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胃
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OCT1是胃癌中synbatin相关ERK信号的决定因素，具有独立的预后意义
  1. 金黔1，
  2. 宣香港1，
  3. Niantao邓2，
  4. 帕特里克·谭2，3.，
  5. Haoyan陈1，
  6. 吉林王1，
  7. Zhaoli李4，
  8. 你们胡1，
  9. 熊维平邹5，
  10. 杰徐1，
  11. 晶圆方1
  1. 1肿瘤基因及相关基因国家重点实验室，消化内科与肝病科，仁济医院，上海交通大学医学院，上海癌症研究所，上海消化疾病研究所，中国上海
  2. 2杜克-新加坡国立大学研究生医学院癌症和干细胞生物学项目，新加坡、新加坡
  3. 3.癌症治疗学和分层肿瘤学，新加坡基因组研究所，新加坡、新加坡
  4. 4中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，中国哈尔滨
  5. 5外科，密歇根大学，密歇根州安阿伯美国
  1. 对应到方景远博士;jingyuanfang在}{yahoo.com徐洁博士;jiexu@yahoo.com

摘要

客观的八聚体转录因子1 (OCT1)在肠化生和胃癌(GC)中均有表达，但OCT1在胃癌中的确切作用尚不清楚。本研究的目的是确定OCT1在胃癌中的功能和预后意义。

设计在成对的正常和癌变胃组织中检测OCT1的表达，并通过单因素和多因素生存分析分析OCT1的预后意义。在体外和异种移植小鼠模型中研究了OCT1对synbindin表达和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的功能。

结果OCT1基因在胃癌中反复扩增和上调。OCT1过表达和扩增与胃癌患者的生存率低相关，其预后意义已由独立患者队列证实。将OCT1过表达与美国癌症分期联合委员会相结合，可以改善胃癌患者的生存预测。OCT1的高表达与GC组织中ERK丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活有关。OCT1通过转激活synbindin发挥作用，synbindin与ERK DEF结构域结合，促进ERK被MEK磷酸化。OCT1-synbindin信号通路导致ERK底物ELK1和RSK的激活，导致细胞增殖和侵袭的增加。人类GC组织样本的免疫荧光研究显示，OCT1蛋白水平与synbindin表达/ERK磷酸化密切相关。在小鼠异种移植模型中上调OCT1诱导synbindin表达和ERK激活，导致体内肿瘤加速生长。

结论OCT1是synbatin介导的ERK信号转导的驱动因子，也是GC预后和分子分型的有希望的标记物。

  • 胃癌
  • 癌症遗传学
  • 信号转导
  • 细胞增殖
  • 细胞迁移

这是一篇开放获取文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 3.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2013-306584

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 八聚体转录因子1 (OCT1)是OCT4多能因子的同源物，在肠化生灶和胃癌(GCs)中表达。

    • 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是GC中最常改变的信号通路之一。

    • Synbindin是细胞外信号调节激酶(ERK)/MAPK信号通路的空间调节因子。

    新的发现是什么?

    • OCT1基因在GC基因组中反复扩增，在受体酪氨酸激酶(RTK)通路中，OCT1扩增与KRAS和FGFR2基因表现出互排性。

    • OCT1基因扩增和上调与胃癌患者生存不良相关，且有独立数据集支持。

    • OCT1转活化synbindin, synbindin结合到ERK DEF结构域，并通过MEK1增强ERK磷酸化，导致ERK底物ELK1和RSK的激活。OCT1的表达与GC组织中synbindin和ERK磷酸化水平密切相关。

    • OCT1上调抑制GC细胞凋亡，促进GC细胞增殖和侵袭。synbindin表达的下调阻断了OCT1的促恶性作用。

    • 在异种移植瘤模型中，OCT1显著促进了synbindin表达和ERK激活，导致体内肿瘤生长加速。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • OCT1的扩增有助于ERK/MAPK的激活，它可能与RTK通路中的其他成分一起标记有可能通过RTK/RAS定向疗法治疗的GC患者(简化估计高达46%的GC人群)。

    • OCT1是胃癌的独立预后因素，将OCT1表达与美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer分期)相结合，可进一步提高对患者生存的预测。OCT1基因的扩增和上调可作为胃癌预后的一个有前景的生物标志物。

    简介

    胃腺癌，或胃癌(GC)，是全球第四大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。1尽管手术和辅助治疗方法有所改善，胃癌患者的预后仍然令人沮丧，5年总生存率低于25%。2鉴定控制胃癌严重程度的基因及其对预后的预测价值具有重要的临床意义。3.，4在GC分子特征的系统研究中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)被发现是这种致命疾病中最常被激活的途径。5为了支持这一点，受体酪氨酸激酶(RTK)/RAS/MAPK通路的几个组分被发现在GC中频繁扩增。6，7由于MAPK信号也受时空调控机制控制，8，9测试其他途径是否有助于GC中的MAPK去监管化是有意义的。

    八聚体转录因子1 (OCT1) (POU2F1)属于POU同源结构域转录因子家族。10这种蛋白质激活或抑制各种基因的转录，如B细胞中的免疫球蛋白基因11还有一些白细胞介素。12越来越多的数据表明，OCT1可能有助于恶性转化过程，而OCT1的缺失抑制小鼠胚胎成纤维细胞的致癌转化和p53缺陷小鼠的致瘤性。13此外，OCT1被认为通过转激活CDX2基因促进胰腺癌和肠癌细胞的成瘤。14有趣的是，在一个系列中，OCT1在87%的肠化生灶(一种癌前病变)和74%的胃癌中呈阳性。15尽管如此，在GC细胞中发现OCT1没有转激活CDX2的能力，尽管它可以结合CDX2启动子。15尽管最近人们努力了解OCT1作为转录因子的活动，16OCT1在胃癌发生中的作用尚不清楚，OCT1的表达是否与胃癌的临床病理特征相关尚不清楚。

