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摘要
客观的戊型肝炎病毒(HEV)感染可在免疫功能低下的患者中发生慢性过程，可能导致肝硬化和肝衰竭。利巴韦林(RBV)是目前许多患者的唯一治疗选择，但治疗失败可能与出现独特的HEV聚合酶突变体(G1634R)有关。在这里，我们对慢性戊型肝炎感染期间HEV病毒在宿主内的进化进行了详细的分析。
设计Illumina深度测序检测慢性感染患者HEV基因组的宿主内变异。利用最先进的HEV细胞培养模型在体外研究了新型聚合酶突变体。
结果总之，这些数据表明(1)病毒多样性在患者之间有显著差异，但在未经治疗的慢性戊型肝炎患者中没有表现出重大的个体内短期变化，(2)RBV治疗与病毒异质性的增加有关，而这种异质性在治疗停止时是可逆的，(3) G1634R突变体在治疗前作为少数人群被检测到，这些患者随后未能对RBV治疗取得持续的病毒学应答。(4)除了G1634R之外，在聚合酶区域出现了进一步的显性变异，影响了HEV的体外复制效率。
结论总之，这一宿主内HEV群体进化的首次调查表明，RBV导致治疗患者的HEV突变，并且在RBV治疗期间，病毒群体中出现了不同的突变体。我们还建议，下一代测序可能有助于指导个性化的抗病毒策略。
- E型肝炎
- 慢性肝炎
- 抗病毒治疗
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
戊型肝炎病毒(HEV)等RNA病毒建立了具有高度宿主内变异性的群体，这使它们能够快速适应不断变化的免疫反应。
HEV是急性肝炎的主要原因，但也可在免疫功能低下的患者中建立慢性感染。利巴韦林(RBV)是目前唯一可用的治疗方案。
RBV在体外通过增加病毒RNA依赖性RNA聚合酶的错误率等机制抑制HEV复制。在RBV治疗过程中，HEV聚合酶区域的突变(G1634R)可导致治疗失败。
新的发现是什么?
病毒多样性在患者之间有显著差异，但在未经治疗的慢性戊型肝炎患者中没有表现出主要的个体内短期变化。
RBV治疗与所有开放阅读框架中病毒异质性的增加有关，当治疗停止时，这是可逆的。
G1634R突变体在治疗前的少数人群中被检测到，这些患者随后未能对RBV治疗取得持续的病毒学反应。
在RBV治疗过程中，聚合酶中出现的其他显性变异影响了HEV的体外复制效率。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
对HEV宿主内种群进化的调查表明，RBV引起治疗患者的HEV突变，并且在RBV治疗期间可能出现不同的病毒种群。
下一代测序方法可以诊断性地用于快速识别有治疗失败风险的患者，并预测临床慢性感染患者的治疗结果，并可能成为个性化抗病毒策略的有用工具。
简介
戊型肝炎病毒(HEV)是一种非包膜单链RNA病毒，是全球急性肝炎的常见病因。1，2每年发生300多万例有症状的戊型肝炎病例，估计造成7万人死亡。1已发现四种不同的HEV基因型感染人类。HEV基因型1和2与中低收入国家的水传播疫情有关，仅感染人类。相反，HEV基因型3和4可在各种动物物种中发现，HEV传播给人类的主要途径是通过食用未煮熟的肉类。1，3.，4现在已经确定，免疫功能低下患者可能会出现长时间的戊型肝炎病毒血症，甚至慢性戊型肝炎病程，这可能导致肝硬化和肝衰竭。5，6
RNA病毒的发病机制、流行病学和进化受到病毒种群组成的影响。7遗传多样性是通过高突变率实现的，因此产生了准物种种群，这可能会导致对抗病毒药物的适应，潜在地诱导耐药性或增强病毒适应性。8此外，病毒多样性代表了一种逃避成功免疫反应的潜在机制，而反过来，免疫压力可能推动病毒进化。9对于HEV，更大的宿主内异质性与进化到慢性有关。10慢性戊型肝炎中HEV的免疫压力可能较弱，HEV特异性t细胞反应几乎检测不到，但各种细胞因子和趋化因子在急性和慢性戊型肝炎中升高，与疾病活动性和肝病进展相关。10，11然而，在接受治疗的持续感染患者中，HEV的进化模式和速度目前尚不清楚。
