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肝脏病学
原文
CD248/endosialin在慢性肝损伤过程中通过pdgf调控机制调控肝星状细胞增殖
  1. 安妮卡威廉1，
  2. 维多利亚奥尔德里奇1，2，
  3. Debashis Haldar1，
  4. 艾米·J·内勒3.，
  5. 克里斯托弗·J·韦斯顿1，
  6. Ditte赫泽高1，
  7. Abhilok Garg1，
  8. 珍妮的恐惧1，
  9. 加里·M·雷诺兹1，
  10. 亚当·P·克罗夫特3.，
  11. 尼尔·C·亨德森4，
  12. 克里斯托弗·D·巴克利3.，
  13. 菲利普·N·纽瑟姆1，2
  1. 1伯明翰肝脏研究所和伯明翰大学肝脏研究中心，伯明翰、英国
  2. 2伯明翰大学医院NHS基金会，伯明翰、英国
  3. 3.伯明翰大学转化炎症研究中心，伯明翰，西米德兰兹郡、英国
  4. 4爱丁堡大学炎症研究MRC中心，爱丁堡、英国
  1. 对应到Philip Newsome教授，NIHR伯明翰肝脏BRU和伯明翰大学肝脏研究中心，Vincent Drive，伯明翰B15 2TT，英国;P.N.Newsome在{}bham.ac.uk

摘要

简介CD248(内皮素)是一种在成纤维细胞和周细胞上表达的基质细胞标记物。在肝损伤过程中，肌成纤维细胞是肝纤维化基质的主要来源。

客观的确定CD248在啮齿动物和人类肝纤维化发展中的作用。

设计采用免疫染色和定量PCR方法研究了正常、病变人和小鼠肝组织及分离的肝星状细胞(hsc)中CD248的表达。CD248诱导肝纤维化−−/野生型对照用四氯化碳(CCl4)治疗。

结果通过免疫染色和基因表达检测，CD248在正常人和小鼠肝脏中均有表达，但在肝损伤中表达显著增加。在小鼠和人肝脏切片中，CD248与一系列成纤维细胞/HSC标记物共表达，包括desmin、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。CD248仅在分离的原代小鼠和人HSC中表达。CD248的胶原沉积和α-SMA表达减少，但炎症和新血管生成没有减少−−/与野生型小鼠比较4治疗。从野生型和CD248分离出HSC−−/小鼠血小板衍生生长因子受体α (PDGFR-α)和PDGFR-β表达水平相似。正如预期的那样，PDGF-BB刺激诱导野生型HSC增殖，而CD248−−/HSC未表现出对PDGF-BB的增殖反应。CD248中PDGF信号缺失−−/CD248中c-fos表达显著降低证实了HSC−−/与野生型HSC比较。

结论我们的数据表明，CD248的缺失通过对PDGF信号的影响降低了肝纤维化的易感性，使其成为治疗肝损伤的一个有吸引力的临床靶点。

  • 肝星状细胞
  • MYOFIBROBLASTS
  • 纤维化

这是一篇根据创作共用署名(CC BY 4.0)许可条款发布的开放获取文章，该许可允许其他人出于商业用途分发、混音、改编和构建此作品，前提是正确引用原始作品。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2014-308325

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 纤维化关键是肝病学的一个挑战，需要新的治疗方法。

    • 肝星状细胞的活化对肝纤维化的发展至关重要。

    新的发现是什么?

    • CD248在小鼠和人肝纤维化中均有基因和蛋白水平上调。

    • CD248的缺失可减少慢性肝损伤期间肝纤维化的发展。

    • CD248效应是通过在肝星状细胞中取消血小板源性生长因子信号通路介导的。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • CD248是抗纤维化药物的一个有吸引力的靶点，值得在临床试验中考虑。

    简介

    进行性肝纤维化是慢性肝损伤的主要后果之一，与肝星状细胞(hsc)从静止状态活化为增殖的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性肌成纤维细胞有关，这些细胞成纤维细胞产生多种细胞外基质(ECM)蛋白。1对肝纤维化发展的核心机制的鉴定提供了在抗纤维化治疗的发展中靶向这些分子的潜力。

    CD248也被称为内皮素和肿瘤内皮标志物1，是一种跨膜糖蛋白，最初被认为在包括结肠癌在内的不同癌症的内皮细胞上表达2和大脑。3.随后在肿瘤血管系统的血管周NG2+细胞(周细胞)以及间质成纤维细胞上均有表达4以及间充质干细胞。5在癌症环境之外，CD248似乎受到发育调控，在胚胎发育早期出现表达，6尽管它对于发育并不是必需的，因为缺乏cd248的小鼠是可存活和可育的。7

