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  • 肠道上皮TRAF6 TLR-independent消炎的功能信号防止DSS-induced结肠炎小鼠

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实验性结肠炎
原文
肠道上皮TRAF6 TLR-independent消炎的功能信号防止DSS-induced结肠炎小鼠
  1. (Katerina Vlantis1,2,3,
  2. Apostolos Polykratis1,2,3,
  3. Patrick-Simon Welz1,2,3,4,
  4. 基尔特•范厕所5,6,
  5. Manolis Pasparakis1,2,3,
  6. 安迪Wullaert1,2,3,7,8
  1. 1科隆大学遗传学研究所,科隆、德国
  2. 2分子医学中心(CMMC),科隆大学,科隆、德国
  3. 3科隆卓越集群在Aging-Associated疾病的细胞应激反应(CECAD),科隆大学,科隆、德国
  4. 4研究生物医学研究所(IRB),巴塞罗那、西班牙
  5. 5炎症研究中心,VIB,根特、比利时
  6. 6生物医学分子生物学、根特大学,根特、比利时
  7. 7医学蛋白质研究,VIB,根特、比利时
  8. 8根特大学生物化学系,根特、比利时
  1. 对应到安迪Wullaert博士医学蛋白质研究,VIB;根特大学生物化学系Technologiepark 927, 9052根特,比利时;andy.wullaert在{}ugent.be博士Manolis Pasparakis, CECAD研究中心研究所遗传学、科隆大学,Joseph-Stelzmann-Str。26日,D50931德国科隆;pasparakis在{}uni-koeln.de

文摘

客观的肠道微生物群调节宿主对肠道炎症,但细胞类型和信号通路策划这个细菌调节肠道内稳态仍然知之甚少。在这里,我们研究了肠道上皮toll样受体的功能(TLR)反应的葡聚糖硫酸钠(DSS)全身结肠炎小鼠模型。

设计我们应用一种体内遗传方法允许肠道上皮细胞(IEC)您删除的关键TLR信号适配器,MyD88和/或TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β(TRIF),以及下游的泛素连接酶TRAF6为了揭示这些TLR信号分子的IEC-intrinsic函数在DSS结肠炎。

结果老鼠缺乏TRAF6 iec显示DSS-induced加剧炎症反应,随后在慢性结肠炎症的发展。抗生素预处理废除了这些老鼠的DSS的易感性增加,表明上皮TRAF6信号途径防止肠道微生物群驾驶过度结肠炎。然而,与上皮TRAF6删除、屏蔽上皮TLR信号同时删除MyD88和TRIF特别是在iec并不影响DSS-induced结肠炎症状。这体内功能对比TRAF6和MyD88 / TRIF删除在iec表明上皮的colitis-protecting影响TRAF6信号并非通常所引发的。

结论肠上皮TRAF6-dependent但MyD88 / TRIF-independent和,因此,TLR-independent信号通路是预防传播的关键DSS-induced结肠炎症的肠道微生物群。此外,我们的实验用小鼠双MyD88 / TRIF删除iec毫不含糊地表明,肠道微生物群触发non-epithelial通常比上皮通常限制DSS结肠炎严重程度。

  • 实验性结肠炎
  • 肠道炎症

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2014 - 308323

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 在无菌的小鼠的研究表明,肠道微生物群的保护作用在葡聚糖硫酸钠(DSS)在小鼠结肠炎。

    • 基因打靶小鼠显示toll样受体(TLR)信号分子,在DSS结肠炎MyD88,搭建起了保护作用。

    • 骨髓移植实验表明,MyD88 / TRIF-mediated TLR信号行为non-haematopoietic细胞保护小鼠免受DSS结肠炎。

    • 不同的细胞类型特异的基因研究应用调制MyD88表明保护性TLR信号在肠道上皮细胞(IEC),在B细胞和骨髓细胞。

    有什么新发现吗?

    • 小鼠IEC-specific MyD88 / TRIF删除显示一成不变的DSS结肠炎严重程度,明确表明微生物群调节结肠炎症通过触发通常驻留在non-epithelial细胞而非iec。

    • 小鼠IEC-specific TRAF6删除显示DSS结肠炎严重程度增加,表明TLR信号,而是TLR-independent TRAF6信号在iec限制急性DSS结肠炎。

    • 微生物群损耗废除过度结肠炎小鼠缺乏肠上皮TRAF6,证明上皮TRAF6信号限制DSS结肠炎结肠通过阻止肠道微生物群加剧DSS-induced上皮损伤后炎症。

    • 这些研究结果建立模型intestinal-immune体内平衡的上皮TLR-independent TRAF6信号阻止微生物群传播结肠炎,细菌侵入粘膜触发器通常在non-epithelial细胞抑制结肠炎严重程度。

