你在这里

条文本

菜单条
XML
胃
原文
HNF4α治疗目标是链接AMPK在早期胃癌WNT信号
  1. 有Ryung常1,
  2. Seungyoon南1,
  3. Myeong-Cherl怪人2,
  4. Kyung-Tae金3,
  5. Xiuping刘4,
  6. 回族么5,
  7. 有Rim荣格1,
  8. 小罗伯特Lemos6,
  9. 惠Hyun Seo7,
  10. 庆熙Seo公园1,
  11. Youme Gim1,
  12. 东莞市港8,
  13. Iksoo啊9,
  14. Young-Woo金10,
  15. 东风谭11,
  16. 长庚刘4,
  17. 战胜挑战者博伊斯庭院6,
  18. Taesung公园9,
  19. 汉梁5,
  20. 你回金1
  1. 1新的实验治疗学分支韩国国立癌症中心,Goyang-si, Kyeonggi-do,韩国
  2. 2病理学系,韩国国立癌症中心,Goyang-si, Kyeonggi-do,韩国
  3. 3分子流行病学分会,韩国国立癌症中心,Goyang-si, Kyeonggi-do,韩国
  4. 4部门的实验治疗学,德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州美国
  5. 5生物信息学和计算生物学,德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州美国
  6. 6癌症中心孚-伯纳姆医药研究所,加州拉霍亚美国
  7. 7动物科学分支韩国国立癌症中心,Goyang-si, Kyeonggi-do,韩国
  8. 8癌症基因组学分支韩国国立癌症中心,Goyang-si, Kyeonggi-do,韩国
  9. 9部门统计,首尔国立大学,首尔,韩国
  10. 10胃癌的分支韩国国立癌症中心,Goyang-si, Kyeonggi-do,韩国
  11. 11病理学系,德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州美国
  1. 对应到你回族金教授,新的实验治疗学分支,国家癌症中心的韩国,Ilsan, Goyang-si,京畿道410 - 769年,韩国;yhkim在{}ncc.re.kr;韩教授,德克萨斯大学MD安德森癌症中心,休斯顿TX, 77030年,美国;hliang1@mdanderson.org;首尔国立大学教授Taesung公园Kwanak-ro, Kwanak-gu首尔,151 - 742年,韩国;tspark@stats.snu.ac.kr

文摘

背景在世界范围内,胃癌(GC)第四最常见的恶性肿瘤,是最常见的癌症在东亚。这种疾病的靶向治疗的发展集中在一些已知的致癌基因,但效果有限。

客观的确定致癌机制和新型治疗靶点为GC具体通过识别特异表达基因从亚太地区和高加索的肿瘤患者。

方法我们生成的转录组的22高加索GC声带良性肿瘤及其匹配样本和跨不同的GC基因表达数据集进行综合分析。我们研究了常见的过表达的抑制致癌基因及其信号通路的RNAi组成和/或药物抑制。

结果肝细胞的核factor-4α(HNF4α)upregulation胃肿瘤的关键信号事件从白种人和亚洲病人,和HNF4α对抗是抗肿瘤药。在GC肿瘤细胞系和异种移植模型扰动实验进一步表明,HNF4α由AMPKα信号表达下调,AMPK受体激动剂二甲双胍;封锁,差别HNF4α活动导致细胞周期蛋白对这些细胞周期阻滞和抑制肿瘤生长。HNF4α也监管WNT信号通过其目标基因WNT5A,胃肿瘤扩散的潜在预后标记类型。

结论我们的结果表明,HNF4αGC通道癌蛋白,是由AMPK信号通过AMPKα和驻留WNT信号的上游。HNF4α可能调节代谢转换的一般恶性表型特征及其目标WNT5A潜在的预后价值。AMPKα-HNF4α-WNT5A信号级联代表一个潜在的通道为药物开发途径。

  • 胃癌
  • 药物开发
  • 致癌基因
  • 分子生物学
  • 基因表达

这是一个开放的分布式条依照创作共用署名非商业性(4.0 CC通过数控)许可证,允许别人分发,混音,适应,建立这个工作非商业化,和其派生作品在不同的条款进行许可,提供了最初的工作是正确地引用和非商业使用。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2014 - 307918

来自Altmetric.com的统计

    请求的权限

    如果你想重用任何或所有本文的请使用下面的链接,这将带你到版权税计算中心的RightsLink服务。你将能够获得快速的价格和即时允许重用内容在许多不同的方式。

    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 胃癌是世界上第四大癌症死因,每年估计有989 000癌症新发病例,有738 000人死亡。

    • 虽然几个风险因素(包括幽门螺杆菌感染、饮食因素和胃返流)、靶向治疗在很大程度上仍未开发。

    有什么新发现吗?

    • 综合分析,高加索和亚太胃肿瘤表达数据集(包括新生成的转录组分析22肿瘤在这项研究)显示一个相对较小的共同的高度过表达基因。这些基因,肝细胞的核factor-4α(HNF4α)是一个关键的转录因子。

    • 抑制RNA和药物抑制HNF4α证明抗肿瘤的活性细胞周期蛋白,体外和体内的差别,通过对这些基因的细胞周期阻滞和细胞凋亡。

    • 同意HNF4α已知的衬底上,表达下调的AMPK energy-sensing激酶,AMPK受体激动剂二甲双胍演示了一个抗肿瘤效应类似于直接HNF4α拮抗剂。

    • WNT5A HNF4α目标基因,从而表明一个AMPK-HNF4α-WNT致癌信号轴可能参与胃肿瘤新陈代谢。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 开发专门针对AMPK-HNF4α-WNT信号级联的疗法可能是毒性最小的有效方法对胃癌的管理。

    介绍

    胃癌(GC)是第四世界上最常见的一种癌症,与989年000例新病例每年(全球癌症总数的7.86%),和738年000人死亡(全球癌症死亡人数的9.7%)。1在东亚,GC是最常见的一种癌症2,3;在北美和欧洲,GC的总体发病率已下降,近端GC的患病率明显增加。4生物,胃腺癌主要与两个传染性病原体,幽门螺杆菌5,6和巴尔病毒,7相关和遗传分散GC的种系突变cadherin-1(背景)。8,9

    手术切除肿瘤早期GC是有效治疗的关键,但由于一些早期症状伴随GC,大多数肿瘤被发现在一个先进的阶段。10GC复发率很高在所有人群中,尽管改善早期检测增加了在韩国5年生存率67%11在日本,57%,12全球5年生存率一直保持在20 - 30%在过去的35年。10开发GC-targeted疗法都集中在几个著名的致癌基因。曲妥珠单抗,例如,一个靶向治疗是被批准用于结合化疗的一线治疗ERBB2-positive GC先进、转移,13,14和其他几个靶向治疗仍在调查中。15 - 17日然而,这仍然是一个迫切需要识别小说通道致癌机制。18 - 20

    开发GC-specific疗法更有效,我们(1)生成whole-transcriptome概要文件为GC在白种人和识别肝细胞的核factor-4α(HNF4α)作为一个关键的组件在多个GC表达数据集;(2)证明HNF4α击倒anti-tumorigenic细胞株和动物研究;(3)阐明HNF4α管理上下文通过展示它活化蛋白激酶(AMPK)的下游和上游的wingless-type MMTV集成网站WNT信号;(4)显示,WNT5A的预后价值,HNF4α下游目标基因,患者的GC。总的来说,我们的研究揭示了一个关键的角色AMPKα-HNF4α-WNT5A信号在GC的发病机制,代表一个潜在的治疗目标。