    CD248的表达在成人中基本消失，仅在感染、组织修复时出现6和癌症。5在癌症的环境中，表达CD248的基质细胞与潜在的配体(包括纤维连接蛋白和I型和IV型胶原)相互作用，并通过Matrigel表现出增强的粘附和迁移，支持CD248在肿瘤进展和侵袭中的作用。8CD248在慢性肾脏疾病中的作用已被证实，其中CD248在肌成纤维细胞上表达，并已被证明可作为肾纤维化程度和疾病结局的标志物。9

    CD248在肝纤维化中的作用尚未确定，但鉴于其在其他纤维化疾病中的潜在作用，我们试图评估CD248在慢性肝损伤中的功能。在此，我们证明CD248在肝纤维化中表达上调，其表达局限于hsc和肌成纤维细胞。此外，在慢性肝细胞损伤小鼠模型中，尽管存在相似水平的肝损伤、炎症和新血管生成，但我们证明CD248的基因缺失通过干扰血小板衍生生长因子(PDGF)信号，可以防止纤维化的发展，因此，这是纤维化肝损伤治疗干预的新靶点。

    材料与方法

    人体肝组织

    组织经英国伯明翰伊丽莎白女王医院肝脏部门的伦理批准和同意获得。移植的人肝标本取自酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性肝炎患者。正常供体肝脏剩余达到手术要求或作为手术切除的副产物作为正常对照。

    老鼠

    C57Bl / 6 CD248−−/7老鼠是David Huso(美国约翰霍普金斯大学)赠送的礼物。野生型C57Bl/6 (CD248 .+/+，下文称为WT)购自英国哈兰实验室。6周至10周CD248−−/WT小鼠每周两次腹腔注射四氯化碳(CCl4)注射(0.25 mL/kg (Sigma)) 8或12周诱导慢性肝损伤，并在最后一次给药后2天处死。矿物油被用作交通工具。在某些情况下，小鼠接受了CCl48周，最后一次给药4周后处死(再提交组)。所有的动物实验都是根据英国法律进行的，并得到了内政部和当地伦理委员会的批准(PPL 40/3201)。为了评估肝功能，在伯明翰妇女医院(Birmingham, UK)的临床生物化学实验室测定了血清样本中的谷丙转氨酶(ALT)活性。

    原代人、鼠肝来源细胞的分离

    原代人和小鼠造血干细胞被分离和培养如前所述。10，11人类造血干细胞是从接受原发性或继发性肝脏恶性肿瘤手术切除的患者未受损伤的肝组织中分离出来的。从正常肝脏中分离出小鼠造血干细胞。采用pronase/胶原酶消化法分离造血干细胞，浮力离心法分离。HSC在培养10天后自发激活，维甲酸缺失，表型改变，α-SMA上调。在某些情况下，用PDGF-BB刺激HSC培养(1-100 ng/mL;Peprotech，伦敦，英国)24小时。如前所述，使用移植的终末期病变肝组织分离胆道上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和肝肌成纤维细胞。10，12

    光镜和免疫组化

    将石蜡包埋的小鼠肝组织切成3 μm厚，按标准方法进行H&E染色。为了进行免疫组化研究，使用Dako Autostainer将石蜡包埋的小鼠肝脏切片与最佳稀释的兔抗鼠vimentin、兔抗鼠desmin、兔抗鼠F4/80(均为Abcam, Cambridge, UK)或大鼠抗鼠CD45 (eBioscience, Hatfield, UK)孵育。用印痕抗兔二抗检测染色，用NovaRED chromagen(两个Vector实验室，Peterborough, UK)进行观察。切片用苏木精反染色(VWR国际，Leighton Buzzard，英国)。对于CD45+免疫细胞定量，使用光学显微镜(蔡司，德国)在相同的光照和曝光下从每个染色切片中捕获5个不重叠的场。使用ImageJ软件进行数字图像分析。CD45值以CD45染色所占切片总面积的百分比表示。

    Immunofluorescent染色

    将肝组织快速冷冻后，在低温恒温器上切成7 μm厚的切片。切片在丙酮中固定5分钟。用100%甲醇固定的原代细胞在玻璃盖玻片上进行免疫荧光染色。对于人切片和原代人造血干细胞，使用以下抗体:单克隆小鼠IgG1抗人CD248(内部生成)，单克隆小鼠IgG2a抗人α-SMA (Dako, Ely, UK)，单克隆小鼠IgG1抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP) (Dako)，单克隆小鼠IgG1抗人vimentin (Vector Laboratories)和单克隆小鼠IgG1抗人CD90 (eBioscience)。用以下抗体对小鼠切片和原系小鼠造血干细胞进行染色:多克隆兔抗鼠CD248(由Clare Isacke教授，癌症研究所内部生成)，多克隆兔抗鼠α-SMA，多克隆山羊抗鼠GFAP，多克隆兔抗鼠desmin(均来自Abcam)，单克隆大鼠IgG2a抗鼠PDGFR-α和单克隆大鼠IgG2a抗鼠PDGFR-β(均来自eBioscience)仓鼠抗鼠CD31 (AbD Serotec, BioRad, USA)。在抗体具有相同同型的情况下，用单独的抗体孵育进行连续染色。常规进行物种同型(Life Technologies, Paisley, UK)染色对照。用荧光偶联二抗检测一抗，在某些情况下，用DAPI作为核反染色检测三抗。切片和细胞安装在荧光支架上(Dako)。使用蔡司共聚焦LSM 510显微镜(蔡司)对幻灯片进行可视化，并使用蔡司LSM图像检查软件(蔡司)进行处理。 Representative images are shown. For quantitative analysis, stained sections were scanned in an automated fashion using identical settings on an AxioScan Z1 (Zeiss) slide scanner and arithmetic mean pixel counts were analysed using Zen Lite 2012 (Zeiss).

