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摘要
客观的当营养物质刺激肠内分泌细胞(EEC)释放肠道激素时，食物摄入的抑制和葡萄糖稳态都得到促进。一些特定的营养受体可能位于EEC上，对饮食中的糖、氨基酸和脂肪酸作出反应。肥胖症和II型糖尿病的旁路手术是通过将营养物质分流到远端肠道来工作的，在那里它增加了营养受体的激活和介质的释放，但激活的细胞机制在很大程度上是未知的。我们确定了哪些营养受体在小鼠和人类的哪些肠道区域和细胞中表达，它们如何与不同类型的EEC相关，它们如何被激活导致激素和5-HT释放。
设计和结果通过定量PCR评估了17种营养受体和EEC介质的mRNA表达，并在小鼠和人肠道上皮中发现。出现了许多物种的相似性，特别是在远端肠道中几个受体的密集表达。免疫标记显示受体与EEC介质PYY和GLP-1 (l细胞)或5-HT(肠染色质细胞)特异共定位。我们将分离的近端结肠粘膜暴露于特定的营养物质中，如后续的免疫标记所示，这些营养物质在特定的EEC细胞外受体调节激酶(p-ERK)和钙调蛋白激酶II (pCAMKII)中募集信号通路，并激活这些介质的释放。芳香族氨基酸在小鼠中激活了这两种途径，但在人类中，它们只诱导pCAMKII，主要与5-HT的表达共定位。激活对百日咳毒素敏感。脂肪酸(C12)在人所有EEC类型中都能有效激活p-ERK，并诱发所有三种介质的有效释放。
结论在EEC内，特定的营养受体与不同的激活途径相关。这些可能为肥胖和II型糖尿病的干预提供离散的、互补的药理学靶点。
- 肥胖
- 肠道激素
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关键信息
关于这个问题我们已经知道了什么?
腔内营养物质刺激肠内分泌细胞(EEC)释放介质，有效地抑制食欲和促进葡萄糖稳态。
存在几种特定的g蛋白偶联营养受体(GPCR)，用于处理膳食中的糖、氨基酸和脂肪酸，这些受体可能在EEC上表达。
营养受体的激活和远端肠道介质的释放是肥胖症和II型糖尿病搭桥手术的核心作用，但激活的细胞机制在很大程度上尚不清楚。
新的发现是什么?
脂肪酸和氨基酸的营养受体在小鼠和人类的肠道上皮中表达，特别是在大肠中。
受体与特定的EEC介质存在特异性共定位，例如钙敏感受体和5-HT。
管腔营养暴露激活中介释放，并在EEC细胞内招募特定的GPCR信号通路:在人类中，色氨酸和苯丙氨酸仅激活肠染色质细胞中的pCAMKII，而月桂酸激活p-ERK。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们已经知道，口服营养预负荷会减少随后的食物摄入，而旁路手术通过将营养分流到远端肠道来减少食物摄入。通过细化营养预负荷并将其制定为远端肠道目标，我们希望在搭桥手术之前，并可能取代搭桥手术，开发出一种成功的减肥和抗糖尿病策略。
简介
肠道上皮的营养感应是葡萄糖稳态、能量摄入、运动和分泌功能的基础。碳水化合物的感知机制已经得到了更好的理解，但蛋白质、氨基酸(AA)和脂肪酸的感知机制却没有得到很好的描述，尤其是在人类身上。对营养传感位点和机制的进一步了解将最终使我们能够优化控制II型糖尿病中的血糖和胃轻瘫，与肥胖相关的贪食症和与衰老相关的贪食症。