    材料和方法

    样本收集和描述

    RNA-seq实验,收集肿瘤从回顾性研究使用档案用来进行人体组织标本来自答应了病人在德克萨斯大学MD安德森癌症中心研究资源组织银行(美国得克萨斯州休斯敦的),机构审查委员会批准的MD安德森癌症中心。肿瘤组织学分类及阶段由病理学家在病理学系MD安德森。我们的分析包括22个胃肿瘤及其匹配non-tumour组织从高加索患者获得符合我们的研究标准(足够数量和质量的RNA)。患者临床和组织病理学特征列在网上补充表S1。

    创建组织微阵列从组织样本GC患者接受了胃切除术和扩展淋巴切除术在国家癌症研究中心在2005年和2006年的韩国,机构审查委员会批准的国家癌症中心的大韩民国。排除标准如下:pT1;没有R0切除;远处转移(包括腹膜cytology-positive)之前或在手术的时候;癌症复发;新辅助治疗;在残胃癌症;不寻常的组织学除了乳头状,管状,印戒细胞或粘液类型;不完整的随访;石蜡包埋组织无法组织微阵列; or other cancer history. These exclusions resulted in final datasets of 502 samples (discovery set: 251 cases in 2006, validation set: 251 in 2005). All patients had undergone D1+β or more lymph node dissection. Tumour stages were reclassified according to the 7th edition of the tumour staging system of the Union for International Cancer Control. Case characteristics (see online supplementary table S3) were determined and reviewed by a pathologist in the National Cancer Center Pathology Division.

    验证AMPKα2表达式,10个病人肿瘤组织样本每阶段提供从Hyun Cheol博士钟作为礼物,癌症中心,韩国延世大学遣散医院。

    实验过程RNA-seq

    RNA-seq进行测序和非编码RNA MD安德森癌症中心的核心设备。RNA隔离、图书馆准备(paired-end, 50元,35元),模板珠准备和固体V.4.0测序之后生活所提供的标准协议技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德),类似于我们的先前的研究。20.测序数据提交给NCBI基因表达综合。

    差异表达分析

    分析RNA-seq数据从高加索GC肿瘤病人,我们短的读取映射到人类参考基因组(hg19)和外显子结点(定义为RefSeq基因注释),在生命科学中使用whole-transcriptome分析管道放映机(V.1.2生命技术)与默认参数。我们只包括正确读对映射和量化的外显子基因表达水平每千碱基读取每百万映射读取(RPKM),对数转换。我们用配对t测试来检测GC之间的基因差异表达与正常样本,与意义p < 0.05。我们获得另一个三发表GC基因表达数据集,两个从NCBI基因表达综合:GSE13861和GSE3696820 21和一个来自TCGA22(三级数据获得,TCGA数据门户)。我们使用t测试来检测差异表达基因和p < 0.0001, p < 0.05, p < 0.001为各自的否决。一般为396个基因在四个微分分析确认,我们分类分成五组基于方向变化(相对于正常差别upregulation /对这些)和平均褶皱变化:(1)一致upregulation > 2倍;(2)一致upregulation与< 2倍;(3)> 2差别一致对这些褶皱;(4)与差别一致对这些< 2倍;和(5)不一致的变化。

    生物功能实验

    细胞和试剂

    我们获得人类NCI-N87 AGS和HS 746 t肿瘤细胞从美国文化集合类型(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。MKN45 GC细胞系是可以从延世癌症中心(首尔,韩国)。SNU-1-5, -16、-620、-216、-484、-601、-638、-668和snu GC - 719细胞系是朝鲜细胞系可以从银行(http://cellbank_snu.ac.kr/)。单克隆抗体对人体低氧诱导因子1α(HIF-1α)和β-catenin买来BD转导实验室(美国加州圣何塞);AMPKα、LKB1 HNF4α,凋亡抗体工具包(tPARP、cPARP t-caspase 3 c-caspace 3), t-mTOR, p-mTOR (Ser 2448和Ser2481),猛禽,eIF4E S6, 4 e - bp1, WNT1, WNT3,葛兰素史克,β-catenin, TCF,中位数,pCAMKII,细胞周期蛋白A, B细胞周期蛋白,细胞周期蛋白D1, D2细胞周期蛋白和β-actin购买从细胞信号技术(美国马萨诸塞州波士顿)或圣克鲁斯生物技术(美国加州Santa Cruz)。抗体WNT5A、葛兰素史克、β-catenin pCAMKII,细胞周期蛋白D2,细胞周期蛋白D1,细胞周期蛋白和细胞周期蛋白B是购自Abgent(美国加州圣地亚哥)、二甲双胍和嘌呤霉素从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。印度国家银行- 0634689.0001 (BI6015 HNF4α拮抗剂)提供了孚-伯纳姆医药研究所(美国加州拉霍亚)。

    细胞培养

    下面的人类使用GC细胞系在6个月内组织复苏:NCI-N87, AGS, HS 746 t, MKN45, SNU-1 SNU-5, SNU-16, snu - 620, snu - 216, snu - 484, snu - 601, snu - 638, snu - 668和snu - 719,和培养rpmi - 1640 (CellGro,荷顿,弗吉尼亚州,美国)和10%胎牛血清(美国犹他州洛根Hyclone) 37°C公司5%2。细胞系验证是短串联重复序列分析(写明ATCC)。细胞(2.5×105常氧条件下)被播种,种植70 - 80%汇合,然后孵化的存在与否10毫米二甲双胍0 - 5天。

    西方墨点法

    在常氧条件下细胞生长在10毫米二甲双胍的存在与否是洗两次磷酸盐和西方墨点法进行了如前所述。23抗体的屁股被量化使用ImageQuant软件(分子动力学/通用电气医疗集团生物科学,桑尼维尔加利福尼亚,美国)。

    定量rt - pcr

    巴黎总RNA分离细胞溶解产物使用工具包(加州福斯特城Ambion /应用生物系统公司,美国)根据制造商的协议。接下来,使用ABI 7300系统和执行定量rt - pcr TaqMan一步掌握混合设备和预先设计引物/探针对AMPKα1,AMPKα2,AMPKβ1,AMPKβ2,AMPKγ1 AMPKγ2,AMPKγ3 LKB1, HNF4α和β2微球蛋白(应用生物系统公司)。相对表达水平正常化β2使用2微球蛋白(−δC (T))的方法245700年,应用生物系统公司GeneAmp SDS软件。所有测量进行了一式三份。

    小干扰RNA转染

    小核RNA) SMARTpool(组四个寡核苷酸)(Dharmacon /热费希尔科学(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)被用来使转染细胞25 nM siRNA-HNF4α或siRNA炒控制,使用Dharma-FECT 1脂质转染试剂。转染介质被24 h后,取而代之的是新鲜的介质和细胞生长在5%股份有限公司2在37°C的额外48 - 72 h。rt - pcr和/或免疫印迹分析来确认在核击倒目标。

    短发卡RNA沉默

    短发卡rna(成分)(Sigma-Aldrich)被用来稳定感染NCI-N87 GC细胞(shRNA空向量或HNF4α)镀在12-well板块和维护RPMI 1640 + 10%胎牛盐水的边后卫,0.3毫克/毫升嘌呤霉素与选择。

    细胞死亡分析

    五个GC细胞系(AGS、N87 NCC19, NCC59和SNU1967)上述条件下生长。分析自噬,Cyto-ID自噬检测设备(美国纽约恩佐生命科学、法明岱尔)是根据制造商的协议。分析细胞凋亡的膜联蛋白V: PE凋亡检测装备我(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)是根据制造商的协议。FACSVerse (BD生物科学)是用于流式细胞术分析。

