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摘要
客观的结肠mucosa-associated大肠杆菌在克罗恩病(CD)和结直肠癌(CRC)中增加。它们以各种方式血凝，侵入上皮细胞系，在巨噬细胞内复制，在M(微折叠)细胞中易位并破坏DNA．我们研究了结肠粘膜分离物中负责这些作用的基因及其联合作用。
设计获得了968个克隆的fosmid库大肠杆菌ep300 - t1使用来自血凝CRC分离物的DNA，得到的血凝克隆经焦磷酸测序454。对281例结肠进行PCR筛查大肠杆菌炎性肠病(IBD)(35例)、CRC(21例)和对照组(24例;散发性息肉或肠易激综合征)。
结果454-对来自血凝克隆(n=8)的fosmids进行焦磷酸测序，确定了缘毛粘连蛋白阿发-1操纵子。转染的阿发-1成大肠杆菌K-12可预测地导致HEp-2和I-407上皮细胞弥漫性粘附和侵袭，以及血管内皮生长因子的上调。大肠杆菌表达afaCCRC (14/21, p=0.0009)和CD (9/14, p=0.005)常见，而溃疡性结肠炎(UC;8/21)与对照组(4/24)比较。大肠杆菌表达两个afaC而且lpfA(与m细胞易位相关)在CD (8/14, p=0.0019)和CRC (14/21, p=0.0001)中常见，但与对照组(2/24)相比，UC(6/21)中不常见。大肠杆菌表达两个afaC而且繁荣正义党(遗传毒性)在CRC (11/21, p=0.0015)和UC (8/21, p=0.022)中常见，但与对照组(2/24)相比，CD(4/14)中不常见。所有表达的分离株dsbA而且htrA与巨噬细胞内复制相关，242/281表达fimH编码1型毛毛粘连素。
结论IBD和CRC通常有结肠粘膜大肠杆菌表达与发病机制相关的基因，包括m细胞易位、血管生成和遗传毒性。
- 细菌粘附
- 细菌的相互作用
- 细菌的发病机理
- 肠道炎症
- 大肠杆菌
这是一篇开放获取文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 3.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
Mucosa-associated大肠杆菌乳糜泻和结肠癌的发病率增加
这些大肠杆菌在培养过程中粘附并侵入肠上皮细胞，并在巨噬细胞内复制。
这些特性使它们被指定为AIEC。然而，所有AIEC分离株的基因型都不一致。
新的发现是什么?
的流行有所增加afaC+乳糜泻和结肠癌中与结肠粘膜相关的DAEC分离物
阴毛粘连素操纵子的存在与弥漫性粘附、侵袭和增加有关VEGF肠上皮细胞的表达
结肠粘膜大肠杆菌具有扩散粘附性并具有与CD(巨噬细胞中的粘膜侵袭、易位和复制)以及结肠癌发病机制(诱导血管生成和遗传毒性的能力)潜在相关的关键基因的细胞，与结肠癌和IBD密切相关，并可能与发病机制相关。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
减少DAEC定殖或阻断其与黏膜相互作用的干预措施可能对结肠癌和乳糜泻具有预防或治疗作用。
简介
细菌参与炎症性肠病(IBD)的发病机制已被公认，但其机制尚不清楚。1粘膜相关的增加大肠杆菌克罗恩病(CD)在两个回肠均有发现2，3.和结肠癌。4 - 7增加mucosa-associated大肠杆菌在结直肠癌中也有报道5，8在溃疡性结肠炎(UC)中则较少。9 - 11这些大肠杆菌通常在培养过程中粘附并侵入肠上皮细胞，并在巨噬细胞内复制。12，13庆大霉素治疗乳糜泻肠活检后裂解和培养暗示细胞内存在大肠杆菌，5，8，14而且大肠杆菌DNA已在大多数乳糜泻肉芽肿中得到证实。15
被指定为“粘附性，侵入性”大肠杆菌(AIEC)的一些特性大肠杆菌与特定基因有关，特别是在“范式”回肠AIEC, LF82的研究中。16其中包括高温要求- a (htrA)和氧化还原酶二硫键a蛋白(dsbA)，支持巨噬细胞内存活17，18和长极柔毛(lpfA)参与跨滤泡相关上皮(FAE) M细胞的易位。19然而，在所有AIEC中没有一致的基因型。此外，它们对上皮细胞系的侵袭在体外在细胞系之间不同，是在其他细胞系中发现的属性大肠杆菌包括弥散粘附大肠杆菌(DAEC)和尿致病性大肠杆菌(UPEC)。20.，21我们之前已经证明结肠粘膜相关大肠杆菌CD和CRC中通常表达血凝素，这与它们粘附和侵入上皮细胞系的能力有关。5