    在这里，我们报道了OCT1作为GC的独立预后标志物，它通过转激活synbindin来调节细胞外信号调节激酶(ERK) MAPK信号。Synbindin是转运蛋白粒子复合物的核心亚基，参与从内质网到高尔基体的囊泡靶向和融合。17我们之前发现synbindin作为一种与MEK和ERK2结合的支架蛋白，促进MEK依赖的磷酸化和ERK2在高尔基体上的激活。9在本研究中，我们进一步证明了OCT1结合并转激活了synbindin的启动子，从而诱导了GC中synbindin介导的ERK信号的激活。我们获得的体外和体内数据支持OCT1对ERK信号通路和GC细胞侵袭行为的主要调节作用。重要的是，我们证明了OCT1的扩增和上调与GC患者的不良预后有关。通过这些方法，我们旨在阐明OCT1在胃癌中的功能和预后意义。

    材料与方法

    免疫荧光

    组织标本取自2003年7月至2009年1月在上海仁济医院接受手术的患者(免疫荧光89例，荧光原位杂交10例)。该议定书得到了上海交通大学医学院仁济医院伦理委员会的批准，研究是根据1975年赫尔辛基宣言的规定进行的。所有参与研究的参与者都获得了书面知情同意，临床信息的收集也得到了机构审查委员会的批准。同时，从这些患者取89个相邻组织标本作为配对对照。组织切片在二甲苯中脱蜡，用分级系列乙醇再水化。所有载玻片均用NaBH4处理以抑制组织自身荧光。用一抗检测OCT1和synbindin表达水平(OCT1，稀释1:40;Synbindin，稀释1:40)根据制造商的说明。用二抗(alexa488 -抗小鼠和alexa546 -抗兔)分别标记synbindin和OCT1。根据染色强度定量表达蛋白。

    荧光原位杂交

    在福尔马林固定的石蜡包埋组织中检测基因拷贝数变异(CNV)的FISH方案已经在前面详细描述过。18简单地说，OCT1 DNA探针使用光谱绿色标记，对照探针使用光谱橙色标记(染色体1的着丝粒CEP探针)(Abbott分子公司，Des Plaines，伊利诺伊州，美国)。混合载玻片用DAPI反染色，并使用蔡司LSM710共聚焦显微镜(卡尔蔡司，雷根斯堡，德国)进行分析。

    其他材料和方法包括染色质免疫沉淀(ChIP)、细胞活力和侵袭分析、流式细胞仪、基因集富集分析(GSEA)、CNV分析、TF结合鉴定、Western blotting和体内实验等，可在网上补充信息。

    结果

    胃癌中OCT1表达与CNV的关系

    我们首先用免疫荧光组织化学方法研究了90例胃腺癌及其邻近正常对照中OCT1的表达水平。结果，在正常胃黏膜中可见到弱或中度的OCT1 (图1A)，但其在GC细胞中的表达量显著升高(p<0.0001，图1B, C)。值得注意的是，OCT1在GC细胞的细胞核中呈强阳性，表明其作为转录因子的活性状态(图1D)。此外，我们在肠化生的胃组织中检测到OCT1表达增加(见在线补充图S1A)，这证实了之前的发现。15

    Amplification and overexpression of octamer transcription factor 1 (OCT1) gene in gastric cancer (GC). (A) Expression of OCT1 in normal gastric tissues as determined by immunofluorescence. Scale bars indicate 10µm in all panels. (B) Immunostain of OCT1 in gastric cancer tissues. (C) Statistical analysis of OCT1 expression in normal and GC tissues (P<0.0001, Mann Whitney test). (D) The immunofluorescent image shows OCT1 (in green) and cell nucleus (in blue)OCT1 is strongly expressed in the cell nucleus (red arrows). (E) The frequency of OCT1 amplification in three independent GC cohorts as indicated. (F) OCT1 genomic amplification confirmed by fluorescence in-situ hybridization (FISH) assay. Green signals indicate the OCT1 FISH probe, and red signals probe to centremore 1. Scale bars indicate 5µm in all panels. (G) OCT1 mRNA levels were significantly higher in samples with OCT1 gained CNA compared with the samples without CNV in the TCGA dataset (P<0.01, 2-sided t-test). (H) Relationship between the CNVs of OCT1 and frequently altered genes in Receptor tyrosine kinase (RTK) pathway. The mutual exclusivity between the CNVs of OCT1 (POU2F1) and other genes was determined by dimension reduction permutation (DRP) algorithm (*P<0.05).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    八聚体转录因子1 (OCT1)基因在胃癌(GC)中的扩增和过表达。(A)免疫荧光法测定正常胃组织中OCT1的表达。比例尺在所有面板上表示10µm。(B)胃癌组织中OCT1的免疫染色。(C) OCT1在正常组织和胃癌组织中表达的统计分析(P<0.0001, Mann Whitney检验)。(D)免疫荧光图像显示OCT1(绿色)和细胞核(蓝色)OCT1在细胞核(红色箭头)中强烈表达。(E) 3个独立GC队列中OCT1扩增的频率。(F)荧光原位杂交(FISH)检测证实OCT1基因组扩增。绿色信号为OCT1 FISH探针，红色信号为centermore 1探针。比例尺表示所有面板中的5µm。 (G) OCT1 mRNA levels were significantly higher in samples with OCT1 gained CNA compared with the samples without CNV in the TCGA dataset (P<0.01, 2-sided t-test). (H) Relationship between the CNVs of OCT1 and frequently altered genes in Receptor tyrosine kinase (RTK) pathway. The mutual exclusivity between the CNVs of OCT1 (POU2F1) and other genes was determined by dimension reduction permutation (DRP) algorithm (*P<0.05).