利巴韦林(RBV)单药治疗目前被认为是慢性戊型肝炎患者的治疗选择。12，13虽然大多数患者清除HEV，但在RBV治疗3-5个月后，治疗失败或治疗后复发的病例已被报道。14 - 16最近，有报道称，在RBV治疗过程中，在HEV聚合酶c端区域(G1634R)选择了一个独特的HEV突变体。G1634R突变体对RBV仍然敏感，但在体外对病毒的复制适应性增强。17因此，G1634R突变体的选择可能导致治疗失败。目前尚不清楚，在治疗开始之前，是否有一小部分病毒种群存在这种特殊的突变。
RBV通过耗尽细胞GTP池来抑制HEV的复制。18RBV的其他作用模式可能在患者中很重要，因为霉酚酸抑制肌苷-5 ' -单磷酸脱氢酶(IMPDH)并不总是能预防hev感染的实体器官移植(SOT)受者的慢性。6RNA病毒宿主内群体被认为存在于基因组错误阈值的边缘，rbv诱导的额外突变超过阈值可能导致一系列错误灾难，导致病毒灭绝。19，20.在这里，我们假设rbv诱导的突变增加可能与HEV治疗结果有关，正如对各种其他病毒所显示的那样。21
本研究的目的是通过Illumina深度测序研究慢性肝炎患者RBV治疗前和治疗期间所有开放阅读框架(orf)中的HEV基因组进化。此外，我们希望确定G1634R突变体是否在治疗前就已经存在，作为对RBV治疗没有实现持续病毒学应答的少数人群。最后，我们旨在探索在治疗过程中是否选择了额外的氨基酸变化，以及这些突变是否对体外HEV复制有影响。
研究对象、材料和方法
研究对象
所有患者均于2008年至2015年在汉诺威医学院招募。总体而言，纳入了12例慢性戊型肝炎患者，其中至少有2份储存的血浆样本可检测到HEV RNA。此外，对于rbv治疗的患者，我们的目标是在治疗期间研究至少一个病毒血症样本，对于没有实现持续病毒学应答的患者，治疗后需要提供HEV rna阳性样本。RBV每天口服两次，初始剂量为600 - 1000mg，根据患者的血红蛋白水平和合并症，如前所述。15如果血红蛋白水平下降和/或患者出现与贫血相关的症状，则减少剂量。每次随访均检测天冬氨酸转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和HEV RNA病毒血症。采用万泰HEV IgG ELISA法检测抗HEV状态。研究方案符合机构审查委员会的伦理准则。这项研究得到了德国汉诺威汉诺威医学院伦理委员会的批准(记录930-2011)，它符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则。所有患者均书面知情同意参加本研究。研究人员还从汉诺威医学院招募了健康的志愿者。
细胞培养
人类Huh7.5肝癌细胞(由Charles Rice教授提供)保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM;Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国)补充10%胎牛血清(FBS;Invitrogen)， 1%非必需氨基酸(Invitrogen)， 100µg/mL链霉素(Invitrogen)和100 IU/mL青霉素。细胞保存在37°C的5% (v/v) CO中2孵化器。
HEV的构建、克隆和体外转录
含HEV Kernow-C1 p6亚基因组克隆的质粒构建(GenBank登录号:JQ679013)序列加上一个gagasia荧光素酶报告基因(p6-Gluc)被用于生成HEV体外转录本，如前面所述，并附加了一个覆盖步骤(m7G Cap Analog, Promega, Madison, Wisconsin, USA)。22，23使用定点诱变PCR或gBlocks基因片段引入单核苷酸变异(IDT, Coralville, Iowa, USA)(详细信息和引物序列可根据要求提供)。
