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摘要
客观的功能性消化不良(FD)患者胃调节功能受损。先前对感染后FD患者的研究结果表明，低级别的炎症和氮能神经功能障碍在调节功能受损中起作用。迄今为止，研究这些变化之间关系的自发动物模型尚缺乏。我们假设血糖正常的生物繁殖糖尿病倾向(BB-DP)大鼠提供了炎症诱导的胃运动功能受损的动物模型。
设计分别于30、70、220日龄处死抗糖尿病、血糖正常和高血糖的BB-DP大鼠，取胃底组织，研究氮能运动控制、炎症反应及一氧化氮合酶(nNOS)神经元亚型和一氧化氮合酶(iNOS)诱导亚型的表达。在血糖正常的BB-DP大鼠中测量营养诱导的胃内压(IGP)变化，以研究适应能力。
结果BB-DP组大鼠与对照组大鼠在30 d时氮能功能和炎症反应无差异。BB-DP大鼠在70天和220天时基底肌弛豫的氮能成分降低。这伴随着nNOS蛋白的大量丢失。营养灌注220 d时，BB-DP大鼠IGP显著升高，表明适应能力受损。70日龄和220日龄BB-DP大鼠基底黏膜和固有肌层可见多形核细胞浸润、髓过氧化物酶活性升高和iNOS表达升高。
结论220天的BB-DP大鼠显示基底运动控制改变和调节功能受损，这至少可以部分解释为氮能功能的丧失。这可能与神经肌肉层的炎症改变有关，提示血糖正常的BB-DP大鼠为炎症诱导的胃调节功能受损提供了自发的模型。
- 肠神经系统
- NEUROGASTROENTEROLOGY
- 功能性消化不良
- 炎症细胞
- 胃蠕动
来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
关于这个问题，我们已经知道了什么?
几项研究报道了功能性胃肠疾病(FGID)患者存在低级别粘膜炎症。
有证据表明肠神经系统水平的炎症和氮能功能障碍，是感染后功能性消化不良患者胃调节功能受损的潜在原因。
这些观察结果提示在该患者组中急性炎症、氮能功能障碍和运动障碍之间存在相互作用。
据我们所知，目前还没有研究和描述胃调节改变的自发动物模型。
新的发现是什么?
正常血糖生物增殖糖尿病(BB-DP)大鼠胃调节功能受损，其部分原因是氮能神经功能的丧失。
这种调节能力受损与低级别炎症和一氧化氮合酶蛋白的神经元亚型损失有关，该模型中一氧化氮合酶蛋白随着时间的推移而发展。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
血糖正常的BB-DP大鼠有助于我们了解炎症性胃调节功能受损患者的病理生理机制。
该动物模型也可能是开发治疗FGID患者的新药物的有用工具。
简介
在两餐之间，胃底的平滑肌保持高休息张力。当食物摄入后，胃近端会产生放松反应，使摄入的食物得以储存而不升高胃内压力。1这种胃调节反射是由迷走神经反射介导的，涉及胃近端肌肠丛中的氮能神经元的激活。2氮能神经元释放一氧化氮(NO)，诱导肌肉放松。一些观察结果支持胃调节反射在决定饭量和饱腹感方面的生理作用。3.此外，调节功能受损与功能性消化不良(FD)、糖尿病胃病和后尼森消化不良的发病机制有关。4 - 6
FD是一种慢性胃肠道(GI)疾病，其特征是出现早期饱腹感、餐后饱腹感和胃脘痛，在内镜检查或其他常规检查中无异常发现。7据报道，约40%的FD患者胃调节功能受损。8FD调节功能受损的机制尚未完全阐明，但临床和药理学观察表明，内源性氮能神经的低级别炎症和功能障碍可能起作用。在感染后FD (PI-FD)患者中，调节功能受损的发生率很高(70%)，这可以归因于胃近端氮能运动控制受损。9PI-FD患者在开始急性胃肠炎后的12个月，粘膜活检显示仍保持持续的低级别炎症迹象，中性粒细胞和肥大细胞数量增加，肥大细胞靠近神经纤维。10
这些结果表明，氮能神经元功能障碍是胃调节功能受损的潜在原因，这可能是由炎症过程触发的。考虑到小肠肌肠丛的淋巴细胞浸润与肠易激综合征患者的神经退行性变有关，这一假设更加合理。11此外，在诱发小肠炎症的动物模型中进行的几项研究显示，神经肌肉功能受损，在初始炎症后持续存在，其特征是神经元一氧化氮合酶(nNOS)表达丧失，小肠肌肉弛豫和体内收缩力下降。12，13
然而，低级别炎症改变与氮运动控制受损和胃调节能力下降之间的联系机制尚不清楚。其中一个原因是缺乏自发的炎症相关神经元功能改变和调节功能受损的动物模型。最近，我们确定了血糖正常的生物繁殖型糖尿病(BB-DP)大鼠作为研究炎症诱导的肠道神经运动功能改变的潜在模型。14 - 16