    此外，我们利用癌症基因组图谱(TCGA) GC队列的数据分析了GC组织中OCT1的CNV，19新加坡6以及VUMC队列。20.采用GISTIC 2.0包基于Affymetrix SNP6微阵列数据(TCGA和新加坡数据集)识别病灶改变事件，采用CGHCall算法分析aCGH数据(VUMC数据集)。OCT1 (POU2F1)基因位于1号染色体的一个反复扩增的区域(见在线补充图S1B)， 305例患者中有31例(10.16%)出现局灶性扩增(q值<0.001)，但只有1例患者缺失(图1E)。这一结果得到了新加坡GC患者队列的证实，该队列报道了193例GC患者中有18例(9.33例)OCT1基因局灶扩增(图1E)。事实上，识别局部性和广域性(q值<0.25)CNV事件的算法显示出更高的OCT1扩增频率，范围从22.2% (VUMC队列中180例中有40例)到32.1% (TCGA队列中305例中有98例)(图1E，见在线补充图S1C-E)。我们对6个GC组织进行FISH分析，发现2个样本的OCT1基因拷贝数增加(图1F).对TCGA队列中mRNA和CNV数据的联合分析显示，获得OCT1的CNV与GC中显著较高的mRNA水平相关(图1此外，在RTK通路中，OCT1基因的扩增与KRAS和FGFR2基因的扩增表现出互排性，这些基因在GC中也经常发生改变(图1H)。

    OCT1基因扩增和上调与胃癌生存率差相关

    我们进一步研究了OCT1表达水平与胃癌不同临床病理特征的关系。当根据OCT1表达水平对患者进行分层(中位数分裂)时，发现OCT1高组肿瘤大小明显更大(p<0.0001，见在线补充图S2A)。然而，OCT1与胃癌患者的性别、年龄、美国癌症联合委员会(AJCC)分期或任何组织学亚型无关(见在线补充图S2B)，数据集(见联机补充表S1)。值得注意的是，OCT1过表达与胃癌患者生存不良密切相关(p<0.0001, Mantel-Cox试验，图2A)， oct1 -高组5年生存率(8.9%)明显低于oct1 -低组(51.1%)。事实上，OCT1水平的分层比广泛应用的AJCC分期显示出更高的预后意义(显著性p=0.0002, 5年生存期:20 vs 42.2个月，图2B)。当GC病例根据OCT1表达(四分位分割)或AJCC分期(I-IV)分为四组时，基于OCT1的方法也能更好地区分(见在线补充图S2C,D)。我们使用AJCC分期或OCT1水平，或两者的组合，确定了用于预测患者生存的受试者工作特征曲线(图2C)，基于oct1的预测曲线下面积(AUC)(0.751)高于基于AJCC阶段的预测模型(0.714)，而两者结合的AUC值最高(0.800)。

    Octamer transcription factor 1 (OCT1) gene amplification and upregulation are associated with poor survival in patients with GC. (A) Kaplan-Meier survival analysis of GC patients stratified by OCT1 expression level (median split). (B) Kaplan-Meier survival analysis of GC patients with different AJCC tumor stages (I-II v.s. III-IV). (C) The receiver operating characteristic (ROC) curves for predicting patient survival using AJCC stage (left panel), OCT1 level (middle panel) or combination of two factors (right panel). The area under curve (AUC) and the corresponding 95% CI are shown in the plots. (D) Different factors (including OCT1, AJCC stage, tumor size, sex and age) were analyzed for their association with patient survival using Cox regression model. The hazard ratio and 95% confident interval (CI) are plotted for each factor. (E) The GC patients in the Singapore cohort were stratified according to OCT1 mRNA level (median split) and compared for the survival using Kaplan-Meier analysis. (F, G) Gain in OCT1 gene copy number associated with poor survival in both the Singapore cohort (F) and VUMC cohort (G).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    八聚体转录因子1 (OCT1)基因扩增和上调与胃癌患者生存不良相关。(A)按OCT1表达水平分层的GC患者Kaplan-Meier生存分析(中位数分裂)。(B)不同AJCC肿瘤分期GC患者Kaplan-Meier生存分析(I-II vs . III-IV)。(C)使用AJCC分期(左)、OCT1水平(中)或两种因素组合(右)预测患者生存的受试者工作特征(ROC)曲线。曲线下面积(AUC)和对应的95% CI在图中显示。(D)采用Cox回归模型分析不同因素(包括OCT1、AJCC分期、肿瘤大小、性别和年龄)与患者生存的关系。为每个因素绘制了风险比和95%置信区间(CI)。(E)新加坡队列的GC患者根据OCT1 mRNA水平(中位数分裂)进行分层，并使用Kaplan-Meier分析比较生存率。(F, G)在新加坡队列(F)和VUMC队列(G)中，OCT1基因拷贝数的增加与生存率差相关。

    调整AJCC分期、肿瘤大小、患者性别和年龄的多因素Cox回归生存分析一致报告了OCT1过表达与较短生存期之间的强相关性(p=0.0001, HR=3.27, 95% CI 1.80 - 5.92，图2D;另见在线补充图S2E)。我们使用新加坡队列验证了预后的意义，发现OCT1 mRNA的下调与GC患者的生存率显著相关(p=0.007, Kaplan-Meier分析，图2E)。21此外，新加坡队列显示，OCT1的CNV增加也与较短的生存期显著相关(p=0.015，图2F)和VUMC GC队列(p=0.040，图2G)。20.这些发现一致表明OCT1是GC细胞有希望的预后标志物。