    介绍

    维护肠道内稳态取决于受到严格监管的肠道微生物群之间的相声,肠道上皮细胞(IEC)和粘膜免疫和基质细胞。即使管制对肠道微生物群的免疫反应被认为有助于炎症性肠病的发展,1无菌的老鼠已经被证明更容易葡聚糖硫酸钠(DSS)全身的结肠炎,2表明有益作用的微生物群在这个模型结肠炎症。符合这一观察,小鼠缺乏个人toll样受体(TLR),或关键TLR-signalling分子,MyD88,显示对DSS结肠炎敏感性增加,这表明microbiota-induced MyD88-dependent TLR反应防止DSS-induced结肠炎症。3 - 7结合基因小鼠模型显示上皮NF-κB激活防止自发和DSS-induced结肠炎症,8 - 11上述研究集体提出细菌可能直接引发上皮TLR / MyD88-dependent NF-κB激活控制肠道炎症。12

    这个合理的假设是一个优雅的讯问研究显示,老鼠缺乏MyD88特别是在B细胞,但不是老鼠缺乏MyD88 iec,显示增加杀伤力DSS治疗的反应。13此外,限制表达MyD88骨髓细胞中废除MyD88-deficient老鼠DSS结肠损伤的易感性。14这些观察表明,MyD88-mediated保护作用在DSS结肠炎源自B细胞和骨髓细胞而非上皮细胞。另一方面,另一项研究发现,IEC-specific消融MyD88破坏上皮的屏障功能,这样,使敏感老鼠DSS结肠炎,15认为赞成epithelial-intrinsic TLR / MyD88-driven保护结肠炎症。此外,虽然上面的研究集中在MyD88-dependent TLR信号,还TRIF-dependent上皮TLR信号可能有助于保护微生物群的影响在DSS结肠炎。事实上,互惠的骨髓移植实验使用野生型和MyD88 / TRIF双缺陷小鼠显示这样的完全堵塞TLR信号non-haematopoietic足以使敏感细胞小鼠DSS结肠炎。16综上所述,尽管大量的肠道微生物群相邻上皮,上皮TLR的作用引起的腔的微生物群在DSS结肠炎目前仍不清楚。

    在这项研究中,我们通过实验解决TLR信号在DSS结肠炎的肠上皮功能通过使用三个不同的小鼠模型允许IEC-specific删除关键TLR信号适配器MyD88 TRIF,以及下游的泛素连接酶TRAF6。令人惊讶的是,同时IEC-specific删除MyD88和TRIF没有DSS-induced结肠炎小鼠变得敏感。相反,IEC-specific消融TRAF6老鼠更容易呈现DSS-induced急性和慢性结肠炎,显示上皮TRAF6-dependent但TLR-independent信号是至关重要的限制炎症后DSS-induced结肠上皮细胞的损害。

    结果

    缺Epithelial-specific TRAF6 tslp老鼠DSS-induced结肠炎

    为了研究肠道上皮TRAF6的角色,我们走过老鼠窝藏LoxP-flankedTraf6等位基因17与Villin-Cre表达下Cre重组酶基因转移Villin启动子。18这些TRAF6IEC-KO老鼠有效删除TRAF6 iec,但内镜和组织学检查没有透露任何结肠或小肠异常(见在线补充图S1),证明上皮TRAF6基底条件下不控制肠道免疫内稳态。

    评估是否结肠上皮TRAF6调节体内平衡的条件下炎症,我们TRAF6治疗IEC-KO老鼠和他们TRAF6FL控制同窝出生7天2% DSS的饮用水紧随其后两天恢复正常饮用水,9天之后,我们牺牲了老鼠。从第五天开始DSS的治疗,TRAF6IEC-KO老鼠失去体重明显多于对照组,表明上皮TRAF6 DSS-induced结肠炎小鼠(缺乏敏感图1),符合增加减肥TRAF6IEC-KO老鼠增加肠道出血和遭受更严重的腹泻(图1B、C)。内镜在6天的分析表明在TRAF6增强结肠炎症IEC-KO老鼠与TRAF6相比FL同窝出生的,不显示半透明的和更细粒度的结肠墙和腹泻的迹象(图1D)。此外,TRAF6IEC-KO老鼠牺牲9天透露相当短的冒号相比,他们同窝出生仔畜控件(图1结肠部分E)。组织病理学检查显示更严重的上皮细胞侵蚀,杯状细胞和粘膜溃疡、以及增加在TRAF6浸润黏膜和黏膜下白细胞的数量IEC-KO老鼠和他们控制的同胞相比,导致更高的组织损伤和炎症组织学评分(图1F, G),结肠组织化学染色部分与特定的抗体显示高数量的浸润在TRAF6中性粒细胞和巨噬细胞IEC-KO冒号TRAF6相比FL同窝出生的(图1H I),伴随着增强一些炎性细胞因子和趋化因子的表达包括肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1βCCL3和CXCL2 (图1J, K)。综上所述,这些研究结果表明TRAF6IEC-KO老鼠更容易DSS-induced结肠炎,露出一个未知函数iec TRAF6-mediated信号的保护从DSS-induced结肠炎症。