最近的研究表明，大肠杆菌拥有聚酮合酶基因复合体(繁荣正义党)产生基因毒素colibactin诱导小鼠炎症相关CRC22在散发性结直肠癌中通常与粘膜相关。22，23
在这里，我们使用了一个基于结肠癌粘膜AIEC基因组DNA的fosmid克隆文库，来研究血凝素基因的性质、它与AIEC表型的相关性以及在粘膜中的分布大肠杆菌IBD、CRC和对照。我们还筛选了这些分离株htrA而且dsbA，与巨噬细胞内的复制有关，lpfA而且fimH与m细胞易位有关，可能是乳糜泻粘膜侵入的入口繁荣正义党基因复合体，与结直肠癌发病有关。
方法
细胞培养
人类结肠腺癌细胞系Caco2(#86010202)，伯基特淋巴瘤细胞系Raji-B(#85011429)和J774A。1小鼠巨噬细胞(#91051511)来自ECACC (Wiltshire, UK)。人I-407 (CCL-6)和HEp-2 (CCL-23)细胞来自美国型培养集(LGC Standard;特丁顿,英国)。由elisisabet Gullberg博士(Linköping University, Sweden)提供的Caco2-cl1细胞最初来自Maria Rescigno博士(欧洲肿瘤研究所;意大利米兰)。24在DMEM中培养Caco2、Caco2-cl1和I-407，在MEM中培养HEp-2, Raji-B和J774A。1在RPMI-1640;添加10% FBS, 4 mMl-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，在5%二氧化碳中37℃保存。
生成大肠杆菌库来自结肠粘膜相关血凝大肠杆菌AIEC表型
使用大肠杆菌HM358，来自CRC患者的血凝阳性分离物5构建随机剪切、无偏倚的fosmid库(CopyControl fosmid library kit;震中，威斯康辛，美国)。基因组DNA提取自HM358 (genome Cell/Tissue kit: Talent;意大利)被剪切，用5 ' -磷酸化的钝端修复末端，30-50 kb DNA片段连接到磷酸酶处理的fosmid pCC1FOS上，并引入噬菌体t1抗性大肠杆菌K-12衍生物EPI300-T1。大肠杆菌在Luria-Bertani氯霉素(12.5 μg/mL)琼脂上选择克隆。
血细胞凝集试验
大肠杆菌筛选1% O组人红细胞(NBS;利物浦,英国)5与haemagglutination-positive大肠杆菌HM358和血凝阴性大肠杆菌以EPI300-T1/pCC1FOS为对照。
454焦磷酸测序
在细菌生长过程中诱导高拷贝数的fosmids(中心复制控制自诱导液)，从血凝阳性克隆大肠杆菌使用Qiafilter midi-kit (Qiagen;克劳利,英国)。测序使用GS-FLX Titanium系列(Roche-454 Life Science;布兰福德,美国)。454-Reads与Newbler组装v2.0用genmark - p鉴定的蛋白质编码序列v2.4（http://exon.biology.gatech.edu/)．预测的开放阅读框架和翻译的氨基酸进行BLASTP，以确定与操纵子的同源性。使用Artemis进行基因表示v13（http://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/)．
在序列分析之后，大肠杆菌HM358和所有含fosmid的血凝阳性大肠杆菌采用PCR法检测毛缘粘连素(afaC)、p缘(原先都效命于)、1型菌群(费马/ fimC1 / fimH)、外膜蛋白c (ompC)和鞭毛蛋白(警察)．引物和条件详见补充文件S1(仅在线提供)。
的存在阿发结肠粘膜中的操纵子大肠杆菌菌株
