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肝脏病学
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添加剂抗肿瘤反应兔VX2肝癌的射频消融和toll样受体9刺激
免费的
  1. 芭芭拉Behm1,
  2. Di Pietro法齐奥2,
  3. 帕特里克·本3,
  4. 丹尼尔Neureiter4,
  5. 拉尔夫年前4,
  6. 埃克哈特Georg哈恩1,
  7. 戴克Strobel1,
  8. 托马斯行走3,
  9. Detlef Schuppan5,6,
  10. 达太直到Wissniowski1,3
  1. 1医学系的1,埃尔兰根-纽伦堡大学医院,埃朗根、德国
  2. 2外科研究所Philipps-University马尔堡,马尔堡、德国
  3. 3胃肠病学分工,大学医院,Philipps-University马尔堡,马尔堡、德国
  4. 4帕拉塞尔苏斯医科大学病理学研究所,萨尔斯堡、奥地利
  5. 5胃肠病学分工,贝斯以色列女执事医疗中心,哈佛医学院,马萨诸塞州的波士顿美国
  6. 6平移免疫学研究所大学医学中心,美因茨、德国
  1. 对应到胃肠病学分工达太直到Wissniowski博士马尔堡大学医院,Baldingerstraße,马尔堡35043年,德国;Wissniowski在}{icloud.com

文摘

介绍射频消融术(RFA)、固体肝肿瘤姑息治疗选择,刺激局部及全身抗肿瘤细胞毒性T细胞。我们研究了多远的CpG B寡核苷酸,toll样受体(TLR) 9受体激动剂,将增加antitumoural RFA的T细胞反应高度积极VX2肝癌。

方法兔子随机接受RFA, CpG B,他们的组合或没有治疗。RFA的抗肿瘤疗效单独或结合CpG B被重新进一步测试了另一组与静脉注射VX2肿瘤细胞后120天。动物生存的评估、肿瘤大小和扩散,肿瘤和免疫相关组织标记后120天。外周血单核细胞检测肿瘤特异的T细胞活化和细胞毒性。免疫调节细胞因子肿瘤坏死因子α,白介素(IL) 2 /引发/ IL - 10 /白介素、干扰素γ和血清中血管内皮生长因子测量。

结果未经处理的动物的生存是36天,与97年相比,78年和114年天RFA,分别CpG和联合治疗。与未经处理的控制相比,抗肿瘤和细胞毒性T细胞刺激增加26/16-fold 32/17-fold RFA 50/38-fold 2周后,分别CpG和联合治疗。结合显著抑制肿瘤扩散到肺部和腹膜,禁止新的肿瘤生长在动物接收二次系统肿瘤细胞注入。RFA单独诱导Th1细胞因子模式,而引发和il - 10只调节CpG对待动物和控制。

结论TLR9识别刺激与RFA的结合导致了强抗肿瘤T细胞反应和细胞毒性VX2肿瘤模型。只有这种组合阻止随后的肿瘤扩散并导致显著提高生存,证明需要进一步探索消融疗法的结合和TLR9识别受体激动剂在肝癌。

  • 免疫疗法
  • 癌症
  • 肝转移
  • 肝细胞癌
  • 介入放射学

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2014 - 308286

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    请求的权限

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 射频消融术(RFA)已经成为标准治疗不可切除的肝肿瘤。

    • RFA是已知肿瘤特异免疫的副作用。

    • ODN论文认定已经作为佐剂疫苗等具体人数受体(TLR)受体激动剂。

    • 抗癌策略与CpG程序缺乏临床意义缺失的抗原的免疫接种。

    有什么新发现吗?

    • 免疫环境CpG后应用程序单独创建一个Th2 / M2的免疫反应。

    • 论文认定RFA后的结合特异性抗原来源肿瘤消融导致Th1定向免疫反应。

    • 肿瘤特异Th1定向免疫反应防止复发的恶性肿瘤生长。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 体内肿瘤疫苗接种与特定TLR9识别刺激一起与当地肿瘤消融可能是未来多通道抗肿瘤策略的一个重要组成部分。

    客观的

    原发性肝细胞癌(HCC)是世界第五位最常见的癌症发病率上升。1一旦确诊,HCC具有很高的短期死亡率,和只有少数病人可以通过切除或肝移植,救出离开姑息疗法,如射频消融(RFA),乙醇注入,肝动脉chemoembolisation,化疗或最好的支持性护理对于大多数肝癌患者。2 - 5值得注意的是,大多数肝癌化疗耐药,multikinase抑制剂索拉非尼,虽然被批准用于治疗肝癌,延长生命仅仅几个月和明显的副作用。6

    RFA是一个重要的姑息治疗肝癌患者。7RFA使用高频交流电导致焦温度高于60°C,从而热坏死。RFA peritumoural地区诱发热应力等后续释放促炎细胞因子白介素(IL) 1、白介素和肿瘤坏死因子α(TNF-α),8,9和热休克蛋白。10此外,RFA可能揭开神秘的肿瘤抗原,可以成为小说的目标抗原呈递细胞(apc)和细胞毒性T细胞,11RFA后证明了一个强大的抗癌免疫反应和类似的消融疗法。12,13这种反应的特点是高度活性抗肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞(ctl),证明在VX2肝癌模型。14不过,目前仍不清楚有这CTL反应主要是针对以前免疫神秘的肿瘤抗原,揭露了在RFA,或者将针对抗原免疫反应的同种异体肿瘤捐献者。而在一些研究自体肿瘤组织,15其他人使用不同的肿瘤细胞。16然而,无论这些机制,刺激免疫反应的主要或次要thermoablative肝恶性肿瘤的治疗时应该更有效的结合进一步免疫调节antitumoural策略。