    TRAF6IEC-KO mice are more susceptible to dextran sodium sulfate (DSS)-induced acute colitis. (A) Body weight change, (B) rectal bleeding score, and (C) diarrhoea score of TRAF6FL (n=9) and TRAF6IEC-KO (n=10) mice administered 2% DSS for 7 days followed by 2 days of normal drinking water. (D) Representative endoscopic pictures and mean endoscopic index of colitis severity of TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice after 6 days of DSS treatment. (E) Colon length and (F) representative H&E stained colon cross-sections of TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice at day 9 of the DSS colitis protocol. Bars, 100 μm. (G) Histological tissue damage and inflammation scoring at day 9 of the DSS protocol. (H) Representative pictures and (I) mean number±SEM per 200× magnification field of myeloperoxidase (MPO)-stained neutrophils and F4/80-stained macrophages in TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice at day 9 of the DSS colitis protocol. Bars, 100 μm. (J) Cytokine and (K) chemokine mRNA induction±SEM in colon of TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice at day 9 of the DSS colitis protocol compared to mRNA levels of untreated TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice. All data shown are representative of at least 2 independent experiments. All statistical analyses were performed with unpaired two-sided Student's t tests with unequal variance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    TRAF6IEC-KO老鼠更容易葡聚糖硫酸钠(DSS)全身急性结肠炎。(A)体重变化,(B)直肠出血分数,和(C)腹泻TRAF6得分FL(n = 9)和TRAF6IEC-KO(n = 10)小鼠接种2% DSS 7天之后2天正常的饮用水。内窥镜的图片和(D)代表的意思是内镜指数结肠炎TRAF6的严重性FL和TRAF6IEC-KO老鼠经过6天的DSS治疗。(E)结肠长度和(F)代表)彩色结肠TRAF6的横截面FL和TRAF6IEC-KO老鼠在DSS的9天结肠炎协议。酒吧,100μm。(G)组织学组织损伤和炎症评分在DSS的9天协议。(H)代表图片和(I)平均数±SEM每200×放大的髓过氧化酶(MPO)彩色中性粒细胞和TRAF6 F4/80-stained巨噬细胞FL和TRAF6IEC-KO老鼠在DSS的9天结肠炎协议。酒吧,100μm。(J)细胞因子和趋化因子(K)的mRNA感应±SEM TRAF6结肠FL和TRAF6IEC-KO老鼠在DSS的9天结肠炎协议而未经处理的TRAF6 mRNA水平FL和TRAF6IEC-KO老鼠。所有数据显示代表至少两个独立的实验。所有统计分析与未配对的双面t测试学生的不平等的方差。

    TRAF6IEC-KO老鼠开发DSS治疗后慢性结肠炎

    尽管DSS如何唤起结肠炎的确切机制并不完全清楚,DSS被认为直接杀死iec结肠上皮细胞的损害,其次是再生增殖反应,旨在恢复上皮屏障,这样,限制传播结肠炎症反应。然而,上皮细胞死亡和再生增殖在DSS治疗TRAF6之间是相似的IEC-KO和同窝出生仔畜控制老鼠(见在线补充图S2)。这些观察表明,在TRAF6结肠炎严重程度增加IEC-KO老鼠不能归因于增加IEC死亡,甚至在一个设定的持续严重的炎症,TRAF6-deficient IEC保持他们的能力引起再生反应试图恢复组织内稳态。此外,这一结果表明,而不是在组织维护或修复功能,抗炎作用可能构成的主导因素从DSS结肠炎上皮TRAF6保护。这个假设促使我们评估的角色上皮TRAF6慢性DSS TRAF6治疗结肠炎IEC-KO和TRAF6FL同窝出生的2% DSS 6天之后七周恢复期,在结肠炎严重程度评估内镜以固定时间间隔(图2)符合上述观测显示敏化作用到DSS结肠炎保留iec的再生能力,TRAF6IEC-KO老鼠遭受更严重的急性结肠炎失去超过20%的原来的体重到第十天,但完全恢复减肥后35天左右(图2B)。有趣的是,尽管缺乏体重差异,内镜检查40和54天后开始显示结肠炎症严重TRAF6 DSS治疗IEC-KO老鼠与一个几乎完全愈合结肠TRAF6墙FL动物(图2C, D)组织学检查结肠部分从动物牺牲在60天显示地区严重的粘膜和粘膜下层的免疫细胞浸润伴有明显的炎症反应在TRAF6组织损伤IEC-KO老鼠,而他们只同窝出生仔畜控件显示轻度炎症的迹象在这个阶段(图2E、F)。因此,尽管TRAF6-deficient iec显示类似的凋亡和再生反应在DSS治疗,他们未能限制持续的炎症反应导致慢性结肠炎。这些观察表明,保护结肠上皮TRAF6信号是可有可无的IEC-intrinsic函数,而是限制了DSS治疗后炎症以旁分泌的方式。