BB大鼠是被研究为人类1型糖尿病模型的动物模型。该模型由一个对照组bb -品系(control)和一个糖尿病易感品系(BB-DP)组成，其中50%-90%的动物最终会根据其环境发展为糖尿病。糖尿病前期胃肠道通透性变化、粘膜炎症和免疫功能改变的组合似乎是糖尿病易感菌株中自身免疫性疾病(如糖尿病)高患病率的基础。17，18已经确定的是，糖尿病动物显示出GI神经肌肉功能改变的证据，这被归因于高血糖的后果。月19 - 21日
此外，在血糖正常的BB-DP大鼠中也报道了一些小肠神经肌肉功能的变化，包括神经节炎症、nNOS表达的丧失和氮能功能。16我们小组的研究已经将肠动力的改变与肌肠丛的炎症变化联系起来。13到目前为止，还不清楚类似的事件是否也出现在胃肠道的其他部分，包括近端胃。
本研究的目的是评估血糖正常和高血糖的BB-DP大鼠是否出现神经肌肉层炎症、氮能神经功能改变和胃调节功能受损。因此，我们研究了这些动物胃近端炎症的发生、nNOS表达改变和神经肌肉功能随时间的变化。最后，在体内测试了这些改变对胃调节的影响。
材料和方法
动物
从加拿大卫生部动物资源司(渥太华，安大略省，加拿大)获得对照组、正常血糖和高血糖糖尿病倾向BB鼠，并在比利时鲁汶大学的动物设施进一步繁殖。老鼠被关在铁丝网的笼子里，可以随意获得饮用水和标准的鼠粮。在不同时间点(30、70和220天)处死大鼠，并收集组织。尽管我们的主要研究重点是研究正常血糖糖尿病易发BB大鼠(在本文其余部分中称为BB- dp)，但我们也添加了年龄匹配的高血糖糖尿病易发BB大鼠(在本文其余部分中称为BB- dph)的数据，以确定在我们的队列中是否存在类似的变化。由于糖尿病是在90至160日龄之间发生的，我们所有的高血糖动物都在第220天被处死。
实验设计
之前的实验已经表明，小肠的变化在220日龄时最为明显。22在此基础上，对对照组和BB-DP大鼠灌注营养饮料过程中胃内压(IGP)的变化进行了测定。在BB-DPH动物中测量IGP是不可行的，因为这些动物不能存活本协议所要求的一夜禁食。
处死30、70、220日龄的对照组大鼠和BB-DP大鼠，处死220日龄的BB-DPH大鼠，解剖胃作进一步研究。在解剖胃底进行肌条实验时，采集胃底粘膜和神经肌肉组织，测定髓过氧化物酶(MPO)活性。其余神经肌肉组织保存进行组织学、MPO测量和蛋白定量分析(western blot analysis)。
显卡的测量
如前所述，在通过植入瘘管灌注营养饮料期间，通过测量IGP来评估胃调节能力。23手术中，在异氟醚镇静下，沿胃大弯插入一个丙烯酸塑料瘘管，与胃食管附着物相对。然后瘘管通过左腹肌外化，使它能够从动物外部进入胃腔。为了防止感染，动物在实验前和整个实验过程中使用Baytril(恩诺沙星，拜耳)。大鼠对限制笼(Bollmann笼)也有一定的习惯。
禁食一晚后，大鼠被放入Bollmann笼子中，瘘管连接到一个定制的输注系统，通过这个输注系统，一个预热的营养饮料(Nutridrink, Nutricia, Zoetmeer, the Netherlands;每100 mL注入630 kJ, 6 g蛋白质，18.4 g碳水化合物和5.8 g脂类)。此外，一个聚乙烯导管连接到一个外部压力传感器(DPT-6100, Pvb Medizintechnik;Kirchseeon，德国)通过瘘管置入胃内。IGP使用WINDAQ记录软件(DataQ仪器)进行记录。稳定30 min后，以30 mL/min的速度开始向胃内灌注试验餐，持续20 min，直到总灌注量达到10 mL。NO抑制剂硝基- l -精氨酸甲酯(L-NAME) (30 mg/mL NaCl 0.9%)在试验饲料灌注前15分钟皮下注射。将L-NAME注射液与对照组(0.9%盐水)注射于同一动物进行比较。如前所述，IGP的变化被用作大鼠胃调节的读数。23比较了不同菌株和实验条件下体积- igp曲线的曲线下面积(AUC)。
胃底平滑肌条松弛实验
