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客观的内质网(ER)压力是参与肝损伤,但分子的决定因素在很大程度上是未知的。本研究调查的角色pleckstrin homology-like域,家人,会员3 (PHLDA3)在肝细胞死亡引起的ER压力和监管的基础。
设计肝PHLDA3表达式在丙肝病毒肝炎患者评估,在一些与ER应激动物模型。Immunoblottings、PCR、报告基因,染色质免疫沉淀反应(芯片)和突变分析探索基因调控。功能性PHLDA3对肝损伤的影响验证使用慢病毒的成分。
结果PHLDA3是过表达与肝细胞损伤患者的急性肝衰竭、肝硬化或在toxicant-treated老鼠。在丙肝病毒肝损伤患者,PHLDA3调节与ER应激标志的感应。治疗小鼠衣霉素(Tm)(一个ER应激诱导物)增加PHLDA3表达式在肝脏。X框结合蛋白1 (Xbp1)是新发现的转录因子负责PHLDA3表达式。Inositol-requiring酶1 (IRE1) (Xbp1的上游调节器)被Tm PHLDA3感应所需,而其他途径(c-Jun n端激酶(物),蛋白激酶RNA-like内质网激酶(活跃)和激活转录因子6 (ATF6))。PHLDA3超表达与肝细胞损伤的严重程度在动物或细胞ER应激模型。在p53-deficient细胞ER应激诱发transactivated PHLDA3降低细胞生存能力。ER应激肝细胞死亡取决于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(一种蛋白激酶)由PHLDA3抑制。慢病毒的交付PHLDA3 shRNA老鼠废除p-Akt抑制肝脏中Tm,衰减肝细胞损伤。
结论在肝细胞ER应激诱发PHLDA3通过IRE1-Xbp1s通路,促进肝损伤的抑制一种蛋白激酶。
- 肝
- 肝细胞
- 细胞凋亡
- 基因表达
- 细胞信号传导
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
严格监管的内质网(ER)应激反应在细胞命运决定,生物的生存至关重要。在肝细胞ER体内平衡是很重要的,一个ER-rich细胞类型。
持续的或未解决的ER应激会导致肝细胞功能障碍和死亡的过程中肝脏疾病。恢复ER体内平衡提供了一个治疗原理,但是新的分子靶点需要确认。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(一种蛋白激酶)作为一个关键的信号节点调节细胞增殖和能量代谢。
Pleckstrin homology-like域,家庭成员三(PHLDA3)是一种蛋白激酶的p53-regulated抑制器和作为一个肿瘤抑制基因在肺和胰腺神经内分泌肿瘤。
有什么新发现吗?
PHLDA3表达升高患者不同肝脏疾病伴随肝细胞损伤和ER应激。
ER应激增加PHLDA3表达肝细胞,它是由inositol-requiring酶1 (IRE1) -Xbp1s通路,但不是通过c-Jun n端激酶(物),蛋白激酶RNA-like内质网激酶(活跃)和激活转录因子6 (ATF6)通路。
X框结合蛋白1 (Xbp1)是一种以前未被发现的独特的转录监管机构PHLDA3基因。
PHLDA3诱发ER应激通过一种蛋白激酶抑制肝细胞死亡,即使在p53-deficient条件发生。
抑制体内PHLDA3改善ER stress-mediated肝损伤。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们的研究结果提供了一个新的见解PHLDA3受IRE1通路在微调的命运在急性或慢性肝病肝细胞,并可能提供一种新的和有吸引力的治疗策略治疗ER跟压力的病理条件。
介绍
肝脏所需提供功能维持血浆蛋白和生产蛋白质必不可少的胆固醇生物合成和生物转化的外源性物质。在肝细胞内质网(ER)体内平衡是很重要的,一个主要的细胞类型丰富的ER内容自ER是合成的细胞器,蛋白质的折叠和贩卖。1,2错误折叠蛋白质的积累导致ER应激反应在各种条件下,包括营养不足和氧化应激。1 - 3在临床情况下,分泌功能(如白蛋白)是减少患者肝炎或肝硬化。4因此,持续或未解决的ER应激可能占肝细胞功能障碍和死亡的过程中急性或慢性肝病。1 - 3
展开的蛋白质反应(UPR)是一个早期的自适应机制,维护ER的功能能力。UPR过程主要由三个规范ER压力传感器:inositol-requiring酶1 (IRE1),蛋白激酶RNA-like内质网激酶(活跃)和激活转录因子6 (ATF6),并在细胞的生存起着至关重要的作用。1,2一旦激活,信号通路导致体内平衡的恢复或可以或者激活级联事件,最终导致细胞死亡。1,2然而,传感器,确定细胞死亡后的执行ER压力尚未完全阐明。此外,分子负责ER应激后伴随肝损伤肝细胞的命运在很大程度上是未知的。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(一种蛋白激酶)作为一个节点在不同的生长因子受体激酶信号级联下游和控制细胞增殖和能量代谢。5的pleckstrin homology-like领域,家庭成员3 (PHLDA3)被认定为PH值领域仅蛋白抑制一种蛋白激酶。6PHLDA3可能限制细胞增殖和作为一个肿瘤抑制基因在肺癌和胰腺癌。6,7尽管这些发现表明PHLDA3反对Akt的拮抗效果,这个事件所涉及的细胞和分子决定因素尚不清楚。此外,它没有探索PHLDA3是否有不利影响急性或慢性肝脏疾病与ER应激。此外,的信号通路PHLDA3控制基因表达在很大程度上仍是个未知数。