    苦天狼星红染色及定量

    切片用蒸馏水水化，然后置于0.5%磷钼溶液中5分钟，然后用0.1%天狼星红(直接红80;% w/v在饱和苦味酸)2小时。载玻片在0.01 M HCl中浸泡，然后在蒸馏水中洗涤，然后安装。为了定量Picrosirius red染色(PSR)，每个切片取5或6个随机场图像，并用ImageJ软件进行处理。胶原值以天狼星红染色所占切片总面积的百分比表示。

    扩散分析

    采用兔抗Ki-67多克隆抗体(Millipore, USA)进行Ki-67染色，定量评价HSC增殖率。计算ki -67阳性核数，并表示为核总数的百分比，以确定ki -67阳性HSC的频率。

    qPCR分析

    总RNA由Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, California, USA)根据制造商说明提取。利用iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad, UK)从1 μg RNA合成互补DNA (cDNA)。然后用Lightcycler 480用探针(Roche, UK)和引物(Alta Biosciences, UK;看到表1)．为了进一步的小鼠研究，使用了TaqMan基因表达测定(Life Technologies，英国);CD248 (Mm00547485_s1)， Tnf-α (Mm00443258_m1)， Il6 (Mm00446190_m1)， Il10 (Mm00439614_m1)， Pdgfb (Mm00440677_m1)， Pdgfra (Mm00440701_m1)， Pdgfrb (Mm00435546_m1)， Tgfb1 (Mm01178820_m1)， Ctgf (Mm01192932_g1)， Hgf (Mm01135193_m1)， Timp1 (Mm00441818_m1)， Mmp2 (Mm00439498_m1)和Mmp9 (Mm00442991_m1)。目标基因的表达水平被归一化为管家基因Gapdh(Mm99999915_g1)。基因表达值表示为2−ΔCt．

    查看该表:
    表1

    qPCR分析所用引物

    西方的屁股

    加入十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(4% SDS (v/v)， 0.1 M二硫苏糖醇，20%甘油(v/v)， 0.0625 M Tris-HCl和0.004%溴酚蓝(w/v)，在100℃下加热10 min，制备细胞裂解液。蛋白质在4-12%的Novex tris -甘氨酸凝胶(Invitrogen Life Technologies, Paisley, UK)上分解，并使用Novex -Cell II Mini Cell转移到Hybond-N膜(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)上。印迹与兔抗鼠总蛋白或phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (197G2, New England Biolabs, Herts, UK)反应。随后用结合辣根过氧化物酶的物种特异性二抗体进行检测(GE医疗生命科学)。蛋白负载由抗鼠β-肌动蛋白抗体(eBioscience)确认。印迹通过增强化学发光(GE Healthcare Life Sciences)进行可视化，使用chemi-doc Bio-Rad系统进行数字图像和密度测定。数据以β-肌动蛋白表达归一化的相对定量表达，并以未受刺激细胞的折叠变化表示。

    统计分析

    采用Prism软件(GraphPad, California, USA)进行Student's t检验或Spearman's相关系数的统计分析。数据用SEs表示为平均值。A值p<0.05被认为是显著的。

    结果

    在小鼠和人肝损伤过程中，肝脏CD248的表达在基因和蛋白水平上均增加，并与纤维化水平相关

    cd248mrna的表达水平在肝硬化终末期肝病中更高(3.85倍差异;P <0.01)，与正常肝脏比较(图1A).在慢性CCl中观察到类似的模式4在小鼠肝脏中，CD248的表达也更高(1.6倍的差异;P =0.09)高于未损伤小鼠肝脏(图1B). CD248免疫荧光染色显示，正常人肝脏偶有阳性细胞，CD248数量明显增加+在肝硬化肝脏中可见的细胞(图1C). CD248在健康小鼠肝脏中也低水平表达，而CD248的数量相当高+在慢性损伤的小鼠肝脏中观察到细胞(图1D).在确定CD248在肝损伤期间表达增加后，我们试图确定肝脏中哪些细胞表达CD248。与人肝窦内皮细胞、胆道上皮细胞和肝硬化肝细胞相比，从正常肝脏中分离出来的被人肝硬化肝的塑料和肌成纤维细胞激活的hsc表达了高水平的CD248 mRNA (图1E)。此外，cd248mrna与人肝脏胶原蛋白含量呈正相关(Spearman's r=0.79;p < 0.01;图1F)。