营养物质被肠内分泌细胞(EEC)感知为碳水化合物、脂肪和蛋白质消化的分解产物。这可能是通过参与AA和葡萄糖吸收的钠偶联转运蛋白的活性发生的，在l细胞中，钠偶联转运蛋白激发细胞并导致释放诸如胰高血糖素样肽1 (GLP-1)等介质。1，2循环GLP-1促进胰腺胰岛素的释放。l细胞还释放肽YY (PYY)，这对抑制食欲很重要。还有其他几种类型的eec，其中最重要的一种是肠色素细胞(EC)，它主要释放5-羟色胺(5-HT)。EC在营养感测中的作用主要体现在对感官的阻断上3.5-HT3受体拮抗剂对腔内葡萄糖的神经反应，4但它们在血糖和食欲控制方面的作用尚不清楚。除了转运体介导的肠道介质释放外，还有针对糖(T1R2和T1R3的二聚体)和游离脂肪酸的特异性g蛋白偶联受体(GPCR)，包括FFAR1, 2和3(也分别称为GPR40, 43和41)，GPR84和GPR120。在某些情况下，在肠道中发现了受体，并在eec中共定位5PYY和GLP-1等激素1，6，7蛋白质分解产物也可能通过一种特殊的受体GPR93起作用，8特定的AAs通过钙敏感受体(CaSR)、GPRC6A、T1R1和代谢性谷氨酸受体mGluR4起作用。9然而，关于这些受体在人类肠道中的表达和共定位，它们在哪些区域被发现，以及如何与其他物种的数据进行比较，我们知之甚少。由于营养素的吸收主要是在小肠中实现的，因此可以假设营养素的检测和能量摄入的反馈控制也在小肠中介导。然而，胃旁路手术对能量摄入和血糖控制的有效影响表明，将营养物质转移到远端小肠和大肠可以对能量摄入产生重大影响。此外，初级蛋白质和脂肪消化的产物可以在正常的结肠中找到，3.在远端肠道的营养物质对上肠功能有强大的影响。10
搭桥手术是目前治疗肥胖症和二型糖尿病最有效的方法。通过将营养物质分流到肠的远端区域，它通过化学感觉机制引起丰富的餐后饱腹感和肠促素激素PYY和GLP-1的释放。11与PYY和GLP-1水平一致，在减肥和血糖稳态方面有巨大而迅速的好处。12 - 14血糖改善先于体重减轻，但两者之间有着密不可分的联系。尽管有这些优点，但手术治疗也有一些缺点，包括由于不可逆性，只能在严重病例中应用，以及费用。毫不奇怪，胃肠病学家和内分泌学家对开发非手术治疗方法越来越感兴趣，从而减少能量摄入、减轻体重和解决II型糖尿病。针对胃肠道产生的饱腹信号的起始是一个有吸引力的选择。另外，蛋白质消化产品对激素释放和血糖控制有明显的作用，这可能对治疗有益。15尽管这些行动的机制目前尚不清楚。因此，我们正在寻找机会直接干预远端肠道的脂肪酸、AA和蛋白质传感通路，以改变内分泌反应。
我们假设营养受体的表达保存在远端肠道中，并能够引起对特定腔内营养物质的反应。我们展示了人类和小鼠肠道中营养受体的表达模式是如何可比性的，它们如何与人类特殊细胞释放的肠道激素耦合，以及哪些信号级联是负责的。我们希望通过收集这些信息，为未来的抗肥胖治疗提供多种靶点，从而直接解决这种情况的病因。
方法
动物研究得到了阿德莱德大学动物伦理委员会和阿德莱德中北部卫生服务机构的批准。在英国，所有的动物实验都是按照内政部的指导方针进行的。人体研究得到了皇家阿德莱德医院(Barts)和伦敦国民保健服务信托(London NHS Trust)的人类研究伦理委员会的批准，并在书面知情同意的情况下进行。
老鼠
实验使用成年雌性C57BL/6小鼠，在无病原体设施的受控环境(12小时光/暗循环，22±0.5°C, 40-60%湿度)中，维持标准实验室食物和水。老鼠被一氧化碳杀死2窒息。收集胃窦、小肠(近2cm为十二指肠，其余分别为空肠近、中、远端和回肠)、盲肠和大肠(近、远端)进行表达分析。刮取各节段黏膜，冷冻于N液中2并保存(- 80°C)以用于后续的基因表达测量。免疫组化方法:将完整的组织在4%多聚甲醛中固定2 h，冷冻保存，切片。在Ussing chamber实验中，快速取出近端结肠，打开并固定30分钟，粘膜朝上，然后放入分裂的Ussing chamber。
人体组织收集
从接受肠镜或结肠镜监测的禁食受试者中收集组织学正常的肠粘膜活检组织，用于基因表达研究。从胃窦、十二指肠、空肠近端和中段(平均深度167 cm)，分别从右、横、左结肠和直肠采集活检，组织学正常。在进行基因表达测量之前，将所有活组织切片存储在−20°C (Qiagen)的RNAlater中。
