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摘要
客观的过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)是一种在具有高氧化活性的组织中表达的核受体，在代谢中起着核心作用。在这项工作中，我们研究了肝细胞PPARα对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的影响。
设计我们构建了一种新的肝细胞特异性PPARα敲除基因(Pparα/玫瑰−−)小鼠模型。使用这个新模型，我们在非诺贝特治疗后进行了转录组分析。接下来，我们研究了哪些生理挑战会影响PPARα。此外，我们测量了空腹期间肝细胞PPARα活性对全身代谢和成纤维细胞生长因子21产生的贡献。最后，我们确定了肝细胞特异性PPARα缺乏在不同脂肪变性模型和衰老过程中的影响。
结果肝细胞PPARα缺失损害脂肪酸分解代谢，导致空腹和两个临床前脂肪变性模型的肝脏脂质积累。空腹小鼠在夜间早期表现出急性ppar α依赖性肝细胞活性，循环游离脂肪酸相应增加，脂肪细胞脂解作用可进一步刺激这种活性。禁食导致轻度低血糖和体温过低Pparα/玫瑰−−与小鼠相比Pparα−−/提示PPARα活性在非肝组织中的作用。与这一观察结果一致，Pparα−−/小鼠在衰老过程中变得超重Pparα/玫瑰−−保持精简。然而,像Pparα−−/老鼠,Pparα/玫瑰−−喂食标准饮食的人在衰老过程中会发生肝脏脂肪变性。
结论总之，这些发现强调了肝细胞PPARα作为NAFLD药物靶点的潜力。
- 基因表达
- 非酒精性脂肪肝炎
- 脂质代谢
这是一篇开放获取文章，根据创作共用属性非商业(CC BY-NC 4.0)许可证发布，该许可证允许其他人以非商业方式分发、混音、改编、在此作品的基础上进行构建，并以不同的条款许可其衍生作品，前提是原始作品被正确引用且使用是非商业性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
数据来自Altmetric.com
本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)是一种在许多组织中表达的核受体，负责几种重要的代谢控制，特别是在禁食期间。
PPARα是贝特家族降血脂药物的一个靶点。
PPARα在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者的肝脏中表达较低。
几种ppar靶向分子，包括双激动剂，目前正在研究用于NAFLD治疗。
新的发现是什么?
肝细胞限制性PPARα缺失损害肝脏和全身脂肪酸稳态。
肝脏PPARα对急性和慢性脂肪组织脂解反应。
肝脏PPARα调节昼夜成纤维细胞生长因子21 (FGF21)和禁食诱导的FGF21，并部分负责脂肪性肝炎中FGF21的增加。
在衰老过程中，肝细胞限制性PPARα缺失足以促进NAFLD和高胆固醇血症，但不会导致小鼠超重。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
这项工作强调了肝脏PPARα作为NAFLD药物靶点的相关性和潜力。
简介
精确控制脂肪酸代谢是必不可少的。脂肪酸稳态调节缺陷可能引起脂肪毒性组织损伤，包括肝脏脂肪变性。1过氧化物酶体增殖激活受体(PPARs)是作为脂肪酸受体的转录因子，有助于调节基因表达，以响应脂肪酸来源的刺激。2ppar作为配体激活的受体，控制靶基因的转录。PPAR的三种同型PPARα、PPARβ/δ和PPARγ显示出特定的组织表达模式并控制不同的生物学功能，3.但它们都在不同的组织中结合脂质并控制脂质稳态，包括肝脏。2
健康的肝脏不会积累脂质，但它在脂肪酸合成代谢和向外周器官(包括白色脂肪组织)输出中起着核心作用，以储存能量。4在饮食限制期间，肝脏脂肪酸分解代谢对于利用白色脂肪组织释放的游离脂肪酸(FFAs)也是至关重要的。PPARα是肝细胞中含量最多的同型，参与脂质代谢的许多方面，5,6包括禁食期间脂肪酸的降解、合成、运输、储存、脂蛋白代谢和生酮。7号到9号此外，PPARα控制甘油用于糖异生9还有自噬10作为禁食的反应。此外，PPARα在饥饿期间调节成纤维细胞生长因子21 (FGF21)的表达。11,12反过来，FGF21作为一种内分泌激素，靶向各种功能，包括代谢控制。13最后，PPARα有助于抑制肝脏的急性期反应和炎症。14
肥胖可导致器官和血管并发症。15非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被认为是代谢综合征的肝脏表现，范围从良性脂肪变性到严重非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，可能进一步损害器官。16中性脂质的持续升高(主要是肝细胞脂滴中的甘油三酯)引发早期病理阶段。不同的脂肪酸来源有助于脂肪肝的发展，包括膳食脂肪摄入、从头脂肪生成和脂肪组织脂肪分解。4在NAFLD中，脂肪变性肝中累积的脂肪酸60%来自脂肪来源。17