    ERK信号通路作为OCT1调控靶点的鉴定

    如上所述，OCT1在癌症中调控的确切途径尚不清楚。为了在无偏倚的基础上探索oct1相关通路，我们使用癌症基因组图谱项目(TCGA, 282名患者)GC队列的高通量rna测序数据和来自基因表达综合数据库的多肿瘤数据集(包括64个人类肿瘤和27个正常组织样本)进行了GSEA。22GSEA旨在检测预定义的功能相关基因集表达的协调差异。23在所有189个预定义的“致癌签名”基因集中，在TCGA GC数据集中，PDGF/ERK通路被确定为与OCT1表达最强的关联(图3A)和多肿瘤数据集(图3B).此外，Enrichment Map算法调整了基因集冗余度，也发现RAS-ERK信号通路与OCT1表达有很强的相关性(见在线补充图S3)。值得注意的是，大约一半(2083/4348)的oct1相关基因被发现是ELK1的诱导靶点，24它是ERK信号通路的主要效应器(图2C).这些发现一致表明OCT1可能参与了ERK信号通路的激活。

    Identification of extracellular signal-regulated kinase (ERK) signalling as a regulatory target of octamer transcription factor 1 (OCT1). (A, B) Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) identified significant association between OCT1 and ERK signaling pathway in both the TCGA gastric cancer dataset and the multi-tumor dataset. (C) Circos plot showing 2083 of the 4348 OCT1-associated genes are inducible by ELK1, a major effector gene in ERK signaling pathway. The histogram shows corresponding P values (log1/2 transformed) of the associated genes, with red color representing ELK1-inducible genes while blue indicating non-inducible genes. (D) The expression levels of OCT1 and ERK2 were subjected to Pearson correlation analysis, which suggested no correlation between the two genes (P=0.97). (E) Correlation between the protein levels of OCT1 and phosphorylated ERK (pERK) as determined by immunostain of gastric cancer and normal tissues. (F) Representative immunofluorescent image of OCT1 (labeled in red) and pERK (green) in normal gastric tissues. Zoomed sections are shown on the right panels. Scale bars indicate 100µm in all panels. (G) Representative gastric cancer immunostain images acquired by the same procedures as described previously.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    鉴定细胞外信号调节激酶(ERK)信号作为八聚体转录因子1 (OCT1)的调节靶点。(A, B)基因集富集分析(GSEA)在TCGA胃癌数据集和多肿瘤数据集中都发现了OCT1和ERK信号通路的显著相关性。(C) Circos图显示，4348个oct1相关基因中有2083个是由ELK1诱导的，ELK1是ERK信号通路中的主要效应基因。直方图显示了相关基因对应的P值(log1/2变换)，红色表示elk1诱导基因，蓝色表示非诱导基因。(D)对OCT1和ERK2的表达水平进行Pearson相关分析，两基因之间无相关性(P=0.97)。(E)胃癌和正常组织免疫染色测定的OCT1蛋白水平与磷酸化ERK (pERK)的相关性。(F)正常胃组织中OCT1(红色标记)和pERK(绿色标记)的代表性免疫荧光图像。放大后的部分显示在右边的面板上。比例尺在所有面板上表示100µm。(G)采用与前文相同的程序获得的代表性胃癌免疫染色图像。

    OCT1表达与胃癌中ERK磷酸化相关

    鉴于OCT1与ERK信号通路的相关性，我们探讨了OCT1是否与GC组织中ERK2的表达水平或其磷酸化/激活相关。有趣的是，rna测序数据分析表明OCT1和ERK2 mRNA水平之间没有关联(图3D)，而组织免疫荧光研究显示GC中OCT1表达与ERK2磷酸化(pERK2)水平有很强的相关性(图3E)。此外，从正常组织到GC组织，OCT1和pERK2水平协调升高(图3F, G)。这些结果提示OCT1在GC中磷酸化/激活ERK2的潜在意义。

    OCT1对synbatin介导的ERK磷酸化的调控

    由于我们小组已经确定synbindin是GC中ERK2磷酸化的关键调节因子，9我们怀疑OCT1是否可能通过调节synbindin来影响ERK信号。这一假设得到了synbindin启动子中假定的oct1结合位点(转录起始位点(TSS)上游- 700 bp内)的很好支持;见网上补充图S4A)。荧光素报告基因分析表明该启动子区域可被OCT1转激活(见在线补充图S4B)。此外，我们进行了ChIP实验，在体内测试OCT1与synbindin启动子的结合。结果，使用针对OCT1的特异性抗体(而不是对照IgG)从免疫沉淀复合物中回收的DNA中扩增出了synbindin的启动子区域，从而证实了OCT1与synbindin启动子区域的结合。为了确定OCT1在synbindin启动子上的确切结合位点，我们开发了一种3DTF序列扫描方法25基于OCT1蛋白- dna复合物的晶体学数据(pdb条目:1O4X)。synbindin TSS上游的- 253 ~ - 241序列与OCT1的结合倾向最高(图4A).为了证实这一发现，我们分析了先前ChIP-seq研究中获得的oct1结合片段的富集26在synbindin启动子中。该方法还确定了−253到−241区域是OCT1最强的结合剂(图4B).最后，该短序列插入的荧光素酶报告基因可被OCT1强转激活(图4C)，而其他映射到非预测位点的序列没有被转激活(见在线补充图S4D,E)。这些结果证实了两种专用预测方法的发现，表明OCT1结合并使synbindin启动子的- 253到- 241区域转活性。