    免疫监视主机的相关性对各种癌症的有效反应获得了越来越多的关注,目前利用在体外和体内免疫刺激性的方法,主要在黑色素瘤和肾细胞癌,包括脉冲树突状细胞(dc)和局部细胞因子的应用。17日至19日例子是肿瘤抗原T细胞疫苗接种和脉冲DCs /或疫苗接种的黑色素瘤患者,17,20.,21或全身或局部应用细胞因子免疫调制的肾癌患者。

    DC活化是特别有吸引力,因为DCs存在肿瘤抗原细胞毒性T细胞,这可能会导致肿瘤的破坏。22肿瘤抗原介绍DCs的效率可以通过刺激增强先天免疫受体,特别是某些toll样受体(通常)丰富可以明确表示对DCs和合成小分子受体激动剂。23,24TLR9识别,识别CpG unmethylated细菌DNA的图案,是一个有趣的但不完全的研究目标,促进抗肿瘤细胞毒性T细胞反应。TLR9识别位于intracellulary核内体,并表示在DCs或其他装甲运兵车如巨噬细胞、单核细胞、B和NK细胞。23

    CpG-oligodeoxynuleotides (CpG-ODN)是合成细菌派生的核苷酸序列与phosphorothioate骨干和重复的CpG图案,让他们直接TLR9识别受体激动剂临床使用作为其余佐剂疫苗抗原的免疫原性。25

    本研究的目的是探讨RFA的组合效应和TLR9识别受体激动剂CpG B生存,肿瘤扩散和antitumoural细胞毒性T细胞反应与高度侵略性的兔子VX2肿瘤模型。

    材料和方法

    寡核苷酸CpG和放射性核素

    ODN CpG B类核苷酸(序列:5′- tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3′;大胆的信件:CpG二核苷酸,普通信件:phosphorothioate联系)获得了兔子Coley辉瑞制药/(德国的杜塞尔多夫)。放射性核素从Amersham /通用电气医疗集团(德国弗莱堡)。

    伦理批准

    动物实验伦理批准从州政府获得的法兰克尼亚(Ansbach,法兰克尼亚政府伦理委员会)和动物使用埃尔兰根大学的委员会。显示所有程序都执行政府的指导方针的巴伐利亚国家实验动物。

    动物肿瘤模型

    在这项研究中,70名女性新西兰白兔(重量2.7公斤;年龄3 - 4个月;查尔斯河,Kimberg,德国)被视为下面,和六个女兔子被用于使VX2肿瘤模型。动物被安置在当地动物设施单笼兔子(查尔斯河,Kimberg,德国)随意提供食物和饮用水。12 + 12 h黑暗/光周期提供了一个自动化系统。毕竟手术,metamizol (5 g / L饮用水)作为止痛剂添加到饮用水以下5天。1毫米肿瘤标本植入中间叶邻近胆囊肝包膜下我们组的描述在先前的研究中。14,26肝包膜被纤维蛋白胶(约翰逊,德国)关闭,以避免腹膜扩散。

    只有tumour-bearing动物总肿瘤直径9 - 12毫米植入部位植入后20天,证实了超声,是包括在这项研究中。动物腹水的迹象,腹膜扩散被排除在外的指示器。

    随机分为对照组和治疗组是由一个独立的科学家与本研究植入后20天。

    外科手术和postinterventional护理进行了描述。14

    静脉注射细胞准备VX2肿瘤细胞和细胞培养

    固体VX2肿瘤芯片通过无菌钢过滤器(网格大小400µm)和PBS洗。细胞悬液是由梯度离心法分离使用Percoll(通用电气医疗集团,弗莱堡,德国),紧随其后的是两个与PBS洗。细胞浓度调整到106细胞/毫升。

    研究设计

    18日初步试验动物找到最有效剂量的CpG B。所有这些动物移植intrahepatically与肿瘤组织,分为团体接受200年,400年或600年μg /公斤体重的CpG B皮下注射三次每周从肿瘤植入后21天。动物们每天监测和牺牲不迟于肿瘤植入后120天。的研究涉及到52动物(图1)。所有动物都牺牲了120天植入后VX2肝癌和治疗21天,除了B组*。A组(肿瘤植入没有任何连续治疗,n = 10)和B组(RFA治疗肿瘤植入只有21天后,n = 10)作为控制。