临床前21页和临床22研究强调PPARα影响NAFLD和NASH。缺乏PPARα的小鼠在禁食期间发生脂肪变性，7,8提示PPARα活性对于利用脂肪细胞释放的FFA的重要性。然而，PPARα在许多组织中表达并活跃，包括骨骼肌，23脂肪组织,24,25肠、26肾脏27和心脏,28这些都有助于脂肪酸的稳态。因此，尚不清楚缺乏PPARα的小鼠脂肪变性易感性的增加是否仅取决于肝细胞中的PPARα活性，还是也取决于其他器官中的PPARα活性。
在这里，我们研究了肝细胞特异性的后果Pparα缺失，重点关注NAFLD对脂肪酸代谢的影响，从脂肪变性到脂肪性肝炎。我们首次报道了当肝细胞缺乏PPARα时，脂肪细胞脂解与NAFLD相关并刺激NAFLD的证据。我们的数据证实肝细胞受限Pparα缺失足以促进脂肪变性，强调了该受体作为NAFLD药物靶点的相关性。
材料与方法
动物
一代的floxed-Pparα老鼠和Pparα肝细胞特异性敲除(Pparα/玫瑰−−）动物的描述在在线补充文件1。
体内实验
体内研究遵循欧盟实验动物使用和护理指南，并由独立的伦理委员会批准。
详细的实验方案在在线补充文件1中提供。
等离子体分析
血浆FGF21和胰岛素分别使用大鼠/小鼠FGF21 ELISA试剂盒(EMD Millipore)和超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem)按照制造商的说明进行检测。使用COBAS-MIRA+生化分析仪(Anexplo设备)测定天冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇、LDL胆固醇和HDL胆固醇。
循环葡萄糖和酮体
使用Accu-Chek Go血糖仪(罗氏诊断公司)测量血糖。β-羟丁酸含量使用Optium β-酮试纸和Optium Xceed传感器(Abbott Diabetes Care)测量。
组织学
将多甲醛固定、石蜡包埋的肝组织切成5 μm切片，H&E染色。可视化使用徕卡DFC300相机进行。
肝脂分析
详细的实验方案在在线补充文件1中提供。
基因表达研究
总RNA用TRIzol试剂(Invitrogen)提取。通过Agilent全小鼠基因组微阵列(4×44k)获得转录组谱。微阵列数据和实验细节可在基因表达综合(GEO)数据库(登录号GSE73298和GSE73299)中获得。对于实时定量PCR (qPCR)，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)对2µg RNA样本进行逆转录。在线补充文件2介绍了SYBR绿色检测引物。扩增使用ABI Prism 7300实时PCR系统(Applied Biosystems)进行。qPCR数据归一化至TATA-box-binding protein mRNA水平，用LinRegPCR.v2015.3进行分析。
转录组数据分析
数据分析采用R (http://www.r-project.org)。微阵列数据使用Bioconductor封装处理(http://www.bioconductor.org， v 2.12)29如GEO条目GSE26728所述。详细信息请参见在线补充文件1。
统计分析
数据分析采用R (http://www.r-project.org)。微阵列数据使用生物导体封装处理(http://www.bioconductor.org)，如GEO条目GSE38083所述。q值<0.001的基因被认为是基因型间差异表达。基因本体论(GO)生物过程富集评估使用条件超几何测试(GOstats包)。对于非微阵列数据，通过方差分析分析差异效应，然后进行学生t检验，并进行汇总方差估计。p值<0.05被认为是显著的。
结果
肝细胞特异性PPARα敲除小鼠的生成
后代携带Pparα液氧/液氧等位基因(图1A)，称为floxed，在C57Bl/6J背景下进行回交叉，然后与之交叉albumin-Cre在相同遗传背景的小鼠中，产生肝细胞特异性PPARα敲除(Pparα液氧/液氧albumin-Cre+ /−)，简称为Pparα/玫瑰−−（图1B).肝脏中未检测到PPARα mRNAPparα/玫瑰−−与floxed小鼠和C57Bl6/J小鼠相比(图1C)，提示大多数肝脏PPARα表达来自肝细胞。肝细胞中PPARα缺失不改变其他PPAR同型的mRNA表达(图1C)。