    CD248 expression is upregulated in chronic liver disease and correlates with levels of fibrosis. CD248 mRNA was analysed by qPCR (A) from normal human livers (n=12) versus end-stage diseased cirrhotic livers (n=18) and (B) livers from untreated mice (control) and mice injected with carbon tetrachloride (CCl4) twice weekly for 8 weeks (n=6). Data represent CD248 mRNA fold changes and are shown as mean±SEM. **p<0.01 (Student's t test). Representative images of CD248 immunofluorescent staining (red) (C) in normal and cirrhotic human liver tissue and (D) in livers from untreated (wild-type) and CCl4 injected mice. Scale bar=50 μm. (E) RNA was isolated from primary biliary epithelial cells (BEC), hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC), hepatocytes, myofibroblasts and activated hepatic stellate cells (n=3 different isolates) and analysed by qPCR for expression levels of CD248 mRNA. Results are expressed as mean±SD. (F) Normal and cirrhotic livers (n=12) were stained using Sirius red. Staining was digitally quantified and expressed as the percentage area covered by staining of five randomly selected fields per sample. Extent of fibrosis was compared with CD248 mRNA (r=0.79; p<0.01; Spearman's r correlation). PSR, Picrosirius red staining.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    CD248在慢性肝病中表达上调，并与纤维化水平相关。通过qPCR (A)分析正常人类肝脏(n=12)与终末期患病肝硬化肝脏(n=18)的cd248mrna， (B)未治疗小鼠(对照组)和注射四氯化碳(CCl)小鼠的肝脏4)每周两次，共8周(n=6)。数据代表cd248mrna的折叠变化，用均值±SEM表示。**p<0.01(学生t检验)。CD248免疫荧光染色的代表性图像(红色)(C)在正常和肝硬化的人肝组织中，(D)在未处理的(野生型)和CCl的肝脏中4注入老鼠。比例尺=50 μm。(E)从原代胆道上皮细胞(BEC)、肝窦内皮细胞(HSEC)、肝细胞、肌成纤维细胞和活化的肝星状细胞(n=3个不同的分离株)中分离RNA，用qPCR分析cd248mrna的表达水平。结果以均数±标准差表示。(F)正常肝脏和肝硬化肝脏(n=12)用天狼星红染色。染色数字量化，表示为每个样品随机选择的五个区域的染色覆盖面积百分比。比较cd248mrna的纤维化程度(r=0.79;p < 0.01;斯皮尔曼相关)。PSR，苦天狼星红染色。

    CD248在人和小鼠组织中窦状肌成纤维细胞样细胞和血管周围表达

    为了进一步研究CD248在损伤肝脏中的表达和定位，我们进行了免疫荧光双染色。CD248的表达位于肝硬化人肝的窦状细胞和血管周围，并与表达一系列肌成纤维细胞/HSC标记的细胞共定位，包括GFAP， α-SMA和vimentin (图2A). CD248的分布+细胞在CCl中相似4-诱导的肝纤维化，同样定位于窦和血管。此外,CD248+损伤小鼠肝脏中的细胞与一系列相关的小鼠成纤维细胞标志物共定位，包括GFAP， α-SMA和desmin (图2B).为了确认细胞的身份，我们从正常肝脏中分离出静止的人和小鼠HSC，然后在培养中激活，并与CD248和HSC标记共染色。从人肝脏分离的活化造血干细胞显示明亮的CD248染色(图3A)小鼠造血干细胞(图3B).人和小鼠造血干细胞与其他已建立的星状细胞标志物共同表达CD248 (图3)．

    CD248 is expressed by stromal cells in the human and mouse liver. Representative confocal images showing localisation of CD248 (red) to cells expressing myofibroblast and hepatic stellate cell markers (green) located in blood vessels and sinusoids in (A) human chronic end-stage liver and (B) chronically injured mouse liver sections. DAPI was used as a counterstain. Insets; zoomed images. Scale bar=50 μm. GFAP, glial fibrillary acidic protein; α-SMA, α-smooth muscle actin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    CD248在人和小鼠肝脏中由间质细胞表达。代表性共聚焦图像显示CD248定位于(A)人类慢性终末期肝脏和(B)慢性损伤小鼠肝脏部分血管和窦状血管中表达肌成纤维细胞和肝星状细胞标记物的细胞(绿色)。DAPI用作反染色剂。Insets;放大图像。比例尺=50 μm。胶质纤维酸性蛋白;α-SMA， α-平滑肌肌动蛋白。