取胃底粘膜，切下长±10 mm，宽1.5 mm的肌条，沿其圆形轴悬挂于充满Krebs (120.9 mmol/L NaCl, 2.0 mmol/L NaH)的器官浴中2阿宝4， 15.5 mmol/L NaHCO3.， 5.9 mmol/L KCl, 1.25 mmol/L CaCl2， 1.2 mmol/L MgCl2和11.5 mmol/L葡萄糖)溶液，37°C，用碳(95% O2/ 5%股份有限公司2)．静息张力为1 g，平衡期40 min后，在器官浴中加入0.1 mmol/L的乙酰胆碱以测量最大收缩。在30分钟的洗脱期后，通过使用Grass S88刺激器(Grass, Guincy, Massachusetts, USA)通过两个平行铂棒电极施加电场刺激(EFS)引起神经元反应。脉冲序列(脉冲0.35 ms，序列10 s, 8 V)获得1 ~ 4 Hz的频谱。使用医学实验室刺激分离器II(医学实验室，Loveland, Colorado, USA)将电压保持在8 V。在每个脉冲序列之间，包括一个90秒的恢复期。使用等量力传感器/放大器(Harvard Apparatus, South Natick, Massachusetts, USA)测量肌肉活动，记录在多记录仪上，并使用Windaq数据采集系统和DI-2000 PGH卡(Dataq Instruments, Akron, Ohio, USA)采样进行数字分析。
从那时起，在非肾上腺素能非胆碱能(NANC，存在阿托品1 μ mol/L和胍乙啶4 μ mol/L)条件下，由EFS谱诱导的所有弛豫反应均进行。每次频谱前，向器官浴中加入P (SP) 1µmol/L物质诱导预收缩，产生稳定的音调。通过在L- name (0.3 mmol/L)存在的情况下重复光谱，在每次EFS光谱前15分钟添加L- name，对反应进行药理学表征。添加L-NAME用于研究肌肉弛豫中氮能成分的变化。在末次电场刺激后立即加入硝酸甘油(NG) 10µmol/L检测肌肉对NO的反应性。
与此方案类似，我们还进行了一个附加的对照实验，以比较粘膜剥离对肌肉收缩力的影响。来自同一动物(共3条)的带和不带粘膜的肌肉条被安装在器官浴中。随后，如前所述，我们测试了肌肉在出现和不出现L-NAME时对EFS的反应。
对电场刺激的响应计算为刺激期间(响应时)的AUC，并根据截面积(g/(mm)进行校正2s))。L-NAME对电致肌肉松弛的降低百分比计算为(R之前- r后)×100 / R之前, R之前和R后表示加入药物化合物前后的反应。这种方法以前被Smits使用过et al。24
MPO活性
将基底组织吸干，称量，然后在含0.5%十六烷基三甲基溴化铵(HTAB, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, USA)的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中冰碎。为了进一步提取，组织然后在相同的缓冲液中均匀化4分钟，然后进行两次冻融循环。离心后，将100µL的上清液加入2.9 mL含0.53 mmol/L o -二苯胺和0.15 mmol/L过氧化氢(H2O2)．o -二酸酐的氧化是由存在于炎症细胞(主要是中性粒细胞)中的过氧化物酶催化的。在分光光度计(Genesys 6, Thermo LabSystems，比利时)中，每30秒测量一次460 nm处吸光度的变化，持续20分钟。一个单位的MPO活性被定义为转化1 mol H所需的MPO活性量2O2到H2在25°C下每分钟O，活性以每毫克组织的单位表示。
组织学和免疫组织化学
透壁基底组织(±15mm24%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，标准H&E染色。活检检查粘膜损伤(存在糜烂或溃疡)，然后评估黏膜下层多形核(PMN)细胞的数量(每10个高倍场(HPF)的PMN细胞总数，=×400放大倍数)。通过计算神经节中PMN细胞的数量，也可以量化肌间神经丛中PMN细胞的浸润。计数是由一位经验丰富的病理学家(GDH)进行的，他不被告知动物的治疗方法、症状或其他实验数据。甲苯胺蓝染色后观察结缔组织肥大细胞，并在肌内水平计数10 HPF定量(×400放大倍率)。
rt - pcr分析