肝细胞特异性过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)敲除小鼠模型的特征。(A)破坏肝脏的靶向策略示意图Pparα的表达。(B) PCR分析Pparα液氧（Pparα玫瑰+ / +),Albumin-Cre（Albumin-Cre+ /−)小鼠肝脏野生型(WT)的基因，(Pparα玫瑰+ / +)或肝脏剔除(Pparα/玫瑰−−)Pparα利用从不同器官中提取的DNA(C)相对mRNA表达水平Pparα,Pparβ/δ而且Pparγ取自小WT的肝脏样本，小WT的肝脏(Pparα玫瑰+ / +)，Pparα肝敲除(Pparα/玫瑰−−),Pparα敲除(Pparα−−/)小鼠(每组n=8只)。数据表示均值±SEM。* * * p≤0.005。FA, floxed等位基因;Flp flippase;FRT，翻转酶识别靶;LoxP, x / p1的轨迹;Nd，未检测到;PparαΔ,Pparα删除;WT，白蛋白cre−−/等位基因。
非诺贝特对PPARα活性的肝细胞自主作用
为了确定PPARα反应是否肝细胞自主，我们挑战野生型(WT)， floxedPparα消息灵通的+/+,Pparα−−/而且Pparα消息灵通的−−/PPARα激动剂非诺贝特小鼠。我们测量了PPARα靶基因的mRNA表达，包括Cyp4a10（图2一)和Cyp4a14（图2B).非诺贝特在WT和floxed中强烈诱导其表达Pparα玫瑰+ / +与小鼠相比Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−老鼠。这些样本也通过微阵列分析用于泛基因组表达分析(图2C).差异表达基因(DEG)分析进行层次聚类，突出WT和floxed之间相似的表达谱Pparα玫瑰+ / +非诺贝特治疗组和载体治疗组小鼠。全身Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−小鼠对非诺贝特无反应，这表明非诺贝特诱导的肝脏变化主要是由于自主的肝细胞反应，而不是继发于肝外PPARα激活。氧化石墨烯生物功能分析显示，非诺贝特可上调脂质代谢，抑制免疫和防御反应、代谢反应以及糖基化和糖蛋白代谢(图2C, 1、2、6、7组)Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−小鼠表现出显著差异(图2C, 3、4、8和9组)。这表明肝外PPARα的缺失对肝脏转录谱有显著影响，并强调了PPARα的相关性Pparα/玫瑰−−小鼠定义肝细胞自主作用的受体控制肝功能。
使用非诺贝特激活过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)揭示了肝细胞特异性PPARα依赖的生物学功能。野生型(WT)肝脏样本，PPARα敲除(Pparα−−/)、肝脏WT (Pparα玫瑰+ / +)和Pparα肝细胞敲除(Pparα/玫瑰−−)灌胃非诺贝特(Feno， +)或对照物(−)小鼠14 d。(A和B)两个特异PPARα靶基因的相对基因表达Cyp4a10(一)和Cyp4a14(B)采用qRT-PCR检测。数据表示均值±SEM。* * * * * p≤0.01,p≤0.005。(C)热图表示来自肝脏样本的微阵列实验数据。分层聚类也显示，这允许定义九个基因簇。基因本体(GO)分析显示各聚类具有显著的生物学功能(p≤0.05)。Nd，未检测到。
肝细胞PPARα活性与环境有关
的Pparα/玫瑰−−以PPARα为研究对象，研究PPARα在空腹诱导的脂肪酸分解代谢和再饲喂期间的脂肪酸合成代谢中是否具有调控作用。通过测量血糖(图3A)和脂肪酸合酶(Fasn)，编码脂肪生成的限速酶(图3B).两者在禁食期间均较低，在自由喂养的动物中居间，而在喂食动物中较高。Cyp4a14(PPARα的一个众所周知的靶点)表达低或无法检测Pparα/玫瑰−−，并在WT小鼠中随着禁食而强烈上调(图3C)。
肝细胞特异性过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)的功能依赖于营养状况。野生型(WT)和PPARα肝脏敲除(Pparα/玫瑰−−) 8周龄的雄性小鼠分别喂自由摄食量、禁食24小时、禁食24小时再进食24小时。于ZT14处死所有小鼠，采集血清和肝脏。(A)循环葡萄糖水平的量化。(B, C)相对mRNA表达Fasn(B)和Cyp4a14(C)在肝脏样本中qRT-PCR定量。数据表示均值±SEM。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.005。(D)基于WT (n=12)的平均基因表达水平进行热图(6 WT和6Pparα玫瑰+ / +)和从Pparα/玫瑰−−(n = 6)。(E)维恩图及相关基因本体(GO)功能分析(p≤0.05)，缺少PPARα时，功能向下对应的GO类别为粗体，缺少PPARα时，功能向上对应的GO类别为正体。