证据和缺乏了解的监管网络PHLDA3鼓励我们假设ER应激诱发PHLDA3并促进肝细胞在肝脏疾病去世。在这里,我们提供了证据表明PHLDA3表达式是增强肝脏的急性肝衰竭患者丙型肝炎和肝硬化和肝炎的动物模型。我们的数据也表明,X框结合蛋白1 (Xbp1)作为转录因子诱导PHLDA3基因,这取决于IRE1但不是c-Jun n端激酶(物),导致肝细胞死亡通过抑制一种蛋白激酶。揭示这个,我们进行了生物信息学方法和分析人类样本的理解它的作用在人类肝脏病理学和雇佣一些慢性或急性肝脏疾病动物模型。此外,我们的结果从功能丧失或功能实验使用肝细胞和慢病毒输送系统的shRNA针对PHLDA3体内揭开新的功能性角色PHLDA3在肝细胞死亡的事件引起的ER应激。
材料和方法
综合网络分析
从基因表达获得基因表达数据综合(GSE25097)。中描述的程序分析在线补充。
丙肝患者样本
肝炎(丙型肝炎患者肝脏样本不低于正常上限的丙氨酸转氨酶(ALT) (ULN 40 U / L), N = 3)或肝炎患者(> 4乘以ULN, N = 3)。综述了研究使用人类样本和机构审查委员会批准。
动物治疗
依法进行了动物实验动物使用和护理机构委员会指南在首尔国立大学。雄性C57BL / 6小鼠在6周的年龄是腹腔内(i.p)注射一剂衣霉素(Tm);2毫克/公斤)和受到分析在24 - 72 h。在体内可拆卸的实验中,小鼠注射慢病毒表达控制成分或PHLDA3成分通过尾静脉(2×107200年病毒μL磷酸缓冲盐(PBS)鼠标)。注射后七天,老鼠接受车辆或Tm(2毫克/公斤,i.p。)和72 h后被杀害。
RNA隔离和实时rt - pcr检测
总RNA提取试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国),reverse-transcribed获得的互补。使用光周期计1.5执行定量一(罗氏,曼海姆,德国)。
细胞培养
HepG2(人类hepatocyte-derived细胞株)和AML12(鼠标hepatocyte-derived细胞株)从美国购买类型文化集合(写明ATCC)(美国马里兰州罗克维尔市)。隔离原发性肝细胞从老鼠在网上补充描述。
瞬时转染和报告基因化验
向量的来源和过程在本研究用于转染和报告基因检测提供了在线补充。
细节在体外和体内的研究在网上补充材料和方法。
结果
PHLDA3超表达患者的肝脏疾病
解开的生物学意义PHLDA3在临床肝脏疾病进展情况,我们分析了人类地理数据库(GSE25097)在公共领域。在肝硬化患者,PHLDA3和Akt的变化水平密切相关的分子参与凋亡基因网络与健康人相比图1),一贯PHLDA3 mRNA水平显著升高肝硬化肝脏,p53的是那些调节细胞凋亡的调制器(彪马,一个基因与细胞损伤引起的ER应激)8(图1B):彪马和PHLDA3 mRNA水平之间存在很强的相关性,提示PHLDA3的作用作为一个潜在的肝细胞死亡的分子标记。此外,分子增强ER应激如Bcl-2-associated X蛋白(伯灵顿)和彪马中直接或间接地与PHLDA3基因网络。在另一组地理数据库的分析(GSE38941)源自于急性肝衰竭患者,PHLDA3水平升高的肝细胞坏死程度增加(图1C)。
Pleckstrin homology-like域,家庭成员三(PHLDA3)超表达不同肝脏疾病患者。(一)PHLDA3协会和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(一种蛋白激酶)apoptosis-related基因网络。填充颜色表明基因调节(红色)或表达下调(蓝色)在肝硬化患者的肝脏与健康受试者相比。(c) PHLDA3表达患者的肝硬化或肝衰竭。B、肝PHLDA3或p53调节细胞凋亡的调制器(PUMA) mRNA水平进行分析在健康个体或肝硬化患者(GSE25097)。C, PHLDA3 mRNA水平分析了患者在健康个体或HBV-associated急性肝衰竭(GSE38941)。SHN submassive肝坏死;MHN,大量肝坏死。(D) PHLDA3表达HCV肝炎患者。定量一(存在)化验PHLDA3或immunoblottings PHLDA3, 78 kDa glucose-regulated蛋白质(GRP78)和Xbp1s针对丙肝病毒患者肝脏样本。 No hepatitis, subjects with lower than upper limit of normal (ULN) in ALT; and hepatitis, subjects with >4 times ULN in ALT. (E) Increases of PHLDA3 or endoplasmic reticulum (ER) stress marker mRNAs after liver injury. Mice were injected with vehicle or carbon tetrachloride (CCl4)(0.6毫升/公斤,i.p。