RT-PCR使用Lightcycler 480 (Roche Applied Science, Penzberg, Germany)进行。LightCycler 480 SYBR Green 1 Master Mix (Roche Applied Science)与cDNA样本和nNOS和iNOS引物结合(forward: ACCCAAGGTCTACGTTCAAGACA;反向:CACATCCCGAGCCATGC)来自TIB molbiol，柏林，德国。其他组报道了不同的nNOS 5 ' -剪接变体，对nNOSα(三种不同的剪接变体nNOSα-a, nNOSα-b和nNOSα-c)和nNOSβ(引物设计基于既往文献)进行PCR。25表达归一化到次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因，结果如前所述呈折叠变化。26
免疫印迹分析
解剖基底神经肌肉组织，液氮速冻，−80°C保存。冷冻组织在裂解缓冲液(组织蛋白提取试剂)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(美国伊利诺斯州罗克福德的赛默飞世尔科学公司)中均质。离心后测定总蛋白浓度。等量的蛋白质(25µg)在4%-12%梯度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)上运行，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用TBS-T缓冲液(Tris-Buffered Saline and Tween 20)溶解的干牛奶阻断后，印迹与兔抗nnos (1/200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)、iNOS (1/200, Abcam, Cambridge, UK)、一般神经元标记:兔抗pgp9.5 (1/500, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)和兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) (1/500, Abcam, Cambridge, UK)在4°C下孵育一夜。然后在室温下与培养的针对兔免疫球蛋白g的辣根过氧化物酶偶联二抗孵育2小时，在Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific, Doornveld, Belgium)中孵育5分钟，观察条带。扫描后，用Image J软件(National Institutes of Health;http://rsb.info.nih.gov.ij/)．相对于管家蛋白GAPDH定量表达PGP9.5。nNOS蛋白总量相对于PGP9.5表达。
统计分析
数据以平均值±SEM表示，“n”表示大鼠数量。体外收缩性数据的分析是用SAS for Microsoft Windows, V.9.2 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA)完成的。对照组和BB-DP组比较采用混合模型分析(proc混合)。将应变(BB-DP和对照)、EFS的频率(1-4 Hz)和由频率相互作用项产生的应变作为固定效应输入模型。电场刺激频率也被作为重复效应。使用Graphpad软件(Graph Pad software, San Diego, California, USA)对所有其他数据进行分析。根据数据分布情况，采用双尾无配对Student t检验或Mann-Whitney U检验检验两组间差异，采用Kolmogorov-Smirnov检验检验。两组以上的差异采用方差分析及事后t检验和Bonferroni校正进行多重检验或适当时采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验进行评价。结果p值<0.05为显著性。
结果
胃住宿