    TRAF6IEC-KO mice develop chronic colon inflammation upon dextran sodium sulfate (DSS) treatment. (A) TRAF6FL (n=8) and TRAF6IEC-KO (n=9) mice were administered 2% DSS for 6 days followed by normal drinking water with endoscopies at the indicated time points until day 60 when they were sacrificed. (B) Body weight change and final survival at day 60. (C) Mean endoscopic index of colitis severity of TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice at indicated time points of the chronic DSS protocol. (D) Representative endoscopic pictures from TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice at day 54 of the chronic DSS colitis protocol. (E) Representative H&E stained colon cross-sections of TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice at day 60 of the chronic DSS colitis protocol. Bars, 100 μm. (F) Histological tissue damage and inflammation scoring at day 60 of the chronic DSS protocol. All data shown are representative of two independent experiments. All statistical analyses were performed with unpaired two-sided Student's t tests with unequal variance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    TRAF6IEC-KO小鼠慢性结肠炎症在葡聚糖硫酸钠(DSS)治疗。(一)TRAF6FL(n = 8)和TRAF6IEC-KO(n = 9)小鼠接种2% DSS 6天之后,正常饮用水内窥镜检查在指定的时间点,直到一天60时牺牲了。(B)体重变化和最终生存60天。(C)的意思是内镜指数结肠炎TRAF6的严重性FL和TRAF6IEC-KO小鼠慢性DSS表示时间点的协议。(D)代表从TRAF6内窥镜的图片FL和TRAF6IEC-KO老鼠在慢性DSS的54天结肠炎协议。(E)代表)彩色结肠TRAF6的横截面FL和TRAF6IEC-KO60天的小鼠慢性DSS结肠炎协议。酒吧,100μm。(F)组织学组织损伤和炎症慢性DSS得分在60天的协议。所有数据所代表的两个独立的实验。所有统计分析与未配对的双面t测试学生的不平等的方差。

    肠道微生物群驱动增加DSS-induced TRAF6结肠炎IEC-KO老鼠

    因为TRAF6细菌TLR介导反应触发以及宿主因素如IL-17 TGFβ,19,20.多重刺激可能引发上皮在DSS TRAF6结肠炎的保护功能。为了区分细菌和宿主factor-mediated TRAF6信号,我们也调查了上皮TRAF6是否缺乏敏感后DSS结肠炎小鼠肠道微生物群的消耗。为此,我们对待TRAF6FL和TRAF6IEC-KO小鼠与广谱抗生素(AB)减少管理前的肠道微生物群腔的DSS。虽然AB-treated TRAF6IEC-KO老鼠后失去了更多的重量比他们的控件(DSS图3),参数反映结肠炎症,如粪便一致性、直肠出血,结肠长度、以及内镜和组织学评价结肠炎严重程度之间比较microbiota-depleted TRAF6IEC-KO老鼠和他们AB-treated控件(图3B、H)。实际上,而TRAF6IEC-KO老鼠窝藏正常肠道微生物群显示更多的隐血和腹泻,更短的结肠内窥镜和更多的可见结肠炎在DSS TRAF6治疗比他们的控制FL老鼠,这些差异都不是,或更少,明显在microbiota-depleted TRAF6IEC-KO的老鼠相比,它们各自的控制(图3B, E)。因此,在microbiota-depleted条件下,上皮TRAF6-deficiency不授予DSS-induced结肠炎易感性增加,表明肠道细菌本身触发保护上皮TRAF6信号。