结肠粘膜281片大肠杆菌研究之前从80例患者中分离出来的;571人来自14名CD患者，51人来自21名UC患者，120人来自21名CRC患者，39人来自24名对照组。IBD和对照组的分离株来自未溃疡乙状结肠的结肠镜活检，CRC分离株来自切除标本的活检。5PCR检测所有阿发菌株，不管afaE子型，使用引物进行扩增afaC,存在于阴毛粘连蛋白家族的所有操纵子中(阿发-1、2、3、5、7、8而且daa)．25由Alain Servin教授(INSERM-UMR756, Châtenay-Malabry，法国)提供的DAEC C1845，它携带有daa操纵子26CD AIEC LF82缺失阿发，16被用作对照。由Arlette Darfeuille-Michaud教授(INSERM-UMR1071, Clermont-Ferrand, France)提供的其他回肠乳糜泻分离株LF10, LF11, LF86和LF13，2也进行了筛查阿发操纵子。
生成阿发-1表达重组大肠杆菌
根据序列鉴定，Afa-1可能是负责血凝的黏附蛋白，从血凝阳性克隆中提取纯化的fosmid大肠杆菌8 h8。完整的afa-1操纵子(6.8 kb)被分离Xba我/SpeI限制性内切酶消化，经凝胶电泳纯化，用T4 dna连接酶连接pUC18并繁殖大肠杆菌1 - shottop10 (Invitrogen)选择在100µg/mL氨苄西林琼脂上。然后，pUCAfa被用来转化化学能力大肠杆菌EPI300-T1包含空的fosmid，以便与大肠杆菌8 h8。的存在和方向afa-1PCR结果证实。功能性粘连蛋白通过血凝和与HEp-2细胞的粘附证实(见补充文件S2，仅在线提供)。
弥漫性粘附于HEp-2细胞
的能力大肠杆菌在1%甲基α-的存在下，评估了分离株、fosmid和pucafa转化的结构介导HEp-2的弥散粘附d-甘露吡喃苷以排除1型毛介导的粘连，27阳性对照包括DAEC C1845。26
肠上皮细胞系的粘附和侵袭
对…的坚持和侵犯大肠杆菌在甲基α-存在的情况下，庆大霉素保护实验评估了HEp-2、I-407和分化的co2细胞(融合后15d)d-mannopyranoside。5细菌在Luria-Bertani琼脂上培养过夜，附着和入侵计算为原始接种量的百分比，数据相对于野生型AIEC HM358表达。
实时PCR检测VEGF
Confluent I-407单元(8×105细胞/孔)被血清饥饿24小时，然后感染4小时，感染多重数20 (MOI 20)大肠杆菌ep300 - t1 /pCC1FOS与afa-1操纵子(pUCAfa)或载体(pUC18)，或DAEC C1845(已知上调血管内皮生长因子(VEGF))。20.总RNA分离(RNeasy试剂盒;Qiagen)并通过NanoDrop进行量化。VEGF信使RNA在使用人类的Lightcycler480系统中通过第一链合成互补DNA (Roche, Burgess Hill, UK)的定量PCR进行评估VEGF或β肌动蛋白特定引物(Eurogentec)和罗氏通用探针库的探针(见在线补充文件S1，仅在线提供)。
大肠杆菌在J774A中的复制。1巨噬细胞
巨噬细胞在24孔板上(105细胞/孔)24小时，并感染(MOI 10)大肠杆菌HM358，库克隆或大肠杆菌在无抗生素介质中构建。巨噬细胞内复制是通过6小时或24小时后裂解庆大霉素处理的细胞内细菌的恢复来确定的，相对于3小时时的细胞内细菌数量。13
培养中通过M细胞的易位
如前所述，通过Caco2-cl1和Raji-B细胞共培养产生的M细胞进行易位。28CD易位证实了m细胞的成功生成大肠杆菌HM605和0.5µm黄绿色fluspheres (Invitrogen)。全程监测跨上皮电阻。
巨噬细胞内复制基因筛选htrA而且dsbA,lpfA以及基因毒素的产生繁荣正义党结肠粘膜致病性岛大肠杆菌
AIEC巨噬细胞存活和复制相关基因的PCR检测dsbA而且htrA，17，18两个主要的通滤波器操纵子(lpfA志贺氏杆菌而且lpfALF82)在回肠CD AIEC中鉴定，19被执行。聚合酶链反应对繁荣正义党在IBD和CRC患者中普遍存在。22详细的引物在补充文件S1中(仅在线提供)。
统计数据。