220日龄大鼠胃内营养物质灌注过程中IGP的变化被用作胃对注入的液体餐的适应能力的读数，较高的压力反映了适应能力受损。23BB-DP大鼠营养输注过程中IGP显著高于同龄对照大鼠(营养输注过程中的AUC: 105.8±5.7 vs 80.3±8.8 mL × mm Hg, p<0.05) (图1A).比较L-NAME处理对BB-DP和对照动物IGP变化的影响，并与相同动物的盐水处理进行比较。这样做是为了评估两组动物间IGP的差异是否可以归因于氮能功能受损。L-NAME治疗组IGP显著升高(AUC 68.9±7.7 vs 116.4±13.8 mL × mm Hg, p<0.01) (图1A).相比之下，在L-NAME治疗220天的BB-DP动物的IGP没有变化(AUC 105.8±5.7 vs 98.1±11.0)。l - name处理的对照组大鼠与盐水处理的BB-DP大鼠IGP比较无明显差异。两组小鼠胃总重量具有可比性。总之，这些数据表明BB-DP bb -大鼠的适应能力受损，这至少在一定程度上可归因于氮能神经元功能的丧失。采用不同年龄的肌条研究氮能功能障碍的发生。
体内测量胃内压(IGP)的变化。(A)营养饮料灌注过程中压力-体积曲线的曲线下面积(AUC)。对照(黑条)和生物繁殖糖尿病易发(BB-DP)动物(白条)在生理盐水和L-NAME硝基精氨酸甲酯(L-NAME)处理下进行比较。(B)对照动物的个体追踪。(C) BB-DP大鼠个体追踪。(D) l - name处理的对照动物与正常条件下的BB-DP大鼠相比，营养饮料对IGP变化的代表性追踪。**p<0.01盐水对照L-NAME对照γp<0.05对照盐水与BB-DP盐水比较。
胃底的神经肌肉功能
30日龄、70日龄BB-DP大鼠和对照大鼠在NANC条件下，efs诱导的肌条弛豫具有可比性(图2A, B)。在220日龄时，BB-DP和BB-DPH大鼠在所有频率上的放松均显著受损(p<0.05) (图2C). SP诱导的收缩和NG诱导的松弛总百分比在各时间点各动物组均相同，说明肌肉的收缩和松弛能力无差异。
在非肾上腺素能和非胆碱能条件下测量efs诱导的肌肉松弛。眼底肌条在p物质预收缩前15分钟用阿托品和胍乙啶孵育。用四种不同频率的电场刺激诱导肌条放松。松弛值用曲线下面积(AUC)表示，通过横截面积进行校正。统计分析采用混合模型分析，在3个不同年龄(N: 6-7;(一)30天;(B) 70天;(C) 220天)。BB-DP,育种学diabetes-prone;BB- dph，高血糖糖尿病倾向BB大鼠;电场刺激。
为了评估氮能对肌肉舒张的贡献的潜在差异，计算了在NANC条件下l - name诱导的肌肉舒张减少。在30日龄时氮能贡献无差异。相反，在70日龄和220日龄的BB-DP和BB-DPH大鼠中，氮能对肌肉放松的贡献显著较小(图3)．
氮能有助于肌肉放松。底肌条用阿托品、胍乙啶和硝基- l -精氨酸甲酯(L-NAME)孵育15分钟，然后用p物质进行预收缩，如前所述诱导肌条放松。通过减去非肾上腺素能、非胆碱能(NANC)条件下每个条带的弛豫值计算Delta L-NAME，然后将该Delta表示为NANC条件下弛豫的百分比。统计分析采用混合模型分析，在3个不同年龄(N: 6-7;(一)30天;(B) 70天;(C和D) 220天)。
对照实验表明，当比较带和不带粘膜组织的肌肉条时，肌肉松弛和L-NAME对松弛的影响相似。这证实了切除粘膜对肌条功能没有相关影响(见在线补充图S1)。
胃底的MPO活性
测量对照组动物粘膜和神经肌肉层的MPO活性，并与年龄匹配的BB-DP大鼠进行比较。在30天内，两种菌株的黏膜MPO活性几乎可以忽略不计，且相似(0.01±0.0 vs 0.0±0.0 U/mg;p = 0.2)。相比之下，BB-DP大鼠70 d时黏膜MPO活性显著升高(1.10±0.04 vs 0.03±0.01 U/mg, p<0.01)， BB-DP和BB-DPH大鼠220 d时MPO活性显著升高(对照组0.02±0.01 vs BB-DP, 0.63±0.40,p<0.01, BB-DPH 0.68±0.25 U/mg, p<0.05) (图4A)。在70天时测量BB-DP大鼠神经肌肉层MPO活性(BB-DP, 0.85±0.70 vs 0.01±0.01 U/mg, p<0.01)和220天时测量BB-DP和BB-DPH大鼠(对照组，0.01±0.005 vs BB-DP, 1.00±0.28,p<0.01, BB-DPH, 0.58±0.32单位/mg, p<0.01)也是如此(图4B)。