    Study protocol. In all, 52 New Zealand white rabbits with confirmed tumour growth (9–12 mm) by ultrasonography on day 20 after implantation and after exclusion of peritoneal spread (like ascites) were randomised into six groups. Ten animals each were assigned to groups A–D. For subgroups B* and D*, an additional six animals were included. In all animals, a subcapsular VX2 tumour was implanted into the liver. Subgroups B* and D* received a further intravenous tumour cell injection 120 days after tumour implantation. Group A was left without therapy and served as control. After 21 days of tumour growth, animals of groups B, D, B* and D* were treated with radiofrequency ablation (RFA). Groups B and B* received no further treatment thereafter. Groups C, D and D* were injected with CpG ODN three times weekly until the end of observation. Groups A–D were autopsied 120 days and subgroups B* and D* 160 days after tumour implantation. RFA treatment; numbers denote days of blood sampling after tumour implantation; +, sacrifice of animals; intravenous tumour cell injection; grey bar: period of CpG ODN treatment.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    研究协议。,52新西兰白兔确诊肿瘤生长(9 - 12毫米)的超声植入后20天,排除后腹膜扩散(如腹水)被随机分为六组。十个动物每个被分配给组模拟。子组B *和D *,包括额外的六个动物。在所有的动物中,被膜下的植入肝脏VX2肿瘤。子组B *和D *收到进一步的静脉注射癌细胞肿瘤植入后120天。A组治疗和作为控制也没有了。经过21天的肿瘤生长,动物组B, D、B *和D *与射频消融术(RFA)治疗。组B和B *收到任何进一步的治疗。组C, D和D *被注射了CpG ODN每周到观察的三倍。 Groups A–D were autopsied 120 days and subgroups B* and D* 160 days after tumour implantation. RFA treatment; numbers denote days of blood sampling after tumour implantation; +, sacrifice of animals; intravenous tumour cell injection; grey bar: period of CpG ODN treatment.

    RFA后的过程中,动物被随机由一个独立的科学家没有关系的治疗在很多动物通过选择是否接受额外的CpG应用程序或保持没有任何额外的治疗。

    C组(n = 10)是处理CpG B(400µg /公斤体重)和D组(n = 10)收到RFA和常规皮下注射CpG B的每周400µg /公斤体重的三倍。组B *和D * (n = 6)被视为组B和D,分别与RFA,但收到的另一个注射106静脉注射VX2肿瘤细胞在120天观察另一个40天。所有的动物,拒绝固体和液体摄入量超过4天,显示超过15%的冷漠和减肥是牺牲在到达端点和之前被认为是早期死亡。

    在牺牲,动物牺牲来确定主要的肿瘤,转移性肿瘤的扩散和组织学和peri-tumoural区域。在所有组,外周血样本取自耳静脉肿瘤植入前和2周后,每2周之后120天(组模拟)或160(组B *和D *)(见也图1)。

    RFA应用程序

    成熟期后的21天导致平均肿瘤大小为10 mm,动物组B, B *, D和D * (n = 32)与超声引导经皮RFA治疗14使用一个射频发生器(Elektrotom HF 106;Integra、Tuttlingen、德国),配备了包括射频针器1.1毫米外径和10毫米活跃的电极。

    分离PBMC与文化;扩散试验和分离PBMC细胞毒性

    PBMCs从柠檬酸的血液通过密度梯度离心分离在Leukosep分离管(PAA实验室、奥地利)和培养如前所述。14

    进行增殖和活化试验使用[3 h] thymidine-incorporation馈线刺激天真PBMC如前所述。14Phytohemagglutinine (PHA)担任积极控制,新鲜肿瘤组织溶解产物作为检测抗原和肝脏组织溶解产物作为消极的控制。

    评估细胞毒性,PBMC或血清独自cocultured VX2肿瘤细胞。肿瘤细胞溶菌作用被一个腺苷酸激酶释放量化分析使用荧光素酶测定(ToxiLight装备,Lonza, Verviers,比利时)和表示为相对发光单元(RLU)根据之前的研究27(见补充材料和方法)。

    细胞因子ELISA

    收集的动物血清肿瘤移植后14天,4周后第一次治疗过程(如RFA, CpG应用程序或两者都有),用于细胞因子分析。

    elisa进行根据制造商的指导方针和评估在450 nm波长校正在540 nm减去背景噪音Genios板读者(Tecan,德国)。

    从Antibodies-onlie ELISA试剂盒,亚琛,德国,被用于2、il - 6,引发,il - 10、il - 12, TNF-α,血管内皮生长因子(VEGF)和干扰素γ(IFNγ)(也见在线补充材料和方法)。

    组织学及免疫组织学

    组织学分析由两个独立病理学家(DN和RK)。完整的肝脏叶轴承的主要肿瘤包括邻近健康的肝组织,心脏、肺、肝脏和所有转移(淋巴结、胸膜、腹膜)存储在10%的缓冲福尔马林。5µm-thick部分染色后被嵌入在石蜡和检查)。T细胞是沾多克隆抗体鼠CD3ε1:10稀释(E Kremmer博士的礼物GSF-National环境与健康研究中心,慕尼黑,德国)28所述。29日Tris-buffered盐水代替主要抗体作为消极的控制。

    彩色部分是数字化使用ImageAccess 9企业软件(形象的,阿弟克公司,瑞士)和评估通过计算CD3 +细胞的数量每10大功率领域。

    统计评估

    统计学评价做了与Microsoft Excel 2008 MAC(微软公司,西雅图,华盛顿,美国)和SPSS V.15.0 (SPSS . n:行情)、芝加哥,伊利诺斯州,美国)软件包。与Kaplan-Meyer生存分析方法比较生存率较生存曲线。所有的数据的意义是证明使用Mann-Whitney U检验和方差分析F检验,分别p < 0.05被认为是显著的。