接下来，我们使用微阵列评估了肝脏转录组表达模式。我们执行了分层聚类(图3D).在禁食小鼠肝脏中观察到大多数ppar α依赖性变化。使用维恩图显示与营养状态相关的ppar α依赖性变化(图3E).在显著的deg中，3048个与禁食有关，390个与自由喂养的动物有关，156个与被喂食的小鼠有关，提示上下文特异性PPARα活性。结果进一步强调，禁食，而不是喂食或再喂食，引发了更广泛的ppar α依赖性肝细胞反应，大多数与代谢相关的基因上调(图3E).然而，几个基因的表达被确定为PPARα依赖，无论测试的营养状况如何(禁食，但也包括喂食和再喂食)。这些基因在缺乏PPARα的情况下大多下调，途径分析强调了它们参与线粒体脂肪酸分解代谢(见在线补充文件3)。
生物学功能分析表明，转录激活和抑制均对PPARα敏感(图3E). ppar α敏感抑制的功能(GO分类在Pparα/玫瑰−−小鼠)因环境而异，包括与代谢不直接相关的氧化石墨烯类别，包括急性期反应(喂食)、翻译(精炼)和蛋白质糖基化(禁食)。
肝细胞PPARα是空腹时肝脏和全身脂肪酸稳态所必需的
接下来我们使用Pparα/玫瑰−−测定小鼠肝细胞PPARα的贡献，并与Pparα−−/和WT小鼠。我们测量了禁食和非禁食小鼠的FFA和β-羟基丁酸(酮血症)水平(图4A).三种基因型的空腹小鼠血浆FFA均升高，但在Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/将小鼠与对照组进行比较。禁食强烈增加WT小鼠的酮体水平，但在较小程度上增加Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/老鼠。这表明肝脏PPARα是FFA处理和β-羟基丁酸生成所必需的。相应地,禁食Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/小鼠显示肝脏甘油三酯和胆固醇酯升高(图4B)，以及大量小叶中心脂肪变性(图4C)，证实肝脏PPARα表达是禁食诱导的FFA分解代谢所必需的。PPARα缺失导致PPARα靶基因表达缺陷(图4D)，包括脂肪酸分解代谢和脂滴加工(图4E).由于肝细胞缺乏PPARα，Pparα/玫瑰−−与WT小鼠相比，小鼠表现出明显的禁食诱导脂肪酸特征，油酸(C18:1n-9)和亚油酸(C18:2n-6)显著增加(见在线补充文件4)。
空腹是肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)活性的主要诱导物。野生型(WT)肝细胞特异性PPARα敲除(Pparα/玫瑰−−)和PPARα总敲除(Pparα−−/)小鼠自由喂食或禁食24 h后处死。(A)血浆游离脂肪酸(FFAs)和酮体(酮血症)的定量。(B)肝脏甘油三酯和胆固醇酯水平。(C)肝切片H&E染色代表图。比例尺，100µm。(D)相对mRNA表达水平Pparα,Cyp4a14而且Vnn1通过qRT-PCR检测肝脏样本。(E) mRNA表达的定量Acox1,Hmgcs2,Acadl,Fsp27而且Plin5中存在。数据以平均值±SEM表示。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.005。
Hepatocyte-specificPparα缺失会损害本构性和空腹诱导的FGF21表达
FGF21是一种主要由肝脏产生的肝因子。我们检查了肝脏Fgf21mRNA表达(图5A)和血浆FGF21水平(图5B)喂养和禁食的动物。我们在两组中都发现了一个白天的本构表达峰值(ZT8)，以及一个由禁食引发的夜间峰值(ZT16)。在Pparα/玫瑰−−在小鼠中，我们检测了禁食诱导的FGF21的表达/产生是否严格依赖于PPARα的肝脏活性。Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−小鼠在禁食时ZT8或ZT16的血浆FGF21蛋白水平非常低(图5C)。
肝细胞和肝外细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)调节成纤维细胞生长因子21 (FGF21)，空腹血糖和体温。(A和B)以C57Bl/6J为背景的11周龄雄性小鼠自由喂食或禁食24 h，从ZT0到ZT24昼夜不停地处死。(一)Fgf21采用qRT-PCR定量表达mRNA。(B) ELISA法定量循环FGF21水平。(C) 12周龄野生型(WT)， ppar α-肝细胞敲除(Pparα/玫瑰−−)和PPARα敲除(Pparα−−/)雄性小鼠自由喂食或禁食16h，在ZT8(喂食ZT8)或ZT16(禁食ZT16)采血。ELISA法测定血浆FGF21水平。