N为独立实验的总数，每个处理组有N个重复。评估独立组的正态性和方差相等性，并使用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis进行分析，然后对治疗手段进行两两比较(StatsDirectv2.6.2；英国销售)。比较PCR数据集，Fisher精确和χ2适当使用试验，其中N为患者数量，N为大肠杆菌．p<0.05为差异显著。
结果
从血凝素阳性中提取的Fosmids大肠杆菌来自CRC粘膜的克隆文库大肠杆菌HM358具有一个包含伞毛粘连蛋白的公共区域afa-1操纵子。
随机剪切30-50 kb的DNA片段，共生成968个fosmid克隆大肠杆菌HM358，血凝阳性CRC结肠粘膜分离物。结果是968人中的8人大肠杆菌文库克隆血凝阳性。对454个序列数据的分析仅识别出完整的阿发-1与血凝阳性fosmids一样，为毛缘粘连蛋白fa-1编码的操纵子，加上一些附加的周围转座酶和整合酶元件(图1一个;参见补充文件S3，仅在线提供)。的阿发识别的操纵子包含6个开放阅读帧，编码AfaA(转录调节因子)，AfaB(质周伴侣)，AfaC(引子)，AfaD(入侵素)，DraP(在dna中发现的连接元件)半径标注操纵子)和AfaE-1(抗甘露糖粘连蛋白);图1a . PCR靶向672 bp的扩增子afaC证实了阿发父操作子中的操作子大肠杆菌HM358和所有8个血凝阳性的fosmid克隆，而8个血凝阴性的克隆随机从文库和大肠杆菌EPI300-T1 / pCC1FOS阿发负(图1B). HM358的核苷酸序列afa-1集群存入GenBank;加入不。JN688153．
Haemagglutinin-positive大肠杆菌的克隆库中大肠杆菌HM358具有一个包含伞毛粘连蛋白的公共区域afa-1操纵子。(A)血凝(HA)阳性克隆共享的共同区域的基因组组织包括afaA(编码转录调节器);afaB(伴侣);afaC(引导);afaD(侵袭素);使滴下(链接元素)和afaE-1(一个adhesin)。(B) PCR用于afaC．8个血凝阳性克隆均检测到一个672 bp的片段大肠杆菌HM358。大肠杆菌缺乏EPI300-T1/pCC1FOS和8个血凝阴性病灶afaC．
PCR检测8种含fosmid的血凝均为阳性大肠杆菌是阳性的fliC, fimA, fimC1，fimH而且ompC但是对于原先都效命于而且lpfA．
发病率上升阿发在粘膜大肠杆菌乳糜泻和结直肠癌患者的分离株
聚合酶链反应对afaC(存在于阴毛粘连蛋白家族的所有操纵子中)在结肠粘膜的一个大面板中大肠杆菌分离株的流行率增加阿发在乳糜泻分离株中(14例患者中有9例;p=0.005, Fisher精确检验)和CRC (14 / 21;p=0.0009)，但UC(21人中的8人)与对照组(24人中的4人)相比没有差异;表1)．当用大肠杆菌作为分母，存在afaCCD(71株分离株中39株(54%))、UC(28/51(54%))和CRC(73/120(60%))也比对照组(11/39(28%))更常见;所有p≤0.02,CRC与对照p=0.0008， χ2；表2．与AIEC LF82一样，回肠乳糜泻分离株LF11和LF86均为阴性afaC回肠分离株LF10和LF13阳性。
存在阿发-1操纵子与HEp-2细胞的弥漫性粘附和侵袭相关
感染HEp-2细胞6 h后，AIEC HM358及全部8个血凝阳性(afa-1拥有的)文库克隆显示DAEC对HEp-2特征的弥散粘附(图2a - c)。随机选择的8个血凝阴性克隆没有观察到HEp-2粘附，K-12镀株也没有大肠杆菌EPI300-T1 / pCC1FOS。所有血凝阳性(afa-1拥有)大肠杆菌入侵HEp-2细胞，其水平与观察到的HEp-2细胞相似大肠杆菌HM358。血凝阴性(afa-1消极的)克隆,阿发-阴性的AIEC LF82和k -12衍生的EPI300-T1电镀菌株对HEp-2的侵袭性都大大降低;p < 0.0001;克鲁斯卡尔-沃利斯(图2D)。