在免疫组化方面，我们从接受胃肠癌手术的患者身上获得全层的近端结肠样本。手术切除后，非病理组织固定在Zamboni固定液中(4°C过夜)。组织在30%蔗糖/磷酸盐缓冲盐水中冷冻保护，然后安装在最佳切割温度的介质中。
在Ussing室研究中，升结肠组织取自接受右半结肠切除术的患者。将非病理性的全层标本分离出来，放在冷的碳代克雷布斯溶液中，然后在硅胶培养皿中从粘膜中切除肌肉层和浆膜层。剩余的粘膜被固定平面朝上，然后放入Ussing室。
在测量激素/肽释放的情况下，从15名患者中收集了4份升结肠活检/患者。组织立即放置在冷的碳代克雷布斯溶液中，然后转移到含有营养和对照溶液的96孔板上。
基因表达研究
定量实时逆转录酶PCR (RT-PCR)用于评估营养GPCRs在小鼠和人体内的相对表达(见在线补充表S1)。同时测定小鼠胃肠食欲激素CCK、PYY和GCG的区域表达。
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从组织中提取RNA。RNA的数量和质量使用NanoDrop进行评估。如前所述，进行RT-PCR。16引物(见在线补充表S1)设计并从Geneworks (Adelaide, Australia)购买;特异性通过凝胶电泳确定产物大小。用甘油醛3-磷酸酶脱氢酶(GAPDH)或β-肌动蛋白表达归一化的比较周期阈值法测定相对于内源性对照的靶基因表达。17
使用室内实验
小鼠和人的结肠黏膜被分成3个1×1 cm的段，每个段安装在Ussing通量室中。管腔表面暴露于10 mL营养液，底外侧表面暴露于10 mL克雷布斯溶液20 min。所有溶液在35-37°C下进行碳生成。结肠黏膜用4%多聚甲醛固定过夜。
释放化验
收集的活检组织(N= 3-6)与250 μL的缓冲液(对照)或营养液在96孔板中孵育15分钟(5-HT法)或2小时(GLP-1和PYY法)，37℃。使用含有4.4 mM l -谷氨酰胺和6 mM葡萄糖的定制组织培养基，以确保细胞健康，但不受营养物质刺激。GLP-1实验中使用DPPIV抑制剂PK 44磷酸酶(50 nM)作为缓冲液，5-HT中使用单胺氧化酶抑制剂莫氯贝胺(10 nM)和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂氟西汀(10µM)防止分解和再摄取。孵育后，收集上清液并在−20°C保存。GLP-1和PYY蛋白水平根据制造商说明书(Milliplex MAP multiplex assay, Merck Millipore)使用人类多重试剂盒定量，其中包括胃促生长素和胃抑制多肽(GIP)作为比较物。5-HT采用ELISA (BA E-5900, Labor Diagnostika Nord)检测。在研究结束后，添加营养物质来控制上清液不影响读数，因此它们的存在不会干扰测定。
营养解决方案
将1和10 mmol/L苯丙氨酸(phylalanine, Phe)和色氨酸(Trp)暴露于小鼠结肠黏膜管腔侧，而人升结肠暴露于25和50 mmol/L Phe/Trp (CaSR的选择性激活剂)。分别用月桂酸(LA, 12.5和25 mmol/L)作为GPR84的激动剂。我们利用百日咳毒素(PT, 200 ng/mL)干扰g蛋白偶联，进一步研究了参与激活的细胞内通路及其与介质释放的关系。克雷布斯溶液中的营养成分要么是正常钙，要么是高钙(Phe/Trp实验)。所有溶液均含有124.05 mM NaCl (Sigma)， 4.78 mM KCl (AnalR)， 1.33 mM NaH2阿宝4(Sigma)， 2.44 mM MgSO4(Sigma)， 5.50 mM d -葡萄糖(Sigma)和25.00 mM NaHCO3.(Sigma)碳生成95% O25% CO2．正常和高钙溶液也含有2.50和5.05 mM的钙2,分别。