,24 h) (N=3 or 6) or fed on a control diet or alcohol Lieber–DeCarli liquid diet for 5 weeks (N=9 or 11). (F) The effect of chemical chaperone on acetaminophen (APAP)-induced liver injury. Mice were injected with vehicle or phenyl butyric acid (PBA) (100 mg/kg, i.p.) 2 h prior to the treatment with vehicle or APAP (500 mg/kg, i.p., 6 h) (N=5 each). For B–F, data represent the mean±SE. Statistical significance of the differences between healthy individuals and patients with cirrhosis (B) or patients with liver failure (C) (**p<0.01) or HCV patient with hepatitis (D) or between each treatment group and the control (E) (*p<0.05, **p<0.01) or APAP (F) (#p < 0.05,# #p < 0.01)。
它已经表明,丙肝病毒感染患者表现出ER应激在肝脏。9我们发现PHLDA3 mRNA水平显著更大的有肝炎的丙型肝炎患者(> 4次ULN ALT)比那些没有肝炎(低于ULN) (图1D左边和中间)。一致,PHLDA3蛋白质含量升高有肝炎的丙型肝炎患者的增加78 kDa glucose-regulated蛋白GRP78和Xbp1s (ER应激标记)(图1D)。我们下一个问PHLDA3是调节动物由其他病理条件诱导ER应激。单个注射四氯化碳(三地4老鼠(24小时)或5%乙醇的饮食喂养5周显著提高PHLDA3, GRP78和肝脏中Xbp1s转录水平(图1E左);PHLDA3和Xbp1s mRNA水平之间存在着正相关(图1右)。在一个单独的动物实验中,我们使用对乙酰氨基酚作为不同肝脏毒物有或没有女伴的化学处理,并发现对乙酰氨基酚治疗增强PHLDA3和肝脏中GRP78转录水平,显著减毒的苯基丁酸(PBA) (图1F)。这些发现指示我们的注意力在ER stress-mediated PHLDA3肝脏损伤的潜在作用。
PHLDA3诱导的肝细胞ER应激
接下来,我们试图确定ER应激的影响PHLDA3表达式在肝脏和肝细胞。治疗小鼠单剂Tm逐渐和大幅PHLDA3 mRNA水平升高在肝脏(图2),一直PHLDA3蛋白质含量明显增加,GRP78。此外,免疫组织化学显示PHLDA3过度静脉周围地区的Tm治疗后第三天。由于AML12是一个非转换肝细胞细胞系,典型的肝细胞功能,10我们主要使用细胞系对肝细胞研究ER应激的影响。治疗AML12细胞与Tm PHLDA3水平增加时间的方式(图2B)。类似的观察增加后24 h thapsigargin (Tg)治疗。Tm增加PHLDA3表达式的能力验证在初选HepG2细胞或鼠肝细胞(图2C)。验证ER应激的作用PHLDA3的感应,我们对化学陪伴降低ER应激的影响。正如所料,治疗AML12细胞tauroursodeoxycholic酸(TUDCA)或PBA废除了Tm的诱导能力PHLDA3 (图2D)。我们的结果显示ER应激的影响在PHLDA3诱导的肝细胞,表明PHLDA3在肝细胞损伤的作用引起的ER应激。
增加pleckstrin homology-like域,家庭成员三(PHLDA3)表达式由内质网(ER)压力。(一)PHLDA3 ER应激诱导的肝脏。定量一(存在),immunoblottings或免疫组织化学PHLDA3是老鼠的肝脏注射车辆或衣霉素(Tm) (N = 4)。酒吧规模:200μm。数据代表均值±SE(明显不同与车辆相比,* * p < 0.01)。(c) PHLDA3 ER应激诱导的肝细胞。AML12细胞治疗与Tm(2μg /毫升)表示时间或thapsigargin (Tg)(0.3μM) 24 h。HepG2和鼠原发性肝细胞处理5和2μg / mL Tm,分别。(D)的影响化学陪伴PHLDA3归纳。HepG2细胞使用100μM tauroursodeoxycholic酸(TUDCA)或1毫米4-phenyl丁酸(PBA) 1 h与Tm,不断孵化。 For B–D, data represent the mean±SE of three separate experiments. Statistical significance of differences between each treatment group and the control (*p<0.05, **p<0.01) or Tm (#p < 0.05,# #p < 0.01)。
PHLDA3 Xbp1s-mediated转录诱导
