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客观的癌症干细胞(二者)代表的根源许多固体癌症包括胰腺导管腺癌,也可以成为鉴别药物抵抗和药物代表高度细胞源疾病复发。然而这些过程所涉及的机制仍需充分阐明。理解的机制与药物抗性和胰腺癌的转移是改善病人预后的关键。
设计微核糖核酸(microrna)表达式分析识别功能定义表观遗传特征在胰腺CSC-enriched sphere-derived细胞和gemcitabine-resistant胰腺二者。
结果我们发现mir - 17 - 92集群中表达下调chemoresistant二者与non-CSCs CSC生物学和展示其重要相关性。特别是,mir - 17 - 92的超表达减少CSC自我更新能力,体内tumourigenicity和药物抗性的目标节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β1信号级联的多名成员以及直接抑制下游目标p21, p57 TBX3。超表达mir - 17 - 92翻译成增加CSC核扩散和p21和p57差别通过对这些最终的疲惫。最后,转化的影响我们的发现可以确诊为胰腺癌的临床前模型。
结论我们的发现因此识别mir - 17 - 92集群功能确定家庭二者microrna的和突出的公认的潜力发展中调节器的集群在胰腺二者克服耐药性。
- 胰腺癌
- 干细胞
- 细胞内信号
- 耐药性
- 细胞周期控制
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
胰腺癌是最致命的癌症治疗有限的选项。
胰腺癌干细胞(二者)专门tumourigenic和高度耐化疗。
节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β1路径由一个核心组的监管控制具备干细胞的基因和转移性胰腺癌二者的活性。
有什么新发现吗?
mir - 17 - 92集群(chemoresistant)二者的表达下调。
节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β1信号二者促进他们的药物抗性,mir - 17 - 92抑制的集群。
超表达mir - 17 - 92结果在CSC表型并最终废除体内tumourigenicity的损失。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
关键作用的发现mir - 17 - 92 / NODAL-ACTIVIN-TGF-β1 p21 / Tbx3轴二者代表了我们对CSC的理解生物学的一个重要进步。
针对胰腺癌二者使用mir - 17 - 92可能是一个非常具体的治疗方法作用的上游和下游节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β1信号级联。
介绍
胰腺导管腺癌(PDAC)是最致命的固体肿瘤,目前全球第四个癌症相关死亡的最常见原因1有人预测,到2030年PDAC将代表第二个癌症相关死亡的最常见原因。2尽管扩大研究成果,几乎没有实质性的治疗进展改善临床结果。目前的治疗方法,包括最近批准的药物Nab-paclitaxel (Abraxane),3稍微提高平均存活率和很少导致长期无进展生存。因此,综合说明机制管理治疗和阻力迅速复发PDAC是迫切需要的。
在这种背景下,癌症干细胞(二者)被确定为关键球员在疾病进展和抵抗许多癌常规化疗4包括PDAC。5,6由于他们的层次组织,二者和non-CSCs共享相同的突变/遗传背景;然而,二者完全tumourigenic chemoresistant。因此,表观遗传机制可能占强表型差异这两种细胞类型。事实上,几个小分子核糖核酸(microrna)已经与正常干细胞的调控以及二者,7 - 10但大鹏与CSC药物抗性迄今为止仍然是难以捉摸的。
材料和方法
更多细节在网上提供补充材料和方法
主要的人类胰腺癌细胞
人类胰腺肿瘤得到书面知情同意所有的病人和扩大裸体小鼠patient-derived异种移植(PDX)。11 - 13体外研究组织碎片被剁碎,保持酶的消化与胶原酶(干细胞技术,温哥华,不列颠哥伦比亚,加拿大)为90分钟37°C14离心5分钟后,在1200 rpm丸resuspended和培养RPMI介质(罗斯威尔公园纪念研究所),10%胎牛血清的边后卫和50个单位/毫升青霉素和链霉素。
体内tumourigenicity和转移化验
tumourigenicity化验,连续稀释的单个细胞在基底膜基质resuspended (BD生物科学)皮下注入女性ν-Foxn1ν裸小鼠(哈伦,实验室,英国)和跟踪3个月。转移化验,5×104FACSorted mCHERRY + miR-control和mir - 17 - 92细胞resuspended 1 x PBS(磷酸缓冲盐)和intrasplenically注入点头scid IL2受体γ链基因敲除小鼠(NSG)如前所述。15串行移植实验中,切除肿瘤被消化和排序的绿色荧光蛋白(GFP),再植入使用相同数量的细胞。老鼠住根据机构的指导方针和所有实验动物实验伦理委员会批准的de Salud卡洛斯三世(西班牙,马德里)和执行按照道德行为指南在动物保健和使用国际生物医学研究指导原则所涉及的动物,由国际医学科学组织理事会(帮助)。