    记者(荧光素酶)测定

    在这项研究中,96 -孔板被播种20 000个细胞/好和瞬变与25海里爬或HNF4αsiRNA转染。TCF / LEF-responsive荧光素酶结构、HNF4αTCF /中位数,消极和积极控制基因转染,分别(美国马里兰州试剂盒科学,盖)。转染细胞然后处理10μM二甲双胍24 - 72 h。积极的控制是一个持续表达绿色荧光蛋白(GFP)的构造和消极的控制是一个最小启动子GFP的记者。这个试验是进行MKN45 NCI-N87, NCC19, NCC59, NCC24和SNU1967 GC细胞。转染后24、48和72 h,细胞细胞溶解与被动裂解缓冲和转移到96 -白色不透明的平底盘子。荧光素酶活性测定使用Dual-Luciferase记者分析系统(Promega,麦迪逊,威斯康辛州,美国)和维克多光(珀金埃尔默,Wallac,图尔库,芬兰)。

    体内抗肿瘤研究

    大约107NCI-N87和MKN45细胞对数生长期悬浮在0.2毫升磷酸缓冲盐和皮下注入侧翼的严重联合免疫缺陷(scid老鼠)。这些动物体重每周和肿瘤直径测量两次每周在直角(d短和d长)与电子卡尺和转化为体积公式的体积= [(d短)×2 (d长)/ 2。当肿瘤达到卷150至300毫米3的老鼠分层分成两组,八个动物约等于意味着肿瘤体积,紧随其后的是每天250毫克/公斤口服二甲双胍治疗25天20.控制动物仅接受车辆(水)。最后的二甲双胍后24小时管理,收集肿瘤免疫印迹分析和免疫组织化学评估HNF4α和WNT5A的表达。当肿瘤达到≥1500毫米3或成为坏死,动物被杀害。动物研究都是通过国家癌症中心IRB动物委员会。

    免疫组织化学

    病人肿瘤样本

    综述了H&E-stained幻灯片和代表地区选择组织微阵列。分别选择正常粘膜和癌组织。核心2毫米直径来自档案石蜡包埋块用环钻装置(Superbiochips实验室、首尔、韩国)。组织微阵列块分段3μm厚度、干在56°C, 1 h和免疫组织化学染色法进行自动化仪表基准XT(美国亚利桑那州图森Ventana医疗系统)如下:部分deparaffinised和水化EZ预科(Ventana)和Tris-buffered盐水洗。pH值8.0中的抗原被热处理检索Tris-EDTA缓冲区(电池解决方案,Ventana)在95°C为WNT5A 30分钟。内源性氧化物酶被封锁H为3%2O2在室温下10分钟。阻塞用现成的蛋白质执行拦截器解决方案(Ventana) 20分钟在室温下,紧随其后的是应用程序的主要抗体在42°C (WNT5A为30分钟1:5000稀释(克隆6 f2, Abgent,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国AO1264a),清洗,孵化与合multimer-labelled二级抗体(ultraView普遍民建联检测装备,Ventana) 20分钟在室温和染色使用ultraView普遍民建联工具包(Ventana) 8分钟(苏木精复染色)。

    异种移植物模型

    免疫组织化学染色进行4μm组织车辆从石蜡包埋组织部分cks在自动化的染色工具发现XT (Ventana医疗系统)使用Chromomap民建联检测设备。检测,anti-HIF-1α抗体(Abcam,剑桥,英国),anti-cleaved caspase-3(细胞信号技术,Danverse,马萨诸塞州,美国),反- ki - 67 (Abcam)和anti-CD31 (Abcam)。分级,ki - 67 h值决定,裂解caspase-3 HIF-1α。

    免疫组织化学的解释

    病人肿瘤样本

    我们定义WNT5A组织染色强度如下:(A)无信号或只有微弱的模棱两可的信号观察到100×电力被认为是负面的,0;(B) > 10%的肿瘤细胞表现出明显的胞质信号在100×权力(类似于孔穴的上皮细胞)被认为弱阳性,+ 1;(C)如果> 10%的肿瘤细胞表现出明显的强信号与40×权力(类似于WNT5A首席细胞或血浆细胞),它被认为是正面的,+ 2。我们测量WNT5A积极性弱的百分比或强烈积极肿瘤细胞染色,得分为0(负面)如果弱或强阳性细胞≤50%,1(积极的)如果> 50%。我们使用生存率较检查WNT5A水平之间的相关性和患者生存。

    异种移植物模型

    免疫组织化学染色分级如下:强度是评分(0 = - 1 =弱,2 =温和,3 =强)和阳性细胞的百分比来计算h值,如下:h值= 3×强烈染色细胞的百分比(s) + 2×强烈染色细胞的百分比(s) + 1×比例的强染色细胞(s),产生一系列0 - 300。微血管密度(MVD)计数、微泡是使用CD31染色法染色,有5个字段选择和计算×200。

    统计分析

    单个基因的实验中,p值< 0.05被认为是统计学意义,基于学生t测试或z检验,实验组与对照组的比较。

    结果

    综合转录组分析显示HNF4αGC的关键信号中介

    在白种人全面视图GC转录组,我们执行whole-transcriptome分析22胃肿瘤(及其匹配的正常组织)使用paired-end RNA-seq(生命技术坚实的平台)。样品包括阶段》从远端肿瘤,胃近端,gastro-oesophageal结和身体区域(见在线补充表S1)。平均而言,5300万年和4900万年我们获得正确配对短读/肿瘤和正常组织,分别。基于这些映射读取,我们量化15 987个蛋白编码基因的表达水平。

    识别一个健壮的基因签名的GC病理学在不同的人群,我们综合高加索RNA-seq以前收集的数据集与其他三个基因表达数据集从患者GC20 - 22(见在线补充表S2)。在四个数据集,12 587个基因的表达水平是同时测量,我们执行一个微分表达式分析来识别那些有明显差表达式(见材料与方法)。所示图1一个,396个基因被四个标识为misexpressed微分表达式分析。识别基因显示改变方向(即相对于那些non-tumour差别upregulation或对这些样本)和褶皱的变化,我们划分成5组(图1B)。

    Differential expression analysis across multiple transcriptome-wide expression datasets. (A) Venn diagram of differentially expressed genes identified from the four expression datasets. (B) Classification of 396 genes into five groups: consistent upregulation with >2 fold; consistent upregulation with <2 fold; consistent downregulation with >2 fold; consistent downregulation with <2 fold; inconsistent changes. Differential expression of HNF4α in (C) Caucasian and (D) Asian RNA-seq datasets, respectively. Caucasian RNA-seq includes normal versus tumour stages I, II and III tissue samples. Asian RNA-seq includes normal versus tumour stages I, II, III and IV tissue samples.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    微分表达式分析多个transcriptome-wide表达式的数据集。(A)差异表达基因的维恩图确定的四个表达数据集。(B)的396个基因分类分成5组:一致upregulation > 2倍;一致与< upregulation 2倍;2 >差别一致对这些褶皱;与差别一致对这些< 2倍;不一致的变化。微分表达式(C)的HNF4α白种人和亚洲(D) RNA-seq数据集,分别。高加索RNA-seq包括正常与肿瘤阶段I, II, III组织样本。亚洲RNA-seq包括正常与肿瘤阶段I, II, III和IV组织样本。

    我们确定新的治疗目标集中在集团一直调节整个四分析> 2折。在148个基因中,HNF4α似乎是一个有趣的候选人。这是一个关键的核受体超家族成员ligand-dependent受体和被建议在结肠癌的发展发挥了作用,肝脏、胰腺和肺癌,8,25,26肠道类型的GC中高度表达。27图1C和D显示高表达HNF4αGC肿瘤来自高加索和亚太的病人。鉴于其健壮的表达式和作为转录因子,我们随后调查HNF4α作为关键调节器GC的发生和发展。

