HepG2细胞在约20%的细胞中显示弱灶性阳性，PLC/PRF/5细胞系为阴性(图3B).使用入侵试验，瞬时击倒KRT19与阴性对照(打乱siRNA)相比，72 h后Huh-7D12的侵袭性降低了34.7% (p<0.01)。相比之下，HepG2和PLC/PRF/5在侵袭性方面没有发现显著差异(图3B).考虑到Huh-7D12侵袭潜能的改变，我们进一步研究了KRT19抑制上述基因的表达。显著减少CD133，VASP，LAMB1，IQGAP1，ROCK2(p < 0.05)NOTCH2，JAG1，RAB25(p<0.01)表达(图3B).基因表达水平无显著差异ANXA3，S100A6，HNF4A，PDGFRA，IQGAP2，LAMC2，CTBP2而且TACSTD2．与迁移实验的结果一致，Huh-7D12细胞稳定地转导KRT19shRNA的构建减少了非多形性的形成，正如gfp偶联明胶降解试验所测试的(图3C)。
在HCC细胞系中，SP技术是一种基于ABC转运蛋白流出Hoechst33342的功能能力的方法，已被证明是有用的，可以分离出具有HPC特征的耐化疗细胞片段。19在本研究中，我们应用SP技术进一步从功能上表征k19阳性hcc与k19阴性hcc。结果表明，SP在k19阳性hcc中所占比例较大(10.2%±4.1;n=6)高于k19阴性hcc(3.3%±2.4;n = 6) (图4A、B)。对分选的SP细胞和大块肿瘤细胞(主要群体或MP)的细胞旋免疫组化显示，所有k19阳性细胞均位于SP (图4C)此外，损害KRT19在Huh-7D12细胞中的表达KRT19shRNA构建物使细胞对1µM阿霉素、1 mM氟尿嘧啶或5µM索拉非尼处理比转导为对照构建物的Huh-7D12细胞更敏感(p<0.05;T =72 h, n=3)。使用MTT法与未处理的细胞进行比较，并显示为%活细胞(图4D)。
角蛋白19和治疗耐药性。侧群(SP)是基于干细胞流出荧光dna结合染料Hoechst 33342的能力。表型是使用atp结合卡带转运蛋白阻滞剂维拉帕米获得的。(A)使用流式细胞术分析，从剩余的主要群体(MP)中筛选出一个SP细胞，在人k19阴性肝细胞癌(HCC) (n=6)中平均为3.3%(±2.4)，在人k19阳性HCC (n=6)中平均为10.2%(±4.1)。(B)人类k19阳性和k19阴性HCC的SP图的代表性例子。(C)对分选细胞细胞旋的免疫细胞化学分析显示，所有k19阳性细胞均位于200µm的SP (scale bar formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)样品中;鳞片条细胞旋100µm)。(D)稳定转导的Huh-7D12细胞分别用1µM阿霉素、1 mM氟尿嘧啶或5µM索拉非尼(n=3)处理72 h。使用MTT法与未处理的细胞进行比较，并显示为%活细胞。细胞稳定地转导对抗KRT19与阴性对照相比，使用所选药物治疗后，/K19的生存能力下降(*p<0.05)。
MicroRNA 200家族与KRT19/ K19表达式
最后，另一种基于microRNA (miRNA/miR)表达的分析方法用于更详细地识别k19阳性的HCC表型。k19阳性hcc中miR-141、miR-200c、miR-199a-3p、miR-218、miR-429和miR-214的表达明显高于k19阴性hcc，而miR-122、miR-885-5p、miR-148a、miR-519a、miR-148b、miR-556-5p、miR-193b、miR-618、miR-548b-3p、miR-10b和miR-566在k19阳性hcc中相对低表达(图5一个)。
k19阳性肝细胞癌(HCC)的MicroRNA分析(A) k19阳性(n=6)和-阴性hcc (n=6)的MiRNA分析。结果描述为k19阳性与k19阴性样品的折叠调节(n-fold) (**p<0.01;* p < 0.05)。(B) Huh-7D12、PLC/PRF/5和HepG2肝癌细胞系的特征KRT19通过qPCR检测人类样本中表达差异最大的miRNAs(如hsa-miR-141、hsa-miR-200c、hsa-miR-122和has-miR-885-5p)。结果描述为与管家基因/核microRNAs相比的折叠表达(*p<0.05)。(C) hsa-miR-141和hsa-miR-200c的功能通过在K19阴性的PLC/PRF/5 HCC细胞系中诱导合成模拟锁住的核酸探针进行体外调节。通过qPCR对诱导的miRNA表达进行靶区读取，数据以mimic/hairpin对阴性对照的倍数调控的log2尺度表示(**p<0.01;* p < 0.05)。(D)对人HCC福尔马林固定石蜡包埋样品进行角蛋白19和miR-141的免疫组化和原位杂交。左图为k19阳性HCC侵袭前部，中图为k19阳性HCC中央块体，右图为周围组织。比例尺200微米。miR-141在hcc中的表达与K19的表达密切相关，并在周围的胆管(星号)/肝祖细胞(箭头)中表达。