药物、重组蛋白和抑制剂
吉西他滨(吉,莉莉SA、Alcobendas、西班牙)是resuspended PBS工作1µg /毫升的浓度。重组节点,激活素A和TGF-β1买来研发系统和resuspended根据制造商的建议。
体内治疗胰腺癌
两毫米3低的异种移植组织来源于患者组织学证实PDAC11 - 13被植入皮下注射进ν-Foxn1ν裸小鼠(哈伦),和老鼠被随机各治疗组。胰腺肿瘤的大小和重量都是被监控的。吉西他滨是管理每周两次(125毫克/公斤/鼠标腹腔内)。强力霉素是饮用水中进行每周两次的浓度2毫克/毫升。
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结果
浓缩的策略主要chemoresistant二者
识别最有代表性的microrna的概要人类胰腺癌二者我们使用两种相互补充的方法:首先,我们使用anchorage-independent文化主要PDAC细胞(即球体)全球丰富二者(见图1A、B和在线补充图S1A)。5,16第二,CSC-enriched球体文化与标准化疗吉西他滨治疗,进一步丰富CSC人口通过消耗更多差异化的后代图1C, D和在线补充图印地)。一致,节点的mRNA表达/苯丙酸诺龙/ TGF-β1 ALK4通路成员,TGFBRII, SMAD2, SMAD4 TBX3,我们以前是CSC的关键功能,16增加在chemoresistant二者(参见图就是S1C在线补充)。我们还指出微分细胞转运蛋白的表达与耐药性,17,18upregulation等蛋白ABCC1 gemcitabine-specific运输车的差别和ABCG2对这些人类集中核苷转运体和equilibrative核苷转运体(见图S1D在线补充),这两个是强制性的吉西他滨吸收。19这些数据然后使用原始patient-derived验证体内异种移植(pdx)。与车辆或吉西他滨(pdx治疗图1E),分离成单个细胞悬液,减少污染的鼠标基质细胞(参见图S1E在线补充)。根据我们的体外数据预测,二者是浓缩后吉西他滨治疗(图1F-H)和mRNA表达的成员节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β1通路也增强(图1我)。
浓缩的策略对癌症干细胞。(一)代表的照片主要胰腺导管腺癌(PDAC)细胞培养附着层或球体(s)(左面板)。流式细胞术分析CD133 +趋化因子受体CXCR4 +和CD133 + SSEA1 +表达式(右面板)。(B) RTqPCR pluripotency-associated Oct4基因的分析,Sox2 Klf4, Nanog。数据是正常ß-Actin表达式(n = 3;* p < 0.05)。(C)的CD133 +趋化因子受体CXCR4 SSEA1 + +和CD133 +细胞流式细胞仪所评估的控制和耐吉西他滨(GR)细胞建立从初级PDAC A6L和185年文化(D)球体形成能力(n = 3;* p < 0.05)。(E) Patient-derived异种移植治疗与车辆或吉西他滨(125毫克/公斤/鼠标两周一次的;从7天到28天)治疗。 Tumour diameters were measured using callipers, and volumes in mm3计算(n = 6;* p < 0.05)。(外)上皮细胞分离外植/消化control-treated和吉西他滨抗肿瘤进行分析。(F) CD133和流式细胞术分析细胞表面趋化因子受体CXCR4表达。(G)球面形成能力。每个栏代表的意思是球数量±SD (n = 3;* p < 0.05)。原来放大×100。(H) RTqPCR pluripotency-associated基因和分析(I)基因在节点/激活素信号(ALK4,节点,SMAD2 SMAD4, TGF-β-RII TGF-β1)(n = 3;* p < 0.05)。
识别静止和chemoresistant二者
在CSC-enriched分数与几个PDX p21模型,我们发现,细胞周期调控和p57不断调节和细胞周期蛋白D1表达下调,与更多的差异化非子代干细胞相比,在RNA和蛋白质水平(图2A、B)。功能,二者表现出显著减少细胞的S期和G2-M阶段,这是伴随着细胞G0显著的浓缩和G1阶段(图2C)和增强药物抗性吉西他滨(图2D)。Gemcitabine-treated二者显示重要的浓缩细胞居住在G0和G1,这是伴随着在S期的细胞减少(图2p21 E)和更高的mRNA水平(1细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)和p57(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 c)的差别,以及对这些周期蛋白d1 (图2F)。为了进一步验证存在慢骑自行车和chemoresistant CSC族群,我们用PKH26染色细胞20.,21,发现只有2 - 3%的最初PKH26-labelled细胞保留强大的染料标签4周后,表明这些罕见的细胞尚未分裂(图2G和数据未显示)。重要的是,label-retaining细胞没有衰老,而是显示增强的球体形成能力与label-negative细胞(参见图开通在线补充),也表达了更高水平的CSC表面标记(参见图S2A在线补充)。这些细胞也高度耐吉西他滨(图2H)我们的数据表明,在二者的异构人口族群的静止和高度chemoresistant二者存在,因此我们进行进一步的深入调查,从力学上看解剖这些细胞。