    HNF4α抑制显示了抗肿瘤活性

    检查其肿瘤函数,我们执行shRNA-mediated HNF4α击倒在NCI-N87鼠标异种移植。使用一个有效成分(克隆4号,图2),我们发现成分大大减少抑制肿瘤生长与控制(图2B, C)所示图2D和补充图S1A, HNF4α击倒抑制生长和血管生成,减少HIF-1α重合。此外,我们沉默的siRNA HNF4αNCI-N87 GC细胞。所示补充图印地siRNA-mediated HNF4α击倒也下调细胞周期蛋白的细胞周期调控,B和D1。分别在2和3,我们观察到62%和68% HIF-1α沉默,细胞周期进展的调节器,葡萄糖代谢和血管生成。28此外,我们执行shRNA-mediated HNF4α击倒在老鼠MKN45异种移植和确认大大减少肿瘤生长与控制(参见图S2A在线补充和开通。

    Hepatocyte nuclear factor-4α (HNF4α) inhibition shows antitumour activities. (A) A pool of five (short hairpin RNA) shRNA lentiviral particles targeting different regions of the HNF4α mRNA transcript and shRNA empty vectors was infected into NCI-N87 gastric cancer (GC) cells. Stably transfected cells were selected by puromycin, and clones 2 and 4 showed loss of HNF4α by immunoblotting. (B, C) Nine 5-week-old female BALB/C nude mice were randomly divided into two groups (4 shRNA control, 5 shRNA HNF4α). Approximately 107 shRNA control (CTRL) and HNF4α (#2 and #4) shRNA-infected NCI-N87 cells in 100 µL phosphate-buffered saline were inoculated subcutaneously. All animals were sacrificed on day 31 after injection. ***p<0.001. (D) Immunoblotting shows antiproliferative activity with loss of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) from HNF4α shRNA-transduced xenograft model tumours.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    肝细胞的核factor-4α(HNF4α)显示了抗肿瘤抑制活动。(A)一个五池(短发卡RNA) shRNA慢病毒粒子目标的不同区域HNF4αmRNA转录和shRNA空向量被感染成NCI-N87胃癌细胞(GC)。稳定转染细胞是由嘌呤霉素,和克隆2和4显示HNF4α通过免疫印迹的损失。(B, C)九5-week-old雌性BALB / C裸小鼠随机分为两组(4成分控制、5 shRNA HNF4α)。大约107成分控制(CTRL)和HNF4α(# 2和# 4)shRNA-infected NCI-N87细胞皮下接种100µL磷酸盐。所有的动物都牺牲了注射后31天。* * * p < 0.001。(D)免疫印迹显示抗增殖活性损失的低氧诱导因子1α(HIF-1α)HNF4αshRNA-transduced异种移植肿瘤模型。

    进一步评估HNF4α作为治疗目标,我们显示HNF4α拮抗剂BI6015不定地抑制HNF4α表达式GC细胞系的面板(图3),同时有效地减少GC (EC细胞生存50μM值从964纳米到4.3,图3B)。因此,药物抑制引起transcript-specific瞄准一样的效果(成分),这表明该药物是专门针对HNF4α而不是流感有毒(图3C)。这些结果强烈表明HNF4αGC信号是一个关键的中介,代表一种有前途的治疗目标。

    Effect of the hepatocyte nuclear factor-4α (HNF4α) antagonist BI6015 on gastric cancer (GC) cell lines. (A) Expression of HNF4α in GC cell lines treated with or without BI6015 using quantitative RT-PCR (*p<0.05) as well as the molecular structure of BI6015. (B) EC50 growth inhibition values of BI6015 in various GC cell lines. (C) BI6015 shows different levels of growth inhibition on five GC cell lines.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    影响肝细胞的核factor-4α(HNF4α)拮抗剂BI6015胃癌细胞系(GC)。(A)表达在GC HNF4α细胞系有或没有治疗BI6015使用定量rt - pcr (* p < 0.05)以及BI6015的分子结构。(2)电子商务50增长的抑制值BI6015各GC细胞系。(C) BI6015显示不同级别的五GC细胞株生长抑制。

    HNF4α下游AMPKα和调制的AMPK受体激动剂二甲双胍

    我们下一个检查HNF4α如何被特别关注AMPKα2监管在GC, AMPK家族的重要成员,保持能量平衡和原发性乳腺癌和卵巢癌表达下调。29日我们最近报道,AMPKα2是一个潜在的肿瘤抑制基因在亚太GC,患者有明显的mRNA的损失相比,早期肿瘤与正常组织或先进的肿瘤。20.重要的是,HNF4α被建议作为一种下游AMPKα信号的目标。30.,31日例如,里贝罗等直接显示,AMPK磷酸化HNF4αSer304配体结合域,抑制二聚和DNA结合。31日,32

    基于一组独立的胃肿瘤每阶段组(n = 10个样本),我们确认损失AMPKα2表达的早期肿瘤(t检验,p = 0.025,请参阅在线补充图S3A)。通过RNA-seq分析在不同肿瘤阶段我们发现,在高加索和亚太病人,HNF4α和AMPKα2显示相反的mRNA表达模式:这种anticorrelation (upregulation HNF4α和亏损AMPKα2)是早期肿瘤比晚期肿瘤(图1C, D,看到在线补充图S3B和S3C)。鉴于这种负相关AMPKα2 HNF4α表达式,我们检查了可能的机械这两个基因之间的联系。首先,我们确认AMPKα2蛋白表达在GC细胞系和异种移植组织小组(分别见在线S4A补充数据和某人),第二,我们发现HNF4α蛋白表达变化在GC细胞系(参见图自己在线补充)。

    检查AMPKα2和HNF4α之间的交互,我们使用二甲双胍(AMPK活化剂)治疗四个GC细胞系(NCI-N87、AGS HS746T和MKN45)。正如所料,二甲双胍激活肿瘤抑制肝脏激酶B1 (LKB1), AMPK的上游调节器,33在这些细胞系(见图S5在线补充)。二甲双胍治疗也增加了AMPKα2表达水平(图4一)和减少HNF4α表达式(图4在GC B)细胞,这表明AMPK活化可能下调HNF4α。调查可能的抗癌效果metformin-mediated HNF4α抑制,我们评估的可行性10 GC细胞株二甲双胍治疗后,包括四个上述细胞和六个细胞系(SNU-1 SNU-16和snu - 620;和三个人类GC从韩国病人主要肿瘤细胞株新成立,NCC-19 NCC-59和snu - 1967)。我们观察到强劲增长抑制在所有10 GC细胞系(图4C)扰动后AMPKα-HNF4α二甲双胍的信号。裂解的水平半胱天冬酶3 (c-caspase 3)和聚ADP-ribose聚合酶(cPARP)减少二甲双胍治疗后,表明细胞凋亡抑制增长的并不是唯一的原因(见图S6在线补充)。在GC面板细胞系我们观察到G2 / M逮捕和细胞周期蛋白,抑制B和D1 (图4D和E),另外发现增加sub-G0数量(请参见图S7在线补充)。接下来,我们使用流式细胞仪进行细胞凋亡和坏死分析和检测各种凋亡的影响在一些GC细胞系(见图S8在线补充)。此外,没有发现自噬在二甲双胍治疗(数据未显示)。整体而言,这些结果表明,HNF4αAMPKα下游,和二甲双胍抗效应主要是由于HNF4αinhibition-induced细胞周期阻滞,尽管我们确实看到了一些诱导细胞死亡。