(D-G) WT雄性小鼠;Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/用含有Fgf21 cDNA的腺病毒构建物或空载体感染基因型。ZT14禁食24 h后处死小鼠。(D) ELISA法定量循环FGF21水平。(E)Fgf21, G6pd而且Scd1用qRT-PCR定量mrna。(F)肝脏胆固醇酯和甘油三酯的定量。(G)肝切片H&E染色代表图。比例尺，100µm。(H) WT组从ZT0到ZT24空腹24 H监测血糖水平，Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/老鼠。(I, J)测定饲喂小鼠ZT0时的血糖(I)和禁食小鼠ZT0时的体温(J)。数据以平均值±SEM表示。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.005。
因为FGF21已被证明可以减少脂肪变性和脂毒性脂质13,30.我们怀疑FGF21的缺失是否决定了在小鼠中观察到的空腹诱导脂肪变性Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/老鼠。FGF21的表达通过腺病毒的传递得以挽救Pparα/玫瑰−−而在Pparα−−/老鼠(图5D). FGF21的比较表达(图5E)在小WT肝脏中获得;Pparα/玫瑰−−而在Pparα−−/老鼠。fgf21敏感基因如G6pd而且Scd1对FGF21过表达的反应有显著差异(图5E).然而，FGF21只降低了WT小鼠的肝脏甘油三酯和胆固醇酯，而对小鼠没有作用Pparα/玫瑰−−而在Pparα−−/老鼠(图5F, G)。这些结果表明，禁食诱导的脂肪变性发生在Pparα/玫瑰−−而在Pparα−−/小鼠不依赖于缺乏FGF21。这与我们观察到的FGF21-和ppar α-敏感靶基因不同(见在线补充文件5A)是一致的。此外，这也与观察到的FGF21过表达并不能挽救PPARα靶基因的表达，相反，PPARα敏感的调控发生在Fgf21−−/小鼠(见在线补充文件5B, C)。
除了脂肪酸分解代谢缺陷，Pparα−−/小鼠在禁食期间出现低血糖和体温过低。7因为FGF21对葡萄糖稳态和产热很重要，13我们研究了肝细胞PPARα在控制空腹血糖和体温中的作用。这两个Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/与野生型小鼠相比，空腹小鼠出现低血糖和低体温。然而，这种表型在禁食组要强得多Pparα−−/老鼠与禁食的老鼠比较Pparα/玫瑰−−老鼠(图5H-J)，表明肝外PPARα强烈影响全身葡萄糖稳态和温度，与肝细胞PPARα活性和FGF21产生无关。
空腹增强的肝细胞PPARα活性受时间限制，对脂肪细胞的脂解反应敏感
接下来，我们在体内测试了其他空腹诱导的肝脏PPARα活性的动力学。我们使用了几种PPARα活性的测量方法，包括Fgf21（图5一)和Vanin1,Cyp4a10, Cyp4a14而且Fsp27信使rna (图6A)，因为这些基因对禁食和非诺贝特最敏感，并且严格依赖PPARα(见在线补充文件6-10A)。空腹期间还测量了血浆FFA和葡萄糖水平(图6B). FFA在夜间早期明显升高(ZT14-ZT16)。FFA模式与PPARα mRNA表达谱和PPARα表达谱相关Fgf21,Vanin1,Cyp4a10, Cyp4a14而且Fsp27（图5一个而且6这有力地表明，禁食期间脂肪细胞释放的FFA影响了肝脏PPARα的表达和活性，而没有炎症反应肿瘤坏死因子αmRNA表达对禁食不敏感。我们进一步确定，用β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243急性治疗禁食小鼠可增强WT和Pparα中的循环FFA水平/玫瑰−−老鼠(图6C)，增加的表达Fgf21,Cyp4a14,Vanin1,Cyp4a10而且Fsp27但Pparα无作用/玫瑰−−老鼠(图6D)不诱导Tnf α对禁食或CL316243的反应(见在线补充文件10C和D)。这些数据支持急性脂肪细胞脂解作用作为空腹期间肝细胞PPARα活性的信号。
肝细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)活性由脂肪组织脂肪分解诱导。(A和B)肝脏样本取自雄性野生型(WT) C57Bl/6J小鼠，分别被自由喂养(黑色曲线)或禁食(蓝色曲线)超过24小时。(A)肝脏mRNA表达水平Pparα,Cyp4a14,Vnn1,Cyp4a10, Fsp27和Tnfα采用qRT-PCR定量。(B)测定血糖和游离脂肪酸(FFA)。(C和D) WT和PPARα肝细胞特异性敲除(Pparα/玫瑰−−)小鼠在ZT6处用β3-肾上腺素能受体激动剂CL316243处理，然后在ZT14处处死。(C)血浆游离脂肪酸定量。(D)相对mRNA表达水平Fgf21,Cyp4a14,Vnn1,Cyp4a10而且Fsp27采用qRT-PCR检测。数据以平均值±SEM表示。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.005。