静和chemoresistant癌症干细胞的识别。(一)RTqPCR分析pluripotency-associated p21基因和基因参与细胞周期调控,p27、p57周期蛋白d1。数据是正常ß-Actin表达式(n = 3;* p < 0.05)。(B)的免疫印迹分析NANOG p21和细胞周期蛋白,p27、p57和周期蛋白d1。附着(抗利尿激素);sphere-derived细胞(sph)。(C)细胞周期分析使用Ki67和DAPI染色法(n = 3;* p < 0.05)。(D)流式细胞术分析细胞凋亡后48 h与吉西他滨治疗(100 ng / mL)确定AnnexinV / DAPI染色。 (E) Cell cycle analysis using Ki67 and DAPI of gemcitabine-resistant cells (n=3; *p<0.05). (F) RTqPCR analysis of cell cycle genes p21, p27, p57 and Cyclin D1 (n=3; *p<0.05). (G) Representative images of PKH26 labelled cells after 1 day, 14 days and 28 days in culture (upper panel) and flow cytometry analysis (lower panel). (H) Percentage of PKH26+ cells before and after gemcitabine treatment in A6L, 185 and 354 pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) tumours (n=3; *p<0.05).
mir - 17 - 92是隐含在静止和chemoresistant二者
为了识别表观遗传监管机构更多的静止,因此chemoresistant二者,我们比较的microrna的表达谱(1)CSC-enriched sphere-derived细胞贴壁细胞和(2)Gemcitabine-treated pdx vehicle-treated控制肿瘤。重要的是,我们的实验是为了确定承担二者相关性的microrna在广泛的胰腺癌患者的数量,这样我们使用一组主要的胰腺肿瘤。感兴趣的,我们发现了一个小数量的microrna在gemcitabine-resistant通常和差异表达二者(图3A)。令人惊讶的是,大多数mir - 17 - 92集群的成员,经常发现调节散装癌症组织包括胰腺癌、22还在的microrna表达下调chemoresistant二者。进一步合作的这些发现,我们下一个分析gemcitabine-resistant细胞的microrna的签名(与vehicle-treated细胞)的microrna的签名CSC-enriched球体(与附着细胞)的差别和再次发现一致的和重要的对这些成员的mir - 17 - 92集群和mir - 513 - a - 5 - p和mir - 513 b (图3B)。重要的是,我们的差别可以确认对这些mir - 17 - 92家庭成员通过RTqPCR分析使用一个独立的组主要文化(请参见图S3A在线补充)以及PKH26-positive(即静止)细胞(参见图S3B在线补充)。因此,这些数据提供了证据表明,不同族群slow-cycling /静胰腺二者PDAC肿瘤内存在大量的特点是低表达mir - 17 - 92集群。
抑制mir - 17 - 92促进tumourigenicity和药物抗性。(A)微阵列分析表示为热图,不同监管microrna控制(Ctrl)治疗或吉西他滨(GEM)治疗胰腺导管腺癌(PDAC)细胞(红色和绿色框表示,差别upregulation和对这些分别)。(B)维恩图解显示重叠在gemcitabine-resistant microrna表达下调(GR)和范围(SPH)文化。(c g)主要PDAC附着文化处理控制炒(SCR) antagomirs或antagomirs mir - 17 - 92集群。(C)流式细胞术分析和量化的CD133细胞表面表达(n = 3;* p < 0.05)。(D) RTqPCR pluripotency-associated基因的分析。数据是正常ß-Actin表达式(n = 3;* p < 0.05)。(E)领域数字/毫升为四个主要PDAC文化(n = 3; *p<0.05). (F) Cell cycle analysis using Ki67 and DAPI (n=3; *p<0.05). (G) Chemoresistance to gemcitabine determined with AnnexinV/DAPI staining after 48 h treatment (n=3; *p<0.05).