    AMP-activated protein kinase (AMPKα) activation and hepatocyte nuclear factor-4α (HNF4α) inhibition by metformin show antiproliferation activity in gastric cancer (GC) cell lines. (A) Expression of AMPKα1 and AMPKα2 in four GC cell lines (NCI-N87, AGS, HS 746T and MKN45), with and without metformin treatment, as measured by quantitative RT-PCR (*p<0.05). For NCI-N87, white bars=day 1, orange bars=day 2, green bars=day 4, red bars=day 5; for AGS and MKN45, white bars=day 2, orange bars=day 3, green bars=day 4; and for HS 746T, white bars=day 1, orange bars=day 2, green bars=day 3. (B) Expression of HNF4α in four GC cell lines, with and without metformin treatment (white bars=non-treated (NT), black bars=metformin-treated (MET)), as measured by quantitative RT-PCR (*p<0.05). (C) Growth inhibition observed in 10 GC cell lines (NCI-N87, AGS, HS 746T, MKN45, SNU-1, SNU-16, SNU-620, NCC59, NCC19 and SNU1967) following metformin treatment (squares=non-treated (NT), diamonds=metformin-treated (MET)). Cells were counted from the onset of metformin treatment (day 0) (*p<0.05). (D) Metformin mechanism of action through AMPKα activation and HNF4α inhibition, resulting in G2/M arrest and antiproliferation of GC cell lines. Two GC cell lines (NCI-N87 and AGS) were treated with metformin and cells were fixed and analysed for DNA content using propidium iodide and flow cytometry. Metformin-treated cells were compared with non-treated cells. The percentage of cells in each cell cycle stage was calculated. Cell cycle arrest in the G2M phase was observed following metformin treatment. (E) Immunoblotting shows the expression levels of cyclins A, B and D1. β-actin was used as control. Decreased cyclin D1 levels were apparent in both NCI-N87 and AGS cell lines upon metformin treatment.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    AMP-activated protein kinase (AMPKα) activation and hepatocyte nuclear factor-4α (HNF4α) inhibition by metformin show antiproliferation activity in gastric cancer (GC) cell lines. (A) Expression of AMPKα1 and AMPKα2 in four GC cell lines (NCI-N87, AGS, HS 746T and MKN45), with and without metformin treatment, as measured by quantitative RT-PCR (*p<0.05). For NCI-N87, white bars=day 1, orange bars=day 2, green bars=day 4, red bars=day 5; for AGS and MKN45, white bars=day 2, orange bars=day 3, green bars=day 4; and for HS 746T, white bars=day 1, orange bars=day 2, green bars=day 3. (B) Expression of HNF4α in four GC cell lines, with and without metformin treatment (white bars=non-treated (NT), black bars=metformin-treated (MET)), as measured by quantitative RT-PCR (*p<0.05). (C) Growth inhibition observed in 10 GC cell lines (NCI-N87, AGS, HS 746T, MKN45, SNU-1, SNU-16, SNU-620, NCC59, NCC19 and SNU1967) following metformin treatment (squares=non-treated (NT), diamonds=metformin-treated (MET)). Cells were counted from the onset of metformin treatment (day 0) (*p<0.05). (D) Metformin mechanism of action through AMPKα activation and HNF4α inhibition, resulting in G2/M arrest and antiproliferation of GC cell lines. Two GC cell lines (NCI-N87 and AGS) were treated with metformin and cells were fixed and analysed for DNA content using propidium iodide and flow cytometry. Metformin-treated cells were compared with non-treated cells. The percentage of cells in each cell cycle stage was calculated. Cell cycle arrest in the G2M phase was observed following metformin treatment. (E) Immunoblotting shows the expression levels of cyclins A, B and D1. β-actin was used as control. Decreased cyclin D1 levels were apparent in both NCI-N87 and AGS cell lines upon metformin treatment.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    活化蛋白激酶激活(AMPKα)和肝细胞的核factor-4α(HNF4α)由二甲双胍抑制显示抗胃癌细胞系(GC)的活动。(A)表达AMPKα1和四GC AMPKα2细胞株(AGS NCI-N87, HS 746 t和MKN45),有或没有二甲双胍治疗,以定量rt - pcr (* p < 0.05)。NCI-N87,白色酒吧=第一天,橙色酒吧=第二天,绿条=第四天,红酒吧=第五天;AGS和MKN45白色酒吧=第二天,橙色酒吧=第三天,绿条=第四天;HS 746 t,白色的酒吧=第一天,橙色酒吧=第二天,绿条=第三天。(B)的表达HNF4α四GC细胞系,有或没有二甲双胍治疗(白酒吧=摘要(NT)、黑条= metformin-treated(遇到)),以定量rt - pcr (* p < 0.05)。(C)增长抑制观察10 GC细胞系(AGS NCI-N87, HS 746 t, MKN45 SNU-1, SNU-16, snu - 620, NCC59, NCC19和SNU1967)二甲双胍治疗后(广场=摘要(NT)、钻石= metformin-treated(遇到))。从二甲双胍治疗的细胞数(0)(* p < 0.05)。(D)二甲双胍作用机理通过AMPKα激活和HNF4α抑制,导致G2/ M逮捕和抗GC细胞系。两个GC细胞系(NCI-N87和AGS)接受二甲双胍和细胞被固定和使用碘化propidium进行DNA分析内容和流式细胞术。摘要细胞相比Metformin-treated细胞。在每个细胞周期阶段细胞的百分比计算。细胞周期阻滞在G2有丝分裂期后观察二甲双胍治疗。(E)免疫印迹显示细胞周期蛋白的表达水平,B和D1。β-actin被用作控制。减少细胞周期蛋白D1水平明显NCI-N87和AGS细胞系在二甲双胍治疗。

    WNT5A HNF4α的目标基因与潜在的预后价值

    我们最近报道WNT5A HNF4α的直接目标基因GC。34进一步确认,我们沉默HNF4α使用核在六个GC细胞系(NCI-N87、MKN45 NCC19, NCC24, NCC59和SNU1967)和执行TCF / LEF记者荧光素酶化验监测WNT信号。与沉默的HNF4α(图5),五个六个GC细胞系表现出显著的抑制TCF /中位数(图5B)和三个GC细胞系(MKN45 NCC24和NCC59) WNT5A(差别显示对这些图5C)下HNF4αshRNA击倒。

    Effects of hepatocyte nuclear factor-4α (HNF4α) knockdown on WNT5A in gastric cancer (GC). (A) Monitoring of HNF4α activity through HNF4α reporter luciferase assay under siRNA-HNF4α in six GC cell lines (diffuse type: SNU1967 and NCC24; intestinal type: NCC19 and NCC59) (*p<0.05). (B) Monitoring of WNT signal pathway activity through TCF/LEF reporter luciferase assays following siRNA-HNF4α knockdown in six GC cell lines (*p<0.05). (C) Suppression of WNT5A mRNA expression levels by negative control (white bars), HNF4α shRNA (black bars) or WNT5A (line filled bars) in three GC cell lines.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    影响肝细胞的核factor-4α(HNF4α)击倒在胃癌WNT5A (GC)。(A)监测HNF4α通过HNF4α记者荧光素酶活性测定在六个GC细胞系(siRNA-HNF4α扩散类型:SNU1967 NCC24;肠道类型:NCC19和NCC59) (* p < 0.05)。(B)监测WNT信号途径活性通过TCF / LEF记者荧光素酶化验后siRNA-HNF4α击倒在六个GC细胞系(* p < 0.05)。(C)抑制WNT5A mRNA表达水平的负控制(白色的酒吧),HNF4α成分(黑条)或WNT5A(满酒吧行)在三个GC细胞系。