阐明ER应激PHLDA3感应的底层基础,我们提出,转录因子(s)激活transactivation ER应激导致了基因。我们假定这转录激活发生在肝细胞,假定的dna结合网站将会出现在基因启动子。我们发现三个假定的Xbp1-binding网站PHLDA3基因启动子。此外,使用促销分析允许我们预测转录因子提取潜在的增加PHLDA3表达式,其中Xbp1是唯一的蛋白质参与UPR通路。治疗AML12细胞与Tm极大地促进了荧光素酶表达从记者构建包含−2.5 kb人类PHLDA3基因(图3A)。Tm暴露在老鼠增加了Xbp1s mRNA水平(一个活跃的形式作为拼接Xbp1)在肝脏(参见图S1A在线补充)。一致,ER-localised DnaJ II型同系物4 (ERdj4),目标基因由Xbp1控制,调节,时间进程相当与PHLDA3 mRNA。时间进程的一项研究也证实ER应激诱导Xbp1 AML12细胞信使rna和蛋白质(参见图印地在线补充和就是S1C): Xbp1s mRNA最大限度增加3 - 6 h Tm治疗后,仍高在12 - 24 h,这与逐步增加Xbp1s蛋白质水平3-24 h(即Xbp1 mRNA增加蛋白诱导)之前。Xbp1s蛋白质的动力学PHLDA3 mRNA的平行。
PHLDA3基因诱导由Xbp1s内质网(ER)压力。(一)TransactivationPHLDA3ER基因的压力。Pleckstrin homology-like域,家庭成员三(PHLDA3)启动子记者活动以AML12细胞处理车辆或衣霉素(Tm)(0.2或2μg /毫升)12 h与pGL3-PHLDA3转染后构造(0.5μg, 12小时)。(B) X框结合蛋白1 (Xbp1)绑定PHLDA3启动子。芯片进行化验HepG2细胞溶解产物的处理5μg /毫升Tm。dna蛋白质复合物沉淀了anti-Xbp1抗体并使用侧翼受到PCR扩增引物为Xbp1-response元素(Xbp1-REs)。免疫球蛋白免疫沉淀反应代表消极的控制。Xbp1绑定验证了使用引物的特异性启动子目标无关的地区。十分之一的交联溶解产物作为输入控制。(C) qPCR化验Xbp1和Xbp1-RE1绑定。(D) Xbp1-RE1突变的影响在PHLDA3 transactivation。 (E) PHLDA3 transactivation by Xbp1s overexpression. AML12 cells were transfected with the PHLDA3 luciferase construct in combination with Mock or Xbp1s-overexpressing construct (as an active form of Xbp1, 0.5 or 1 μg). (F) The effect of Xbp1 knockdown on PHLDA3 induction. AML12 cells were treated with Tm after transfection with control siRNA or Xbp1 siRNA for 48 h. For A and C–F, data represent the mean±SE of three separate experiments. Statistical significance of differences between each treatment group and the control (*p<0.05, **p<0.01) or Tm (# #p < 0.01)。
验证在PHLDA3 Xbp1感应的影响,我们试图评估Xbp1绑定PHLDA3基因启动子。假定的dna结合蛋白的网站(Xbp1-RE1, RE2公司和RE3), Xbp1与网站互动位于远端地区(RE1;1764−−1755个基点),显示芯片分析(图3B);Xbp1的特异性结合使用了非特异性引物也是目标无关的启动子区域。qPCR分析验证Xbp1和Xbp1-RE1绑定(图3C)。此外,突变transactivate Xbp1-RE1废除Tm的能力PHLDA3基因(图3D)。这种效果验证了在小鼠原发性肝细胞(参见图S1D在线补充)。一致,Xbp1s超表达明显促进PHLDA3基因transactivation (图3E),而Xbp1击倒完全抑制PHLDA3过度Tm (图3F)。相比之下,Xbp1不足影响Tm CCAAT-enhancer-binding诱导蛋白质同源蛋白质(切),表明相互独立的途径。在一起,这些数据表明,由ER应激transactivates Xbp1诱导PHLDA3基因,这是有别于ER压力激发了砍通路。
监管PHLDA3感应的UPR通路