肝细胞PPARα在脂肪性肝炎中起保护作用
接下来，我们检测了在缺甲硫氨酸和缺胆碱饮食(MCD)诱导的体重减轻期间，肝细胞PPARα对慢性脂肪分解的反应是否发生。在啮齿动物中，这种饮食迅速促进脂肪细胞中的脂肪分解，导致脂肪性肝炎。在MCD饮食中，每种基因型的小鼠都表现出体重减轻(图7A)、脂肪变性(图7B)，以及肝脏甘油三酯、胆固醇酯(图7C)和血浆ALT (图7D).与WT相比，Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/小鼠表现出更大的脂肪变性和肝损伤，表明在没有肝细胞PPARα的情况下，MCD饮食诱导的表型更严重。MCD还诱导表达增加Cyp4a14而且Vanin1在WT小鼠中，但没有Pparα/玫瑰−−或Pparα−−/老鼠(图7E)。Fgf21信使rna (图7E)及循环FGF21 (图7F)通过部分依赖于肝脏PPARα的机制而增加。总的来说,hepatocyte-specificPparα缺失加重MCD饮食诱导的肝损伤，与慢性脂解反应中ppar α依赖通路上调缺陷相关。
肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)缺乏加重非酒精性脂肪性肝炎反应蛋氨酸缺乏和胆碱缺乏饮食(MCD)。野生型(WT) PPARα肝细胞敲除(Pparα/玫瑰−−)和PPARα敲除(Pparα−−)小鼠分别饲喂MCD或对照饮食2周，ZT8时处死。(A)测量体重增加超过2周。(B)肝切片H&E染色代表图。比例尺，100µm。(C)肝甘油三酯和胆固醇酯的定量。(D)血浆中丙氨酸转氨酶活性水平。(E)肝mRNA表达水平Cyp4a14,Vnn1而且Fgf21．(F)成纤维细胞生长因子21 (FGF21)的血浆水平。数据以平均值±SEM表示。*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.005。
此外，我们还质疑肝细胞PPARα是否也可能在脂肪变性的早期袭击(如短期暴露于高脂肪饮食(HFD)的反应中发生)中对肝脏的保护所必需。HFD超过2周，小鼠肝脏甘油三酯和胆固醇酯积累。重要的是，这种脂肪变性在Pparα/玫瑰−−与WT小鼠相比，在Pparα−−/鼠标(见在线补充文件11)。总之，这些数据表明，肝脏PPARα在肝脏保护中是必不可少的。
肝细胞PPARα缺乏导致衰老小鼠脂肪变性和高胆固醇血症，但不会导致体重过度增加
最后，我们对肝细胞特异性的长期后果提出了质疑Pparα老化过程中的缺失。更具体地说，由于PPARα在代谢组织中广泛表达，我们的目的是阐明脂肪变性是否在老年全身发展Pparα−−/小鼠是由于肝细胞PPARα活性缺陷。WT,Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/小鼠被喂食标准饮食超过1年。Pparα−−/老鼠，但不是Pparα/玫瑰−−老鼠随着年龄的增长而变胖(图8a - c)。这两个Pparα/玫瑰−−而且Pparα−−/小鼠出现自发性小叶中心脂肪变性(图8D)、肝甘油三酯和肝胆固醇酯升高(图8E)，以及高胆固醇血症(见图8F在线补充文件12)无高血糖(图8总的来说，肝细胞特异性PPARα缺乏足以诱导自发脂肪变性，破坏全身脂肪酸和胆固醇的稳态，但不影响衰老过程中的体重增加和糖尿病。
缺乏肝脏过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)的小鼠在衰老过程中会发生自发的肝脏脂肪变性。野生型(WT) PPARα肝细胞敲除(Pparα消息灵通的−−/)和PPARα敲除(Pparα−−/)老鼠被喂食了51周的食物。所有小鼠在ZT16非禁食状态下被杀死。(A)随着时间的推移体重增加。(B)第11周和第50周体重的比较。(C)三种基因型的52周龄小鼠的代表图片。(D)肝切片H&E染色的代表性图像。比例尺，100µm。(E)肝甘油三酯和胆固醇酯的定量。(F)测定血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。(G)空腹血糖。 Data are shown as mean±SEM. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.005.
讨论
NAFLD是一系列与肥胖密切相关的重大公共卫生问题。NAFLD中积累的大部分肝脂肪酸来自空腹状态下增加的非酯化FFA。17因此，确定肝脏适应这种涌入的机制是至关重要的。FFA的处理过程主要涉及脂肪酸氧化途径，再加上生酮，允许肝脏使用脂质，31这在禁食期间是至关重要的，需要对限速酶进行转录调节。32