HEV复制试验
如前所述，HEV亚基因组rna通过电穿孔转染到细胞中。24简而言之，5×106细胞/mL Huh7.5细胞400µL细胞ix含有2 mM ATP和5 mM谷胱甘肽与3µg p6-Luc亚基因组HEV RNA混合。电穿孔采用Gene Pulser系统(Bio-Rad, Munich, Germany)进行。细胞立即转移到12.1 mL完整的DMEM中，50µL含有2×104将细胞/孔接种到96孔板上。4小时后，添加50 μ L含指定浓度RBV的完整DMEM，或仅添加完整DMEM。在转染后72小时，通过测定96孔板上清中的荧光素酶活性来确定病毒复制。
荧光素酶报告试验
如前所述，评估HEV亚基因组复制子(SGR)复制。25简而言之，在96孔白色平底微孔板中每孔加入20µL上清，然后使用微孔板阅读器(CentroXS3 LB960, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)以腔肠嗪为底物检测HEV编码高斯荧光素酶的发光。
统计数据
使用GraphPad Prism V.6.0b (GraphPad Software, La Jolla, California, USA)分析数据。单核苷酸变异(SNV;个体间的单核苷酸变异)在接受RBV治疗的患者和未接受RBV的患者之间进行Mann-Whitney U检验。p<0.05为显著性(*p<0.05;* * p < 0.01;***p<0.001或****p<0.0001)。采用GraphPad Prism 5软件计算剂量-反应曲线。
结果
病人的特点
我们研究了12例慢性HEV基因型3感染患者(基因型3c 8例，基因型3f 3例，基因型3e 1例)。患者队列的中位年龄为46岁(范围14-70岁)，其中8例为男性。12名病人中有11名接受器官移植(表1)．在减少免疫抑制药物治疗后，3例患者清除了HEV，而9例患者开始了RBV抗病毒治疗。RBV治疗在5例患者中成功，在4例器官移植受者中失败(患者# 1-4)。初始免疫抑制药物列于表1包括皮质类固醇、增殖抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂和雷帕霉素的机制靶点(mTOR)抑制剂。免疫抑制方案随着时间的推移根据患者的临床参数进行调整。
慢性戊型肝炎患者宿主内HEV种群的演变
RNA病毒存在于基因相关但不同变体的多样化种群中。对于HEV，在单一时间点确定的病毒异质性与感染结局相关。10在这里，我们首先对未接受RBV抗病毒治疗的患者至少两个时间点的HEV ORF1区RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)编码进行Illumina深度测序，分析宿主内HEV病毒种群进化(图1)．同义(沉默)和非同义(氨基酸替换)snv的显著个体间变异是明显的(图1)．然而，在一个特定的患者(#1，#4，#8，#9，#10，#11)中，在开始RBV治疗之前以及从未接受过抗病毒治疗的患者中，大多数患者的HEV人群组成在几周甚至几个月内相当稳定。
慢性感染戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框1 (ORF1)区域随时间变化而不受利巴韦林(RBV)影响的总位点数量的变化描述了本研究包括的6名慢性感染患者中出现非同义(黑线)和同义(灰线)单核苷酸变异(snv)的时间过程。
RBV对HEV ORF1 RNA依赖性RNA聚合酶编码异质性的影响