    结果

    剂量找到CpG B

    动物,每周至少三次收到400µg /公斤CpG B活75.4天15.6 (SD)与65.3天16.9 (SD)与200年相比µg /公斤和71.2天12.3 (SD)与600µg /公斤,和34.2天9.4 (SD)未经处理的动物。小学和转移性没有显著差异(肺、腹膜、淋巴结)肿瘤生长都没有出现在任何组(数据未显示)。因此,400µg /公斤被选作进一步调查。

    主要研究:生存和肿瘤扩散

    归纳了数据图1和2A、B、表1。未经处理的对照组(n = 10)只达到平均生存35.9天(范围31-42)后肿瘤植入。所有的动物都被认为是早期死亡的10/10。所有的动物都有主要和次要恶性病变(肺、腹膜和淋巴结)。B组(n = 10),肿瘤植入RFA治疗21天后,达到平均生存97.3天(范围76 - 120年),只有两只动物幸存下来,直到最后的观察和7/10必须根据协议考虑牺牲早逝。只有一个动物是自由的恶性组织,而九遭受到主要和/或次要恶性肿瘤(肺和/或腹膜和淋巴结)。每周至少三次C组收到CpG B后肿瘤植入。生存是77.6天(范围54 - 120)。总的来说,1/10的动物存活下来,直到最后的观察,而9/10的动物必须牺牲。只有一个动物是自由的恶性肿瘤,但也有显著减少肺转移与B组相比仅接收RFA (CpG B 3/10 vs RFA 7/10; p<0.01). Animals of all groups with peritoneal spread also developed metastasis within peritoneal lymph nodes.

    把这个表:
    表1

    概述的存活时间和所有的动物尸体剖检的结果

    Kaplan–Meier survival curves for groups A–D. Log-rank ratios of survival curves of animals treated with radiofrequency ablation (RFA), CpG B, RFA/CpG B or left without treatment. *p<0.05 versus controls; **p<0.05 versus CpG B only; ***p<0.05 versus RFA only.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    kaplan meier生存曲线组模拟。Log-rank比率的生存曲线的动物用射频消融术(RFA)治疗CpG B, B RFA / CpG或没有治疗。* p < 0.05与控制;* * p < 0.05和CpG B;* * * p < 0.05和RFA只。

    D组收到RFA紧随其后CpG B每周在整个观测期间的三倍。这些动物的结果明显好于其他组:生存是113.9天(范围89 - 120)。总的来说,2/10的动物不得不牺牲到年底前观察。在第一次治疗后120天,动物没有任何恶性肿瘤组织的8/10,1/10有原发性肿瘤肺转移,1/10的原发性肿瘤腹膜转移。

    120天后,12个额外的动物治疗组B和D(命名为B组* (n = 6)和D * (n = 6))是没有进步的迹象,恶性肿瘤(肿瘤筛查的< 1厘米植入部位超声评估,缺乏先进的肿瘤的临床症状负担像减肥或减少食物摄入量)被挑选接受静脉注射VX2肿瘤细胞并观察了40天(组B *和D *)。B组的生存*,最初RFA应用在肿瘤植入后21天,是134.5天(范围127 - 141);没有动物达到最终的观察。所有动物发达肺转移,2/6已经腹膜转移,但3/6没有剩下的肿瘤在主要的植入端(图2一个,表1)。所有这些肿瘤相关参数进一步显著降低与B组相比,D组* * (p < 0.01;图2B,表1)。

    肿瘤特异激活PBMC

    对照组,没有治疗肿瘤植入后,没有显示肿瘤特异激活外周T细胞(PBMC,刺激指数(SI) 2.01, 0.63 SD),而所有治疗动物显示显著的刺激。

    D组收到RFA的组合和CpG B,显示最高的肿瘤特异淋巴细胞激活(SIRFA / CpG B55.55 = 103.43,SD)相对于其他治疗组(SIRFA= 88.49,SD 39.30;如果CpG B35.74 = 80.75,SD团体接受CpG或RFA作为单一疗法,分别;p < 0.05) (图3一个)。