免疫组织化学
在小鼠近端空肠和结肠中评估了GPRC6A、T1R2、GPR93和FFAR3的免疫标记，后三个靶点与空肠中的CCK和结肠中的PYY/GLP-1共定位(见在线补充表S2)。CaSR和GLP-1/PYY/5-HT在人结肠中的共定位也被确定，而pERK和pCamKII在人和小鼠Ussing chamber实验中进行(见在线补充表S2)。简单地说，用阻断缓冲液清洗10 μm切片，涂抹一抗(19小时，4℃)，然后用种特异性Alexa Fluor偶联二抗(1:200,Invitrogen)清洗组织并在室温下孵育(60分钟)。切片成像如前所述。16每个靶标的免疫阳性细胞在每个切片中手工计数，并在五个视野中平均。
统计分析
数据以均数±SEM表示。采用单向方差分析和Tukey事后检验(GraphPad Prism, V.5.02, GraphPad Software, Inc)进行统计学分析，以p<0.05为差异有统计学意义。对于释放测定，采用非配对单尾t检验，采用Mann-Whitney事后检验，以p<0.05定义为显著，进行统计学意义的检验。
结果
营养受体分布
为了回答在胃肠道中存在哪些受体来感知营养物质的问题，我们首先通过对其转录本的定量测量，研究了主要候选受体在小鼠和人类肠道中的相对分布。营养GPCRs在小鼠从胃到结肠的整个胃肠道中都有表达，除了甜味受体T1R2只在小肠中检测到(图1)．胆汁酸传感器TGR5未显示出任何区域特异性。蛋白水解物受体GPR93在肠中表达量最高，在远端空肠中表达量最高。AA受体CaSR, mGluR4和T1R1远端表达较高，在盲肠(CaSR)和近端结肠(mGluR4, T1R1)表达高峰明显。T1R1共受体T1R3在回肠中表达最高。短链脂肪酸(SCFA)受体FFAR2在结肠近端高表达，而FFAR3在空肠远端最高表达。中位CFA (MCFA)受体GPR84和双位MCFA和长位CFA (LCFA)受体FFAR1在回肠中最高，而GPR120在结肠近端最高。油乙醇酰胺受体GPR119在远端胃肠道表达量最高。正如预期的那样，胆囊收缩素(CCK)转录水平在小肠中最高，而胰高血糖素(GCG)和PYY表达分别在近端和远端结肠中达到峰值(见在线补充图S1)。
g蛋白偶联受体(GPCR)在小鼠胃肠道的区域表达碳水化合物甜T1R2 (A)，胆胆酸，TGR5 (B)，氨基酸，GPR93, T1R3, CaSR, mGluR4和T1R1 (C)，脂肪酸GRP120, FFAR3, FFAR1, FFAR2, GPR84和GPR119 (D)，相对于GAPDH(所有表达研究n=7)。(E和F)小鼠近端结肠中GPR93、FFAR3、GLP-1和PYY的免疫标记。图表表示单个GPCRs与表达GLP-1或PYY的细胞(黄色)，单独GPCR的细胞(绿色)和单独激素的细胞(红色)共定位的比例。
由于人类和小鼠的饮食和食物摄入行为有很大差异，因此确定这些物种之间的表达模式是否保守是很重要的。这是普遍的情况，因为所有的营养GPCRs都在人类胃肠道的活组织检查中表达，除了T1R2，它只在两个物种的小肠中检测到(图2)．GPR93受体在小鼠和人的小肠黏膜中表达最高，而LCFA受体GRP120在大肠中表达最高。GPR93和SCFA受体FFAR2在这两个物种的大肠中也高度表达。
g蛋白偶联受体(GPCR)在人胃肠道的区域表达碳水化合物甜T1R2 (A)，胆胆酸，TGR5 (B)，氨基酸，GPR93, T1R3, CaSR, mGluR4, T1R1 (C)，脂肪酸GRP120, FFAR3, FFAR1, FFAR2, GPR84和GPR119 (D)相对于β-actin(所有表达研究n=6)。(E)人近端结肠CaSR、GLP-1、PYY和5-HT的免疫标记。图表表示单个细胞与PYY、GLP-1或5-HT共定位的比例，有和没有CaSR。