为了确定RBV治疗是否对病毒异质性有影响，我们通过下一代测序方法比较了接受RBV治疗和未接受RBV治疗的慢性戊型肝炎患者中显示非同义和同义snv的位点数量的差异。事实上，接受RBV的患者在这两个同义词(图2A)和非同义的(图2B) SNVs与未治疗患者时抽取的样本进行比较。这一发现表明RBV治疗导致HEV患者核苷酸替代率增加。接下来，我们分析了三名未获得持续病毒学应答的患者(患者#1、#2和#4)的同义和非同义SNV总数的长期演变。对于这些患者，在RBV用药前、期间和之后均可获得样本(图3)．感染过程中，1号患者的HEV RNA拷贝数从5.6×10不等51.09×107，来自1.66×10的2号患者41.2×1074号病人来自1.54×1046.75×108RNA拷贝数/mL。总的来说，在RBV治疗过程中，同义和非同义SNV都在逐步增加，表现出同义SNV替代的位点数量变化较大(图3)．患者1在RBV停止后出现明显的SNV下降，患者2在治疗3-6个月后逐渐明显下降，无论是同义SNV还是非同义SNV (图3A, B).患者4号在RBV治疗的第二个疗程中snv明显增加;然而，在这种情况下，没有处理后的样品(图3C).在所有3例患者中，核苷酸取代的发生主要是由转变引起的，即嘌呤-嘌呤或嘧啶-嘧啶交换，而核苷酸转换(嘌呤-嘧啶或嘧啶-嘌呤取代，图3a - c)。总之，对个别患者治疗期间和治疗后病毒进化的分析表明，随着时间的推移，snv的增加与RBV的持续给药相关。此外，当停止治疗时，rbv诱导的突变似乎是可逆的。
利巴韦林(RBV)对慢性感染患者宿主内病毒群体中戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框1 (ORF1)区域异质性的影响比较实体器官移植患者中戊型肝炎病毒宿主内群体中显示同义(A)和非同义(B)单核苷酸变异(SNVs)的核苷酸位点总数。开圈表示患者在接受RBV或其他抗病毒治疗之前和期间可用样本的分析。黑点表示RBV治疗期间在患者中发现的HEV ORF1中snv的数量。横柱表示中位数，Mann-Whitney U检验检验显著性(***p<0.001;* * * * p < 0.0001)。
在三个慢性戊型肝炎病毒(HEV)感染的实体器官移植受者经历利巴韦林(RBV)治疗失败时，随着时间的推移，显示核苷酸取代的位点数量的过程。所示为三名慢性感染患者(A, 1号患者;B, 2号病人;C, 4号病人)。黑柱表示从第0个月的第一次RBV剂量开始的RBV治疗持续时间。
在对RBV治疗未达到持续病毒学应答的患者中，不同的非同义snv的时间过程
接下来，我们分析了病毒异质性和通过深度测序检测G1634R突变是否可以预测RBV治疗的后续反应。在应答患者和对RBV治疗未达到持续病毒学应答的患者中检测到的同义和非同义snv数量没有显著差异(见在线)补充图S1)。在大多数清除HEV感染的患者中，G1634R突变无法被识别或在病毒人群中存在于非常低的水平。在两名患者中，1634号位置的精氨酸从一开始就已经是优势菌株。然而，在治疗失败的患者中，治疗期间选择的G1634R突变体在患者1号和患者2号治疗前作为少数人群被检测到(图4)．深度测序显示，持续RBV治疗到第11个月，G1634R变异逐渐增加，在第11个月，G1634R变异占HEV人群的三分之二以上(图4A).在2号患者中，G1634R变异也随着RBV治疗的进展逐渐增加，直到第9个月(图4B).值得注意的是，G1634R的相对优势在停止RBV药物治疗后约3个月下降，并下降到总人口的三分之一(图4B). G1634R在治疗前已经是3号患者的主要菌株，在治疗期间没有变化(数据未显示)，而在4号患者中，G1634R变体仅在第11个月时在人群中检测到，并且仅为3.4%左右的非常低的频率(数据未显示)。因此，HEV的整体异质性似乎与RBV治疗的反应无关。然而，可能与治疗失败相关的变异可能在抗病毒治疗之前就已经作为少数人群被检测到。