胃底粘膜和肌层髓过氧化物酶(MPO)活性的研究。MPO活性以每毫克组织的单位表示。在黏膜(A)和肌肉(B)组织中测量MPO，并在对照(黑条;N: 5-6)，生物繁殖易患糖尿病(BB-DP)(白色条;N: 6-7)和高血糖糖尿病倾向BB大鼠(BB- dph)(灰色条;护士:在年龄组内完成。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。
粘膜下层和肌肠神经节的嗜中性粒细胞浸润
在宏观和微观评价胃底时，没有动物在黏膜和肌肉水平出现任何糜烂或损伤。在30日龄时，BB-DP大鼠和对照组大鼠的粘膜和肌肠神经节中均无PMN细胞，证实此时无炎症。70日龄和220日龄的BB-DP大鼠和220日龄的BB-DPH大鼠与同龄对照动物相比，黏膜下层的PMN细胞明显增加(图570、220天的BB-DP大鼠和220天的BB-DPH大鼠的肌肠神经节内PMN细胞数量也显著增加(图5B, D, F)。
基底组织炎症变化的组织学评价和定量。在h&e染色的组织中对多形核(PMN)细胞进行组织学评价和定量。由一位经验丰富的病理学家在10个高倍场(10×60)下量化黏膜(A)中PMN细胞的总数。神经节(B)中嗜中性粒细胞的数量以每个神经节的细胞数表示。对照之间的比较(黑条;N: 5-7)，生物繁殖易患糖尿病(BB-DP)(白色条;N: 5-7)和高血糖糖尿病倾向BB大鼠(BB- dph)(灰色条，N: 6)在年龄匹配组内完成。* * * * p < 0.05, p < 0.001。220日龄对照(C)和BB-DP (D)大鼠H&E染色后的代表性图片。对照组(E)和BB-DP (F)大鼠神经节的详细图片，BB-DP大鼠神经节中存在PMN细胞。
BB大鼠70天(3.7±2.7 vs 27.2±14.2/10 HP, p<0.05)和220天(对照组3.3±1.8 vs BB- dp, 58.6±13.2 HP, p<0.01, BB- dph 10.4±2.7/10 HP, p<0.01)结缔组织肥大细胞总量显著增加，但在30天时无差异。
为探讨炎症改变与胃功能改变之间是否存在直接关系，研究BB-DP大鼠IGP值与MPO活性水平和PMN细胞数量的相关性。MPO活性(r²=0.39)和PMN细胞数量(r²=0.089)与BB-DP动物的IGP值无显著相关性。
胃底神经肌肉层nNOS和iNOS mRNA的表达
与BB-DP大鼠和BB-DPH大鼠比较，iNOS和nNOS剪接变体的表达没有改变。表达式数据在表1．
胃底神经肌肉层nNOS和iNOS蛋白的表达
神经肌肉层中nNOS蛋白的数量相对于一般神经元标记PGP9.5表达。GAPDH和PGP9.5的表达在任何时间点均无差异，说明神经元总量基本保留。在30和70日龄时，与对照组比较BB-DP的nNOS蛋白表达无差异(图6A, B)。相比之下，BB-DP大鼠和BB-DPH大鼠在220日龄时nNOS蛋白表达显著减少(p<0.01和<0.05)，iNOS蛋白表达显著增加(p<0.01和<0.05)(图6C).比较BB-DP和BB-DPH大鼠nNOS和iNOS蛋白表达无显著差异。
Western blot检测一氧化氮合酶(nNOS)神经元亚型和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达。通过western blot分析量化胃底肌肉组织中的蛋白表达，并比较对照组(黑条)和生物繁殖糖尿病(BB-DP)易发动物(白条)之间的差异。对于nNOS，所有年龄(A) 30天，(B) 70天，(C和D) 220天。对于iNOS，在220日龄时进行(E和F)。(G和H)代表印迹。nNOS和iNOS蛋白总量归一化为PGP9.5蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。相对于对照组的平均值测定蛋白质折叠率的变化。* * p < 0.01。
讨论
临床观察和病理生理学研究表明，消化不良症状和胃调节功能障碍可能是胃肠道炎症的结果，导致胃近端氮能神经功能受损。揭示这些事件背后的病理生理级联将受益于调节功能受损和胃氮能功能障碍的自发动物模型的可用性。在本研究中，我们证实了血糖正常的BB-DP大鼠胃底炎症增加，随之而来的是氮能运动控制受损和nNOS蛋白表达减少。同时伴有胃调节功能受损，这至少在一定程度上是由于氮能神经元诱导的肌肉放松丧失所致。此外，我们发现BB- dph大鼠也存在同样的改变，这与之前在高血糖BB大鼠中观察到的结果一致。20.