功能丧失的实验
我们撞倒mir - 17 - 92更分化的癌细胞,经常过度表现mir - 17 - 92,使用反义抑制剂mir - 17 - 92(称为antagomir - 17 - 92)为了具备干细胞研究公认的变化特性和药物抗性。事实上,antagomir - 17 - 92治疗导致CSC表面标志物CD133的表达增加(图3ABC转运蛋白(C), pluripotency-associated基因和图3D)以及功能转化为增强自我更新由球体形成(图3E)。值得注意的是,转染细胞显示增加居住在G0和G1阶段伴随着减少细胞S期(图3F), p21表达明显增加(见图S3C在线补充),最重要的是增加药物抗性吉西他滨(图3克)。值得注意的是,这些细胞也显示增强体内tumourigenicity就是明证明显高于肿瘤采取利率(见图S3D在线补充)和更快的增长率(数据未显示)。综上所述,抑制分化mir - 17 - 92集群的胰腺癌细胞产生细胞的善意二者化学抗性增强,支持假设mir - 17 - 92集群消极控制CSC的特性。
功能实验
不利,mir - 17 - 92的超表达二者应该抵消CSC具备干细胞特性。测试这个假设我们使用慢病毒构建表达GFP的共同前体mir - 17 - 92集群(mir - 17 - 92)或炒控制(miR-Ctrl)。与miR-Ctrl相比,mir - 17 - 92集群过度导致的有效upregulation mir - 17 - 92家庭成员在二者(参见图S4A在线补充)CSC的差别和随后对这些表面标记(图4),pluripotency-associated基因(参见图S4B在线补充)和球体形成能力(图4B)。有趣的是,mir - 17 - 92的分数降低居住在G0期和G1期细胞,而细胞S期增加表明静止表型(图4C)。实际上,我们没有观察到任何改变衰老的水平(见图自己在线补充),而是减少了静止,由PKH26功能验证标签(参见图S4D在线补充)和翻译成在化学敏感性显著增加吉西他滨(请参见图4 d)在线补充Abraxane以及研究者用(见图S4E在线补充)。这些数据表明,mir - 17 - 92年废除静止CSC表型和随后恢复化学敏感性。尽管mir - 17 - 92细胞的增殖率较高,长期在体内tumourigenicity减少(图4E)。在三个连环体内通道,高度增殖mir - 17 - 92细胞逐渐失去了潜在的扩大和最终耗尽观察癌细胞分化,但不是miR-Ctrl二者(图4F)。事实上,体外自我更新能力mir - 17 - 92 overexpressing二者收获后体内通过大幅减少在球体形成化验(参见图S4F在线补充)。此外,细胞周期分析验证扩散的初始增加(见图S4G在线补充),最终达到在CSC的疲劳。
过度的mir - 17 - 92逆转静止和药物抗性。(a)癌症干细胞(二者)慢病毒感染控制(miR-Ctrl)或慢病毒overexpressing pre - mir - 17 - 92集群(mir - 17 - 92)比较分析。(一)表面表达CD133和SSEA1褶皱变化。虚线代表水平获得miR-Ctrl样本(n = 3;* p < 0.05)。(B)球体形成能力(n = 3;* p < 0.05)。(C)细胞周期分析使用Ki67和DAPI (n = 3;* p < 0.05)。(D)药物抗性AnnexinV / DAPI染色与吉西他滨治疗后(n = 3; *p<0.05). (E) In vivo tumourigenicity results. CSC frequencies (Freq) determined using the extreme limiting dilution analysis algorithm (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)(p < 0.05)。(F)体内连续移植的结果。肿瘤体积(毫米3在表示时间)测定。在5周postimplantation,肿瘤移植和连续移植到天真的裸体小鼠(n = 4;* p < 0.05)。(G)代表入侵细胞的图像(上半部分)。刺激后细胞的百分比(通过人工基底膜与节点、苯丙酸诺龙或TGF-ß1(降低面板;n = 3;* p < 0.05)。(H) RTqPCR量化mCHERRY信使RNA复制/μg总RNA的新鲜从NSG小鼠肝匀浆后10周intrasplenic注入5×104miR-Ctrl或mir - 17 - 92 mCherry-labelled细胞(左面板;n = 4;* p < 0.05))和ALU探针原位杂交和免疫组织化学的CK-19外植FFPE肝脏(右面板)。