患者样本中戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框架1 (ORF1)某些位置非同义单核苷酸变异的时间过程核苷酸频率的变化(x轴)导致慢性感染患者的主要氨基酸随监测时间的变化(y轴)在图上所示的氨基酸位置上进行了描述。在编码三联中改变的核苷酸下划线。白色条形表示腺嘌呤的比例，浅灰色条形表示鸟嘌呤的比例，深灰色条形表示胞嘧啶，黑色条形表示胸腺嘧啶的数量。(A)在1号患者中发现了3个显性氨基酸改变的位置，在2号患者(B)和4号患者(C)中发现了4个非同义snv。黑色竖线表示利巴韦林(RBV)的给药过程。
除G1634R外，在治疗第5个月时，1号患者在HEV ORF1的c端区域出现了另外两个突变(K1383N和Y1587F) (图4A). RBV药物治疗开始前，变异Y1587F不存在，变异K1383N以极低频率存在(图4A).对于第二个无反应的患者(患者#2)，我们还发现随着时间的推移，HEV聚合酶中有三种额外的氨基酸变化(K1383N, D1384G和V1479I;图4B).与G1634R相似，当RBV停止时，这些变异的选择是可逆的。图4C显示了唯一没有携带G1634R的无应答者(患者#4)的SNV的时间过程。在患者4中，我们观察到患者1 (K1383N和Y1587F)和患者2 (K1383N和D1384G)中先前检测到的三种氨基酸变化。此外，还发现了一种在其他患者中未检测到的变异(K1398R) (图4)．利用克隆测序方法进行连锁分析，利用从病毒异质性最高的时间点获得的扩增子，揭示了单个病毒基因组上已识别变异的不同组合(见在线补充图S2)出现在不同的频率。在这三名患者的病毒种群中，野生型序列不再被检测到。对于1号患者，可以检测到包含所有三种突变的病毒基因组补充图S2A)，而在患者2号和患者4号中检测到几种突变组合，但没有包含所有四种氨基酸变化的病毒基因组(见在线补充图综上所述，G1634R突变在治疗前已被检测到，并在RBV治疗期间成为显性突变。此外，ORF1中的其他氨基酸变化可以在病毒群体中以各种组合出现。
携带snv的HEV亚基因组复制子的RBV敏感性和病毒复制
在我们之前的研究中，G1634R突变体对RBV仍然敏感，但在体外对病毒的复制适应性增强。17在此，我们首次证实了先前描述的G1634R突变体(EC50= 12。9µM, 95% CI 11.91至13.98)引入基因型3复制子具有与HEVp6野生型(wt)复制子相当的RBV敏感性(EC50=13.61 μ M, 95% CI 12.35 ~ 15.00) (图5A)。然而，与野生型相比，G1634R突变导致发光信号增加，这表明病毒RNA复制增加(图5B).在本实验设置中，RBV进一步作为活性病毒RNA复制的对照。因此，在深度测序发现1号患者中靠近G1634R位点的另外两个显性氨基酸变化后，我们还将所有三个突变(K1383N/Y1587F/G1634R)引入HEVp6复制子中，与HEVp6野生型复制子和HEVp6 G1634R复制子相比，研究RBV的敏感性和病毒复制。有趣的是，与野生型或G1634R突变体相比，K1383N/Y1587F/G1634R组合对RBV的敏感性增加50=4.95 μ M, 95% CI 4.47 ~ 5.49) (图5A).转染Huh7.5细胞后，K1383N/Y1587F/G1634R构建体与野生型构建体相比，可以检测到类似的病毒复制(图5B).在2号患者中发现的突变可以观察到类似的表型(K1383N/D1384G/V1479I/G1634R, EC50=3.03 μ M, 95% CI 2.80至3.28)，而在4号患者中发现突变的HEV结构(K1383N/D1384G/K1398R/Y1587F, EC50=11.98 μ M, 95% CI 10.39至13.82)显示出复制水平以及RBV敏感性，如野生型复制子(图5总之，除了G1634R之外，还可以识别出额外的ORF1突变，这些突变取消了改进的复制适应度，并显示出增加的RBV敏感性。