    探索WNT5A的临床相关性,我们进行免疫组织化学染色在两个队列(251年251年发现集和验证集)情况下,先进的GC获得亚太病人(临床特点总结在网上补充表S3)。图6结果显示代表WNT5A GC合并肿瘤的组织化学染色two-cohort研究。non-neoplastic组织,胃腺体和整体的颈部区域的长度为WNT5A肠化生的腺体是积极的。总的来说,WNT5A表达观察195年(77.7%)和214年(85.3%)发现和验证集样品,分别。强度高表达(2 +)是观察在57例(22.7%)和68年(27.1%)样品。WNT5A强度之间的关系以及各种临床变量是在网上提供补充表S3。有趣的是,WNT5A显示,劳伦肠道类型GC(高表达水平图6A, B,方差分析测试,p = 9.7×10−6),而负面WNT5A染色水平与扩散类型GC,关系维护验证和合并集(图6C, D,看看网上补充表S4)。发现案例集》(2006),高表达与年龄相关的WNT5A和更先进的癌症状态(更深层次的入侵和淋巴结的转移增加);然而,这些关系都没有出现在验证设置(见在线补充表S4和S5和补充图S9)。这些不一致引起的免疫组织化学染色的变化或两组之间的差异。

    WNT5A is a potential prognostic marker in gastric cancer (GC) of the diffuse type. (A) WNT5A shows a strong bias with regard to the Lauren types in discovery data set (2006). (B) Kaplan–Meier plot showing correlation of WNT5A intensity with patient overall survival in the diffuse type in the discovery dataset (2006). (C, D) Merged (discovery data set 2006 and validation data set 2005) dataset shows WNT5A as a prognostic marker of diffuse type GC.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    WNT5A是一个潜在的预后标记在胃癌(GC)的散射类型。(一)WNT5A显示强烈的偏见对劳伦类型发现数据集(2006)。(B) kaplan meier情节展示WNT5A强度的相关性与弥漫型患者总生存期发现数据集(2006)。(C, D)合并(2005)发现2006数据集和验证数据集的数据集显示WNT5A预后标记扩散类型的GC。

    WNT5A表达水平没有显示预后意义当所有病例的分析(见S10A在线补充数据和C)不考虑劳伦类型。然而,当病例分为劳伦类型、强度强WNT5A总体存活率较差的漫射GC类型(p = 7.8×10日志等级测试−5,图6B)的发现队列。虽然我们不能显示这个协会多次验证队列(请参见图S11A在线辅助和补充表S5),协会与总体存活率较差的还是出现在合并后的集(图6D)。无显著联系WNT5A水平被发现在两组肠GC类型(见S10B在线补充数据和D)。这些结果表明WNT5A的潜力作为分子标记,以方便病人分层。WNT5A在肠道类型癌症的高表达和肠上皮化生non-neoplastic腺可能伴随肠道分化现象。在扩散类型癌症,然而,高表达的WNT5A不是伴随着分化现象和可能代表一个功能获取更激进的行为。

    动物模型确认AMPK-HNF4α-WNT5A信号级联

    从我们之前的研究和上面的GC细胞系扰动实验(二甲双胍治疗和siRNA-mediated击倒),我们在GC阐明HNF4α信号的背景下,与上游监管者LKB1-AMPK WNT5A-HIF-1α和下游目标。确认上面的发现更生物相关的背景下,我们进行了两个实验异种移植(NCI-N87和MKN45)小鼠模型,显示二甲双胍具有很强的抗肿瘤活性(图7A、B)。重要的是,我们发现监管关系符合我们观察的细胞系的研究。二甲双胍治疗后,LKB1 NCI-N87细胞表达增加了3.6倍和2.8倍MKN45细胞而没有治疗;AMPKα表达也显著增加(图7C)。与此同时,HNF4αNCI-N87细胞信使rna水平下降了44%,50%在MKN45细胞而没有治疗(图7D)。免疫组织化学还透露在差别HNF4α蛋白质对这些异种移植模型(图7E)和WNT5A及其直接下游靶基因,β-catenin TCF1,都下调了二甲双胍(图7F)。这些体内结果进一步验证我们的免疫组织化学和RNA-seq发现,表明LKB1-AMPK-HNF4α-WNT5A-HIF-1α代表一个GC肿瘤发生的关键信号级联。这些结果进一步验证我们的计算方法(“PATHOME”),我们有牵连的GC HNF4α-WNT5A信号耦合,34一种方法我们认为提高的仅仅是检查基因本体或基因集富集分析。

    Animal models confirm the liver kinase B1/AMP-activated protein kinase/hepatocyte nuclear factor-4α (LKB1/AMPK/HNF4α) signalling cascade in gastric cancer (GC) mouse models. (A, B) Antitumor activity of metformin treatment on NCI-N87 and MKN45 GC mouse xenograft models (scid mice, n=8 per cell type). Cells were subcutaneously injected and grown for 22 days for NCI-N87 cells and 5 days for MKN45 cells before treating with metformin. Tumour size growth was measured and compared between mice treated with or without metformin, as depicted by the growth curve (diamond=non-treated (NT); triangle=metformin-treated (MET)) (*p<0.05, ***p<0.001). (C) AMPK subunit expression levels with and without metformin after 25 days (open bars=NT, black bars=MET). The expression levels of AMPKα1 and AMPKα2 were significantly higher when treated with metformin, but not those of AMPKβ1, AMPKβ2, AMPKγ1, AMPKγ2, AMPKγ3 (*p<0.05). (D) Expression level of HNF4α with and without metformin at 25 days (open bars=NT, black bars=MET). HNF4α expression level decreased upon metformin treatment. *p<0.05. (E) Immunohistochemistry results showing WNT5A staining of mouse model xenograft tumours. WNT5A levels in tumours strongly decreased when mice were treated with metformin. The stain was scored as 0–3, representing weakly or strongly positively stained cells. (F) Xenograft model protein levels for β-catenin and TCF1, the downstream genes of the HNF4α, WNT5A and WNT pathway. Mice were untreated or treated with metformin for 25 days. Four graphs represent quantified immunoblots using ImageQuant software normalised to β-actin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    Animal models confirm the liver kinase B1/AMP-activated protein kinase/hepatocyte nuclear factor-4α (LKB1/AMPK/HNF4α) signalling cascade in gastric cancer (GC) mouse models. (A, B) Antitumor activity of metformin treatment on NCI-N87 and MKN45 GC mouse xenograft models (scid mice, n=8 per cell type). Cells were subcutaneously injected and grown for 22 days for NCI-N87 cells and 5 days for MKN45 cells before treating with metformin. Tumour size growth was measured and compared between mice treated with or without metformin, as depicted by the growth curve (diamond=non-treated (NT); triangle=metformin-treated (MET)) (*p<0.05, ***p<0.001). (C) AMPK subunit expression levels with and without metformin after 25 days (open bars=NT, black bars=MET). The expression levels of AMPKα1 and AMPKα2 were significantly higher when treated with metformin, but not those of AMPKβ1, AMPKβ2, AMPKγ1, AMPKγ2, AMPKγ3 (*p<0.05). (D) Expression level of HNF4α with and without metformin at 25 days (open bars=NT, black bars=MET). HNF4α expression level decreased upon metformin treatment. *p<0.05. (E) Immunohistochemistry results showing WNT5A staining of mouse model xenograft tumours. WNT5A levels in tumours strongly decreased when mice were treated with metformin. The stain was scored as 0–3, representing weakly or strongly positively stained cells. (F) Xenograft model protein levels for β-catenin and TCF1, the downstream genes of the HNF4α, WNT5A and WNT pathway. Mice were untreated or treated with metformin for 25 days. Four graphs represent quantified immunoblots using ImageQuant software normalised to β-actin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    动物模型证实肝脏激酶B1 /活化蛋白激酶/肝细胞的核factor-4α(LKB1 / AMPK / HNF4α)在胃癌信号级联(GC)小鼠模型。(A, B)二甲双胍治疗的抗肿瘤活性NCI-N87和MKN45 GC鼠标异种移植模型(scid老鼠,n = 8每个细胞类型)。细胞皮下注射和增长了22天NCI-N87细胞和前5天MKN45细胞与二甲双胍治疗。肿瘤大小增长之间的测量和比较小鼠有或没有二甲双胍治疗,所描述的生长曲线(钻石=摘要(NT);三角= metformin-treated(遇到))* * * (* p < 0.05, p < 0.001)。(C) AMPK亚基表达水平有或没有二甲双胍后25天(开放酒吧= NT,黑条=满足)。AMPKα1和AMPKα2的表达水平明显高于用二甲双胍治疗,但不是AMPKβ1,AMPKβ2,AMPKγ1,AMPKγ2 AMPKγ3 (* p < 0.05)。(D)表达水平的和不使用二甲双胍HNF4α25天(开放酒吧= NT,黑条=满足)。HNF4α表达水平下降在二甲双胍治疗。* p < 0.05。(E)免疫组织化学染色结果显示WNT5A鼠标异种移植肿瘤模型。 WNT5A levels in tumours strongly decreased when mice were treated with metformin. The stain was scored as 0–3, representing weakly or strongly positively stained cells. (F) Xenograft model protein levels for β-catenin and TCF1, the downstream genes of the HNF4α, WNT5A and WNT pathway. Mice were untreated or treated with metformin for 25 days. Four graphs represent quantified immunoblots using ImageQuant software normalised to β-actin.