    Tumour-specific immune response in peripheral blood. (A, B) Relative increase of stimulation indices (SIs) of PBMC exposed to tumour lysate compared with baseline stimulation (before treatment). SI was assessed by 3H-thymidine incorporation of isolated PBMC. Baseline was assessed before treatment (21 days after tumour implantation). (A) Mean increase of SI in groups A–D. Animals were treated as indicated. (B) Mean increase of SI in subgroups B* and D*. All animals received an additional systemic injection of viable tumour cells intravenously 120 days after first tumour inoculation and were treated as indicated. *p<0.05 to controls; **p<0.05 to radiofrequency ablation (RFA) or CpG monotherapy. (C, D) Relative increase of cytotoxicity of isolated PBMC co-incubated with viable tumour cells. Cytotoxicity was assessed by adenylate kinase release and expressed as relative light units (RLU). Baseline was assessed before treatment 21 days after tumour implantation. (C) Mean increase of RLU in groups A–D. Animals were treated as indicated and were autopsied 120 days after tumour implantation. (D) Mean increase of RLU in subgroups B* and D*. All animals received an additional systemic injection of viable tumour cells intravenously 120 days after first tumour inoculation and were treated as indicated. *p<0.05 to controls; NS, not significant; **p<0.05 to RFA or CpG monotherapy.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    外周血肿瘤特异的免疫反应。(A, B)相对增加的刺激指数(si) PBMC暴露肿瘤溶解产物与基线相比刺激(治疗前)。如果是评估3 h-thymidine整合孤立PBMC。基线评估治疗前肿瘤植入后(21天)。(一)意味着增加SI组模拟。动物被视为表示。(B)的意思是增加SI的子组B *和D *。所有的动物收到额外的系统性的可行的肿瘤细胞注射静脉注射后120天第一肿瘤接种和被视为表示。控制* p < 0.05;* * p < 0.05射频消融术(RFA)或CpG单药治疗。 (C, D) Relative increase of cytotoxicity of isolated PBMC co-incubated with viable tumour cells. Cytotoxicity was assessed by adenylate kinase release and expressed as relative light units (RLU). Baseline was assessed before treatment 21 days after tumour implantation. (C) Mean increase of RLU in groups A–D. Animals were treated as indicated and were autopsied 120 days after tumour implantation. (D) Mean increase of RLU in subgroups B* and D*. All animals received an additional systemic injection of viable tumour cells intravenously 120 days after first tumour inoculation and were treated as indicated. *p<0.05 to controls; NS, not significant; **p<0.05 to RFA or CpG monotherapy.

    还收到了静脉注射的动物肿瘤细胞(B组*和D *), T细胞刺激甚至更高(SIRFA / CpG B= 145.47,SD 57.35;如果RFA= 133.37,SD 27.92;p < 0.05) (图3B)。

    细胞毒性

    没有显著的溶解性活动对培养分离PBMC VX2肿瘤细胞在肿瘤植入或在所有组治疗之前,而在对照组在整个观察期(数据没有显示)。RFA后的两周内和/或CpG B应用,细胞溶解的活动PBMCs 10-15-fold VX2肿瘤细胞显著上升,而没有检测到细胞溶解在VX2肿瘤细胞与自体cocultured兔血清。

    最高的PBMC细胞溶解的活动是在动物中发现收到的组合RFA结合CpG B,而最低的活动被发现在动物对待CpG B单一疗法(RLURFA / CpG B= 972.72,SD 362.77;RLURFA= 487.79,SD 148.69;RLUCpG B= 344.52,93.81 SD组B, C和D,分别;p < 0.001;图3C)。类似的结果组织B *和D *,收到的静脉注射VX2肿瘤细胞(图3D)(无统计差异与动物没有进一步的肿瘤细胞注入(组B和D))。

    组织学及免疫组织学

    植入肿瘤治疗RFA (B组)、CpG B (C组)或其组合(D组)显示更明显纤维化的保证金与混合含有单核细胞和中性粒细胞炎症浸润较未经处理的控制(a组)。此外,中央肿瘤坏死的程度从CpG B或增加RFA治疗他们的组合。有密集的CD3 +淋巴细胞浸润主要肿瘤的中心在所有治疗组(罪犯),无论哪一类型的治疗。CpG B应用导致增强CD3 +淋巴细胞内部和外围的肿瘤与RFA治疗肿瘤(图4),和CD3 +淋巴细胞浸润明显更明显的联合治疗比组B或C D组(p < 0.05,图4)。

    Immunohistochemical analysis. Immunostaining for CD3 in native tumour implants treated with CpG B or the combination of CpG B and radiofrequency ablation (RFA). Nuclei were counterstained with haematoxylin. Margin and centre of tumour treated with a combination of CpG B and RFA showed a marked increase of CD3-positive T lymphocytes compared with tumour implants treated with CpG B alone (arrows indicate CD3-positive T lymphocytes, dotted lines delineate margins between normal liver and tumour tissue; ×400; bar 50 μm). Quantification of CD3-positive T lymphocytes per 10 hpf (high power fields: magnification of ×400 or per 0.06 mm2 using ImageAccess) confirmed that numbers of CD3-positive T lymphocytes increased significantly from tumour periphery to centre and between animals treated with CpG B alone and the combination of CpG B and RFA (**p<0.01, Mann–Whitney U test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    免疫组织化学分析。疣状的CD3本地肿瘤植入治疗CpG B或CpG B和射频消融术(RFA)。核与苏木精复染色。保证金和肿瘤治疗中心的组合CpG B和RFA显示显著增加CD3-positive T淋巴细胞与肿瘤移植治疗CpG B单独(箭头表示CD3-positive T淋巴细胞,虚线描绘正常肝脏和肿瘤组织之间的利润率;×400;酒吧50μm)。量化的CD3-positive T淋巴细胞每10高通滤波器(大功率领域:放大每0.06毫米×4002使用ImageAccess)证实,CD3-positive T淋巴细胞数量显著增加从肿瘤边缘之间的中心和动物对待CpG B单独和组合CpG B和RFA (* * p < 0.01, Mann-Whitney U测试)。

    细胞因子

    从血清细胞因子测定表明(图5a)。相关的炎性Th1细胞因子- 2、TNF-αIFNγ和白介素强烈调节动物接收论文认定,RFA(或其组合图5B、D、G H)。只有动物对待CpG不及时治疗或仅显示免疫抑制/ tolerigenic细胞因子il - 10的水平显著升高,结合RFA被抑制(图5F)。