存在afa-1血凝作用中的操纵子大肠杆菌与HEp-2上皮细胞的弥漫性粘附和侵袭有关。感染HEp-2细胞的吉氏染色大肠杆菌菌株。(A)所有8个血凝素阳性文库克隆均与细胞培养呈弥漫性粘附。(B)从文库中随机选择的8个血凝(HA)阴性的fosmid克隆是非粘附的。(C)结肠粘膜相关大肠杆菌HM358表现为弥漫性黏附大肠杆菌C1845。的大肠杆菌含pCC1Fos的K12电镀菌株EPI300T1无粘附。(D) 8个血凝阳性的fosmid库克隆afa-1表现出弥漫性粘附的基因簇，与血凝阴性克隆相比，显示出更强的入侵Hep-2细胞的能力。入侵计算为原始接种的百分比(感染的多样性10)，并表示相对于大肠杆菌LF82先前被证明对该细胞系具有侵袭性。2* p<0.05， *** p<0.001与仅含pCC1Fos的无创镀菌EPI300-T1相比(均值±SEM;N=3个试验，每个试验重复N=3个;克鲁斯卡尔-沃利斯)。
存在阿发-1操纵子与能力相关大肠杆菌粘附:粘附并侵入肠上皮细胞
8个血凝阳性大肠杆菌克隆具有阿发-1均显示粘附未分化的I-407细胞(相对于HM358的粘附为0.55±0.13)(平均±SEM)，而非血凝，阿发负大肠杆菌, 0.12±0.02;n=4 p<0.0001, Kruskal-Wallis (图3A)同样，血凝阳性，阿发-1拥有大肠杆菌与血凝阴性相比，I-407细胞(相对HM358细胞的浸润为0.31±0.13),阿发-阴性克隆(0.01±0.01);p < 0.0001 (图3B)。Haemagglutination-positive大肠杆菌克隆具有阿发-1也显示出对完全分化的Caco2细胞有更强的粘附力(阿发阳性克隆数，0.74±0.14阿发,阴性克隆，0.3±0.02);N =4, p<0.0001 (图3C).值得注意的是，8个血凝阴性(阿发-1消极的)大肠杆菌能够侵入分化的Caco2 (图3D).电镀菌株EPI300-T1/pCC1FOS对两种细胞系的粘附和侵袭均可忽略不计。
存在阿发-1在血凝大肠杆菌与粘附和侵入肠上皮细胞的能力有关。拥有8个血凝阳性文库克隆的相对能力afa-1（afaC+ (PCR测定)和血凝阴性克隆(n=8) (A)粘附和(B)侵入I-407细胞。数据平均值(±SEM)相对于观察到的大肠杆菌HM358;n = 4。增加(C)粘附，(D)入侵分化的Caco2细胞通过afa-1观察到具有-的克隆体。(E及F)大肠杆菌ep300 - t1 /pCC1FOS与afa-1(pUCAfa)粘附并侵入I-407细胞。与电镀应变相关的数据;N=3，每个N=3 - 5个重复)。p由Kruskal-Wallis确定的值。阿发，阴毛粘连素;afa-1，阴毛粘连素操纵子1;afaC，编码伞毛粘连蛋白外膜引入蛋白的基因。
转染的充分afa-1将操纵子(pUCAfa)转化到电镀菌株中，与pUC18转化的电镀菌株相比，操纵子对I-407细胞的粘附和侵袭性增加;p<0.0001, Kruskal-Wallis (图3E、F)。使用分化的Caco2细胞也得到了类似的结果(数据未显示)。
评估afaC先前评估的24株结肠粘膜分离物粘附和侵入I-407上皮细胞的状况513个中有9个afaC阳性菌株对I-407细胞具有侵袭性。然而,各种各样的afaC-阴性菌株，包括LF82，也被观察到对该细胞系具有侵袭性。
的存在afa-1在大肠杆菌移植VEGF肠上皮细胞表达
VEGF感染I-407细胞mRNA表达上调3.07±0.16倍大肠杆菌ep300 - t1 /pCC1FOS与afa-1与未感染的细胞相比，AIEC HM358的操纵子(pUCAfa)和3.71±0.22倍(N=4, N= 3;p < 0.001克鲁斯卡尔-沃利斯)。感染DAEC C1845的细胞反应水平相似(N=2, N= 3;p < 0.001);图4．
存在阿发在大肠杆菌上调血管内皮生长因子(VEGF)在体外培养肠上皮细胞中的表达。融合血清饥饿I-407细胞(8×105细胞/孔)感染野生型结肠直肠癌粘附，浸润性4小时大肠杆菌HM358, Afa/Dr弥散粘附大肠杆菌C1845或大肠杆菌ep300 - t1 /pCC1FOS与afa-1操纵子(pUCAfa)或载体(pUC18)和总RNA提取。VEGF相对于β肌动蛋白．相对于未感染细胞的数据平均值(±SEM)(设为100%);N = 2 - 4;每个n=3个重复)。*p<0.05， *** p<0.001由Kruskal-Wallis测定。AIEC，粘附性，侵入性大肠杆菌；DAEC，弥漫性粘附大肠杆菌。