    讨论

    在这项研究中我们从高加索以及亚太异形GC转录组的病人,提供关键的基础这一疾病的分子基础在不同的民族。重要的是,而不是选择候选基因从一个数据集,我们进行了一次sub-pathway方法,整合多个表达式的数据集不同患者群体(亚太地区和高加索)。34鉴于高GC的生物学异质性,这种整合过程允许我们定义一组小基因最健壮的表情签名,与GC肿瘤发生。

    这些分析确定HNF4α作为一个关键GC致癌基因。HNF4α核受体,激活内胚层发育相关基因的表达和葡萄糖、脂肪酸和胆固醇代谢,及其亚型在肝脏进行研究。35,36先前的研究表明HNF4α作为一个潜在的直接或间接目标药物的药物作用于肠道上皮细胞(主站点的代谢控制),32和一个HNF4α同种型被证明与eb病毒感染在GC肿瘤。37HNF4α评估函数,我们执行GC细胞扰动实验通过shRNA或直接拮抗剂或通过二甲双胍,一种广泛使用的降糖药。38同意我们的结果,二甲双胍抑制MKN-1以前发现,-45年和-74年GC细胞系和异种移植增长通过其对细胞周期调控蛋白的影响。39这里我们进一步表明,二甲双胍治疗激活LKB1-AMPK激活而下调HNF4α。我们的研究表明,间接(AMPK)或直接HNF4α抑制强劲下调HIF-1α,符合一个拟议中的抑制作用AMPK Warburg效应的厌氧代谢特征的恶性表型。40

    重要的是,我们的结果表明,HNF4α拮抗剂抗癌活性而且HNF4α表达式可以调制通过二甲双胍AMPK信号,提供洞察可能GC的药物组合。此外,HNF4α可以调节WNT信号通过其直接目标WNT5A这是一个潜在的预后指标,我们发现WNT5A抑制的AMPK同意一项研究显示肝upregulation WNT5A在禁食条件下。41在一起,我们的研究结果强调AMPKα-HNF4α-WNT5A信号级联的潜力是一个有前途的通道未来药物发展的途径。

    总而言之,我们相信,我们的方法识别子集的信号通路与特定癌症的标志着一个重大的进步标志在前面的方法只考虑特定的基因本体或基因集富集。特定算法,指定“PATHOME”,34之前假设的存在HNF4α/ WNT5A信号耦合,计算的结果,我们已经通过实验验证在当前工作。在一起,我们的研究结果强调AMPKα-HNF4α-WNT5A信号级联的潜力是一个有前途的通道为未来的GC药物开发途径。