    Transactivation of synbindin by octamer transcription factor 1 (OCT1) and effects on extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation. (A) TF-DNA crystallography structure-based prediction of OCT1 binding sites on synbindin promoter (OCT1-DNA complex structure shown on the right). Arrow heads in red and in grey respectively indicate the predicted binding sequence and other sequences tested by luciferase assay. (B) ChIP-seq enriched motif-based prediction of OCT1 binding on synbindin promoter (analysis scheme shown in the right panel). (C) The predicted OCT1-binding sequence (-253 to -241) and its mutated variant (both sequences indicated) were respectively inserted into a luciferase reporter and analyzed for their responses to OCT1. (D) Gastric cancer cells were transfected with OCT1 or control vector, and the mRNA level of synbindin was quantified by qPCR. (E) Western Blot of OCT1 and synbindin of cells treated as described as above. (F) Cells were treated by OCT1 siRNAs and control siRNA, and the level of synbindin mRNA was quantified by qPCR. The 18S rRNA level was used for normalization. (G) Western Blot showing decrease of synbindin protein upon knockdown of OCT1 using specific siRNAs. (H) Western blot showing the expression levels of OCT1, synbindin, p-ERK and ERK in five gastric cell lines. OCT1 expression is upregulated in GC cells as compared to normal gastric mucosa cell GES-1. (I) The mRNA level of synbindin in gastric cell lines was detected by RT-qPCR. (J) Cells were transfected by OCT1 or control vector, followed by Western Blot analysis using specific antibodies for synbindin, phosphorylated ERK (pERK) or total ERK.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    八聚体转录因子1 (OCT1)对synbindin的转激活及其对细胞外信号调节激酶(ERK)激活的影响。(A)基于TF-DNA晶体结构对synbindin启动子上OCT1结合位点的预测(OCT1- dna复合物结构如右侧所示)。红色箭头和灰色箭头分别表示预测的结合序列和荧光素酶检测的其他序列。(B)基于ChIP-seq富集基序预测OCT1与synbindin启动子结合(分析方案见右图)。(C)预测的OCT1结合序列(-253到-241)和其突变变体(两个序列都表示)分别插入荧光素酶报告基因，并分析它们对OCT1的反应。(D)用OCT1或对照载体转染胃癌细胞，qPCR检测synbindin mRNA水平。(E)经上述处理的细胞OCT1和synbindin的Western Blot。(F)用OCT1 siRNA和对照siRNA处理细胞，用qPCR检测synbindin mRNA水平。用18S rRNA水平归一化。(G) Western Blot显示使用特定siRNAs敲除OCT1后，synbindin蛋白减少。 (H) Western blot showing the expression levels of OCT1, synbindin, p-ERK and ERK in five gastric cell lines. OCT1 expression is upregulated in GC cells as compared to normal gastric mucosa cell GES-1. (I) The mRNA level of synbindin in gastric cell lines was detected by RT-qPCR. (J) Cells were transfected by OCT1 or control vector, followed by Western Blot analysis using specific antibodies for synbindin, phosphorylated ERK (pERK) or total ERK.

    为了支持OCT1在转激活synbindin启动子方面的作用，OCT1的异位表达在mRNA和蛋白水平上显著上调了synbindin的表达(图4D, E)。一致地，特定siRNAs对OCT1的抑制显著降低了synbindin的mRNA和蛋白质水平(图4F, G)。OCT1和synbindin在不同GC细胞系中的表达水平呈相似趋势，支持OCT1对synbindin的调控作用(图4H, I)。因此，磷酸化ERK (p-ERK)的水平在OCT1和表达synbindin的细胞(图4H)，虽然AGS (KRAS突变)和MKN45 (MET扩增)的遗传背景也应考虑在内。OCT1异位表达显著提高GC细胞中synbindin水平和ERK2磷酸化(图4J). ERK2总水平的细微变化证实OCT1对ERK2表达影响不大。综上所述，这些结果表明OCT1在GC细胞中通过转激活synbindin来调节ERK2的磷酸化/激活。

    OCT1作为GC组织中synbindin表达的决定因素

    进一步，我们采用免疫荧光法分析了OCT1和synbindin在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达水平。如图5A-C、OCT1与synbindin蛋白水平呈显著相关(p<0.0001, Pearson相关)。rna测序数据一致显示，在不同癌症类型和正常组织中，OCT1和synbindin mRNA水平之间存在显著相关性(p<0.0001, Pearson相关，图5D).利用微阵列数据进一步分析GC组织中OCT1和synbindin mrna之间的关系，27提示两种基因mRNA水平之间存在较强的相关性(p=0.0002, Pearson相关，图5E).这些基于人类癌症组织的结果强烈表明，OCT1是GC细胞中synbindin表达的决定因素。