Afa-1的存在与粘膜相关大肠杆菌是否具有在巨噬细胞内复制或通过M细胞转运的能力
与亲本分离物HM358相比，8种血凝阳性(afa-1拥有)大肠杆菌克隆(见补充文件S4，仅在线提供)。同样，8个血凝阴性克隆中有7个被检测(4C11除外)大肠杆菌含有pUCAfa的EP1300-T1电镀菌株不能在巨噬细胞内复制。此外，在初次感染和庆大霉素治疗后，重组较少大肠杆菌包含阿发-1内化于巨噬细胞内(0.6±0.1×104CFU/well)与大肠杆菌仅含pUC18(11.0±2.1×10)4CFU /;p<0.0001)，表明拥有Afa-1抑制吞噬作用(表3)．还观察到血凝阳性的fosmid文库克隆具有afa-1Operon，表现出比血凝阴性无明显的能力增加(afa-1阴性)克隆从巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α (TNFα)(见补充文件S4，仅在线提供)。AIEC HM358从巨噬细胞中释放出类似的TNFα水平(1712±236 pg TNFα/mL)大肠杆菌K-12菌株ep300 - t1 /pCC1FOS从pUCAfa中表达Afa-1(1742±31 pg/mL)，与未感染对照组(16±5 pg/mL;n = 3)。全部281结肠粘膜大肠杆菌分离株(包括HM358)表达dsbA而且htrA,与巨噬细胞内复制相关。
而HM358(表达lpfA)在M细胞间易位，未见显著易位大肠杆菌EPI300-T1 pUCAfa，表明拥有Afa-1粘连素不支持FAE转胞作用(见补充文件S5，仅在线提供)。
讨论
本研究表明结肠粘膜相关afa-1 -CD和CRC中DAEC阳性增高。它们在培养中粘附并侵入肠上皮细胞，但也通常表达lpfA与m细胞易位有关，m细胞易位更有可能是入侵的主要初始途径在活的有机体内．19结肠粘膜DAEC分离株也具有htrA而且dsbA与巨噬细胞的存活有关，17，18这是cd相关AIEC的部分特征表型。12
afa的表达赋予了上皮细胞诱导VEGF表达的能力，与血管生成和肿瘤发展相关29，30.这在这里得到了证实。我们最近展示了结肠粘膜大肠杆菌从IBD和CRC患者中更常见的表达繁荣正义党致病性岛，其基因产物导致代谢产物大肠杆菌素的形成，大肠杆菌素是一种基因毒素，能够引起上皮DNA损伤并在炎症相关CRC小鼠模型中诱导肿瘤。22这里是结肠粘膜大肠杆菌CRC和UC分离株通常表达两者繁荣正义党而且afaC在一起。CDafaC -表达大肠杆菌然而，分离株通常不表达繁荣正义党．这可能与没有结肠受累的乳糜泻中CRC风险的增加有关，也增加了CRC风险增加的可能性繁荣正义党粘膜相关表达大肠杆菌可能是结肠炎的结果，因为繁荣正义党被证明没有影响大肠杆菌-诱导炎症的小鼠IBD模型。22
管有阿发-1的子组大肠杆菌对HEp-2上皮细胞具有特征性弥散粘附模式，包括UPEC和腹泻性DAEC菌株。20.，21，27，31测序结果显示阿发-1在我们的结肠粘膜分离物中鉴定的操纵子具有相同的连接子元件使滴下就像博士操纵子，编码与afa相关的Dr粘附蛋白。转染阿发-1操纵子变成非致病性的大肠杆菌EPI300-T1 (K-12)菌株不仅具有粘附HEp-2的能力，而且还具有侵入HEp-2和其他细胞系的能力，从而赋予部分CD AIEC表型。野生型菌株HM358仍表现出较强的粘附和入侵能力afa-1转染大肠杆菌K-12菌株，这意味着其他粘连素/入侵素也参与其中，这在偶尔出现的I-407入侵中得到证实阿发消极的隔离。
的阿发-1操纵子不赋予AIEC报告的与CD发病机制相关的其他表型属性，即巨噬细胞内复制。两个基因htrA而且dsbA已知支持AIEC LF82在巨噬细胞内的复制，两者都编码耐压蛋白，减少吞噬溶酶体内的细菌杀伤。17，18从乳糜泻和结直肠癌患者的结肠粘膜中分离出的DAEC也具有htrA而且dsbA需要完成AIEC表型。