转移性活动代表二者的综合功能的一个子集。5强劲而miR-Ctrl二者反应化学引诱物的关键因素,TGF-β1和节点,mir - 17 - 92二者显示明显减少响应能力的迁移(请参见图S4H在线补充)和入侵(图4克)。如上预测的实验中,药物抑制Alk4和TGFBR2降低miR-Ctrl的迁徙能力二者,而额外的受体抑制mir - 17 - 92年二者本质上切除整个迁徙的能力。重要的是,我们验证这些发现intrasplenic注入体内的miR-Ctrl-mCherry或mir - 17 - 92 mcherry二者评估肝脏转移传播和后续发展。十周接受,我们发现显著降低小鼠细胞传播注入mir - 17 - 92二者,由原位杂交使用人类特定Alu II (Alu)重复调查调查,人力cytokeratin-19免疫组织化学分析提取formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)肝脏,和RTqPCR分析mCherry hGAPDH mRNA表达整个肝匀浆(图4H)。
mir - 17 - 92目标节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β1信号
开始了解mir - 17 - 92集群改变了CSC转录组,我们使用的几种计算方法寻找潜在目标mir - 17 - 92。TargetScan (http://www.targetscan.org)确定守恒的结合位点的几个成员mir - 17 - 92集群3′utr(翻译regioin)一个ctivin -就像4 (ALK4或ACVR1B),TGF-β受体2(TGFBR2) SMAD2和SMAD4已知基因的基因,核心组控制胰腺二者具备干细胞和/或转移的,16p21和p57,静止的主要监管机构第23 - 25TBX3,已经涉及到胚胎干细胞的自我更新的调控26和乳房二者27(见图5和在线补充图S5A)。来验证这些基因直接的功能目标mir - 17 - 92,我们分析了一组原发性胰腺癌细胞表达mir - 17 - 92的控制下或miR-Ctrl强力霉素(参见图S5B在线补充)。感应mir - 17 - 92导致减少ALK4细胞表面表达(图5B)以及p21的表达减弱,p57, pSMAD2 Tbx3 mRNA (图5C)和蛋白质水平(图5D)。我们还验证预测的目标由单一的监管mir - 17 - 92集群的成员表示antagomirs qPCR分析治疗后,虽然所有mir - 17 - 92成员都能够抑制靶基因的分析,mir - 92显示一个特定的偏好只有一个确定的目标(p57)(参见图S5C在线补充)。
mir - 17 - 92目标节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β信号。(A)的图形表示预测的目标集群mir - 17 - 92。(B) ALK4流式细胞术分析细胞表面表达之前和96 h与强力霉素治疗后2μg /毫升。(C) RTqPCR mir - 17 - 92分析目标基因与强力霉素治疗72 h后。数据是正常ß-Actin表达式(n = 3;* p < 0.05)。(D)细胞周期蛋白免疫印迹分析p21和p57 pSMAD2 TBX3。(E)的完整3′UTR ALK4和TBX3基因被克隆到GLuc Dual-luciferase记者向量和cotransfected mir - 17 - 92或miR-Ctrl模仿(n = 3;* p < 0.05)。荧光素酶活性测定和正常化Renilla荧光素酶活性(n = 4; * p<0.05). (F) Luciferase activity of pCAGA12-luc SMAD4 reporter after stimulation with NODAL, ACTIVIN and TGF-β1 in cells overexpressing miR-17-92 versus control cells.(G) RTqPCR p21和TBX3 mRNA表达分析(上半部分)和免疫印迹分析pSMAD2, p21和GAPDH(下图)与TGF-β1刺激后,节点和激活素在细胞overexpressing mir - 17 - 92与控制细胞。
进一步显示之间的直接交互mir - 17 - 92成员和他们的目标,我们评估能力的集群成员互动的3′UTR Alk4 Tbx3用荧光素酶报告结构。完整的3′UTR Alk4或Tbx3基因被克隆到GLuc Dual-luciferase记者向量和二者cotransfected GLuc向量包含3′UTR Alk4或Tbx3和mir - 17 - 92模拟。正如预期的那样,我们发现mir - 17 - 92年大大降低荧光素酶表达二者(图5E)。功能验证SMAD4的直接目标mir - 17 - 92,我们还使用了pCAGA12-luciferase SMAD4的记者。与TGF-β1刺激后,节点或苯丙酸诺龙,我们观察到荧光素酶表达的增加miR-Ctrl细胞,在细胞overexpressing mir - 17 - 92效果明显减少,表明SMAD4强烈抑制mir - 17 - 92 (图5F),这表明mir - 17 - 92水平升高散装PDAC SMAD4表达的肿瘤细胞可能导致损失散装PDAC样本。28,据报道,TGF-β1-mediated癌细胞迁移和入侵p21依赖,29日我们与TGF-β1刺激细胞,节点或苯丙酸诺龙评估p21的感应,Tbx3 pSMAD2。在控制细胞中,我们观察到p21的表达增加,TBX3 pSMAD2,而在细胞overexpressing mir - 17 - 92,这个效果是废除(图5G)。