    Roles of octamer transcription factor 1 (OCT1) in regulating synbindin expression and cell aggressiveness. (A) Immunofluorescent detection of OCT1 and synbindin expression in normal gastric tissues. Scale bars indicate 20 μm in all panels. (B) Immunostain of OCT1 and synbindin in human gastric cancer tissues. (C) Correlation between the protein levels of OCT1 and synbindin in human gastric cancer tissues as determined by immunofluorescence. (D) The mRNA levels of OCT1 and synbindin determined by RNA-sequencing (GSE28866) showed strong correlation in cancer and normal tissues. (E) The OCT1 and synbindin mRNA levels detected by microarray (GSE27342) were strongly correlated in human gastric tissues. (F) Representative Transwell assays of MGC803 cells stably expressing the control vector or OCT1 vector treated without/with the specific siRNAs for synbindin. Scale bars indicate 100 μm in all panels. (G) Statistical result based on three independent Transwell assays. (H) Cell Counting Kit-8(CCK8) assay of MGC803 cells stably expressing control vector or OCT1 vector without/with treatment by synbindin siRNAs. (I) Apoptosis of cells treated by above-mentioned procedures as measured by flow cytometry combined with phycoerythrin (PE)-conjugated annexin V staining. (J) Statistics based on 3 independent apoptotic assays (**P<0.01; ***P<0.001, t-test). (K) The MKN45 cells were treated by two specific siRNAs (left and right panels) without or with ectopic expression of synbindin, and cell proliferation was measured by CCK8 assay (OD450 absorbance). (L) Effects of OCT1 silencing and synbindin ectopic expression on the invasiveness of MKN45 cells. Scale bars indicate 100 μm in all panels.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    八聚体转录因子1 (OCT1)在调控synbindin表达和细胞侵袭性中的作用。(A)免疫荧光检测正常胃组织中OCT1和synbindin的表达。所有面板的比例尺均为20 μm。(B) OCT1和synbindin在人胃癌组织中的免疫染色。(C)免疫荧光测定人胃癌组织中OCT1和synbindin蛋白水平之间的相关性。(D)通过rna测序(GSE28866)测定的OCT1和synbindin mRNA水平在癌症和正常组织中显示出很强的相关性。(E)通过微阵列(GSE27342)检测到的OCT1和synbindin mRNA水平在人胃组织中强相关。(F) MGC803细胞的代表性Transwell检测结果稳定表达对照载体或OCT1载体，没有/使用synbindin的特定sirna处理。所有面板的比例尺均为100 μm。(G)基于三种独立Transwell测定的统计结果。 (H) Cell Counting Kit-8(CCK8) assay of MGC803 cells stably expressing control vector or OCT1 vector without/with treatment by synbindin siRNAs. (I) Apoptosis of cells treated by above-mentioned procedures as measured by flow cytometry combined with phycoerythrin (PE)-conjugated annexin V staining. (J) Statistics based on 3 independent apoptotic assays (**P<0.01; ***P<0.001, t-test). (K) The MKN45 cells were treated by two specific siRNAs (left and right panels) without or with ectopic expression of synbindin, and cell proliferation was measured by CCK8 assay (OD450 absorbance). (L) Effects of OCT1 silencing and synbindin ectopic expression on the invasiveness of MKN45 cells. Scale bars indicate 100 μm in all panels.

    OCT1在GC细胞中的synbatin依赖性作用

    为了测试OCT1对ERK磷酸化/激活的影响是否依赖于synbindin的表达，在不存在或不存在synbindin特异性sirna的情况下，用OCT1表达载体或对照载体转染人GC MGC803细胞。OCT1显著提高pERK和pELK1水平(不影响p-MEK水平)，而敲低synbindin有效抑制了OCT1的作用(图5F).这些结果支持了我们的观点，即synbindin在介导oct1诱导的ERK信号传导中起着核心作用。

    此外，我们发现OCT1对GC细胞恶性行为的影响需要synbindin。Transwell实验显示表达oct1细胞的侵袭性显著增加，这可以通过敲低synbindin来抑制(图5F, G)。MTT实验显示OCT1对GC细胞有促增殖作用(图5H)，流式细胞仪联合annexin V-FITC染色显示OCT1具有较强的抗凋亡作用(图5I, J)。重要的是，通过特定的sirna抑制synbindin的表达会损害OCT1的这些促恶性作用(图5f j)。由于MKN45细胞表达了较高水平的OCT1，我们检测了抑制OCT1对细胞增殖和侵袭的影响。结果，使用特定的sirna敲低OCT1抑制了MKN45细胞的增殖和侵袭，而异位表达synbindin则恢复了细胞的增殖和侵袭(图5K, L)。这些结果表明，OCT1通过调节synbindin的表达参与GC细胞的恶性行为。

    OCT1-synbindin信号通路促进ELK1和RSK磷酸化

    先前的研究表明，ERK信号可以在空间上被分离成与DEF(对接位点for ERK, FXFP)域或D(文档)域。28为了确定受OCT1和synbindin影响的特定ERK底物，我们使用Western blot检测表达异位OCT1的MGC803细胞中ELK1 (deff结构域底物)和RSK (d结构域底物)的磷酸化情况。有趣的是，我们发现OCT1上调后，ELK1和RSK的磷酸化水平均升高，但p-ELK1的变化更为明显(图6A).为了支持这一点，MKN45细胞中OCT1的沉默大大降低了ELK1的磷酸化，而synbindin的异位表达在很大程度上恢复了p-ELK1的水平。相反，OCT1沉默只导致p-RSK水平轻微下降(见在线补充图S5)。

    Effects of octamer transcription factor 1 (OCT1) on the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and substrate proteins. (A) Cells were transfected with OCT1 expression vector in the absence or presence of siRNAs specific for synbindin (si-synbindin #1 & #2), and the levels of pERK/ERK, p-ELK1/ELK1, p-RSK/RSK were detected by Western Blot. The α-tubulin level was used as loading control. (B) Effects of ectopic OCT1 expression and knockdown of ERK substrates (RSK and ELK1) on cell proliferation at the last time point (48h) using t-test (*P<0.05, **P<0.01). (C) The Hex spherical polar Fourier protein docking algorithm was employed to probe the synbindin-ERK complex conformation based on the crystallography structures of synbindin (PDB ID code 3EAP) and ERK2 (PDB ID code 2J0Z). (D) Input amount of the ERK mutants in D-domain (mut-D, D319N) and in DEF domain (mut-DEF, L198A, L232A, and Y261A) for GST pull-down assay. (E) The co-immunoprecipitated synbindin protein under each condition is shown in the Western Blot.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    八聚体转录因子1 (OCT1)对细胞外信号调节激酶(ERK)和底物蛋白磷酸化的影响(A)在synbindin特异sirna (si-synbindin #1 & #2)缺失或存在的情况下，用OCT1表达载体转染细胞，Western Blot检测pERK/ERK、p-ELK1/ELK1、p-RSK/RSK水平。以α-微管蛋白水平作为负荷对照。(B)在最后一个时间点(48h)， OCT1异位表达和ERK底物(RSK和ELK1)的下调对细胞增殖的影响，采用t检验(*P<0.05， **P<0.01)。(C)基于synbindin (PDB ID code 3EAP)和ERK2 (PDB ID code 2J0Z)的晶体结构，采用Hex球形极性傅里叶蛋白对接算法探测synbindin- erk配合物构象。(D)用于GST下拉试验的ERK突变体在D域(mut-D, D319N)和DEF域(mut-DEF, L198A, L232A, Y261A)的输入量。(E) Western Blot显示各条件下免疫共沉淀的synbindin蛋白。