具有DAEC表型的UPEC先前已被证明可侵入上皮细胞在体外但目前还不确定它们是否会侵入完全分化的肠细胞。32值得注意的是，这同样适用于从乳糜泻分离出的AIEC，在人类粘膜样本的肠上皮细胞中还没有令人信服的发现。事实上，即使是真正的肠道病原体，如沙门氏菌spp。志贺氏杆菌杆菌、分枝杆菌和霍乱弧菌需要在覆盖在佩耶氏斑和淋巴滤泡上的特化M细胞中进行转位，作为它们最初的入口。33这似乎是与cd相关的大肠杆菌同时，初始入侵发生在活的有机体内通过M细胞，这一过程可能需要同时拥有LpfA，如图所示，在CD DAEC和FimH中很常见。19，34这与回肠远端的Peyer斑块和结肠中的淋巴滤泡是乳糜泻最早病变(蚜虫溃疡)的部位的证据相一致。34，35有趣的是，早期克罗恩病病变影响的Peyer斑块和淋巴滤泡周围有新生血管，在结肠镜检查中可能被视为“红环征”36之前注射的荧光素增强了37这一现象可能合理地反映了由afa阳性驱动的血管生成大肠杆菌．
粘膜相关的AIEC已被报道，特别是在乳糜泻患者的回肠，2，3.，14虽然它们也发生在结肠中，4 - 6包括来自同一个体的回肠和结肠样本的研究显示了粘膜相关大肠杆菌，如有，遍及回肠末端和结肠。7它们与回肠粘膜的粘附需要过度表达CEACAM6，发生在炎症反应中。38，39“范例”回肠AIEC LF82，2是afaC负的,16虽然其他回肠分离物测试发现是afaC积极的。从这里提出的研究来看，似乎DAEC拥有afa-1可能更适合结肠环境的殖民。
Afa/Dr家族成员通常使用糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，即腐烂加速因子(DAF)作为细胞受体。20.DAF位于分化的Caco2细胞的顶端。40Afa/Dr粘连素也不同程度地结合到CEACAM-1, CEACAM-5 (CEA)和CEACAM-6。41DAEC结合通过脂筏依赖机制诱导粘附细菌周围DAF和CEA家族受体的募集，从而启动内化和细胞信号传递。29，40-43CEACAM-6和DAF在IBD和CRC中均上调，44，45从而有利于Afa/ dr表达大肠杆菌殖民。DAEC感染人结肠T84细胞系促进IL-8释放和中性粒细胞经上皮迁移，进而诱导TNFα和il -1β依赖性DAF上调。46
先前的研究表明，DAEC对嗜中性粒细胞的吞噬有部分抗性。47重组大肠杆菌表达Afa/Dr粘连蛋白，包括Afa-1, Afa- iii, Dr和F1845，粘附在中性粒细胞上，但保持在细胞外。48目前的研究表明，阿发也赋予巨噬细胞的吸收抗性。
有趣的是，Afa-1的存在虽然赋予了侵入某些上皮细胞系的能力，但并不赋予在M细胞间易位的能力。尽管这里已经使用了在体外m细胞模型，我们之前已经证明了在该模型中获得的人类结肠粘膜相关的结果之间的良好相关性大肠杆菌以及它们在Ussing室培养的回肠外植体中跨人类FAE转运的能力。28M细胞是吞噬性的在体外这可能是M细胞间的易位与吞噬作用的关系大于与侵袭的关系。转位不仅依赖于LpfA的占有，而且依赖于FimH与其受体GP2之间的相互作用，GP2由M细胞选择性表达。19，34大多数的大肠杆菌这里显示的是占有afaC，dsbA, htrA而且lpfA，也拥有fimH．有趣的是，在CD患者中发现的循环抗胰腺抗体以GP2为表位。49在乳糜泻相关自身抗体的发展过程中，细菌蛋白和GP2的组合可能以类似于麦胶蛋白肽和组织转谷氨酰胺酶的共同呈现的方式作为外来抗原呈现，这似乎是合理的。
我们的数据显示结肠粘膜的患病率较高afaC -积极的大肠杆菌回肠和/或结肠乳糜泻和结直肠癌患者的发病率高于对照组。以前的研究大肠杆菌从CD患者分离的分离株中未发现显著差异afaE-3或阿发/ draBC在乳糜泻患者中也没有阿发/ draBCAIEC/非AIEC分离株之间的频率。10，11然而，同一研究小组最近报告说afaE-3大约24%的大肠杆菌新诊断的乳糜泻患者的分离物。50这些研究的一个主要区别是用于筛选分离株的引物的选择。本研究中所使用的引物均为靶向阿发菌株，不管afaE亚型。25
DAEC不仅能促进上皮细胞分泌VEGF，还能诱导上皮-间充质转化(epithelial - mesenchymtransition, EMT)29与癌的进展有关。51EMT有助于CD小鼠模型的肠道纤维化，EMT标记物也已在克罗恩瘘管中检测到。52，53VEGF/VEGFR2信号在炎症和结肠炎相关癌症之间也有类似的联系，并促进肿瘤生长在活的有机体内．30.