    Excessive dextran sodium sulfate (DSS)-induced acute colitis in TRAF6IEC-KO mice is driven by the gut microbiota. TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice were treated with antibiotics (+AB) or were left untreated (−AB) for 4 weeks before administration of DSS. (A) Body weight change, (B) rectal bleeding score, and (C) diarrhoea score of TRAF6FL −AB (n=8), TRAF6IEC-KO −AB (n=10), TRAF6FL +AB (n=8), TRAF6IEC-KO +AB (n=11) mice that were administered 2% DSS for 7 days followed by 2 days of normal drinking water. For A–C, asterisks above the data points indicate statistically significant differences between TRAF6FL −AB and TRAF6IEC-KO −AB mice, while asterisks below the data points indicate statistically significant differences between TRAF6FL +AB and TRAF6IEC-KO +AB mice. (D) Colon length, (E) mean endoscopic index of colitis severity and (F) representative endoscopic pictures of indicated mice at day 9 of the DSS colitis protocol. (G) Representative H&E stained colon cross-sections of indicated mice, and (H) histological tissue damage and inflammation scoring at day 9 of the DSS colitis protocol. Bars, 100 μm. All data shown are representative of two independent experiments. All statistical analyses were performed with unpaired two-sided Student's t tests with unequal variance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    过度的葡聚糖硫酸钠(DSS)在TRAF6全身急性结肠炎IEC-KO老鼠是由肠道微生物群。TRAF6FL和TRAF6IEC-KO老鼠使用抗生素治疗(+ AB)或不及时治疗前4周(−AB) DSS。(A)体重变化,(B)直肠出血分数,和(C)腹泻TRAF6得分FLTRAF6−AB (n = 8)IEC-KOTRAF6−AB (n = 10)FLTRAF6 + AB (n = 8)IEC-KO+ AB (n = 11)老鼠注射2% DSS 7天之后2天正常的饮用水。得了,星号以上数据表明TRAF6之间的显著差异FL−AB和TRAF6IEC-KO−AB老鼠,而星号以下数据表明TRAF6之间的显著差异FL+ AB和TRAF6IEC-KO+ AB老鼠。(D)结肠长度、(E)的意思是结肠炎严重程度和内镜指数(F)代表内窥镜的图片显示在DSS的9天结肠炎小鼠协议。(G)代表)彩色冒号表示老鼠的横截面,和(H)组织学组织损伤和炎症评分在DSS的9天结肠炎协议。酒吧,100μm。所有数据所代表的两个独立的实验。所有统计分析与未配对的双面t测试学生的不平等的方差。

    抗炎作用的上皮TRAF6 TLR信号的信号在DSS结肠炎是独立的

    获得的结果从AB-treated小鼠微生物群的可能性可以保护小鼠免受DSS-induced结肠炎通过触发TLR-dependent iec的保护性反应。另外,TLR-independent host-derived上皮TRAF6信号可能防止肠道微生物群在DSS结肠炎驾驶non-epithelial细胞炎症反应。也的确,在后一种情况下,肠道微生物群的缺席将废除TRAF6的敏化作用IEC-KO老鼠DSS结肠炎。区分这两个选项,我们生成的老鼠缺乏上游TLR信号分子MyD88(参见图S3)在线补充或TRIF21在iec,允许直接评估上皮TLR信号在DSS结肠炎的作用。无论是MyD88IEC-KO也不是TRIFIEC-KO老鼠DSS-induced结肠炎严重程度的差异与各自的控制相比(见在线补充S4数据和S5),证明无论是MyD88-dependent还是TRIF-dependent TLR信号在iec从DSS-induced保护结肠炎症至关重要。

    然后,我们调查是否完全堵塞TLR信号在iec影响DSS-induced结肠炎症通过对比DSS结肠炎小鼠的反应缺乏专门在iec (MyD88 MyD88和TRIFIEC-KO/ TRIFIEC-KO)MyD88FL/ TRIFFL同窝出生的。为了直接比较这个上皮细胞与上皮TRAF6 TLR堵塞效果不足,我们也包括年龄和sex-matched TRAF6FL和TRAF6IEC-KO老鼠关在同一个笼子里。此外,为了更容易地探测到增强的DSS易感性,在这个实验中,我们应用一个轻度结肠炎协议管理只有1% DSS的饮用水。令人惊讶的是,DSS-treated MyD88IEC-KO/ TRIFIEC-KO小鼠显示出类似的减肥,直肠出血和腹泻相比,他们同窝出生仔畜控件(图4MyD88 A, C)IEC-KO/ TRIFIEC-KO和MyD88FL/ TRIFFL老鼠也并没有显示出相当大的差异在结肠长度牺牲后9天(图4D)。此外,组织病理学评分的小鼠的结肠部分牺牲一天9未能揭示相当大的结肠组织损伤或炎症MyD88之间的差异IEC-KO/ TRIFIEC-KO和MyD88FL/ TRIFFL老鼠(图4E、F)。相比之下,TRAF6IEC-KO老鼠遭受更严重的DSS-induced结肠炎TRAF6相比FL同窝出生的,而且MyD88FL/ TRIFFL和MyD88IEC-KO/ TRIFIEC-KO老鼠(图4F)。当老鼠也获得了类似的调查结果处理2% DSS(数据未显示)。因此,完全消融在iec TLR信号并不使敏感老鼠DSS-induced结肠炎。此外,这一结果表明,观察保护作用的上皮TRAF6结肠炎症的信号在这个模型独立于MyD88 / TRIF-mediated TLR信号。