发现Xbp1拼接激活PHLDA3感应促使我们需要寻找上游UPR监管途径。因为Xbp1 mRNA的拼接其活性形式取决于IRE1核酸内切酶的活动,11我们确定的角色IRE1 PHLDA3感应的ER应激。正如所料,IRE1击倒Xbp1s的增加和减少PHLDA3 Tm (图4自IRE1)。有一个激酶活性,导致物活化,12我们评估是否PHLDA3感应的ER应激依赖于物。JNKi治疗(物抑制剂)未能影响增加PHLDA3 Tm或Tg治疗(图4B)。我们另外评估的磷酸化信号传感器和转录激活3 (STAT3)在这个实验中。Tm治疗增加STAT3酪氨酸磷酸化(一个活跃的形式),这种效应被JNKi(减毒图4B) (Tg未能增加p-STAT3大概是因为它有一个不同的ER应激机制),表明STAT3的缺乏与PHLDA3感应ER应激。转染的显性负(DN)活跃突变或ATF6 siRNA影响PHLDA3感应(图4C)。总的来说,我们的研究结果表明,Xbp1s-mediated PHLDA3感应的ER应激特别依赖于核酸内切酶活动的独立IRE1激活物或其他压力传感器。
Inositol-requiring酶1 (IRE1)端依赖诱导pleckstrin homology-like域,家人,会员3 (PHLDA3)。(A)的影响IRE1击倒PHLDA3感应。(B)的影响c-Jun n端激酶(物)抑制PHLDA3 mRNA, p-c-Jun或传感器信号转换和转录激活3 (STAT3)的水平。AML12细胞暴露于20μM JNKi 1 h,并不断接受衣霉素(Tm)或thapsigargin (Tg)。(C)蛋白激酶的影响RNA-like内质网激酶(活跃)或激活转录因子6 (ATF6)抑制。AML12(左)和HepG2细胞(右)治疗后Tm转染与模拟或显性负(DN)活跃构造或控制或ATF6核。Immunoblottings p-PERK和ATF6 (90 kDa形式)确诊DN-PERK的影响和小干扰rna转染ATF6,分别。得了,数据代表三个独立实验的均值±SE。统计学意义的差异治疗组和控制(* * * p < 0.05, p < 0.01)或Tm (#p < 0.05)。
PHLDA3对ER应激引起的细胞死亡的影响
不同的病理生理情况下通过ER应激激活导致细胞死亡。血清剥夺会导致能量不平衡,导致细胞ER应激。13,14因此,我们研究了血清饥饿影响PHLDA3表达和细胞生存能力。PHLDA3 mRNA明显增加血清剥夺AML12细胞,是符合Xbp1s mRNA的变化(见图S2A在线补充),它支持Xbp1s增加ER应激导致PHLDA3超表达。血清饥饿明显减少细胞生存能力,由化学治疗废除监护人(参见图开通在线补充),表明ER应激发挥作用在细胞死亡引起血清剥夺(增加PHLDA3 mRNA水平后24 h血清饥饿可能部分由于UPR signalling-independent,例如,p5315)。这些结果支持这样的观点:PHLDA3超表达ER应激与肝细胞死亡有关。
确定的角色PHLDA3 ER应激诱导肝细胞损伤,我们接下来评估功能PHLDA3和肝损伤小鼠之间的联系。Tm管理导致小鼠肝PHLDA3水平的增加不仅所示图2一个,而且在血清转氨酶活动(例如,ALT和天冬氨酸转氨酶(AST)),并存在高度显著相关(图5)。我们在末端转移酶逐渐增加确诊dUTP缺口末端标记(TUNEL)阳性细胞在肝脏,也与PHLDA3表达水平呈正相关。验证PHLDA3和细胞死亡之间的因果关系,我们检查了PHLDA3调制对细胞活力的影响减少了ER应激。PHLDA3击倒阻止Tm减少细胞生存能力(图5B),一贯PHLDA3超表达显著减少细胞生存能力和增强的Tm的细胞毒性效应。我们验证了ER应激的影响监管机构负责PHLDA3表达在细胞生存能力通过调制Xbp1或IRE1。Xbp1击倒PHLDA3(一样有类似的效果图5C)。过度Xbp1s倾向于增加Tm的效果,但在统计学上微不足道的数量可能是因为Xbp1s激活Tm可能足够了PHLDA3感应和/或Xbp1s也可能参与细胞生存的适应性反应。16,17此外,缺IRE1启用AML12对ER应激细胞生存,这影响是废除PHLDA3超表达(图5D)。PHLDA3超表达细胞增殖率下降(见图S3在线补充)。
致病作用pleckstrin homology-like域、家庭,会员3 (PHLDA3)内质网(ER)压力诱导细胞死亡。(A)之间存在一种正相关PHLDA3肝脏和血清转氨酶或TUNEL积极性。老鼠接受衣霉素(Tm)中描述图2答:每组四个独立样本被用于分析。酒吧规模:100μm。(B) PHLDA3调制的影响ER应激细胞死亡。转染后HepG2(左)或AML12(右)细胞与控制或PHLDA3 siRNA或模拟或PHLDA3构造,细胞与Tm不断孵化。(C)的影响X框结合蛋白1 (Xbp1)调制ER应激细胞死亡。AML12细胞转染与控制或Xbp1 siRNA或模拟或与Tm Xbp1s构造和治疗。(D)衰减的ER应激细胞死亡inositol-requiring酶1 (IRE1)击倒,和这种效应的逆转PHLDA3超表达。在p53-null细胞(E) PHLDA3感应。SKOV3细胞治疗thapsigargin (Tg)(1μM)或Tm(2μg /毫升)对转染后24 h PHLDA3荧光素酶构建单独或结合模拟或Xbp1s构造。(F)对SKOV3细胞ER应激诱导的细胞毒性效应。 For B–F, data represent the mean±SE of at least three samples. Statistical significance of differences between each treatment group and the control (**p<0.01) was determined.