eec内的GPCRs
在小鼠中评估了T1R2、GPR93和FFAR3的免疫标记，同时在小鼠空肠中进行了CCK标记，在结肠中进行了GLP-1和PYY标记，因为这些介质的mRNA在这些位置占主要地位(见在线补充图S1)。T1R2没有与CCK共定位，而32%的ffar3阳性细胞具有CCK免疫反应性(IR)(见在线补充图S2)。结肠l细胞为GLP-1和PYY的IR，并经常与GPR93和FFAR3标记相关(图1E, F).在人类升结肠中发现了GLP-1和PYY相似的共定位，分别标记为69%的细胞重叠。由于我们对远端肠道在营养感测中的作用特别感兴趣，因此使用双染色免疫标记检测了CaSR与主要EECs介质PYY、GLP-1和5-HT的共定位。数据图2E表明，尽管有大量的l细胞(GLP-1和/或PYY-IR)表达CaSR，但大多数表达CaSR的细胞没有共定位。相反，它们经常与5-HT- ir相关(91%)，这表明CaSR信号通路可能在人类升结肠中优先释放5-HT。在人类中，CaSR-IR细胞数量最多的是在前庭内(见在线补充图S3)，这与其在aa诱发胃泌素释放中的既定作用一致。18然后是回肠和结肠。在小鼠结肠中未发现5-HT与CaSR共定位的优势(见在线补充图S4)，这表明物种差异。
下游通路被CaSR激活
我们发现AA感受器mRNA在小鼠和人远端胃肠道中表达，CaSR蛋白在人结肠中表达，我们探索了该受体在食欲调节通路激活中的功能作用。细胞激活标记磷酸细胞外信号调节激酶(pERK)和pCaMKII被用作一般细胞激活的标记。在小鼠近端结肠中，通过CaSR激动剂苯丙氨酸和色氨酸(Phe/Trp)的刺激，我们观察到pERK增加(图3A)和pCaMKII (图3B)表达与缓冲控制的比较。这些标记揭示了细胞群激活的不同模式(pERK;图3C (i))或单个细胞(pCAMKII;图3C(2))。这种pERK激活模式可能暗示了某些类型的eec周围细胞的夹带，而不是其他类型的eec。为了证实这些效应是受体介导的，我们用CaSR选择性激动剂cinacalcet(1µM)重复了实验，19显示了类似于Phe/Trp激活标记的诱导(见在线补充图S5)。
苯丙氨酸和色氨酸(1和10 mmol/L)对小鼠近端结肠黏膜酶磷酸化的影响。与对照组相比，两种浓度刺激后的pERK-IR (a)和pCamKII-IR (B)细胞数量均显著增加(*p<0.05)。pERK-IR细胞通常成群分布在黏膜绒毛顶端。在perk阳性细胞组中，通常有一两个细胞比周围的IR细胞染色更阳性(C (i)，箭头)。隐窝中出现相对较少的perk阳性细胞。pCamKII-IR细胞则相反(C (ii)和(iii)中的示意图)。插图显示40倍放大的激活细胞。比例尺为15 μm。
CaSR刺激对人近端结肠的影响也进行了研究。pCaMKII诱导对Phe/Trp的响应是浓度依赖的(图4A)，而与小鼠相比，我们从未观察到高于基线的pERK诱导。由于CaSR主要存在于含有5- ht的细胞而非l细胞中(图2E)，我们研究了活化细胞中5-HT或GLP-1的存在。本实验证实了CaSR与含有5- ht的细胞(图4B).在腔内暴露于25 mmol/L Phe/Trp后，5-HT-IR细胞显示pCamKII-IR共定位(42±11%)是对照组(10±5%，p<0.01, n=10)的4倍。GLP-1细胞也显示CamKII激活，但激活程度较低(29±5% p<0.01)。