    确认

    我们感谢LeeAnn柴斯坦编辑援助。

    引用

    1. ↵
      1. Jemal一个,
      2. 布雷F,
      3. 中心毫米,等
      。全球癌症统计数据。CA癌症中国2011年;61年:69年- - - - - -90年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    2. ↵
      1. 帕金DM,
      2. 布雷F,
      3. FerlayJ,等
      。统计,2002年全球癌症。CA癌症中国2005年;55:74年- - - - - -108年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    3. ↵
      1. 麦当劳米,
      2. 赫兹RP,
      3. 皮特曼Lowenthal西南
      。辉瑞的事实,在亚洲癌症的负担。美国:辉瑞,2008年。
    4. ↵
      1. Ferlay工装裤
      。GLOBOCAN 2008年全球癌症发病率和死亡率。CancerBase2010年;2010年。
    5. ↵
      1. Fucciol,
      2. Eusebi韩,
      3. BazzoliF
      。胃癌、幽门螺杆菌感染和其他风险因素。世界Gastrointest肿瘤学杂志2010年;2:342年- - - - - -7。
      OpenUrl PubMed
    6. ↵
      1. Suerbaum年代,
      2. MichettiP
      。幽门螺杆菌感染。N拉米夫地中海2002年;347年:1175年- - - - - -86年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    7. ↵
      1. IizasaH,
      2. Nanbo一个,
      3. NishikawaJ,等
      。eb病毒(EBV)有关胃癌。病毒2012年;4:3420年- - - - - -39。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    8. ↵
      1. 金J,
      2. 霍夫曼摩根大通,
      3. AlpaughRK,等
      。iPSC线从人类胰腺导管腺癌发生胰腺癌的早期侵入阶段进展。细胞的报道2013年;3:2088年- - - - - -99年。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    9. ↵
      1. DankelSN,
      2. 黄平君T,
      3. FlagengMH,等
      。cAMP-mediated HNF-4alpha取决于监管水平共激活剂PGC-1alpha。Biochim Biophys学报2010年;1803年:1013年- - - - - -9。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    10. ↵
      1. 山下式K,
      2. Sakuramoto年代,
      3. Nemoto米,等
      。胃癌的趋势:在日本35年的手术经验。世界杂志2011年;17:3390年- - - - - -7。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    11. ↵
      1. 荣格千瓦,
      2. 赢得了YJ,
      3. 香港沪江,等
      。在韩国癌症统计:2010年发病率、死亡率、生存和流行。大肠癌的治疗2013年;45:1- - - - - -14。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      1. (尽管)W,
      2. 根据N
      。早期胃癌和发育不良。Gastrointest Endosc中国北部2013年;23:77年- - - - - -94年。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      1. 爆炸YJ,
      2. 来说实在E,
      3. Feyereislova一个,等
      。曲妥珠单抗联合化疗与单独化疗治疗her2阳性癌症晚期胃或gastro-oesophageal结(宽外袍):第三阶段,非盲、随机对照试验。《柳叶刀》2010年;376年:687年- - - - - -97年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    14. ↵
      1. Okines亚足联,
      2. 坎宁安D
      。曲妥珠单抗在胃癌。欧元J癌症2010年;46:1949年- - - - - -59。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    15. ↵
      1. ArkenauHT
      。胃癌分子靶向制剂的时代:目前药物开发策略。J癌症Res肿瘤防治杂志2009年;135年:855年- - - - - -66年。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    16. ↵
      1. Ku孔侑,
      2. IlsonDH
      。Esophagogastric癌症:靶向制剂。癌症治疗牧师2010年;36:235年- - - - - -48。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    17. ↵
      1. 温伯格咱,
      2. Anghel一个,
      3. 德赛AJ,等
      。拉帕替尼,双重EGFR和HER2激酶抑制剂,有选择性地抑制HER2扩增人类胃癌细胞和协同曲妥珠单抗在体外和体内。中国癌症Res2010年;16:1509年- - - - - -19。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    18. ↵
      1. 崔J,
      2. 陈Y,
      3. 周WC,等
      。一个集成的转录组和计算分析的生物标志物识别胃癌。核酸Res2011年;39:1197年- - - - - -207年。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    19. ↵
      1. 梁H,
      2. 金本产品
      。通过下一代测序识别胃癌的分子的司机。癌症列托人2013年;340年:241年- - - - - -6。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    20. ↵
      1. 金本产品,
      2. 梁H,
      3. 刘X,等
      。AMPKalpha调制在癌症进展:多层综合分析整个转录组的亚洲胃癌。癌症Res2012年;72年:2512年- - - - - -21。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    21. ↵
      1. 赵司法院,
      2. Lim司法院,
      3. 畅JH,等
      。基因表达在胃癌基于签名的预后风险评分。中国癌症Res2011年;17:1850年- - - - - -7。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    22. ↵
      癌症基因组图谱。http://cancergenome.nih.gov/(评估2014年11月9日)。
    23. ↵
      1. 金本产品,
      2. 浣熊一个,
      3. 贝克房颤,等
      。抗肿瘤剂PX-12抑制HIF-1alpha蛋白质含量增加通过Nrf2 / PMF-1-mediated亚精胺和精胺乙酰转移酶。癌症Chemother杂志2011年;68年:405年- - - - - -13。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    24. ↵
      1. Schmittgen道明,
      2. LivakKJ
      。分析实时PCR数据比较C (T)的方法。Nat Protoc2008年;3:1101年- - - - - -8。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    25. ↵
      1. ChellappaK,
      2. 罗伯逊GR,
      3. Sladek调频
      。HNF4alpha:一个新的生物标志物在结肠癌?Biomark地中海2012年;6:297年- - - - - -300年。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    26. ↵
      1. Hwang-VersluesWW,
      2. Sladek调频
      。HNF4alpha-role在药物代谢和潜在的药物目标?当今药物杂志2010年;10:698年- - - - - -705年。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    27. ↵
      1. 田中T,
      2. 江年代,
      3. HottaH,等
      。特异表达的表达P1和P2 promoter-driven肝细胞的核factor-4alpha人类癌症的发病机理。中草药2006年;208年:662年- - - - - -72年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    28. ↵
      1. 西门GL
      。针对HIF-1癌症治疗。Nat牧师癌症2003年;3:721年- - - - - -32。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    29. ↵
      1. ·海尔萨姆TC,
      2. 森年代,
      3. 奈文斯小
      。一个E2F1-dependent基因表达程序决定了增殖和细胞死亡之间的平衡。癌症细胞2008年;13:11- - - - - -22。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    30. ↵
      1. Cattin艾尔,
      2. Le BeyecJ,
      3. BarreauF,等
      。肝细胞的核因子4α,体内平衡的一个关键因素,细胞结构,和成人肠上皮屏障功能。摩尔细胞生物2009年;29日:6294年- - - - - -308年。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    31. ↵
      1. 在香港本产品,
      2. 瓦拉纳西我们,
      3. 杨W,等
      。活化蛋白激酶调节HNF4alpha转录活动通过抑制二聚体形成和减少蛋白质的稳定性。J临床生物化学2003年;278年:27495年- - - - - -501年。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    32. ↵
      1. 里贝罗一个,
      2. 弓箭手一个,
      3. Le BeyecJ,等
      。肝核4,一个关键的转录因子在十字路口之间的上皮细胞的结构和功能。最近拍Endocr金属底座免疫药物盘2007年;1:166年- - - - - -75年。
      OpenUrl CrossRef
    33. ↵
      1. 森林一个,
      2. 约翰斯通老,
      3. 迪克森K,等
      。LKB1的上游激酶活化蛋白激酶级联。咕咕叫杂志2003年;13:2004年- - - - - -8。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    34. ↵
      1. 不结盟运动年代,
      2. 常人力资源,
      3. 金KT,等
      。PATHOME:差异表达subpathways准确检测的算法。致癌基因2014年;33:4941年- - - - - -51。
      OpenUrl CrossRef PubMed
    35. ↵
      1. Torres-Padilla我,
      2. Fougere-DeschatretteC,
      3. 维斯MC
      。表达HNF4alpha亚型在小鼠肝脏发展是由顺序启动子用法和本构3′端拼接。机械工程开发2001年;109年:183年- - - - - -93年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    36. ↵
      1. 瓦特AJ,
      2. 驻军WD,
      3. 邓肯SA
      。HNF4:肝细胞分化和功能的中央监管机构。肝脏病学2003年;37:1249年- - - - - -53。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    37. ↵
      1. UozakiH,
      2. BaruaRR,
      3. Minhua年代,等
      。转录因子与SOX2打字、HNF4aP1和CDX2密切相关肿瘤入侵和巴尔病毒在胃癌的地位。Int中国实验病理学研究2011年;4:230年- - - - - -40。
      OpenUrl PubMed
    38. ↵
      1. 加拉格尔EJ,
      2. LeRoithD
      。糖尿病、癌症、代谢和细胞增殖和二甲双胍:连接。安N Y科学2011年;1243年:54- - - - - -68年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    39. ↵
      1. 加藤K,
      2. 龚J,
      3. IwamaH,等
      。抗糖尿病的药物二甲双胍抑制胃癌细胞增殖在体外和体内。摩尔癌症其他2012年;11:549年- - - - - -60。
      OpenUrl 文摘/免费的全文
    40. ↵
      1. 沙克尔福德DB,
      2. 肖RJ
      。LKB1-AMPK通路:新陈代谢和生长控制肿瘤的抑制。Nat牧师癌症2009年;9:563年- - - - - -75年。
      OpenUrl CrossRef PubMed 网络的科学
    41. ↵
      1. 刘H,
      2. •弗格森毫米,
      3. 吴JJ,等
      。Wnt信号调节肝脏代谢。Sci的信号2011年;4:ra6。
      OpenUrl 文摘/免费的全文

    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

      在这个数据补充文件:

    脚注

    • 人权组织、SN和M-CK同样贡献了第一作者。TP、HL和YHK同样贡献了相应的作者。

    • 贡献者TP、HL和YHK构思和设计实验。DH、锡、IH、HL和YHK分析数据。HRC, K-TK、M-CK HRJ, HSP YG、GP和YHK进行了实验。霍奇金淋巴瘤,TP和YHK写道。所有作者都阅读和批准出版的手稿。

    • 资金这项研究是由美国国立癌症中心的支持韩国,ncc - 1210350 - 2 (YHK), ncc - 1210460 (SN);韩国国家研究基金会由大韩民国(NRF)拨款2012 r1a3a2026438 (MSIP), 2008 - 0062618, 2013年m3a9c4078158 (TP);拨款来自美国国立卫生研究院,CA95060, CA129616, CA17094和CA98920 (GP), CA143883和CA016672 (HL);UTMDACC-G.S。霍根肠胃研究基金和洛林戴尔项目个性化的癌症医学生物信息学(HL)。

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。

    • 数据共享声明本研究中的基因表达数据可以在网上找到的基因表达综合(GSE63288)。