根据我们的观察,Xbp1的转录因子PHLDA3报告,p53基因和转录激活它,6我们问是否ER应激诱发PHLDA3和可以执行细胞死亡在p53的缺失。在SKOV3细胞p53的不足,18Tg或Tm治疗增加了PHLDA3基因transactivation, Xbp1s超表达(图5E),持续治疗与Tg或Tm显著减少细胞生存能力图5F)。总的来说,我们的研究结果支持PHLDA3超表达ER应激通过IRE1-Xbp1s途径导致细胞毒性,即使没有p53。
一种蛋白激酶抑制作用由PHLDA3 ER应激细胞死亡
鉴于PHLDA3之间的联系和Akt为核心的信号网络中节点proapoptotic分子(图1A)的影响,PHLDA3 Akt活动为抗肿瘤效果,6我们提出PHLDA3是否抑制Akt介导ER应激细胞死亡。的确,p-Akt水平明显降低HCV肝炎患者肝脏的相比之下,那些没有肝炎(图6),这与PHLDA3感应(图1D)。此外,我们测量p-Akt小鼠接受Tm水平。基底p-Akt水平在肝脏被Tm下降,与PHLDA3水平负相关(图6B)。还有TUNEL-positive细胞数量和p-Akt之间的负相关。此外,我们发现Tm的抑制作用p-Akt逆转PHLDA3击倒,但被PHLDA3增强超表达肝细胞细胞模型(图6C)。接下来,我们评估的影响磷脂酰肌醇3-kinase (PI3-K)或特定Akt抑制剂单独或结合ER应激诱导的细胞生存能力。治疗AML12细胞LY294002 (PI3-K抑制剂)细胞的生存能力下降∼30%和增强Tm的细胞毒性效应(∼70%)(图6D)。A443654(特定Akt抑制剂)治疗作用增加了Tm效应(∼90%),尽管A443654仅仅只有一个小的效果。一致,PHLDA3过度强化LY294002的细胞毒性效应或A443654。地址是否PHLDA3参与建立机制,损害一种蛋白激酶信号,我们测量p-IRS1 p-JNK;PHLDA3击倒稍微增强IRS1 (Ser307)或物磷酸化(图6E),这可能反映了自适应变化(PHLDA3抑制Akt招聘到质膜,6一个事件从IRS1下游)。所以,PHLDA3抑制Akt可能不直接链接到IRS1磷酸化或物信号。总的来说,我们的研究结果表明,PHLDA3超表达ER应激抑制一种蛋白激酶磷酸化,促进肝细胞的死亡。
的影响pleckstrin homology-like域、家庭,会员3 (PHLDA3)介导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(一种蛋白激酶)抑制肝细胞死亡。(一)一种蛋白激酶抑制丙型肝炎患者的肝脏。Immunoblottings p-Akt和总Akt的形式进行对肝脏匀浆中使用图1d (B) PHLDA3 p-Akt或p-Akt之间成反比关系,TUNEL积极性在肝脏。Immunoblottings p-Akt是肝脏标本上进行。(C)的影响PHLDA3击倒或超表达p-Akt和总Akt的水平。(D)的影响磷脂酰肌醇3-kinase (PI3-K)和Akt抑制剂在内质网(ER)压力诱导细胞死亡。AML12细胞治疗LY294002(20μM)或A443654(2μM)结合车辆或衣霉素(Tm) 24小时或与模拟或PHLDA3转染24 h。(E)的影响PHLDA3击倒p-IRS1或p-c-Jun n端激酶(物)的水平。对于罪犯来说,数据代表均值±SE的至少三个样品。统计学意义的差异治疗组和控制(* * * p < 0.05, p < 0.01)。
改善肝损伤的慢病毒PHLDA3成分
作为持续努力验证PHLDA3对肝细胞损伤的影响,我们采用慢病毒输送系统的shRNA干扰PHLDA3表达在一个小鼠模型(图7),发现这种效应阻止Tm的抑制肝脏p-Akt (图7B)。PHLDA3击倒也阻止了组织学变化,包括肝细胞膨胀、变性和坏死,引起Tm (图7TUNEL C)。始终+染色强度明显减弱(图7D)。同样的,一个缺乏PHLDA3使用ALT的shRNA显著减少增加,血清中AST和乳酸脱氢酶活动(图7E)。我们的数据支持论点,抑制PHLDA3和合成Akt复苏活动有效地保护肝脏免受损伤对ER应激(图7F)。
慢病毒表达的影响pleckstrin homology-like域、家庭,会员3 (PHLDA3)成分对肝损伤的内质网(ER)压力。(一)PHLDA3击倒了慢病毒的成分。七天尾静脉注射后的慢病毒表达控制或PHLDA3成分,老鼠管理与车辆或衣霉素(Tm)(2毫克/公斤,i.p)。定量一(存在)化验PHLDA3 72 h后对肝脏(N = 3 - 8)。(B) Immunoblottings p-serine /苏氨酸蛋白激酶B(一种蛋白激酶)和总Akt肝匀浆。p-Akt水平评估通过扫描微免疫印迹。显示值的比值p-Akt Akt。(c - d))和TUNEL染色。酒吧规模:100μm。(E)血液生物化学。(F)提议的方案说明ER应激引起肝损伤的机制通过PHLDA3超表达。 For A and E, data represent the mean±SE. Statistical significance of differences between each treatment group and the control (*p<0.05, **p<0.01) was determined. LDH, lactate dehydrogenase.