全身Pparα−−/小鼠在长时间禁食后表现出应对能力受损，导致脂肪酸氧化缺陷和脂肪变性、低血糖和体温过低。然而，PPARα也通过在其他组织中的表达促进代谢稳态。在这里，我们研究了肝细胞特异性PPARα缺失对体内肝脏生理和脂质代谢的影响。据我们所知，这是第一个报告，选择性PPARα缺失在肝细胞(Pparα/玫瑰−−)足以促进肝脏脂肪变性。
PPARα被几种贝特类药物靶向，33泛激动剂用于PPAR同型21目前正在进行NASH治疗的临床试验。使用Pparα/玫瑰−−在小鼠实验中，我们证明了肝细胞对非诺贝特的自主转录反应，这表明贝特对肝脏基因表达的影响在很大程度上独立于肝外组织。此外，肝脏基因表达谱在未处理之间有显著差异Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−提示肝外细胞PPARα活性显著影响肝脏转录组。
食物限制诱导PPARα活性，内源性PPARα配体的产生需要肝脏脂肪生成，而脂肪生成在喂食后增加。34,35因此，PPARα可能在禁食诱导的脂质分解代谢和对合成代谢脂肪酸衍生信号的响应中起重要作用。我们的数据揭示了由deg定义的PPARα肝细胞活性的上下文依赖性。这种活动在禁食期间明显最高。在禁食期间，肝细胞特异性PPARα缺失导致脂肪变性，血浆FFA增加和酮体受损。这支持了禁食期间从脂肪储存中释放的FFA可能激活PPARα供肝脏使用的概念。因此，我们发现Pparα/玫瑰−−小鼠在禁食期间会在肝脏中积累高油酸和亚麻酸(见在线补充文件4)，这与这两种脂肪酸都是储存在小鼠白色脂肪组织中的主要脂肪酸这一事实是一致的。36重要的是，我们发现循环FFA增加的动力学与PPARα及其几个靶基因的表达高度相关。此外，β3-肾上腺素能受体激动剂通过PPARα在体内进一步增强了这种反应，但没有诱导由toll样受体4 (TLR4)驱动的有害ffa敏感反应。这可能是由于从脂肪储存中释放的FFA的混合物。的确，脂肪酸积聚在肝脏Pparα/玫瑰−−禁食期间的小鼠主要是油酸(C18:1n-9)和亚油酸(C18:2n-6)，而不仅仅是饱和脂肪酸，如棕榈酸(C16:0)。有趣的是，研究表明棕榈酸在不饱和FFA存在时不能激活TLR4。37
总的来说，我们的数据强调了脂肪细胞释放的脂肪酸对肝脏PPARα活性的调节。这与先前的证据相反，PPARβ/δ而不是PPARα可能作为FFA传感器。38然而，我们的数据支持这种脂肪来源的信号是有时间限制的，并且在傍晚特别有效的可能性。此外，其他途径可能通过提供配体来影响PPARα的活性。34,35,39,40几种胰岛素敏感信号机制影响肝脏PPARα，脂肪细胞的脂解是胰岛素敏感的。41因此，胰岛素可能通过细胞自主机制和脂肪细胞脂解诱导FFA释放介导的器官间通讯来协调肝脏PPARα。我们的发现也与最近的证据相一致，即脂肪细胞的脂解作用可能调节肝脏Fgf21。42禁食期间循环的FGF21严格依赖于肝细胞PPARα的激活。大多数循环中的FGF21来源于肝脏43而且Pparα−−/小鼠很少显示FGF21。11,12其他转录因子也可调节肝脏Fgf21表达式44-48PPARα也在肝外组织中表达。13我们在Pparα/玫瑰−−在喂食和禁食状态下，没有肝脏PPARα的小鼠都很少显示FGF21。Pparα−−/小鼠在禁食期间出现低血糖和体温过低7而FGF21因其对葡萄糖稳态和产热的内分泌作用而闻名。13然而，与禁食相比Pparα−−/老鼠,禁食Pparα/玫瑰−−小鼠的低血糖和体温降低，而FGF21在两个模型中同样不存在。这表明，在禁食期间，肝细胞外PPARα强烈影响全身葡萄糖稳态和温度，独立于肝细胞PPARα和FGF21的产生。此外，FGF21在不同的小鼠模型中预防脂肪变性13,30.和FGF21降低WT小鼠肝脏脂质，其过表达不足以保护脂质积聚Pparα/玫瑰−−而在Pparα−−/老鼠。因此，缺乏FGF21不是主要原因的脂肪变性观察Pparα/玫瑰−−老鼠。
肝脏PPARα的缺乏会损害肝脏利用急性脂肪分解产生的FFA的能力，导致脂肪变性。MCD饮食诱导的体重减轻49,50也与肝脏PPARα活性相关，表明慢性脂肪分解可提高非禁食小鼠的肝细胞PPARα活性。与在全身ppar α缺失小鼠中的发现一致，20.我们的数据表明，缺乏肝细胞PPARα足以增加MCD饮食诱导的肝损伤。脂肪性肝炎中FGF21表达/循环水平升高，支持FGF21升高可能反映了在不禁食的情况下肝脏应激。MCD饮食诱导的FGF21增加并非严格依赖ppar α，这与氨基酸剥夺通过ATF4诱导肝脏FGF21表达的发现一致。44PPARα的存在导致更大的FGF21增加，并可能有助于保护肝脏免受脂毒性脂质积聚的影响。30.