    MyD88IEC-KO/TRIFIEC-KO mice are not more susceptible to dextran sodium sulfate (DSS)-induced acute colitis. (A) Body weight change, (B) rectal bleeding score, and (C) diarrhoea score of TRAF6FL (n=8), TRAF6IEC-KO (n=8), MyD88FL/TRIFFL (n=7) and MyD88IEC-KO/TRIFIEC-KO (n=6) mice administered 1% DSS for 7 days followed by 2 days of normal drinking water. For A–C, asterisks indicate statistically significant differences between TRAF6FL and TRAF6IEC-KO mice. (D) Colon length, (E) histological tissue damage and inflammation scoring and (F) representative H&E stained colon cross-sections of indicated mice at day 9 of the DSS colitis protocol. Bars, 100 μm. All data shown are representative of two independent experiments. All statistical analyses were performed with unpaired two-sided Student's t tests with unequal variance.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    MyD88IEC-KO/ TRIFIEC-KO老鼠不是更容易葡聚糖硫酸钠(DSS)全身急性结肠炎。(A)体重变化,(B)直肠出血分数,和(C)腹泻TRAF6得分FLTRAF6 (n = 8)IEC-KOMyD88 (n = 8)FL/ TRIFFL(n = 7)和MyD88IEC-KO/ TRIFIEC-KO(n = 6)小鼠接种1% DSS 7天之后2天正常的饮用水。得了,星号指示TRAF6统计上显著的差异FL和TRAF6IEC-KO老鼠。(D)结肠长度、(E)组织学组织损伤和炎症评分(F)代表)彩色结肠截面表示老鼠的DSS的9天结肠炎协议。酒吧,100μm。所有数据所代表的两个独立的实验。所有统计分析与未配对的双面t测试学生的不平等的方差。

    讨论

    在这里,我们表明,IEC-specific删除MyD88和TRIF没有增加DSS-induced结肠炎易感性的老鼠。这个结果是令人惊讶的,一些研究显示,没有更严重的DSS结肠炎肠道微生物群,2TLR信号,3 - 6,22或上皮NF-κB信号,9 - 11共同导致了一个广泛的假设microbiota-induced TLR信号在iec保护小鼠免受DSS-induced结肠炎。12尽管研究表明一个上皮屏障功能受损,更严重的DSS结肠炎小鼠上皮MyD88消融强化了这一假说,15我们的研究结果提供了明确的遗传证据表明肠道微生物群不协调保护作用DSS-induced结肠炎通过触发上皮TLR反应。我们的结果,因此,研究表明,支持保护MyD88信号在DSS结肠炎在B细胞,防止系统性传播肠道细菌,以及骨髓细胞,启动再生反应的上皮细胞所必需的DSS损伤后组织修复。13,14此外,而骨髓嵌合体实验表明双MyD88 / TRIF radio-resistant细胞缺乏足够的感光DSS结肠炎小鼠,16我们的观察排除上皮的作用MyD88 / TRIF信号表明,这一现象可能是由TLR信号non-epithelial基质细胞。因此,连同上面的研究,我们的研究结果支持模型的微生物群入侵对DSS-induced粘膜上皮损伤引发non-epithelial TLR信号细胞协调响应限制细菌的传播,并且作用于上皮细胞旁分泌的方式为了保持组织的完整性。相比之下,epithelial-intrinsic TLR信号不产生至关重要的作用在炎症或保留性反应DSS结肠炎。