讨论
ER应激反应的紧张和微调监管是根本的在细胞命运决定自UPR过程是生物生存的进化保存路径。在这里,我们的研究结果表明,ER应激促进PHLDA3基因诱导肝细胞,促进细胞死亡过程中肝脏疾病。本研究的一个重要发现是PHLDA3作为分子的发现触发ER应激引发的肝细胞损伤。这一结果支持了临床地理数据库的分析;PHLDA3是在肝硬化患者的肝脏;有PHLDA3 mRNA水平的变化在这些患者中,可能在肝细胞死亡的程度反映个体差异(Xbp1s mRNA并不在这个数据库统计不同大概是因为mRNA半衰期和/或差异的巨大差异)。我们可以看到的PHLDA3大大增强感应HBV-infected大规模坏死患者比那些submassive坏死。在我们的样本来自患者hcv感染肝炎,PHLDA3超表达观察ER应激。临床上,我们评估PHLDA3表达不同肝脏疾病和/或不同阶段(即急性/慢性丙肝病毒/乙肝病毒或肝炎或肝硬化)。虽然疾病的病因学和特点各不相同,一个共同的特点是协会的ER应激与疾病发生(或进程)。2PHLDA3之间的正相关和ER应激标记CCl使用几种不同的动物模型进行验证4Lieber-DeCarli饮食,APAP即ER应激诱导物和化学伴侣治疗)。功能性PHLDA3对ER应激的影响肝损伤是由实验结果进一步证实在小鼠使用慢病毒成分输送系统。总的来说,我们的研究结果支持了这样的观点,即PHLDA3过度可能导致肝细胞在肝脏疾病的不同阶段与ER应激。
本研究的另一个有趣的发现是识别Xbp1的转录因子负责PHLDA3基因诱导的ER应激。假定的dna结合蛋白元素,远端站点位于1764 bp和−−之间的地区发现了1755个基点的活跃元素在人类PHLDA3基因。这个想法被观察到的突变增强网站无效PHLDA3 transactivation Tm。一致,Xbp1s超表达促进PHLDA3感应,而Xbp1击倒了相反的效果。虽然Xbp1-binding序列在鼠标PHLDA3基因不完全相同,在人类,这似乎是守恒的整个物种。在其他的研究中,报告为Xbp1-binding元素展开的蛋白质反应元素(UPRE),内质网压力元素(分散)或内质网应激II (ERSE-II)。19,20.Xbp1优先与UPRE互动,而ATF6必然分散。19一致,我们发现Xbp1-RE1的识别PHLDA3基因启动子像UPRE核心序列(CGTGG)。最保守的压力传感器,IRE1介导Xbp1信使rna剪接和激活,11导致适应性UPR和ER内稳态。16,17,21因此我们提出规范化的ER压力传感器,IRE1调节PHLDA3通过Xbp1s基因在肝细胞ER应激过程中,作为支持减少PHLDA3 IRE1击倒。
尽管密集研究UPR监管者,通路参与肝发病机制尚未完全阐明。Xbp1增加脂质在肝脏合成。22这里显示我们的数据表明在ER stress-mediated Xbp1细胞死亡的作用过程。然而,Xbp1s超表达没有明显导致细胞死亡。因此,很可能Xbp1 PHLDA3感应是必要的,是由一个负面的反馈途径。在大多数的压力条件下,适应性反应和凋亡信号可以同时激活因为受伤的细胞会对整体的多细胞生物体内平衡很重要如果赔偿不解决。在以前的研究中,注意力一直集中在Xbp1的适应性反应的作用。我们的研究结果表明,Xbp1也会导致凋亡过程。因此,IRE1-Xbp1通路可能编排的开关UPR proapoptotic信号。UPR和细胞死亡通路之间的微调可能依赖的PHLDA3连同其他介质(如p53和彪马)。我们的数据,IRE1击倒减毒ER应激肝细胞死亡暗示IRE1可能控制一个变阻器prosurvival之间切换和细胞凋亡。
IRE1有不同效果和活动可能特定于上下文的方式取决于细胞类型。23在胰腺β细胞过度活化的IRE1 ER应激引起炎症。24物可能参与BAX-mediated细胞凋亡,25和c-Jun激活物促进细胞的生存。26物的作用在肝细胞死亡和IRE1作为JNK-activating激酶的功能考虑,12我们评估PHLDA3感应物的作用;缺乏改变PHLDA3表达式由JNKi支持物的途径可能不是与ER应激诱导PHLDA3。其他的途径,活跃的磷酸化和随之而来的失活真核蛋白质合成起始因子2减毒一般。长期活跃的信号可以提高细胞凋亡,这种效果可能依赖于切归纳。27ATF6也诱发UPR目标基因。28在我们的研究中,无论是DN-PERK过度也ATF6击倒减少PHLDA3超表达肝细胞ER应激。这些结果支持IRE1专门调节PHLDA3表达式,是独立于物的途径或其他压力传感器。