MCD饮食被广泛用于临床前NASH研究。然而，它有许多局限性，包括在喂食这种饮食的小鼠身上发生的重要体重减轻。因此，我们还测试了肝细胞PPARα在短期高脂饲料的脂质稳态中的作用，这足以启动可能促进NAFLD的早期中性脂质积累。Pparα/玫瑰−−高热量膳食喂养2周后，小鼠肝脏脂肪变性显著增加(见在线补充文件11)，这表明肝细胞PPARα在外源性(饮食)和内源性(从脂肪细胞脂肪分解释放)脂肪酸稳态中起双重作用。
之前的研究表明Pparα−−/小鼠显示出系统脂代谢的显著改变，导致衰老小鼠肝脏脂肪变性。由于PPARα在骨骼肌中很活跃，23脂肪组织,24,25肠、26肾脏27和心脏,28这些都有助于脂肪酸的稳态，无法确定是否自发脂肪变性发生在衰老Pparα−−/小鼠来源于肝细胞PPARα活性的缺陷。这促使我们调查与年龄有关的差异Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−老鼠。在老化期间,Pparα−−/小鼠变得超重并发生脂肪变性，而Pparα/玫瑰−−小鼠只出现脂肪变性。因此，肥胖和高血糖都不会促进NAFLD，15,16是肝细胞特异性PPARα缺失小鼠脂肪变性的原因。
此外,这两个Pparα−−/而且Pparα/玫瑰−−衰老的小鼠高胆固醇血症。这可能是由于载脂蛋白基因表达失调以及胆固醇运输(Abcg8)显示在微阵列分析(见在线补充文件12A)。也有可能在缺乏PPARα的情况下，由SREBP-2驱动的胆固醇生物合成途径可能失调，因为一些SREBP-2基因在PPARα中升高Pparα−−/和/或在Pparα/玫瑰−−小鼠(见在线补充文件12B)。因此，这表明激活肝细胞PPARα的药物可能会影响全身脂肪酸和胆固醇的稳态。
总的来说，我们广泛的分析在Pparα/玫瑰−−在小鼠实验中，PPARα在肝细胞脂肪酸稳态中的中心作用(图9)。PPARα对于脂肪酸稳态的许多方面都是非常重要的，包括通过氧化途径降解。我们的工作首次证明，在禁食、MCD和HFD喂养以及衰老过程中，肝细胞特异性PPARα缺失会损害全身脂肪酸稳态。这些发现强调了PPARα在清除膳食脂肪酸和脂肪细胞释放的FFA中的核心作用，脂肪细胞是NAFLD中脂质积聚的主要来源。这些数据强调了PPARα作为NAFLD治疗药物靶点的相关性。
肝细胞特异性过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)调控基因参与脂肪酸代谢的概述。该图是根据肝细胞ppar α依赖基因表达的转录组分析设计的。常规字体所列的基因在野生型(WT)中是由非诺贝特和禁食诱导的，而在野生型(WT)中不是Pparα/玫瑰−−老鼠。斜体中的基因在WT中被非诺贝特和禁食抑制，但在WT中没有Pparα消息灵通的−−/老鼠。粗体中引用的基因在Pparα/玫瑰−−与WT小鼠相比，无论在什么条件下
致谢
我们感谢EZOP的所有工作人员，特别是Colette Bétoulières，她从这个项目的早期开始就提供了仔细和出色的帮助。我们感谢Aurore Dequesnes和Laurent Monbrun在血浆生物化学方面的出色工作。我们感谢Christine Salon和Florence Capilla在组织学方面的出色工作。我们感谢Genotoul: Anexplo, Get-TriX和metatul - lipidomic设施的工作人员。作者要感谢Daniel Metzger教授，Pierre Chambon教授(IGBMC, Illkirch, France)和小鼠临床研究所(Illkirch, France)的工作人员对这个项目的重要支持。我们感谢Didier Trono教授(EPFL，洛桑，瑞士)为我们提供了白蛋白cre小鼠。我们感谢David Mangelsdorf教授(Howard Hughes Medical Institute, Dallas, TX)和Steven Kliewer教授(UT Southwestern, Dallas, TX)为我们提供了缺乏fgf21的小鼠。我们感谢Alice Marmugi和Géraldine Michel的技术援助。我们感谢Bertrand Cariou教授和Bart Staels教授的建设性讨论。
参考文献
补充材料
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补充数据
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- 数据补充1-在线补充
脚注
贡献者AM发起项目，设计实验，执行实验，分析数据，撰写论文。AP、EF、SD、YL、FL、MR、CL、FB和AI参与了实验设计、实验执行和数据分析。VB设计并完成了一个关键实验。JB-M, TAS, PC和LL提供了关键分析和技术支持。SL对数据进行了分析。GM、FR和TP提供了关键材料，并为项目设计做出了贡献。NL、CP和DL对设计项目和监督实验做出了重要贡献。WW提供关键试剂，设计方案，分析数据，撰写论文。HG设计了项目，进行了实验，分析了数据，并撰写了论文。
资金这项工作由人类前沿科学计划(HFSP) (WW)、新加坡南洋理工大学李光前医学院(给WW)的创业资助、SFN(给HG)、ANRs ' Crisalis(给CP和HG)、Obelip(给DL、CP、AM和HG)资助。DL是法国大学学院(Institut Universitaire de France)的成员。AM, DL, WW和HG由Région Midi-Pyrénées支持。
相互竞争的利益没有宣布。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明基因表达阵列原始数据如手稿所示存放在GEO中。