    然而,而不是上皮TLR信号,我们发现TLR-independent上皮TRAF6信号阻止DSS-induced过度结肠炎症的发展,是由肠道微生物群。有趣的是,TRAF6最近发现施加一个非常类似的止血功能在树突状细胞(DC),作为MyD88-independent TRAF6信号在DCs至关重要保护小肠微生物群的免疫耐受。23然而,至关重要的身份TLR-independent先天免疫受体通过TRAF6控制肠道内稳态信号在DCs或iec仍不清楚。我们注意到,尽管上皮TRAF6缺陷并不影响IEC生存或扩散,TRAF6IEC-KO老鼠开发DSS治疗后慢性结肠炎症。这表明触发启动上皮TRAF6信号不限制调解DSS结肠炎epithelium-intrinsic功能参与上皮内稳态,而是诱导上皮细胞因子的释放,产生直接或间接的抗炎功能旨在表达下调粘膜DSS-induced损伤后炎症反应。TRAF6-dependent众多细胞因子信号,但是MyD88 / TRIF-independent方式,可能诱发负责在iec等抗炎功能。例如,抑制上皮TGFβ信号表达的显性负TGFβ-RII特别是在iec老鼠DSS结肠炎的敏感性增加。24虽然TRAF6只是参与TGFβ-induced信号通路的一个子集,19的保护作用,这是合理的上皮在DSS TRAF6结肠炎可以部分被TGFβ信号诱导。此外,一些研究表明,老鼠缺乏IL-17信号无法控制DSS结肠炎症。25日- 27日自从TRAF6介导MyD88 / TRIF-independent信号IL-17,20.一个角色TRAF6在IL-17引起的保护作用是可能的。然而,未来的研究解决各种受体的体内肠道上皮的作用开始TRAF6-dependent信号将被要求披露重要的身份代理负责启动保护上皮TRAF6结肠炎症的信号。

    综上所述,本研究增加了我们理解microbiota-host交互控制肠道内稳态。我们的观察上皮MyD88 / TRIF消融不使敏感DSS结肠炎明确表明IEC-intrinsic TLR信号不需要限制DSS-induced结肠炎症,并支持这一概念,TLR / MyD88信号行为non-epithelial细胞,如B细胞、骨髓细胞和间质细胞,促进康复DSS-induced受伤。然而,类似于他们的小肠稳态效应作用在DCs, TRAF6-dependent信号通路在iec限制DSS-induced受伤后结肠炎症。与MyD88 / TRIF缺陷的影响的比较表明,临界TRAF6-dependent上皮通路控制DSS结肠炎不是由TLR触发。在一起,我们的观察表明,肠道微生物群触发TLR-dependent和TLR-independent稳态信号通路在不同细胞类型的保护肠道内稳态。进一步识别这些microbiota-induced通路和细胞目标将宝贵的微生物群在理解的机制影响慢性肠道炎症的发病机制。

    材料和方法

    老鼠

    TRAF6和TRIF-floxed老鼠已经被描述。17,21我们生成MyD88-floxed使用基因打靶小鼠同源重组在Bruce-4胚胎干细胞来自C57Bl / 6小鼠28如网上所示补充图S3使用过程描述。29日生殖系传输嵌合体生成使用胚胎干细胞携带各自的目标基因。Flp-Deleter转基因老鼠了30.以特许权FRT-flanked新霉素选择磁带,然后用villin-Cre老鼠繁殖18在iec删除相应的基因。Flp-Deleter和villin-Cre老鼠backcrossed C57Bl / 6为至少10后代遗传背景。在所有的实验中,co-housed同胞携带LoxP-flanked等位基因,但不表达Cre重组酶,被用作控制。在这项研究中使用的老鼠被安置在单独的通风笼在特定的无菌动物设施在科隆大学遗传学研究所。所有动物进行了程序按照欧洲、国家和机构的指导方针和协议,被当地政府当局批准。

    感应和DSS结肠炎的临床评价

    已到八周大sex-matched co-housed同窝出生接种1%或2% DSS (36-50 kDa;议员生物医学)的饮用水随意连续7天,其次是2天正常的饮用水。生存和临床参数,如减肥、直肠出血和腹泻每天监测。便血的外观是衡量haemoccult测试(贝克曼库尔特),并给定一个从0到4分,定义如下:0没有血液;2积极haemoccult;和4的总出血。腹泻的严重程度是给定一个从0到4分,定义如下:0格式良好的颗粒;2馅饼和semiformed凳子;和4对液体粪便。所有临床生长残痕进行盲评。后期,整个结肠肛门被撤盲肠,和结肠长度测量作为炎症的一个标志。

    抗生素治疗,1 g / L氨苄青霉素(ICN生物医学),1 g / L新霉素(σ),0.5 g / L meronem(阿斯利康)和0.5 g / L万古霉素(σ)被添加到饮用水从断奶了28天。每隔一天AB-containing饮用水被刷新。

    内镜手术

    监控结肠炎体内,老鼠所使用腹腔内注射ketamin (Ratiopharm) / Rompun(拜耳)和高分辨率miniendoscope表示Coloview(德国)Karl-Storz如前所述。31日均值内窥镜结肠炎严重程度指数(MEICS)被蒙蔽的方式取决于评价粪便一致性、纤维蛋白沉积,血管、半透明和肠壁的粒度。这些炎症的五个不同的参数得到得分从0到3,导致总MEICS从0到15。