戊型肝炎病毒(HEV)亚基因组复制子SGR野生型(wt)和突变体的利巴韦林(RBV)敏感性和复制适应度在经历RBV治疗失败的患者中确定。(A) RBV对HEVp6 wt复制子的抗病毒活性(实线，EC50=13.61 μ M, 95% CI 12.35 ~ 15.00)， G1634R突变体(虚线，EC50=12.9 μ M, 95% CI为11.91 ~ 13.98)，K1383N/Y1587F/G1634R突变体(虚线，EC50=4.95 μ M, 95% CI 4.47 ~ 5.49)， K1383N/D1384G/K1398R/Y1587F突变体(点虚线，EC50=11.98 μ M, 95% CI 10.39 ~ 13.82)和K1383N/D1384G/V1479I/G1634R突变体(虚线，EC50=3.03µM, 95% CI 2.80 ~ 3.28) Huh7.5中的复制子。(B)转染这5种构建物72 h后Huh7.5细胞的发光读出。作为复制特异性读出的对照，wt复制子用62.5µM RBV处理。
RBV对HEV在ORF2和ORF3基因组区异质性的影响
为了将rbv诱导的突变分析扩展到ORF1中RdRp以外的HEV基因组区域，我们接下来对rbv治疗和未治疗的慢性戊型肝炎患者的ORF2和ORF3区域进行了深度测序(图6)．与ORF1的研究结果一致，接受RBV的患者表现出更多的非同义位点(图6A, C)和同义(图6B, D)分别在ORF2和ORF3中。对于未接受持续病毒学应答的三名患者，ORF2和ORF3中snv总数的长期演变表明，随着时间的推移，snv增加，这也与RBV的管理和ORF1的发现相关(图7；比较图3)．由于每个ORF参考的扩增子大小不同，我们对显示snv的位点数量以及ORF1、2和3之间snv的平均频率(百分比)进行了归一化比较补充图S3A-D)。这些结果表明，在所有基因组区域都可以观察到RBV的突变效应。与未接受RBV治疗的患者样本相比，只有ORF1中同义替换的平均频率没有显著增加(见在线)补充图S3C)。监测三名慢性感染患者ORF2和ORF3中核苷酸频率的变化导致主要氨基酸随时间的改变，发现患者2 (P25S, G71R, P95S和V245I)和患者4 (G38S, A64T, P79S和T324S)的ORF2中有四个突变，另外患者4 (S82N)的ORF3中有一个突变(见在线)补充图S4)。总之，与ORF1描述的结果一致，在HEV ORF2和ORF3中也可以观察到接受RBV的个体患者snv的增加。
利巴韦林(RBV)对戊型肝炎病毒(HEV)开放阅读框架2 (ORF2)和ORF3在慢性感染RBV治疗失败患者宿主内病毒异质性的影响比较患者1号、患者2号和患者4号在RBV治疗前(开圈)和治疗期间(黑点)可用血清样本的时间点在ORF2 (A和B)和ORF3 (C和D)中发现的戊型肝炎病毒宿主内群体中显示同义(A和C)和非同义(B和D)单核苷酸变异(snv)的位点总数。横柱表示中位数，采用Mann-Whitney U检验检验显著性(*p<0.05;* * p < 0.01)。
在三个慢性戊型肝炎病毒(HEV)感染的实体器官移植受者经历利巴韦林(RBV)治疗失败时，随着时间的推移，显示核苷酸取代的位点数量的过程。所示为同义(黑色实线)和非同义(黑色虚线)单核苷酸变异(SNVs)的总数，以及在三名未实现持续病毒学应答的慢性感染患者(a, 1号患者;B, 2号病人;C, 4号病人)。黑柱表示从第0个月的第一次RBV剂量开始的RBV治疗持续时间。