    CD248 expression in stromal cells in vitro from human and mouse liver. Hepatic stellate cells (HSCs) were isolated from normal (A) human and (B) mouse livers and activated on plastic. Representative confocal images showing CD248 expression (red) in human and mouse HSC expressing HSC markers. DAPI was used as a counterstain. Scale bar=50 μm. GFAP, glial fibrillary acidic protein; α-SMA, α-smooth muscle actin.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    CD248在人、小鼠肝基质细胞中的表达。从正常(A)人类和(B)小鼠肝脏中分离出肝星状细胞(hsc)，并在塑料上活化。代表性共聚焦图像显示CD248在表达HSC标记的人和小鼠HSC中的表达(红色)。DAPI用作反染色剂。比例尺=50 μm。胶质纤维酸性蛋白;α-SMA， α-平滑肌肌动蛋白。

    在确定CD248的表达仅限于造血干细胞和肌成纤维细胞后，我们试图通过CD248缺陷小鼠模型来确定CD248在肝纤维化生成中的功能意义。腹腔注射CCl后48周后，我们证实肝脏中cd248mrna和蛋白的表达没有增加(图4A)。CD248−−/与WT对照组相比，小鼠cd248mrna水平极低(p<0.01)。此外，在CD248中检测到少量CD248蛋白−−/跟随CCl的小鼠4与WT对照组比较(p<0.05)。相反，用CCl处理的WT小鼠CD248蛋白表达显著增加4与单纯载体相比(p<0.01)。CCl后4管理、CD248−−/H&E染色显示小鼠和WT小鼠均有小叶中心坏死灶(图4B)。

    CD248 knock-out does not alter inflammatory response to carbon tetrachloride (CCl4) injury. CD248−/− mice and wild-type (WT) mice were injected biweekly with CCl4 or vehicle for 8 weeks and then sacrificed after 2 days of the final dose (n=6). (A) Levels of CD248 mRNA and protein were quantified using qPCR and morphometric analysis. (B) Representative images of H&E staining of paraffin-embedded liver tissue sections are shown and serum alanine aminotransferase (ALT) activity was assessed as a measure of acute liver injury. Scale bar=200 μm. (C) Digital quantification of CD31 expressed as the percentage area per section. (D) Digital quantification of CD45 expressed as the percentage area of five randomly selected areas per sample. (E) Expression levels of inflammatory mediators were analysed by qPCR. Data are mean±SEM. *p<0.05, **p<0.01 (Student's t test). GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; TNF-α, tumour necrosis factor-α.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    CD248敲除不改变对四氯化碳(CCl)的炎症反应4)损伤。CD248−−/小鼠和野生型(WT)小鼠每两周注射一次CCl4或载药8周，最后一次给药2天后处死(n=6)。(A)用qPCR和形态计量分析定量CD248 mRNA和蛋白水平。(B)石蜡包埋肝组织切片H&E染色的代表性图像显示，血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性被评估为急性肝损伤的衡量标准。比例尺=200 μm。(C)以每节面积百分比表示的CD31数字量化。(D) CD45的数字量化表示为每个样本随机选择的五个区域的面积百分比。(E)用qPCR分析炎症介质的表达水平。数据为均值±SEM。*p<0.05， **p<0.01(学生t检验)。甘油醛3-磷酸脱氢酶; TNF-α, tumour necrosis factor-α.

    cd248缺陷小鼠在慢性CCl后具有相似水平的血管生成和炎症4肝损伤

    CD248的血清ALT活性无差异−−/在注射8周或12周后与WT小鼠进行比较4管理局(图4B)。此外，通过肝脏CD45蛋白表达评估炎症水平(见图4D和在线补充图S1)和肿瘤坏死因子-α，白细胞介素(IL)-6和IL-10 mRNA (图4E)在CD248之间没有变化−−/小鼠和WT小鼠。（图4B).两组间肝巨噬细胞表达无差异(见在线补充图S1)。此外，CD248中CD31的表达在血管生成水平上没有发现显著差异−−/小鼠和WT小鼠用氯化铬处理4为期八周(图4C)。

    cd248缺陷小鼠不受CCl的影响4-诱导性肝纤维化

    为了进一步研究CD248在肝纤维形成中的作用，我们检测了CD248中胶原沉积和肌成纤维细胞积累的程度−−/和WT小鼠。而慢性损伤WT小鼠的PSR显示，8周和12周后，肝门静脉区胶原蛋白大量堆积，延伸至肝小叶，CD248中胶原蛋白染色−−/小鼠几乎没有被观察到(图5A). PSR切片的数字形态测量分析显示CD248的肝纤维化显著减少−−/与WT小鼠相比，降低了8 (56.4%;P <0.0001)和12周(减少51.1%;P <0.05)，分别(图5B).为了进一步量化纤维化的差异，通过qPCR检测胶原蛋白1的组成部分α 1前胶原蛋白(I)和α- sma mRNA的水平(图5C, D)。α前胶原蛋白1(I)在CD248中的表达分别低65.3%和64.0%−−/8周和12周后的小鼠(p<0.05)4分别受伤(图5C).同样，α-SMA的表达(图5D)在CD248中被减少−−/在8周和12周时分别降低62.5%和86.1%(均p<0.05)。