通过qPCR分析了HCC细胞株Huh-7D12、HepG2和PLC/PRF/5中上调幅度最大的miRNAs miR-141和miR-200c以及下调幅度最大的miR-885-5p和miR-122的基线表达水平。miR-200家族成员(miR-141/miR-200c)与KRT19表达，特别是miR-141 (图5B).研究这些特定的miRNAs对KRT19mRNA表达和KRT19 -相关基因，miR-141/miR-200c模拟物在PLC/PRF/5中被诱导KRT19-低肝癌细胞系。瞬时诱导mir -141和miR-200c的表达显著上调LAMC2，KRT19，KRT7，EPCAM与k19阳性hcc本身的基因表达平行，并显著降低肝细胞特异性标记物的表达铝青铜而且HNF4A(p<0.01)，与阴性对照(图5C)。
原位杂交证实了miR-141和K19在人类HCC样本和周围组织中的表达之间的强联系。另外，对差异上调最多的mirna的原位杂交可以在在线补充文件5中找到。
讨论
在本研究中，K19的临床病理相关性在一项前瞻性高加索系列的242个连续HCC样本中进行了评估，包括167个手术标本和75个针活检。正如先前在韩国的一个主要由乙型肝炎病毒感染患者样本组成的HCC队列中报道的那样，我们能够在不同潜在病因的高加索队列中证实K19表达的预后价值，因为它与肿瘤大小、肿瘤分化减少、转移和微血管侵袭显著相关。尽管蛋白表达可能被高估或低估，但我们证实了K19表达在诊断穿刺活检中的预后价值。4在本研究中，EPCAM未被证明具有与K19相同的预后价值。这可以解释为，在肝脏再生中，EPCAM是一个比K19更广泛的标记，因为它也标志着HPCs的后代，中间肝细胞，类似于K7。20.
为了更好地理解k19阳性hcc的更具侵袭性的行为，我们揭示了潜在的分子表型。的KRT19-相关基因签名与其他先前描述的恶性HCC亚型有很强的重叠，如“低生存期HCC亚型”、“增殖型HCC亚型”和“Wnt激活异常的亚型S1签名”。14，21，22除了其他HPC/胆道标志物(如:PROM1 / CD133，问题，KRT7)， k19阳性hcc表达了一系列侵袭相关/转移相关基因，其中一些被证明存在于周围的非肿瘤性hpc中(如TACSTD2, VASP, PDGFRA)。12，23，24迄今为止，尚不清楚HPC标记物在人类hcc中的表达是否是恶性肝细胞在持续突变过程中去分化的结果，或者这是否是HPC肿瘤起源的保守“指纹”。Dumble发现了HPCs参与HCC组织发生的直接证据等通过从p53缺失小鼠中分离HPCs。25在人类慢性肝病中，我们的小组描述了大约一半的癌前小细胞发育不良灶几乎完全由具有HPCs和中间肝细胞样细胞免疫表型的细胞组成，这表明HPCs可以在人肝脏中产生hcc。26在本研究中，HPC和k19阳性hcc中相似标记物的表达与HPC起源一致。Notch通路的异常表达至少暗示HPCs和k19阳性HCC细胞共享一些共同的激活通路。27我们最近对Notch信号在肝脏再生中的作用的研究表明，Notch通路的激活对于胆道细胞的分化至关重要。28此外，在k19阳性hcc中观察到层粘连蛋白的强细胞质表达，如周围组织中非肿瘤性HPCs区域所注意到的那样。据报道，在人类肝脏疾病中，层粘连蛋白是HPCs周围基底膜的一部分，以帮助它们保持未分化状态，这表明k19阳性的hcc可能会产生层粘连蛋白来维持它们的“茎性”。29同样，细胞系中的MicroRNA分析和功能验证说明了miR-200家族成员(如miR-141/miR-200c)如何与K19/密切相关KRT19表达式。在k19阴性/KRT19-低的HCC细胞株实际上诱导了胆道/HPC标志物的表达LAMC2．miR-141和miR-200c可能通过调节层粘连蛋白来促进HPC微环境和“干性”。