    组织学和免疫组织化学

    结肠组织在4%多聚甲醛固定在一夜之间,嵌入在石蜡和4μm部分。细胞死亡是评估在石蜡切片通过TUNEL染色(无出路荧光TUNEL系统,Promega)根据制造商的指示。量化,TUNEL-positive细胞的数量至少在三个不同的200×放大领域从三个不同的截面计算每个鼠标。评估细胞增殖,小鼠腹腔注射100毫克/公斤BrdU牺牲前2 h。疣状与执行anti-BrdU (Chemicon)。量化,BrdU-positive细胞的数量在所有以纵向分组隐窝在至少三个不同的200×放大领域从三个不同的截面每个老鼠都计算在内。染色的巨噬细胞和中性粒细胞,主要抗体F4/80 (Serotec)和MPO (Dako),分别和二级Alexa-coupled抗体(表达载体)。核和4′,复染色6-diamidino-2-phenylindole(向量实验室)。immunefluorescence图片都是用荧光显微镜(莱卡)在同一接触和强度设置。所有组织生长残痕和量化进行盲评。

    组织病理学评价

    专家评估的肠道病理蒙蔽的基因型得分H&E-stained肠道部分基于三个参数的炎症、组织损伤和四个参数和增加这些分数因素占组织受影响的程度,如前所述。32简单,评估组织损伤,三个不同的成绩归功于地穴增生的程度,上皮损伤/侵蚀和水肿(每个从0到3 0缺席,1轻微,2中等和3严重)。评估炎症,三个不同的分数是由单核细胞的数量,多形核细胞和淋巴细胞细胞(也从0到3,0,1轻微,2中等和3严重)。第四个参数炎症占炎性浸润的位置:0,1粘膜、粘膜下,3透壁的扩展到肌层和浆膜,和4分散。这些组织损伤或炎症的总和成绩然后乘以一个系数根据组织受影响的部分:1,< 10%;2、10% - -25%;3、25% - -50%;4,> 50%。这半定量的综合组织病理学评分系统导致组织损伤和炎症得分从0到36和0到48岁。

    南部的印迹

    10微克的基因组DNA与指定的限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶上分离和转移到硝基。杂交进行表示32P-labelled调查。

    IEC隔离和免疫印迹

    iec分离肠道组织的顺序孵化1毫米二硫苏糖醇(德勤)和1.5毫米EDTA的解决方案,和蛋白质提取物是从iec准备如前所述。33蛋白质的提取分离,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)凝胶和转移到Immobilon-P聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔)。探讨了膜与主要抗体anti-TRAF6 (MBL)国际集团公司,anti-α-tubulin(σ),anti-MyD88 (ProSci合并),反对环保荧光蛋白(GFP) (Biozol)。膜与二次孵化HRP-coupled抗体(通用电气医疗集团,杰克逊ImmuneResearch)和发展与化学发光检测底物(热科学)。

    定量实时聚合酶链反应

    总RNA从结肠孤立使用试剂盒(表达载体),互补脱氧核糖核酸制备上标(表达载体)和分析通过实时PCR TaqMan基因表达分析(应用生物系统公司)。值是正常水平的参考基因真沸点。

    统计数据

    所有数据显示代表意味着±SD,除非另有指示。统计分析未配对的双面学生的t测试使用Microsoft Excel软件,与不平等的方差和显著差异说明如下:* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。

    确认

    我们感谢C Uthoff-Hachenberg, J·冯·大黄酸,E Mahlberg D贝尔,J布赫兹,B hulse和B Kuhnel优秀技术援助。

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    补充材料

    • 补充数据

      仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。

      在这个数据补充文件:

    脚注

    • KV和美联社作家分享第一作者。

    • 议员和addison - wesley的作者分享资深作者。

    • 调整通知本文已经被修正,因为它第一次在网上发布。的从属关系Manolis Pasparakis已经更新。

    • 贡献者这项研究是由啊,KV和国会议员。实验由啊,KV和P-SW。美联社生成MyD88 TRIF-floxed老鼠,GvL生成TRAF6-floxed老鼠。结果分析了啊,KV和国会议员。议员协调这个项目。AW输入从所有其他作者的论文中写道。

    • 资金议员承认伦理委员会(2012 - adg_20120314)的资助下,脱硫(SFB670, SFB829 SPP1656),欧盟委员会(European Commission)(223404年拨款(闸门)和223151 (InflaCare)),德意志Krebshilfe格兰特(110302),否则Kroner-Fresenius-Stiftung和亥姆霍兹联盟(PCCC)。AW的部分支持由洪堡基金会的奖学金P-SW被国际研究生奖学金支持科隆大学遗传学和功能基因组学。从研究Foundation-Flanders AW拥有博士后奖学金(FWO)和支持FWO奥德修斯返回格兰特G.0C49.13N数量。

    • 相互竞争的利益一个也没有。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。