p21击倒的抑制CSC表型包括药物抗性
上面给出的结果表明,mir - 17 - 92的目标集群对于二者至关重要。我们先前已经表明,mir - 17 - 92目标Alk4二者的自我更新是至关重要的,因此我们关注p21专门表达下调与chemoresistant二者(图2),击倒p21使用短发卡rna (sh-p21) (图6)导致减少在串行使球体形成能力(图6B),即使sh-p21细胞显示增加整体扩散由细胞周期分析(图6C)。因为这些体外数据表明p21在二者生物学的一个重要的角色,我们下一个验证发现体内。限制稀释化验使用sh-scramble和sh-p21二者显著降低体内tumourigenicity披露,特别是低数量的细胞被注入(图6D)。此外,sh-p21细胞失去了入侵的能力(见图S6A在线补充),成为chemoresistant吉西他滨(图6E)。因此,p21只是沉默,许多目标之一mir - 17 - 92集群中,我们能模仿,至少部分,mir - 17 - 92二者的表型。
击倒p21或TBX3抑制癌症干细胞表型(CSC)。(a)二者稳定感染慢病毒表达炒控制成分(Ctrl),针对p21的shRNA (sh-p21)或一个成分对TBX3 (sh-TBX3)。(一)免疫印迹分析p21在感染细胞。ADU、任意密度测量单位。(B)串行球体形成能力sh-p21-infected胰腺导管腺癌(PDAC)细胞(n = 3;* p < 0.05)。(C)细胞周期分析使用Ki67染色(n = 3;* p < 0.05)。(D)限制稀释tumourigenicity sh-p21-infected 185个细胞的分析。频率= CSC频率(* p < 0.05)。 (E) Chemoresistance to gemcitabine as determined with AnnexinV/DAPI staining after 7 days treatment (n=3; *p<0.05). (F) Comparative western blot analysis of TBX3 protein levels in adherent (Adh) and sphere (Sph) from several primary PDAC cultures and densitometric quantification (left panel). Western blot analysis for TBX3 in cells expressing sh-Tbx3 (sh1 and sh2) and densitometric quantification (right panel). (G) Flow cytometry analysis for CSC surface markers CD133 and CXCR4 (n=3; *p<0.05). (H) Sphere formation capacity of sh-TBX3-infected PDAC cells (n=3; *p<0.05).
击倒的TBX3抑制CSC表型
接下来,我们研究了TBX3在二者基于其在胚胎干细胞功能至关重要的作用30.以及它的含义在致癌过程。33节实际上,在sphere-derived TBX3一直调节二者的信使rna(参见图S6B在线补充)和蛋白质水平(图6F,左面板)。一致,TBX3显著增加在二者定义为CD133 +(参见图S6C在线补充)或ALK4 +(参见图S6D在线补充),以及随后TBX3击倒(图6F,右面板)导致显著减少CSC表面标记(图6G)和受损的球体形成能力(图6H)。最近,TBX3被认定为TGF-β1目标有双重功能:抑制增殖和促进乳腺上皮细胞的迁移。34的确,沉默的TBX3二者也废除他们的入侵能力,特别是当刺激与节点、苯丙酸诺龙或TGF-β1(参见图S6E在线补充)。因此,像p21, TBX3也代表了一个关键因素,mir - 17 - 92集群负调节CSC表型。
针对静止二者作为PDAC新颖的治疗方法