与k19阴性hcc相比，k19阳性hcc表达更多的侵袭相关/转移相关基因，并且在体外也表现出更强的侵袭能力。此外，角蛋白19阳性肿瘤细胞表现出最高的侵袭能力。早在1985年，细胞骨架和相关蛋白在肿瘤过程中作为细胞整合者的作用就已经被提出。30.我们的发现证明了K19表达的功能后果，因为KRT19敲低显著降低了肝细胞癌的体外侵袭能力，并阻碍了非浸润畸形的形成。一种可能的解释是K19对VASP而且LAMB1．VASP是丝状足形成的调节因子，有报道称其通过以整合素依赖的方式主动将细胞骨架连接到ECM，从而在粘连动力学和迁移中发挥作用LAMB1已知与整合素受体相互作用，与肿瘤侵袭有关。31，32考虑到K19对这些特定基因的影响，我们假设K19是细胞骨架、丝状足形成和ECM之间跨膜串接的关键元素。
化疗耐药在HCC的治疗中很常见，并与癌症复发和转移有关。多药耐药通常是由于ABC转运蛋白的高表达，使耐药细胞排出潜在的有害物质;从而获得生存优势。SP分析是一种基于ABC转运蛋白功能区分细胞群的分离技术。33这项技术是由古德尔首先提出的等34用于分离具有长期多系再生潜力的小鼠造血干细胞。在人类HCC细胞系中，与非SP部分相比，SP分离已被证明是一种有用的方法，可以对具有“干性”特征的细胞进行分类，这些细胞具有增强的肿瘤起始能力和对细胞毒性药物(如阿霉素、5-氟尿嘧啶和吉西他滨)的耐药性。19，35，36这些干细胞样癌细胞被认为是癌细胞系统的异质性。这种癌症干细胞的概念对癌症治疗有着巨大的意义。大多数治疗针对的是构成肿瘤主要部分的快速分裂的分化细胞，通常会导致肿瘤大小的显著减小，尽管没有消除肿瘤进展的驱动力，即耐药癌症干细胞。在本研究中，与K19阴性HCC相比，K19阳性HCC中的SP分数明显更大，最重要的是，SP包含了所有表达K19的细胞。这可以解释为什么在HCC中K19免疫阳性从只有5%的细胞阳性开始就具有临床相关性，因为这些K19阳性细胞可能是这些癌症中耐药/干性表型的原因。7此外，通过减少K19/破坏HPC/胆道表型KRT19在体外实验中，肝癌细胞对阿霉素、氟尿嘧啶和索拉非尼等细胞毒性药物更加敏感。
K19本身既不是癌基因(因为它在非恶性细胞中也有表达)，也不是直接参与化学抗性的蛋白质，但我们的数据清楚地表明，K19在这些亚型hcc的侵袭性和抗性行为中起着关键作用。可能需要更多的合作伙伴来支持K19的这个特定功能。VASP和LAMB1是潜在的候选者，但PDGFRA的存在也为k19阳性hcc的恶性增加提供了可能的解释。一些PDGFRA激活突变已被描述为有助于肿瘤的起始和进展。对k19相关基因的鉴定和进一步了解可能会为更多的患者特异性治疗开辟前景，例如，通过伊马替尼治疗PDGFRA靶向治疗。24
鉴于k19阳性hcc的不同分子和表观遗传学特征以及不同的侵袭性特征，在日常临床实践中，这类具有不良临床结局的hcc应被视为与k19阴性hcc分开的实体。基于免疫组织化学的诊断病理学提供了一种快速、廉价和广泛可用的方法来识别这种特殊的hcc亚类。
致谢
作者要感谢Valeer J Desmet教授，Raymond Aerts教授，evelyn Lerut教授，Katharine Irvine博士，Sara Vander Borght博士，Kathleen Van den Eynde博士，Paula Aertsen, Miet Vanherck和Frank Vanderhoydonc教授不可或缺的支持。
参考文献
补充材料
脚注
贡献者OG:研究理念与设计;数据采集;数据分析和解释;文稿起草;统计分析。MK、JB、BS:学习概念与设计;数据采集;数据分析和解释。
CJ、FdL、JW、AD、CV、JD K、JP:数据采集。
AK:数据采集;统计分析。
LCvK:研究理念与设计;数据的获取。
VR, LAvG, HV和FN:研究概念和设计。
BT:物质支持。
JvdO:对重要知识内容的手稿进行批判性修订;获得资金;监督学习。MP:研究理念与设计;对重要的知识内容进行批判性的修改;获得资金;监督学习。TR:研究概念与设计;数据分析和解释;对重要的知识内容进行批判性的修改; obtained funding; study supervision.
资金这项研究得到了比利时科学政策办公室的校际吸引极(IAP)计划(第六和第七阶段:HEPRO I和II)的资助。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准比利时鲁汶大学医院伦理委员会。
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