(A)以25和50 mmol/L Phe/Trp或高钙Krebs刺激人升结肠黏膜作为对照。与对照组相比，两种浓度刺激后pCamKII-IR细胞数量均显著增加(*p<0.05)。未诱导pERK-IR(未显示)。比例尺为15 μm。(B)在人结肠中，25 mmol/L的Phe/trp可特异性激活5-HT-IR pCaMKII细胞，而未发现GLP-1细胞与pCaMKII共定位。5-HT-IR和GLP-IR主要在基底外侧膜中发现，这表明该肽位于囊泡中，在CaSR刺激后预计会释放。比例尺为15 μm。(C)月桂酸(12.5和25 mmol/L)对人近端结肠黏膜中pERK-IR的影响。与对照组相比，随着浓度的增加，IR细胞数量呈浓度依赖性增加(*p<0.05)。比例尺为15 μm。
由于pERK是在小鼠组织中诱导的，而不是在人类组织中，这提高了pERK途径是物种特异性的可能性。为了确定pERK是否实际上是由人体组织中的营养物质诱导的，我们研究了LA的作用，众所周知，LA是一种除5-HT以外的激素的有效释放剂。20.暴露于LA后，人类近端结肠中pERK-IR细胞的数量确实存在浓度依赖性的增加(图4C)，我们发现它发生在含有5- ht和l细胞中(见在线补充图S6)。
CaSR通过Gαq和Gαi/o g蛋白偶联，因此我们想确认这种机制参与了人EEC对Phe/Trp的反应。因此，PT被用来阻断Gi/o的激活，从而阻断下游的激活。PT预处理导致pcamkii激活细胞/隐窝数量显著减少(图5)，证实g蛋白参与其中。因此，在人类CaSR偶联方面，它似乎是通过g蛋白激活的，g蛋白在含5- ht的ECs中与pCAMKII偶联，或者在l细胞中与另一种机制偶联，但不是pERK。
与未处理的对照组相比，百日咳毒素(+PT)预处理的人升结肠黏膜的Phe/trp刺激导致pCamKII-IR细胞/隐窝(箭头)数量显著减少(−PT， *p<0.05)。比例尺20µm。
中介发布
我们在小鼠和人类远端胃肠道中发现了EEC的激活，在人类结肠中发现了CaSR和GPR84的表达，我们通过测量免疫组化检测的三种介质的释放来探索受体激活的功能后果。与对照相比，LA(最有效激活GPR84)显著增加了所有三种介质的释放，而Phe/Trp(最有效激活CaSR)仅增加了GLP-1的释放，并有增加PYY和5-HT的趋势(图6)．这些刺激都没有引起GIP或ghrelin的释放(数据未显示)。
营养物质苯丙氨酸/色氨酸(P/T)和月桂酸(LA)刺激人类近端结肠中食欲调节激素的释放。(A) 50 mM P/T刺激的结肠活检可诱导GLP-1释放显著增加，但PYY或5-HT没有。(B)与缓冲对照相比，25 mM LA显著增加了GLP-1、PYY和5-HT的释放(*p<0.05)。
讨论
在这项研究中，我们已经了解到哪些受体介导了胃肠道中营养物质的饱腹作用。AA和FA受体在小鼠和人的胃肠道中从胃到结肠均有表达，且在远端肠道具有高度的物种相似性和表达保守性。我们发现受体与特定的EEC介质的特异性共定位，例如，钙敏感受体和5-HT，这表明EEC对特定刺激的微调。这在功能研究中很明显:在人类结肠中，在含有5-HT的细胞中，AAs优先激活一个细胞内信号通路(pCamKII)，而在含有GLP-1和/或pyy的细胞中，脂肪酸激活另一个(p-ERK)。
如前所述，EEC介质胆囊收缩素(CCK)主要在小肠中发现，而胰高血糖素(GCG)和PYY基因表达在结肠中达到峰值。肠腔中的碳水化合物与CCK释放无关，而蛋白质和脂肪通常与CCK释放有关。相应地，我们发现T1R2没有与CCK共定位，而32%的ffar3阳性细胞是CCK- ir。结肠l细胞为GLP-1和PYY的IR，并经常与GPR93和FFAR3标记相关，再次表明与蛋白质和脂肪感测有关。尽管有大量的l细胞(GLP-1和/或PYY-IR)表达CaSR，但大多数表达CaSR的细胞没有共定位。相反，它们几乎只与5-HT-IR有关。这些观察结果与eec的重叠谱系一致，ECs与其他ECs具有很大程度上不重叠的表型。21