    因此，ELK1的下调也消除了OCT1过表达对细胞增殖的影响，但RSK的沉默仅轻微影响了OCT1的作用(图6B).综上所述，我们的数据表明ELK1(停靠在DEF结构域)在介导OCT1/synbindin的促恶性潜能中发挥更重要的作用。

    synbindin-ERK相互作用模式

    我们之前发现synbindin与高尔基体上的MEK和ERK结合，促进ERK被MEK磷酸化。9此外，synbindin的c端Longin (LDc)结构域被发现与ERK蛋白相互作用。本文通过蛋白-蛋白对接结合实验验证，进一步探讨了ERK与synbindin相互作用的结构基序。六角球形极傅里叶蛋白对接算法29实现了synbindin (PDB ID code 3EAP)和ERK2 (PDB ID code 2J0Z)的复杂构象。有趣的是，synbindin LDc结构域与ERK DEF结构域在几何结构和静电互补方面完美匹配(图6C).结合模式类似于ERK与PEA-15 (ERK空间调控因子)的相互作用30.并设计了锚蛋白重复蛋白31这是最近通过结晶学确定的(见在线补充图S6A-C)。由于ERK氨基酸残基Leu198、Leu232和Tyr261被发现对DEF对接很重要，28我们认为它们可能也参与了与synbindin的结合。为了验证这一点，我们将ERK与谷胱甘肽s -转移酶(GST)融合，并产生突变来破坏上述残基(L198A, L232A和Y261A)。GST下拉试验确定了synbindin和野生型ERK之间的相互作用，这种相互作用被DEF结构域的突变所取消(图6D, E)。而位于d域的对照突变D319N不影响synbindin与ERK的相互作用。这些数据表明synbindin与ERK的DEF域结合，而不是D域。蛋白质对接表明，synbinin - ERK相互作用促进了MEK1与ERK激活环的后续对接(预测模型见在线补充图S6D)，这似乎与我们之前研究中观察到的ERK激活增强有关。9

    此外，我们怀疑synbindin的潜在磷酸化是否参与了这一过程。通过分析PhosphoSite数据库32我们总结了32个已报道的GC细胞系中所有检测到的蛋白质磷酸化的频率(数据在在线补充表S2中)。ERK2蛋白被发现是这些GC细胞系中磷酸化频率最高的蛋白(见在线补充图S6E)，这与之前关于ERK在GC中活化的高流行率的报道是一致的。5虽然在蛋白质组中检测到6497个磷酸化位点，但在任何细胞系中都没有发现synbindin磷酸化。因此，在GC细胞中，synbindin的磷酸化似乎不是ERK激活所必需的。综上所述，这些发现支持了我们的观点，即synbindin促进MEK-ERK相互作用和ERK磷酸化，导致ERK底物的激活(拟议的模型显示在在线补充图S6F中)。

    OCT1对异种移植小鼠ERK激活和肿瘤生长的影响

    最后，我们在裸鼠异种移植模型中测试了OCT1的上调是否能促进GC细胞在体内的致瘤性。将携带OCT1表达载体或对照载体的稳定细胞系皮下注射到裸鼠右侧，以形成异种移植瘤。第一次注射后14天，处死OCT1组和对照组小鼠，Western blot和免疫荧光分析异种移植组织。结果是，与对照组相比，OCT1组的OCT1有效上调(图7A).同时，synbindin的表达水平(图7B)和磷酸化ERK2 (图7C)在oct1上调组显著升高。Western blot也证实了这些结果，结果显示oct1上调组的组织中synbindin和磷酸化ERK2(但不是全部)水平显著增加(图7D).由于ERK信号的增强，oct1上调组的异种移植瘤生长明显快于对照组(图7eg)。这些结果有力地支持了我们的观点，即OCT1促进胃癌的发生，这种作用涉及到synbinin介导的ERK信号激活。

    Octamer transcription factor 1 (OCT1) promotes synbindin expression and extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation in vivo. (A) The right panel shows statistical analysis of OCT1 expression based on multiple xenograft tumors (P<0.01, two-sided student t-test). (B) Representative image and statistical analysis of synbindin expression in xenograft tumors expressing OCT1 or control vector. Synbindin is stained using specific antibody in red. Scale bars indicate 10 μm. (C) The level of phoshporylated ERK (pERK) was dramatically increased by the expression of OCT1. (D) Western Blot of xenograft tissues in OCT1-expressing group and control group. (E) Growth curves of xenograft tumors expressing OCT1 or control vector. (F) Nude mice carrying xenograft tumors that expressed OCT1 or control vector. The ranges of tumors are marked by dashed lines. (G) Image of excised tumors expressing OCT1 or control vector. (H) Schematic representation for the OCT1-synbindin-ERK regulatory pathway proposed in this study. OCT1 transactivates synbindin, which is a core subunit of a tether complex on the Golgi involved in vesicle transportation. Synbindin functions as a molecular scaffold that binds to both MEK and ERK2, facilitating ERK phosphorylation on the Golgi apparatus. This promotes the activation of ERK substrates (especially the DEF-domain substrate ELK1), leading to potentiation of cell proliferation and invasion in gastric cancers.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    八聚体转录因子1 (OCT1)在体内促进synbindin表达和细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化。(A)右图显示基于多发性异种移植瘤的OCT1表达的统计分析(P<0.01，双侧学生t检验)。(B)表达OCT1或对照载体的异种移植瘤中synbindin表达的代表性图像和统计分析。Synbindin用红色的特异性抗体染色。比例尺为10 μm。(C) OCT1的表达显著增加磷酸化ERK (pERK)的水平。(D) oct1表达组和对照组异种移植组织Western Blot。(E)表达OCT1或对照载体的异种移植瘤生长曲线。(F)携带表达OCT1或对照载体的异种移植瘤裸鼠。肿瘤的范围用虚线标出。 (G) Image of excised tumors expressing OCT1 or control vector. (H) Schematic representation for the OCT1-synbindin-ERK regulatory pathway proposed in this study. OCT1 transactivates synbindin, which is a core subunit of a tether complex on the Golgi involved in vesicle transportation. Synbindin functions as a molecular scaffold that binds to both MEK and ERK2, facilitating ERK phosphorylation on the Golgi apparatus. This promotes the activation of ERK substrates (especially the DEF-domain substrate ELK1), leading to potentiation of cell proliferation and invasion in gastric cancers.