讨论
慢性戊型肝炎是免疫功能低下患者日益严重的问题，在许多病例中，RBV是唯一的治疗选择。最近，据报道，在慢性HEV RBV治疗过程中出现了一种独特的HEV聚合酶突变(G1634R)，显示出增强的复制动态，这可能导致治疗失败和临床长期结果不佳。17在该研究中，通过标准群体测序确定了HEV-G1634R突变体的选择。在这里，我们通过在多个时间点对更大队列患者的HEV基因组进行深度测序，对宿主内HEV病毒种群进化进行了详细分析。我们发现(1)大多数慢性HEV患者的HEV群体组成在几周甚至几个月内是稳定的，尽管患者之间存在差异;(2)RBV治疗与病毒群体异质性的显著增加有关;(3)除了G1634R之外，RBV治疗期间出现了更多的突变体，构成了大多数病毒群体，这影响了HEV的复制效率。
HEV通常引起急性感染，感染宿主的病毒血症持续时间相当短。HEV感染病程延长甚至慢性只发生在引入免疫抑制药物治疗时。然而，以前从未研究过长时间病毒血症期间HEV种群的进化。先前在图卢兹的一项优雅的研究中提出了HEV异质性对慢性感染发展和纤维化进展的潜在重要性。10与该研究一致，我们在这里还观察到不同患者之间HEV人群复杂性的广泛变异性。然而，在随访几个月的特定患者中，HEV多样性保持相当稳定。这一观察结果表明，在这些使用不同类型免疫抑制药物的患者中，免疫压力水平较低。这与我们之前的发现相一致，慢性感染的实体器官移植受者的HEV特异性t细胞反应相当弱，而在急性HEV基因3型感染的免疫正常患者中可以观察到更强的t细胞反应。11一旦确定慢性戊型肝炎感染，需要更多更大规模的研究来更好地确定病毒多样性对疾病进展的重要性。
RBV对广泛的RNA和DNA病毒显示抗病毒活性。26RBV在体外抑制HEV复制已被证明是通过消耗细胞GTP池介导的。18然而，RBV的其他作用模式可能是重要的，因为即使在霉酚酸存在的情况下，患者也可以发展为慢性戊型肝炎，这也抑制了IMPDH，从而改变了细胞GTP池。6我们认为rbv诱导的病毒突变对HEV治疗效果很重要。各种体外研究表明，RBV对GB病毒B、脊髓灰质炎病毒、汉滩病毒和口蹄疫病毒等不同病毒具有诱变特性。的观众然而，很少有研究提出体内证据表明rbv诱导的突变是相关的。最好的研究例子是丙型肝炎，通过每个时间点约30个克隆的PCR产物的直接测序，观察到部分矛盾的结果。31-34然而，对接受RBV单药治疗的患者的深度测序显示，尽管在治疗期间丙型肝炎的核苷酸取代没有总体增加，但更频繁的G-to-A和C-to- u核苷酸转变证明了诱变效应。35我们在这里证明RBV治疗与HEV异质性的增加有关，这表明在治疗过程中核苷酸取代会随着时间的推移而积累。值得注意的是，在停止RBV治疗后，两例患者的这种多样性再次部分下降，进一步支持RBV正在诱导HEV突变，并且这种影响是可逆的。与HCV的研究结果相似，我们还观察到HEV聚合酶的转化比反转多，此外，我们观察到在大多数情况下同义取代比非同义取代多(图1，3.而且7)．35在整个研究的HEV区域中，ORF1、ORF2和ORF3中都发生了核苷酸变化，但没有snv的优先位置——这也与丙型肝炎中的发现一致，其中各自的snv并不局限于先前提出的特定的非结构蛋白，而是在HCV基因组中普遍存在。32，35总的来说，我们的研究结果可能表明，rbv诱导的HEV突变可能导致超过基因组错误阈值，随后发生致命突变，正如其他病毒所显示的那样。19尽管如此，还需要在更多患者中进行进一步的研究，以试图确定病毒下降与rbv诱导的病毒多样性之间的相关性。