先前的研究报道了BB-DP大鼠胃肠道的炎症改变。早期数据发现这些动物的结肠中有明显的炎症浸润，包括肌层和肠神经节。27在这些动物的小肠中，MPO活性也有增加的报告，并且随着时间的推移而增加。28在此基础上，我们研究了对照组、BB-DP和BB-DPH动物在不同时间点的胃底炎症发生情况，并测定了该组织黏膜和肌肉层的MPO和PMN细胞浸润情况。我们发现BB-DP大鼠在70和220日龄时胃近端黏膜和神经肌肉层的MPO总活性增加，而在30日龄时MPO活性极低。MPO检测的炎症变化与粘膜下层和肠神经节中PMN细胞数量的增加相一致。在这些时间点，圆肌层和纵肌层内的肥大细胞数量显著增加。此外，高血糖动物也表现出MPO活性和PMN细胞的增加，这与正常血糖动物的值相当。正常血糖和高血糖动物之间没有显著差异，这表明糖尿病队列的炎症变化很可能不是由高血糖状态引起的。然而，我们不能排除高血糖状态也有助于这些情况的严重性，但解决这个问题超出了本研究的范围。在BB-DP动物中的发现让人想起在儿科FD患者的胃窦活组织检查中发现的一些改变，其中粘膜肥大细胞计数的增加与运动障碍显著相关。29炎症类型为低级别炎症，因为在这些动物的胃底活检中没有发现瘢痕组织或肉眼可见的粘膜病变。
先前三硝基苯磺酸诱导大鼠模型的数据表明，炎症可导致小肠肠神经系统的氮能功能受损。13在该模型中，由于局部炎症导致nNOS蛋白表达缺失，小肠动力被破坏。在本研究中，分别在不同时间点进行了L-NAME缺失和存在的肌肉条状实验。但70日龄和220日龄的BB大鼠氮能弛豫受损，这与220日龄时总弛豫明显下降有关。
Western blot分析证实BB-DP动物近端胃nNOS表达在220天下降，但在30和70天没有。虽然nNOS表达在70日龄时没有改变，但我们在这个时间点确实发现氮能弛豫受损。这可以解释为炎症改变可以在不损失nNOS蛋白的情况下损害nNOS功能。30.既往资料显示，在结肠炎动物模型中，炎症状态改变导致iNOS表达增加与nNOS表达减少相关。31我们发现BB-DP和BB-DPH大鼠iNOS蛋白水平均显著升高，这可能是由局部炎症引起的。iNOS水平升高可以部分解释nNOS蛋白的丢失，这是胃功能受损的基础。
与蛋白质水平的表达相比，在我们的模型中，nNOS和iNOS的mRNA表达均未发生显著变化，这表明变化主要发生在翻译水平。虽然我们不能排除在转录和转录后水平上的调控被改变，但已经提出了几种机制，通过这些机制iNOS和nNOS在蛋白质上增加，但在mRNA水平上保持不变。先前的数据已经表明，nNOS具有复杂的转录调控作用，多个mRNA剪接变体会转译为相同的nNOS蛋白。25反义RNA转录本、RNA结合蛋白和蛋白酶体活性可以改变nNOS和iNOS蛋白的表达量。尺码
在30日龄时，炎症改变和nNOS损失都不存在，这解释了为什么这些动物的氮能功能尚未受损。在更早的时间点，炎症改变和氮能神经元的丧失都出现了，这可能是胃中观察到的肌肉功能受损的潜在原因。
在所有时间点，两组之间PGP9.5的表达没有差异，这表明神经元的总数被保留了下来，并反驳了由炎症变化引起的非特异性神经元损伤。