最后,我们旨在提供平移相关性的概念验证我们的结果和执行体内诱导过度治疗干预研究的mir - 17 - 92建立PDAC使用doxycycline-switchable系统模型。一旦肿瘤形成(∼100毫米3),强力霉素诱导接种mir - 17 - 92的表达。一些老鼠也收到了吉西他滨(两周一次的125毫克/公斤腹腔内)从63年14天,模仿标准的护理。之间没有显著差异观察miR-Ctrl和mir - 17 - 92肿瘤对大部分肿瘤增长,预计基于大部分肿瘤细胞的大量增殖能力。然而,有趣的是,mir - 17 - 92肿瘤明显更敏感的吉西他滨(见图7一个和在线补充图S7A)或Abraxane(参见图S7B在线补充)。重量评估(图7B)和流式细胞仪分析显示显著减少CSC内容mir - 17 - 92肿瘤接受吉西他滨(图7C)。持续,限制稀释tumourigenicity化验显示,降低了细胞的体内tumourigenicity overexpressing独自mir - 17 - 92,另外用吉西他滨治疗,表明高水平的mir17 - 92被迫二者更分化和增殖状态,减少体内自我更新能力,同时使感光吉西他滨(图7D)。
针对静止癌症干细胞(二者)作为一种新型治疗方法胰腺导管腺癌(PDAC)。(一)试验装置体内治疗(上面板)185年吉西他滨(GEM)和治疗效果patient-derived异种移植肿瘤(PDX)有或没有感应mir - 17 - 92表达(下图)。肿瘤体积是报道(n = 6每组肿瘤;* p < 0.05)。(B)代表图片(上半部分)和量化的肿瘤重量(降低面板;n = 6;* p < 0.05)。)。(C)流式细胞术分析CSC标志物CD133,趋化因子受体CXCR4和SSEA1细胞分离切除肿瘤在84 d (n = 4;* p < 0.05)。(D)限制稀释tumourigenicity分析- 84 D的PDAC细胞分离肿瘤(* p < 0.05)。
结论/讨论
胰腺癌包含一个罕见的人口高度tumourigenic和未分化的干细胞样的细胞产生更多的分化后代。5,6从力学上看,这些细胞有激活途径不同于non-differentiated同行,包括激活节点/激活素信号,我们以前确认为一个CSC的具备干细胞的重要调节器。16随着二者及其多分化后代共享相同的遗传背景,我们提出,明显的机械的,二者之间存在的差异和non-CSCs独特的表观遗传相关签名。因此,我们旨在更好地描述的表观遗传调节机械胰腺二者使用互补的方法。有趣的是,我们能够识别一个特定的和常见的microrna的签名出现在首次治疗二者和gemcitabine-resistant二者从一组代表性的pdx孤立。
具体来说,我们发现mir - 17 - 92集群,由六个成员mir - 17, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a mir - 92 a,在胰腺二者显著抑制与更多的分化和敏感的同行相比。有趣的是,mir - 17 - 92集群已被确认为一个致癌的监管机构,同时作为一个肿瘤抑制的监管机构。这种双重角色可以解释说,在某种程度上,频谱和多样性的mrna的目标集群和肿瘤细胞和/或上下文。虽然mir - 17 - 92已经被证明可以作为癌基因在某些人类癌症,35,36杂合性丢失13 q12-q13也与加速肿瘤进展和糟糕的结果在乳腺癌,喉鳞状细胞癌,视网膜母细胞瘤、肝癌和鼻咽癌,37,38和删除mir - 17 - 92集群一直在观察卵巢癌患者的一个子集,乳腺癌和黑色素瘤。39此外,mir - 17 - 92集群的作用作为一个肿瘤抑制基因在乳腺癌细胞已经证明,40在胃肠道间质肿瘤41在口腔鳞状细胞癌。42因此,这个集群的二元性反映了癌症恶化的复杂性以及错综复杂的microrna的监管网络和他们的目标在肿瘤和细胞泛型类型的方式。
现在我们的数据表明,有针对性的抑制胰腺non-CSCs mir - 17 - 92的这些细胞装备固有局限于善意二者的特性,如upregulation CD133的球体形成能力的提高,降低了扩散和随后的体外药物抗性,更重要的是,增加体内tumourigenicity和体内抗化疗。相比之下,mir - 17 - 92的超表达二者导致失去干细胞特性,包括减少自我更新(即球面形成能力),和减少CSC表面标记物的表达,但也增加了增殖。后者通常是最有趣的,因为它导致疲惫slow-cycling二者,在连续被反映在体内tumourigenicity下降使和吉西他滨和Abraxane,敏感性增加。因此,我们的数据表明,抑制mir - 17 - 92是至关重要的维持二者具备干细胞表型,而明显过度non-CSCs装备这些细胞与广泛,虽然不是无限期,增殖能力。
mir - 17 - 92集群的几名成员已被证明目标多样化的途径,包括TGF-β143,44HIF-1α信号,45但是他们的角色在胰腺癌的规定和具体的胰腺二者仍有待确定。有趣的是,我们能够确定路径聚类的几个目标,之前与二者相关监管和“具备干细胞”(例如,节点/苯丙酸诺龙通路和细胞周期调控)。我们发现miR-18a调节SMAD2和SMAD4,两个关键组件的节点/激活素信号级联。mir - 17和miR-20a针对更广泛的基因包括TGFBR2 ALK4, SMAD4, p21和TBX3,所有这一切又与节点/苯丙酸诺龙/ TGF-β信号16,44和细胞周期调控。24,29日最后,mir - 92也被发现目标TBX3 p57。这些数据的总和因此表明,mir - 17 - 92专门抑制了节点/激活素信号多方面的方式表演pSMAD2 / SMAD4的上游和下游。