在两例未实现持续HEV清除的RBV治疗患者中选择了HEV G1634R突变，该突变体在体外具有更好的复制能力。17我们在这里提供了一个更详细的分析，该变异是如何随着时间的推移在病毒种群中占主导地位的。重要的是，深度测序显示，在1号患者治疗前，G1634R突变体已经作为小群体存在，直到治疗第11个月，该比例逐渐增加，当时G1634R是优势菌株，占HEV群体的三分之二以上(图4A). 2号患者在治疗前也检测到突变株，该患者未能获得持续的病毒学应答(SVR)，在3号患者中G1634R也是整个随访过程中的优势菌株。总的来说，这些数据扩展了我们之前的观察，并表明G1634R的选择可能导致了治疗失败。下一代测序可能用于诊断，以早期识别可能需要替代治疗方法的治疗失败风险的患者。
重要的是，下一代测序显示情况可能更加复杂，因为在一些患者中检测到各种额外的氨基酸变化(图4)．这些变异可能对复制效率有额外的影响图5．在G1634R突变旁边的ORF1区域含有额外突变的病毒结构取消了G1634R病毒改进的复制适应度，并显示出增加的RBV敏感性。必须记住，p6 HEV克隆是一种细胞培养适应的分离物，它可能不能反映在特定患者体内发现的个体优势患者菌株。此外，由于Illumina测序的局限性，即多态性之间没有关联，我们还通过克隆测序方法进行了关联分析，其中单个病毒扩增子克隆到载体中，随后通过标准Sanger测序进行测序。在这里，我们能够在患者#1中识别包含所有三种snv的病毒基因组。虽然没有检测到患者2号和患者4号的全部4个snv的基因组，但在这些人群中也存在多达3个snv的不同组合。
这项研究有几个优点，因为这是第一项通过深度测序评估慢性戊型肝炎患者病毒进化随时间变化的研究。我们可以研究对RBV治疗有持续反应和没有持续反应的患者队列，作为单个患者，我们可以研究多达9个不同的时间点。但是，需要考虑局限性。在常规临床环境下进行血液采样，并根据可用性对样本进行回顾性分析。患者数量仍然有限，需要进行更大的队列研究。此外，不同患者使用不同的免疫抑制方案，特定药物可能会干扰病毒RNA复制，从而影响病毒种群组成。36，37最后，RBV的剂量在患者之间有所不同，甚至在治疗期间根据耐受性、血红蛋白水平和肾功能进行调整。因此，药物接触在个体之间可能是不同的。
总而言之，这一关于HEV宿主内进化的首次调查揭示了不同患者之间的病毒多样性不同，但在未治疗的患者中未显示出主要的个体内短期变异，这表明在免疫功能下降的慢性戊型肝炎患者中，HEV没有主要的免疫选择压力。此外，我们提供了强有力的证据，证明RBV在治疗患者中引起HEV突变，并且在RBV治疗期间可能出现不同的病毒群。下一代测序可能有助于快速识别没有实现持续病毒学反应的风险患者。总的来说，这项研究为更好地理解慢性戊型肝炎的病理生理学提供了新的见解，并可能指导个性化抗病毒策略的开发。
致谢
作者感谢Charles Rice为Huh7.5细胞，Suzanne Emerson为HEV p6克隆和Julia Hinzmann提供出色的技术支持。作者感谢汉诺威医学院所有参与治疗戊型肝炎患者的医生和护士。作者非常感谢所有同意为本研究提供材料的患者。
参考文献
脚注
DT和AG的贡献相当。
ES, CTB和HW共同拥有高级作者身份。
贡献者研究的概念和设计:ES和HW，数据的生成、收集、组装、分析和解释:DT、AG、AR、PB、PVS、SP、AN、BB、RJPB、MPM、MC、CTB，手稿的起草:DT、AG、RJPB、CTB、ES、HW。
资金这项工作得到了德国柏林罗伯特·科赫研究所的资助。ES由Helmholtz感染研究中心和德国教育与研究部(BMBF)通过GINAICO赠款16GW0105提供支持。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准德国汉诺威汉诺威医学院伦理委员会(记录930-2011)。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。