    Cytokines in serum and tumour surrounding tissue. ELISA from blood serum. Blood was sampled as indicated. Levels of interleukin (IL)-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, interferon γ (IFNγ), tumour necrosis factor α (TNF-α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were measured by ELISA as detailed in Material and methods section and are expressed as relative light units (RLU). (A) IL-6: 4 weeks after treatment combination of CpG and RFA significantly highest vs. CpG or control, resp. (p<0.0001); CpG vs. controls not significant (p=0.34); 4 weeks after treatment CpG/RFA significantly higher than RFA alone (p<0.001); (B) IL-2: 4 weeks after treatment combination of CpG and RFA significantly highest vs. CpG or RFA alone or control, resp. (p<0.001); At the end of observation RFA alone significantly lower vs. CpG or the combination, resp. (p<0.05). RFA/CpG vs. CpG alone without significant difference (p=0.42); (C) VEGF: 4 weeks after treatment the group receiving RFA only showed higher VEGF levels compared to all other groups which was highly significant (RFA vs. control or CpG only p<0.0001; RFA vs. RFA/CpG p<0.001). CpG monotherapy showed no significant differences to controls; At the end of observation VEGF levels were lowered with no significant differences between controls, RFA only or CpG monotherapy. Only the group receiving RFA alone showed significant higher levels of VEGF compared to all other groups (p<0.01); (D) IL-12: Combination of CpG and RFA significantly highest vs. CpG or RFA alone or control, resp. (p<0.001); Combination of CpG and RFA significantly highest vs. CpG or RFA alone or control, resp. (p<0.001); At the end of observation RFA alone significantly higher vs. CpG (p<0.01); (E) IL-8: RFA treatment alone or even combined with CpG co-treatment showed significantly highest levels of serum IL-8 compared to controls and CpG treated animals throughout the observation (RFA and/or RFA/CpG vs. controls or CpG alone, resp. p<0.0001); IL-8 significantly suppressed by CpG co-treatment to RFA (p<0.001); (F) IL-10: Controls and CpG treated animals significantly higher levels vs. RFA or RFA/CpG up to the end of observation (p<0.0001); (G) TNFα: 4 weeks after treatment all groups showed significant risen levels of serum-TNFα while (co)treatment with CpG ODN showed significantly higher levels compared to RFA alone (CpG or RFA/CpG vs. RFA alone p<0.01); At the end of observation there was no significant difference between RFA alone vs. controls while CpG (co)treated animals still had significantly elevated levels (CpG or CpG/RFA vs. RFA alone p<0.001); (H) IFNγ: 4 weeks after treatment until the end of observation all treated groups (RFA, CpG, RFA/CpG) showed significantly risen IFNγ levels compared to controls (p<0.001) while there was no difference between the treated groups. Only at the end of observation animals receiving a combination of RFA/CpG had significantly elevated IFNγ levels compared to animals of the mono-therapy groups (RFA/CpG vs. RFA or CpG, resp. p<0.001). Significance was assessed by Mann-Whitney-U-Test.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    血清中细胞因子和肿瘤周围组织。从血清ELISA。血液样本显示。白介素(IL) 2、IL - 6,引发,IL - 10、IL - 12,干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)是衡量ELISA详细在材料和方法部分,表示为相对光单位(RLU)。(一)il - 6:治疗后4周CpG和RFA明显与CpG或控制最高,分别地。(p < 0.0001);CpG与控制不显著(p = 0.34);治疗后4周CpG / RFA明显高于单独RFA (p < 0.001);(B): - 2治疗后4周CpG和RFA显著与最高CpG或RFA单独或控制,分别地。(p < 0.001); At the end of observation RFA alone significantly lower vs. CpG or the combination, resp. (p<0.05). RFA/CpG vs. CpG alone without significant difference (p=0.42); (C) VEGF: 4 weeks after treatment the group receiving RFA only showed higher VEGF levels compared to all other groups which was highly significant (RFA vs. control or CpG only p<0.0001; RFA vs. RFA/CpG p<0.001). CpG monotherapy showed no significant differences to controls; At the end of observation VEGF levels were lowered with no significant differences between controls, RFA only or CpG monotherapy. Only the group receiving RFA alone showed significant higher levels of VEGF compared to all other groups (p<0.01); (D) IL-12: Combination of CpG and RFA significantly highest vs. CpG or RFA alone or control, resp. (p<0.001); Combination of CpG and RFA significantly highest vs. CpG or RFA alone or control, resp. (p<0.001); At the end of observation RFA alone significantly higher vs. CpG (p<0.01); (E) IL-8: RFA treatment alone or even combined with CpG co-treatment showed significantly highest levels of serum IL-8 compared to controls and CpG treated animals throughout the observation (RFA and/or RFA/CpG vs. controls or CpG alone, resp. p<0.0001); IL-8 significantly suppressed by CpG co-treatment to RFA (p<0.001); (F) IL-10: Controls and CpG treated animals significantly higher levels vs. RFA or RFA/CpG up to the end of observation (p<0.0001); (G) TNFα: 4 weeks after treatment all groups showed significant risen levels of serum-TNFα while (co)treatment with CpG ODN showed significantly higher levels compared to RFA alone (CpG or RFA/CpG vs. RFA alone p<0.01); At the end of observation there was no significant difference between RFA alone vs. controls while CpG (co)treated animals still had significantly elevated levels (CpG or CpG/RFA vs. RFA alone p<0.001); (H) IFNγ: 4 weeks after treatment until the end of observation all treated groups (RFA, CpG, RFA/CpG) showed significantly risen IFNγ levels compared to controls (p<0.001) while there was no difference between the treated groups. Only at the end of observation animals receiving a combination of RFA/CpG had significantly elevated IFNγ levels compared to animals of the mono-therapy groups (RFA/CpG vs. RFA or CpG, resp. p<0.001). Significance was assessed by Mann-Whitney-U-Test.