    讨论

    OCT1转录因子是OCT4多能因子的同源物，被发现在胃癌及其癌前病变中表达。然而，OCT1在胃癌中的功能意义和预后价值尚不明确。在本研究中，我们报道了OCT1基因的反复扩增和上调与胃癌患者预后不良有关。此外，我们通过证明OCT1在GC细胞中作为synbinin介导的ERK信号传导和相关侵袭性表型的决定因素，揭示了这种关联的潜在机制。

    首先，我们的研究确定OCT1是GC诊断和预后的有前途的生物标志物。OCT1在胃癌及其癌前病变中明显上调，通过胃镜获得的组织活检组织化学可以方便地检测OCT1的表达。因此，OCT1在早期GC的诊断价值有待进一步评估。重要的是，我们的数据和一个独立的数据集证实了OCT1上调与GC患者预后差之间的强相关性。此外，OCT1 CNV的预后意义也得到了两个独立数据集的支持。这些有趣的结果表明，OCT1过表达(免疫组化检测)或获得CNV (FISH检测)可作为胃癌的预后标志物。GSEA表明OCT1过表达标志着RAS/ERK信号通路的激活，因此可能为靶向治疗提供有用的信息。

    OCT1基因的反复扩增及其增强肿瘤侵袭性的显著能力表明，OCT1可能在胃癌发生中起驱动作用。因此，靶向OCT1可能为GC细胞提供了一种有利的治疗策略，特别是对于ERK信号解除调控的病例。有趣的是，OCT1最近被报道与食管癌发生中的ERK信号有关，33这表明OCT1可能在更广泛的情况下影响ERK信号和癌症侵袭性。因此，有必要进一步研究以阐明OCT1在其他类型癌症中的临床和生物学相关性。

    通过展示OCT1对转激活synbindin的影响，我们能够为ERK信号在高尔基体上的空间调控提供一个更完整的模型(图7H中的示意图)。除了典型的Ras-Raf-MEK-ERK信号转导流外，最近的研究强调了ERK信号在特定亚细胞区室中的调节的重要性，即所谓的“空间调节”机制。34在我们最近的研究中，9我们发现synbindin是一种关键的分子支架，在高尔基体上给予ERK信号的空间调节(见图7H).在本研究中，我们进一步确定OCT1作为GC中synbindin的上游调控因子，并对synbindin介导的ERK激活提供了结构上的见解。我们发现synbindin LDc结构域与ERK的DEF结构域结合，导致ERK底物(特别是DEF结构域底物)的磷酸化和细胞侵袭性的增加。重要的是，我们对GC组织样本的研究报告了OCT1表达与ERK2磷酸化水平之间的强相关性(p<0.0001)，这表明OCT1是GC中ERK2激活的关键调节因子。OCT1基因的反复扩增及其对synbindin相关ERK信号的调控，表明OCT1是GC细胞恶性行为的潜在驱动因素。

    OCT1对ERK信号的影响也可能有助于解释其他报道的OCT1活动。OCT1作为OCT4多能性因子的同源物，被发现没有诱导多能性的能力。35相反，OCT1被认为与癌症干细胞的自我更新有关36以及上皮细胞-间充质转化(EMT)过程。16有趣的是，ERK信号也被发现对多种癌症中的干细胞样细胞至关重要，包括GC，37结直肠癌、38前列腺癌,39乳腺癌40和胶质母细胞瘤。41最近的研究也清楚地证明了ERK信号在EMT过程中的重要作用。42- - - - - -44因此，OCT1是否可能通过调控ERK信号通路参与癌细胞的茎样行为和EMT过程，值得进一步研究。

    总之，我们的结果确定OCT1是GC中synbinin介导的ERK信号激活的决定因素，并且OCT1是GC中潜在的预后标志物和治疗靶点。

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    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

      本数据补充文件:

    脚注

    • 贡献者JQ和JX撰写了论文。JQ, XK, JW, HC和YH进行实验。ND和PT提供了数据。JX, HC, WZ和J-YF分析数据。J-YF和JX监督了这项研究。JQ和XK的贡献相当。

    • 资金方建勇获国家973计划基础研究计划项目(2010CB5293)、国家863计划高技术研究与发展计划项目(2012AA02A504)、上海市教委创新团队计划项目、国家自然科学基金项目(30971330,31371420,81320108024)资助。项目还获得了国家自然科学基金(81000861、81322036、81272383)、上海市“东方学者”项目(2013XJ)、上海市科委“浦江项目”(13PJ1405900)、上海市自然科学基金(12ZR1417900)的部分资助。这项研究的发起者在数据的收集、数据的分析和解释、提交手稿发表的决定或手稿的撰写方面没有任何作用。

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 病人的同意获得的。

    • 伦理批准伦理批准由上海交通大学医学院仁济医院伦理委员会提供。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。