康等35描述了胃内注射醋酸诱发胃溃疡后大鼠调节功能障碍和胃过敏的模型。溃疡周围的黏膜和固有肌层均有损伤，但肌肉收缩力无差异。虽然行为上的改变表明，在诱导调节时，患者的不适和疼痛增加，但这些变化只在溃疡诱导后的14天内描述。另一个研究小组的实验表明，在新生儿期用碘乙酰胺刺激胃也会增加诱导后8-10周的胃敏感性和调节障碍。36两项研究都证实，胃功能的变化可以在动物模型中模仿，炎症可以对胃功能产生急性或长期影响。然而，这些诱导损伤或毒性模型不太可能反映在人类FD中观察到的感染后调节功能受损的临床情况。
与胃近端氮能神经调节胃调节的既定作用相一致，我们在血糖正常的BB-DP大鼠中证实了胃调节功能受损的存在。我们认为这一缺陷可归因于胃底水平氮能控制的丧失，因为L-NAME对调节没有抑制作用。延迟胃排空不太可能在这一观察中起作用，因为这在这些动物中是正常的。14正如Janssen此前报道的那样等23，排空率的变化(我们使用的膳食有80-140分钟的半排空时间)不太可能影响住宿，因为这是在仅20分钟的短时间内测量的。这些观察结果证实，血糖正常的BB-DP大鼠可以被认为是炎症相关胃调节功能受损的自发动物模型，并为进一步的机制和治疗研究提供了一个有吸引力的模型。然而，我们无法找到炎症变化和胃调节变化之间的显著直接线性相关。这可能是由IGP技术测量的胃调节变化中综合了多个控制因素的事实来解释的。
与之前的观察相似，与对照大鼠相比，高血糖动物的氮能功能也受到干扰。BB- dp大鼠的潜在病理生理学可能与高血糖BB大鼠胃底观察到的病理生理学不同，代谢功能障碍更可能是关键机制。20.
功能性胃肠功能障碍患者可发现肠通透性增加和低级别炎症。37我们之前描述过BB-DP大鼠在黏膜炎症之前有肠通透性增加，随后是氮能神经功能的丧失。22这些数据表明，通透性增加促进局部炎症，可能经壁进展，并影响氮能神经功能。虽然这些发现是在小肠中，但先前的数据表明，BB大鼠模型在糖尿病发展之前胃通透性也增加了。38这表明，胃通透性的增加是一个潜在的触发器，可能导致低级别炎症和氮能神经元的损失。然而，这方面超出了本研究的范围。
总之，尽管之前在高血糖的BB大鼠中观察到肠道和胃窦水平的氮能功能受损，但我们首次报道了正常血糖的BB- dp大鼠也出现了胃底肌肠丛水平的氮能运动控制受损。这是在同样的动物中观察到的胃调节功能受损的基础。这些改变的诱发因素似乎是低级别炎症，伴随着肥大细胞的增加，随之而来的是nNOS表达的减少。这些发现让人联想到先前对带有调节功能受损的感染后FD患者的观察，这些患者也提示有持续的低级别炎症。9，11我们的研究结果表明BB- dp BB大鼠是研究炎症诱导胃运动功能障碍的第一个有前途的自发动物模型。
参考文献
补充材料
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脚注
贡献者CV、TV、TM、GDH和HV对实验工作有贡献。CV和TV对统计分析有贡献。CV、TV、PVB、RF和JT参与了论文的撰写和修改。
相互竞争的利益一个也没有。
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