    炎性il - 6显著调节RFA和CpG接受治疗的动物与动物相比仅接受RFA治疗(RFA vs RFA / CpG p < 0.001和RFA对控制p > 0.0001),而免疫刺激性CpG只有效果没有达到显著水平不同的价值观与控制(图5一个)。

    Proangiogenic VEGF和引发显著升高仅在动物接收RFA,尤其是一起CpG治疗后4周(VEGF:组B / D;RFA vs CpG / RFA p < 0.001;CpG / RFA vs CpG独自p < 0.001;RFA vs CpG只有p < 0.0001) (图5C, E)。

    结论

    这里,我们测试如果主要刺激的装甲运兵车TLR9识别激活CpG B可以加强RFA-mediated破坏VX2肿瘤的兔子,咄咄逼人,转移性肝癌的典范。30.此外,我们检查了多少有效的主要肿瘤控制会抑制转移性肿瘤扩散到肺、腹膜和淋巴结。结果肿瘤控制与肿瘤特异的T细胞刺激和细胞毒性T细胞反应。此外,数据探索的性质之前描述RFA后肿瘤特异的免疫反应。14

    符合我们之前的数据12,14从其他组织和发现,31日RFA的影响,仅thermoablation触发激活肿瘤特异(细胞毒性)淋巴细胞在外周血和肿瘤组织本身,我们可以证明与SIs高度升高与肿瘤细胞体外溶细胞的活动,一个健壮的T细胞渗透在原发性肿瘤,和降低肿瘤负担和增强生存在RFA治疗的动物。然而,这些影响还不足以实现肿瘤控制或完全保护动物免受致命的肿瘤细胞的重新被他人所示,31日,32卵清蛋白(OVA)转染黑素瘤细胞,免疫原性的模型预计将超过syngenic肿瘤细胞系没有特异抗原修改。因此,尽管RFA似乎生成一个更广泛的肿瘤抗原谱招聘抗原的淋巴细胞,最后控制肿瘤生长的能力仍然有限。

    疫苗佐剂的使用已成为一个普遍的策略来增强特异性免疫反应。这样的佐剂效应tlr的主要介质,突出表达了对专业的装甲运兵车。33尤其是和意外,只有少数研究TLR9识别癌症的辅助效果设置。34,35

    生物反应调节剂已被证明有明显保护作用RFA后体内研究。因此,减毒从酿脓链球菌抗原(ok - 432)在几个动物研究成功地通过了测试。ok - 432的辅助治疗能延长生存近两倍在兔VX2肿瘤模型肝或肺,即使rechallanged通过肿瘤细胞的耳朵。36,37

    识别细菌DNA的TLR9识别是由低聚物的,尤其是unmethylated CG二核苷酸序列上下文(CpG图案)。38合成oligodeoxynucleotides (ODNs)包含这样的CpG图案(CpG ODNs)模拟细菌DNA和诱导一套协调的先天免疫反应,如NFkB-mediated释放引发,il - 12和顺向增强了Th1-mediated细胞和体液免疫。39因此,在小鼠和非人类的灵长类动物,CpG ODNs可以提高疫苗细菌的功效,病毒和寄生虫病原体,包括增强小鼠的CTL反应。34,35CpG B, phosphorothioate骨干和缺乏poly-G反面,强烈促进成熟和激活血浆DCs但诱发IFNγ响应较小。39最近的数据表明,血浆DCs和B细胞是唯一直接响应的细胞在人类PBMCs CpG ODN,和NK细胞的激活和IFNγ感应似乎间接影响的CpG ODNs释放IFNα和IFNβ血浆DCs的媒介。40

    类似于窝Brok的结果等32用冷冻消融术的OVA-transfected小鼠黑色素瘤,我们发现一个高度显著增加外周血激活肿瘤特异淋巴细胞的动物收到RFA CpG B的组合与动物相比,接受RFA或独自CpG B。这与一个强烈的细胞毒性免疫反应的肿瘤细胞和很好地预测控制肿瘤生长和扩散,和生存的。因此,联合治疗组中,所有的动物肿瘤移植后存活120天相比,平均生存77.6天(CpG B)和97.3天(RFA)单药治疗组。此外,只有2/10的动物在联合治疗显示剩余恶性组织与9/10动物的每个单一疗法组。在重新与可行的肿瘤细胞,只有动物CpG的组合和RFA治疗长期生存,与先前的研究使用更多的人工ova-transfected黑色素瘤小鼠异种移植模型。32这些作者使用冷冻消融术结合TLR9识别刺激,导致存活率只有50%后80天,而在我们的研究中结合RFA治疗预防继发性肿瘤生长在大多数动物(4/6)与恶性肿瘤细胞重新后经过160天的观察。相反,肿瘤细胞重新后,所有的动物在RFA单药治疗组肺转移,这是转移性传播的第一个目标后静脉肿瘤种子,而只有两个六个动物组合组肺转移和所有的动物这群幸存下来的观察期结束(160天)。