针对节点/苯丙酸诺龙的生物相关性和ALK4二者已经证明了我们的实验室,16这里我们集中我们的努力在其他更少的特征目标p21和TBX3 mir - 17 - 92。p21,我们观察到,这种细胞周期监管机构在chemoresistant二者表明p21控制CSC扩散的重要作用。的确,有强有力的证据从小鼠模型p21正常进展期造血干细胞自我更新是一个重要的监管机构。在缺乏p21,正常造血干细胞以及转换的进展干细胞功能排气。25,46现在我们的数据也支持一个角色p21在预防胰腺CSC疲惫通过细胞周期限制。抑制p21在二者导致受损的自我更新和药物抗性。DNA损伤的积累就是明证增加gH2AX焦点及其后续消除/功能障碍可能是通过有丝分裂混乱。
TBX3是属于T-box转录因子基因家族和包含一个守恒的dna结合蛋白域称为T-box。47TBX3胚胎发育中发挥着重要作用,细胞周期调控和癌症进展。27,33例如,overexpressing TBX3 non-tumourigenic早期黑色素瘤细胞促进肿瘤形成和入侵。此外,它已被证明,TBX3功能之间的相互切换substrate-dependent细胞增殖和肿瘤入侵。33TBX3 TGF-β1-mediated抗和promigration也扮演一个关键的角色34在节点信号的调控胚胎干细胞。48我们现在表明,TBX3调节二者及其廉价的负面影响通过TGF-β1-dependent CSC表型和NODAL-dependent机制。因此,我们的数据展示的重要性TBX3胰腺二者自我更新的调控和转移通过调节TGF-β1和节点的信号。
总之,我们的研究已经确定了mir - 17 - 92集群作为一个前所未知的胰腺二者的负面主监管机构。虽然我们仍在调查为什么这个集群在二者与non-CSCs差异表达,我们已经观察到MYC,已知调节器mir - 17 - 92的集群,36,38,43在胰腺二者持续下调。更重要的是,我们所演示的那样,第一次,mir - 17 - 92集群通过针对ALK4调节二者,p21和TBX3。mir - 17 - 92的超表达导致CSC表型并最终废除体内tumourigenicity丧失,而抑制mir - 17 - 92导致PDAC侵犯包括侵袭性。此外,重要的是要注意,同时针对不同的组件的节点/激活素信号级联以及其下游效应器通过多个microrna mir - 17 - 92集群允许非常严格控制转录的计划。因此,从临床的角度,针对胰腺癌二者使用的多方面影响,mir - 17 - 92节点/激活素信号可能是一种很有前途的和非常具体的治疗方法,因为它会导致ALK4表达降低,诱导直接mir - 17 - 92介导镇压节点/苯丙酸诺龙反应基因。后者将避免SMAD4地位的偏见SMAD4突变在胰腺肿瘤的50%左右,49即使这些肿瘤仍然保持活跃节点/激活素信号作为他们的自我更新能力的主要监管机构。16事实上,plasmid-based修改microrna的生产,这也使得多顺反子的生成结构如mir - 17 - 9250可以代表一个重要的下一步进一步评估这个PDAC的小说在临床治疗的概念模型。
确认
作者感谢索尼娅Alcala Aristidis博士优秀的技术支持和工程(路德维希癌症研究中心,乌普萨拉,瑞典)提供的pCAGA12-luc SMAD4的记者。
引用
脚注
贡献者MC开发研究的概念,获得,分析和解释数据以及起草的手稿;YS-R、SMT、IM-L EL、JD和AA获取和分析数据;CRV和JCR设计开发所有病毒研究中使用;SH microrna的微阵列实验和分析执行;MH提供广泛的PDAC样本为特征的;BSJr开发研究的概念,解释数据和写的手稿;CH开发研究的概念,获得资金,解释数据和写的手稿。
资金CH:伦理委员会高级研究员格兰特(Pa-CSC 233460),欧盟第七框架计划(fp7/2007 - 2013)根据授权协议没有256974 (EPC-TM-NET)和602783年(CAM-PaC) Subdireccion一般de Evaluacion y持有de la Investigacion洋底de Investigacion疗养地(PS09/02129 & PI12/02643)和下Internacionalizacion de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 ple2009 - 0105;Ministerio de隐藏y Competitividad、西班牙)。主持人:La Caixa博士前的奖学金。
相互竞争的利益一个也没有。
病人的同意获得的。
伦理批准研究院祝您健康卡洛斯三世,马德里,西班牙。
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