为了确定营养受体在食欲调节通路激活中的功能作用，我们寻找细胞激活的标记物。细胞外信号调节激酶(ERK)在许多系统中通过Gq和Ras-Raf蛋白偶联的GPCRs的级联激活而磷酸化，并与分泌、基因表达和细胞代谢途径相互作用。22钙调蛋白激酶(CaMKII)由细胞内钙的增加而激活，通常与磷脂酶C的Gq激活和内质网上ryanodine受体的刺激有关。23该途径与细胞内依赖钙的分泌囊泡对接一起被激活。因此，这两条细胞内通路可能具有收敛性和发散性的作用，并具有gq蛋白激活的共同特征。23大多数营养受体都是通过这种g蛋白偶联的，所以我们选择研究的标记很可能揭示了替代的下游级联。pCaMKII先前已被证明是受刺激的完整黏膜中激活EEC的合适标记物。pERK是突触神经激活的一个组成部分。24
在小鼠近端结肠中，对CaSR激动剂苯丙氨酸和色氨酸的刺激做出反应，这两种标记物都被诱导，但显示出不同的激活模式。在几种情况下，pERK在细胞群中被诱导，而pCAMKII仅在单个细胞中被激活。pERK激活的模式表明，某些类型的EEC周围的细胞被夹带，而其他类型的则没有。我们推测这可能是结肠腺细胞吸收、免疫或增殖功能的旁分泌控制机制。CaSR刺激对人近端结肠的影响不同。pCaMKII对Phe/Trp的诱导依赖于浓度，而与小鼠相比，我们没有观察到pERK的诱导。因此，确定是否仍涉及GPCR机制是很重要的。这是通过PT阻断g蛋白的激活得到证实的。这些数据提出了一种可能性，即pERK仅是小鼠中营养受体激活的标记，因此我们研究了对人类结肠中存在的另一种营养受体的反应。因此，我们用LA(12.5和25 mM)孵育人体组织，LA是GPR84的激动剂，可引起PYY和GLP-1的释放。20.这在大量的EECs中引起了强大的pERK反应，表明在不同类型的细胞中有不同的途径参与芳香AA和MCFA的感知。相应地，LA诱发了所有三种EEC介质的强烈释放。
由于CaSR主要存在于含有5- ht的细胞而非l细胞中(图2E)，我们研究了活化细胞中5-HT或GLP-1的存在。本实验证实了Phe/ trp敏感受体CaSR主要与含5- ht的细胞相关(图3D).因此，在CaSR偶联方面，它似乎是通过g蛋白激活人EE细胞的，而g蛋白在含5- ht的ECs中又与pCAMKII偶联，并且在l细胞中可能还涉及一种不同的机制，但这一机制独立于pERK。
结论
我们的结论是，人类和小鼠的远端肠道广泛配备了脂肪和蛋白质消化产物的传感器，这些传感器与特定的信号通路有关，其中两种已经在这里展示。这些又与特定介质的释放相关。我们已经发现了5-HT在对腔内芳香aa反应中的作用，这可能有助于远端肠道暴露于膳食的代谢和行为反应。众所周知，口服营养预负荷会减少随后的食物摄入量15搭桥手术通过将营养分流到远端肠道来减少食物摄入。通过细化营养预负荷并将其制定为远端肠道目标，我们希望在搭桥手术之前或可能取代搭桥手术之前制定成功的减肥和抗糖尿病策略。
参考文献
补充材料
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补充数据
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本数据补充文件:
- 数据补充1-在线补充
脚注
ELS和MP的贡献相同。
贡献者ELS和MP进行了实验，分析了数据，并为撰写手稿做出了贡献。AJP和RLY监督实验，并对手稿编辑做出贡献。BC、HD、AM、VG、MA进行实验。DB发明了方法。LAB获得资助，监督实验并撰写手稿。
资金阿斯利康，威康信托，肠道和癌症研究，巴茨和伦敦慈善机构。
相互竞争的利益一个也没有。
伦理批准皇家阿德莱德医院和皇家伦敦医院。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。