    各种因素可能是负责改进的结果在我们的研究中。除了可能的immunogenity肿瘤模型的差异,RFA触发的合成和表示集群co-stimulatory分子独特的热接触,如热休克蛋白,41最后导致增强的释放促炎细胞因子,吸引装甲运兵车渗透到肿瘤组织和编排的细胞免疫应答。42这种强烈的效果被发现突显出动物对待CpG仅显示短比与只有RFA治疗的动物生存。虽然它可能认为观察到的针对移植抗原的免疫刺激对之前隐藏的肿瘤抗原,而不是我们的数据表明,肿瘤植入并不能引起免疫系统对肿瘤细胞的检测。同样,PBMC获得控制动物从来没有回应过肿瘤溶解产物。

    已经证明RFA使当地的和系统性的T细胞刺激分子像热休克蛋白质释放压力43B组和高流动性(HMGB-1)。26,44,45然而,正如上面所讨论的,这个反应似乎并没有强大到足以产生完整的肿瘤抑制和防止未来的转移扩散。14这里,CpG B可以作为佐剂来增强对特定抗原预制适应性免疫。24

    由于缺少抗体试剂VX2-tumour模型在兔子的主要局部烧蚀模型治疗,不可能阐明深入的组织病理学变化。然而,可用的技术,我们可以展示的重要upregulation Th1细胞因子如- 2、il - 12和IFNγ在这些设置最大肿瘤特异的T细胞激活或细胞毒性活动而被发现,例如,免疫抑制il - 10在增强肿瘤扩散条件高。值得注意的是,CpG B单独诱导高水平相关的细胞因子Th1、Th2 /平方米,25表明它是非常重要的在设置CPG B。甚至令人失望的是,我们的数据表明,CpG治疗没有预制直接免疫反应目标甚至引发了免疫耐受对恶性组织tolorigenic M2指示环境中。

    最后,更高的VEGF水平在动物接收RFA只是按照之前的发现,而不完全可行的肿瘤组织的破坏会导致增强的肿瘤生长。46VEGF表达此前缺氧相关,肿瘤相关巨噬细胞浸润和增强血管生成。综上所述,RFA出现在体内环境中创建一个类似于T细胞疫苗广泛的相关抗原,CpG B作为佐剂导致进一步激活现有的装甲运兵车和抑制血管生成的反应。

    最初发现的CpG寡核苷酸在1995年最初创造了巨大的热情。然而,一些临床试验产生了令人失望的结果。47一个可能的解释效率低下可能是缺乏明显的(肿瘤衍生的)目标。这仍然是一个陷阱等无向免疫刺激性癌症治疗的CpG ODN治疗这些可能激活Th1反应和免疫抑制免疫反应,例如,通过分泌il - 10的肿瘤相关巨噬细胞或DCs在慢性肿瘤炎症有关。48

    总之,我们的数据表明,RFA充当司机免疫反应的诱导释放ER-linked糖蛋白(比如gp96)和热休克导致Th1 / M1-specific免疫反应对肿瘤抗原的切除肿瘤组织,作为增强表达和IFNγ- 2所示。CpG ODN作为天生的辅助驾驶Th1和Th2T细胞释放细胞因子(il - 10)的反应。数据的组合表明Th1直接免疫反应造成局部消融疗法与系统性增强的免疫反应可以改善结果即使在全身恶性肿瘤扩散。

    因为CpG ODNs已经在使用耐受性良好和有效的佐剂疫苗,添加剂治疗CpG ODN结合介入局部消融疗法可能是大有前途的途径anti-HCC疗法。

    我们的数据表明细胞细胞毒性免疫反应是RFA后抗肿瘤疗效的主要决定因素。鉴于目前正在测试的CpG寡核苷酸II和III期临床试验对非小细胞肺癌49,50和黑素瘤51在晚期失败的一线治疗,这可能意味着他们独特的结合消融疗法如RFA为中小学提供了一个特别有吸引力的治疗选择肿瘤通过提供一个独特的肿瘤破坏性免疫热改变抗原和当地的环境。

    确认

    目前的工作是在需求的满足为BB获得医学学位。

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    补充材料

    • 补充数据

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    脚注

    • 贡献者所有作者都充分的研究工作的手稿和/或有显著影响和/或从事的设计研究:BB, PDF:实验,研究设计和手稿写;一些点,EGH, TG:研究设计,手稿撰写和编辑;DN, RK:免疫组织化学、统计评估,手稿撰写和编辑;侦破,TTW:研究设计、手稿写作和编辑、实验、外科手术、主要知识影响和融资。

    • 资金本研究是跨学科的赠款支持临床研究中心(IZKF),埃朗根大学的Hans Lowel基础班贝克,德国,NIH U19 AI066313 DS。

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。