    CD248-deficicient mice are protected from carbon tetrachloride (CCl4)-induced hepatic fibrosis. CD248−/− mice and wild-type (WT) mice were injected biweekly with CCl4 for 8 or 12 weeks (n=6). (A) Liver sections were stained with Picrosirius red staining (PSR) to reveal collagen deposition. (B) The percentage fibrotic areas were assessed by ImageJ analysis of microphotographs taken of six randomly selected areas. (C) Col1a1 and (D) α-smooth muscle actin (α-SMA) gene expression analysis was performed with qPCR using total liver mRNA. Data are mean±SEM. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001 (Student's t test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    cd248缺陷小鼠不受四氯化碳(CCl4)引起的肝纤维化。CD248−−/小鼠和野生型(WT)小鼠每两周注射一次CCl48或12周(n=6)。(A)肝切片用苦蓟红染色(PSR)显示胶原沉积。(B)通过ImageJ分析六个随机选择区域的显微照片来评估纤维化区域的百分比。(C) Col1a1和(D) α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因用全肝mRNA进行qPCR表达分析。数据为均值±SEM。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * * p < 0.0001(学生的t测试)。

    CCl后cd248缺陷小鼠的关键纤维生成因子TGF-β减少4全身的伤

    为了进一步分析CD248在纤维化中的作用，在CCl后评估了参与纤维化发生和肝损伤的生长因子4管理。转化生长因子-β (TGF-β) mRNA是调控hsc的关键促纤维化生长因子，其表达水平降低−−/与WT对照组相比(p<0.05)，而PDGF-BB、结缔组织生长因子和肝细胞生长因子mRNA水平无差异(图6A).此外，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2、MMP-9、tissue inhibitor of metalloproteinase-1等参与基质重构的酶的mRNA表达水平在CD248之间保持不变−−/小鼠和WT小鼠在CCl后4管理局(图6B).为了排除CD248缺失影响造血干细胞丰度的可能性，我们在WT和CD248之间进行了组织学检查−−/无氯化小鼠4-致肝损伤。用两种常见的HSC标记物vimentin和desmin染色的肝脏表明，HSC的数量不受CD248基因缺失的影响(图6C)。

    Hepatic transforming growth factor-β (TGF-β) is reduced in CD248-deficient mice following carbon tetrachloride (CCl4)-induced injury. CD248−/− mice and wild-type (WT) mice were injected biweekly with CCl4 for 8 weeks (n=6). (A) Transcript levels of growth factors and (B) enzymes involved in matrix remodelling were analysed by qPCR of whole liver tissue. (C) Representative images of livers from untreated CD248−/− mice and WT mice stained with vimentin or desmin are shown. Scale bar=100 μm. CTGF, connective tissue growth factor; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; HGF, hepatocyte growth factor; MMP, matrix metalloproteinase; PDGF, platelet-derived growth factor; TIMP, tissue inhibitor of metalloproteinase.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    四氯化碳(CCl)引起cd248缺陷小鼠肝转化生长因子-β (TGF-β)降低4全身的)伤害。CD248−−/小鼠和野生型(WT)小鼠每两周注射一次CCl4持续8周(n=6)。(A)通过全肝组织qPCR分析生长因子和(B)参与基质重塑的酶的转录水平。(C)未处理CD248的肝脏代表性图像−−/示用波形蛋白或desmin染色的小鼠和WT小鼠。比例尺=100 μm。CTGF，结缔组织生长因子;甘油醛3-磷酸脱氢酶;HGF，肝细胞生长因子;MMP，基质金属蛋白酶;PDGF，血小板衍生生长因子;TIMP，金属蛋白酶组织抑制剂。

    缺乏CD248不影响肝纤维化的解决

    确定CD248的纤维化分辨率是否改变−−/用WT和CD248处理小鼠−−/小鼠注射CCl 8周4并在受伤4周后检查他们的肝脏。4周后，WT和CD248−−/小鼠的肝纤维化水平与对照组相似(图7A). α-SMA和Col1a1 mRNA水平在两组中也相似(图7B, C)。