结肠粘膜DAEC与结直肠癌之间的关系增加了细菌与结直肠癌发病机制之间的联系。我们之前推测，细菌-上皮的相互作用可能在从发育不良到癌症的进展中特别重要。54粘膜发育不良通常是杯状细胞耗尽和缺乏粘膜。此外，下层的糖萼稀疏。因此，细菌更容易直接接触正常结肠中相对无菌的粘膜表面。这将允许细菌成分和toll样受体之间的相互作用，随后通过MyD88向核因子κ B激活发出下游信号。上皮核因子κ B激活，而不是组织学炎症，被认为是炎症相关CRC的机制，55此外，myd88缺陷小鼠杂交Apc最小值小鼠的肿瘤形成明显减少。56的能力繁荣正义党表达大肠杆菌如果这些细菌与结肠上皮密切接触，可能会使这些细菌对宿主特别危险。如果上皮相关细菌(如DAEC)在结直肠癌和乳糜泻中起致病作用，那么饮食中摄入可溶性植物纤维可防止细菌在粘膜上聚集5，28可能对两种情况都有保护作用。
结肠粘膜间的强关联阿发-阳性DAEC以及CD和散发性CRC均提示DAEC可能在这两种疾病的发病机制中发挥作用，但并不意味着两者所涉及的机制相同。因此，共表达lpfA，对m细胞易位很重要，与CD有关，但不太可能与CRC有关。基因毒性岛的共表达繁荣正义党，具有诱导双链DNA断裂的能力，与CRC相关，但与IBD不明显。因此，可能的机制大肠杆菌-诱导的癌变可能独立于IBD发病机制的任何影响。与Afa表达的联系可能与DAEC定植结肠粘膜的倾向有关，尽管尚未进行直接研究来解决这一问题。最终需要进行干预研究，以评估DAEC在CD和CRC发病机制中的作用。
参考文献
补充材料
脚注
贡献者BJC和JMR贡献相当。BJC、JMR和CW获得了资金，并与JRM一起设计了研究。AA、BJC、CC、CLR、FS、MKF、MP-H、PKF、PK、NH进行实验。BJC、CW、MP-H、MKF、JRM和JMR对数据进行分析和解释。BJC, JMR和MP-H起草了手稿，并由所有作者进行了批判性修订。
资金MPH, FS, PKF和PK得到了利物浦NIHR微生物疾病生物医学研究中心(01CD1)的支持。MKF由Crohn's and Colitis UK (M/08/1)资助。AA由沙特阿拉伯达曼大学支持。JRM和CC得到了爱尔兰科学基金会的支持。BJC感谢来自英国西北癌症研究基金(CR727)的资助和欧洲科学基金会在研究网络计划(欧洲胃肠健康研究网络)框架内的支持。发起人在研究设计中没有任何作用，也没有数据的收集和解释。
相互竞争的利益JMR是大西洋、宝洁和福尔克咨询委员会的成员，曾获得雅培、福尔克、Ferring、葛兰素史克、宝洁和先灵葆雅的演讲荣誉，并与利物浦大学和Provexis PLC一起，拥有使用可溶性纤维制剂作为克罗恩病维持疗法的专利。BJC获得了安进公司的演讲酬金。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明我们申明，所有资料对于读者是必要的Gut为了理解和评估论文的结论将被存档在一个批准的数据库中，并提供给任何读者。出版后，所有对材料和数据的合理要求都将得到满足。有一个利物浦大学MTA关于人体粘膜大肠杆菌．我们可以证实，迄今为止，国际科学界的研究人员提出的从利物浦档案中提取分离物的所有要求都得到了批准，并提供了材料。
加入数量核苷酸序列afa-1操纵子的大肠杆菌HM358已提交GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）;加入数量JN688153．