    CD248 does not alter resolution of liver fibrosis. CD248−/− mice and wild-type (WT) mice were injected biweekly with carbon tetrachloride (CCl4) or vehicle for 8 weeks and then sacrificed either 2 days or after 4 weeks of the final dose (resolution) (n=3–6). (A) The percentage fibrotic areas were assessed by ImageJ analysis of Picrosirius red stained (PSR) microphotographs taken of six randomly selected areas. (B) Col1a1 and (C) α-smooth muscle actin (α-SMA) gene expression analysis was performed with qPCR using total liver mRNA. Data are mean±SEM. *p<0.05, ***p<0.001 (Student's t test).
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    CD248不改变肝纤维化的消退。CD248−−/小鼠和野生型小鼠每两周注射四氯化碳(CCl)4)或载体8周，然后在最终剂量(分辨率)的2天或4周后牺牲(n= 3-6)。(A)通过ImageJ分析六个随机选择区域的Picrosirius red染色(PSR)显微照片来评估纤维化区域的百分比。(B) Col1a1和(C) α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因用全肝mRNA进行qPCR表达分析。数据为均值±SEM。*p<0.05， ***p<0.001(学生t检验)。

    在PDGF-BB的作用下，cd248缺陷小鼠免受继发于HSC增殖减少的肝纤维化的影响

    为了了解CD248对纤维发生的作用机制，我们试图确定PDGF是否发挥作用，PDGF是一种已知的强效HSC有丝分裂原，已知与CD248相互作用。从WT和CD248中分离出造血干细胞−−/小鼠PDGFR-α mRNA和蛋白表达水平相近(图8A, B)。虽然PDGFR-β mRNA在hsc中略低于CD248−−/小鼠PDGFR-β蛋白表达水平在WT与CD248的造血干细胞中无明显差异−−/小鼠，表明它们可以对PDGF刺激做出反应(图8A、B)。

    Platelet-derived growth factor (PDGF)-induced proliferation is impaired in hepatic stellate cells (HSCs) from CD248−/− mice. HSCs were isolated from normal liver tissue from wild-type (WT) and CD248−/− mice and plated on plastic to initiate activation. (A) Transcript levels of PDGF receptor (PDGFR)-α and PDGFR-β was analysed by qPCR (n=3). (B) Representative images of immunofluorescent staining of HSCs with antibodies against PDGFR-α and PDGFR-β are shown. (C) After stimulation with PDGF-BB, the number of WT and CD248−/− HSCs (n=5) proliferating was numerated by the percentage that were Ki-67 positive. (D) qPCR was used to analyse c-fos expression in WT and CD248−/− HSCs after stimulation with PDGF-BB (E) Protein analysis by western blot for expression of phosphorylated ERK (P-ERK) and total ERK (T-ERK) relative to β-actin in WT and CD248−/− HSCs following treatment with 100 ng/mL PDGF-BB. A representative blot is shown with quantification by digital densitometry. Data are normalised to β-actin and expressed as fold change from unstimulated cells (n=2 independent experiments). Data are mean±SEM. *p<0.05, **p<0.01 (Student's t test). GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图8
    图8

    血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的肝星状细胞(hsc)增殖从CD248受损−−/老鼠。从正常肝组织野生型(WT)和CD248分离出造血干细胞−−/小鼠和镀在塑料上启动激活。(A)通过qPCR分析PDGF受体(PDGFR)-α和PDGFR-β的转录水平(n=3)。(B)显示了抗PDGFR-α和PDGFR-β抗体的造血干细胞免疫荧光染色的代表性图像。(C) PDGF-BB刺激后，WT和CD248的数量−−/肝星状细胞(n=5)增殖以Ki-67阳性百分比计算。(D) qPCR检测c-fos在WT和CD248中的表达−−/PDGF-BB刺激后的hsc (E)蛋白western blot检测WT和CD248中相对于β-actin磷酸化ERK (P-ERK)和总ERK (T-ERK)的表达−−/100 ng/mL PDGF-BB处理后的hsc。用数字密度法定量显示了一个有代表性的斑点。数据归一化为β-肌动蛋白，并表示为未受刺激细胞的折叠变化(n=2个独立实验)。数据为均值±SEM。*p<0.05， **p<0.01(学生t检验)。甘油醛3-磷酸脱氢酶

    尽管CD248−−/HSC表达PDGFR-α和PDGFR-β，它们对PDGF-BB刺激的反应与WT型HSC不同。暴露于10 ng/mL剂量的PDGF-BB后，WT型造血干细胞比CD248型造血干细胞表现出明显的增殖反应−−/老鼠(图8C). CD248中PDGF信号通路缺失的下游效应−−/与WT小鼠相比，c-fos mRNA表达显著降低(0.03±0.01 vs 0.22±0.06,p<0.05)，证实了hsc的存在(图8D).同样地，在PDGF暴露后，CD248也钝化了ERK的磷酸化−−/HSC与WT型HSC比较。正如我们之前报道的，CD248中磷酸化erk的基线水平更高−−/肝星状细胞(图8E)。

    讨论

    在这篇文章中，我们首次证明了CD248是肝纤维化的一个主要调节因子，以应对慢性损伤，在人和小鼠的肝纤维化中都上调。我们证明，CD248的基因缺失通过干扰PDGF信号，在慢性肝细胞损伤的小鼠模型中防止纤维化的发展，因此是纤维化肝损伤治疗干预的新靶点。

    造血干细胞被认为是导致肝纤维化的关键细胞。13，14CD248在活化的HSC和肌成纤维细胞中的表达促使我们评估CD248在肝纤维化中的作用。我们发现，在肝纤维化的实验模型中，缺乏CD248的小鼠纤维化程度较低，这可能是继发于PDGF信号转导的降低，导致有缺陷的HSC增殖，从而减少ECM沉积。PDGF是已知的最有效的HSC有丝分裂原，是肝纤维化过程中HSC增殖的关键调节因子。15Tomkowicz最近的一项研究等16CD248的表达是小鼠周细胞PDGF信号通路的必要条件。在造血干细胞中缺乏CD248并不改变PDGF受体的水平，这表明CD248具有抗增殖作用−−/HSCs不通过调节PDGF受体表达介导。值得注意的是，我们的研究表明，PDGF信号在CD248中−−/hsc被废除，表现为显著减少c-fosCD248中PDGF信号通路的表达−−/HSC。

    PDGF- bb结合PDGF受体引起PDGF受体磷酸化，进而诱导ERK磷酸化。17CD248的作用是调节ERK的磷酸化，18因此，在CD248缺失的情况下，ERK不会磷酸化以响应PDGF。ERK磷酸化导致c-fos转录，然后介导下游效应(如增殖)，被用作PDGF信号传导的衡量标准。事实上，之前已经有人提出，调节PDGF信号通路可能代表一种指导组织再生或骨组织工程的策略。19在这项研究中，我们证明了PDGF对ERK的磷酸化因CD248的缺失而减弱，但与我们在成骨细胞中报道的程度不同。因此，靶向CD248可能只允许在肝损伤中激活的hsc和肌成纤维细胞上选择性抑制PDGF信号。

    尽管CD248降低了造血干细胞的增殖潜能−−/在小鼠中，可能有其他机制参与降低CD248的纤维化水平−−/老鼠。其他研究人员报道CD248可能降低炎症水平。CD248−−/在关节炎模型中，白细胞和促炎细胞因子减少，与WT对照相比，小鼠的炎症明显减少。20.值得注意的是，我们在CD248中没有观察到炎症或血管生成的差异−−/小鼠在纤维形成中起着更大的作用。

    CD248在造血干细胞和肌成纤维细胞中的限制性表达以及疾病期间的短暂调控使其成为调控肝纤维化的一个有吸引力的靶点。值得注意的是，CD248的纤维化分辨率没有变化−−/老鼠。此外，CD248在细胞表面表达，因此CD248阳性的间质细胞可能是使用新型抗血管生成药物(如抗人CD248单克隆抗体MORAb-004)调节肝纤维化的潜在靶点。21目前在癌症的临床试验中。

    在这项研究中，我们发现CD248是肝纤维化的一种新的治疗靶点。重要的是，我们的研究表明，在慢性肝病小鼠模型中，干扰CD248信号可以显著减少肝纤维化。我们的数据表明CD248可能是人类纤维化肝病的一个新的治疗靶点。

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    补充材料

    • 补充数据

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    脚注

    • 调整通知这篇文章在Online First发表后已被更正。作者Ditte Hedegaard已被添加。这篇文章现在也包括开放获取许可证。本文的许可自发布以来已更改为CC BY 4.0。

    • 贡献者AW, VA和DH是共同第一作者。PNN、CDB、NCH、AW和VA具有最初的概念，并为研究方案的设计做出了贡献。AW, VA和DH，在AJN, CJW, AG的协助下。JF, GMR和APC进行了实验，并为手稿生成了所有数据。VA、DH、CJW和AG进行了体内实验。VA、AW、NCH、CDB和PNN对数据进行分析和解释。VA和AW进行统计分析。AW和VA撰写了手稿的初稿，所有作者都审阅了最终版本。PNN和AW是保证。

    • 资金伯明翰大学医院慈善机构和国家卫生研究所(NIHR)伯明翰肝脏生物医学研究所(BRU)。APC由威康基金会博士后临床培训奖学金(WT104551AIA)支持。Neil Henderson Wellcome Trust临床科学高级研究奖学金(103749/Z/14/Z)。

    • 免责声明本文仅代表作者个人观点，并不代表NHS、NIHR或卫生部的观点。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人的同意获得的。

    • 伦理批准本地研究伦理委员会(文献编号06/Q2702/61)。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。