研究表明细胞凋亡的内在途径激活ER压力,这可能涉及BH3 domain-containing蛋白质(即伯灵顿,贝克和Bim)。1,2,29日,30.我们的结果证明PHLDA3的角色,PH值领域仅蛋白质,细胞死亡过程中激活ER应激:它作为一个效应细胞凋亡的执行。治疗肝细胞化学陪伴PHLDA3的增加改善,支持善意PHLDA3 ER应激的影响。我们发现PHLDA3缺乏废除ER stress-mediated肝细胞死亡,而PHLDA3过度加剧它加强PHLDA3的角色在决定细胞命运。这个概念是强化了PHLDA3成分的体内实验使用慢病毒。另外,我们最近研究PHLDA3作为急性肾损伤的效应分子支持它对细胞死亡的影响。31日在这里,我们扩大了知识的新功能PHLDA3行列式的肝细胞病理进展。此外,PHLDA3表达与肝细胞损伤的程度老鼠暴露在ER应激(如血清转氨酶和TUNEL阳性)。由于PHLDA3蛋白在尿液中排出(金等未公开的数据),它可能作为一种非侵入性的ER应激和/或肝损伤的生物标志物。
在时间进程的一项研究中,PHLDA3 ER应激后逐渐增加体内和体外。在早期时候ER应激后,PHLDA3感应弱或中等的程度。大量增加的PHLDA3在稍后时间将有利于肝细胞死亡的过程通过触发阈值。大增加了PHLDA3比肝细胞在肝脏可能是由于激活炎症细胞和/或不同的药物动力学。PHLDA3竞争Akt,如图所示,我们的结果和其他人。6PHLDA3击倒的数据有助于提高肝细胞的一种蛋白激酶磷酸化,而超表达了相反的效果支持这个概念。提出的假设是符合发现轻微减少一种蛋白激酶信号变弱的细胞生长,而其严重减少导致细胞凋亡。5,32额外的一种蛋白激酶抑制通过化学手段增强ER应激细胞毒性。一致,PHLDA3超表达另外一种蛋白激酶抑制强化肝细胞死亡,支持PHLDA3抑制细胞死亡的一种蛋白激酶的作用(低浓度PI3K和Akt抑制剂的选择在这个实验中显示增强的细胞毒性)。PHLDA3可能影响分子使用一种蛋白激酶,PI3K和/或适配器蛋白质,在未来仍然是澄清。在我们的研究中,Xbp1-mediated PHLDA3 ER应激发生即使没有p53诱导的SKOV3细胞。一个适当的p53通路在肝细胞,减少p-Akt将增强自一种蛋白激酶抑制p53 p53活动。总的来说,足够多的PHLDA3可能触发细胞死亡可能通过增强积极的前馈激活PHLDA3与p53,暗示PHLDA3作为变阻器来确定UPR或细胞死亡通路。
不同的刺激产生活性氧促进蛋白质聚合和脂质过氧化反应,导致ER压力和肝损伤。肝脏疾病的进展,包括病毒、酒精和非酒精性脂肪肝,胆汁郁积和ischaemia-reperfusion伤害,更严重的情况可能与ER应激。1 - 3因此,很有可能,PHLDA3作为一个行列式审问肝细胞在肝脏疾病进展的命运。此外,PHLDA3抑制胰岛素受体的一种蛋白激酶信号可能引发胰岛素抵抗,支持之间的关系异常的能量代谢和肝脏疾病的发病机理。
总体而言,我们的研究结果所示提供新的见解PHLDA3受IRE1通路在微调的命运在急性或慢性肝病肝细胞,并可能提供一个潜在的新战略保护肝细胞免受ER跟压力病理条件。
确认
A443654是请提供的RF诺瓦克博士(后来医院国际儿童、FL)。
引用
补充材料
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补充数据
仅这个web文件已经由英国医学杂志出版集团从一个电子文件提供的作者(年代)和没有对内容进行编辑。
- 数据补充1——在线补充
脚注
贡献者CYH SWL:研究概念和设计,采集的数据,分析和解释数据,统计分析,起草的手稿。JHK:采集的数据,分析和解释数据。周:学习使用人类样本的管理、技术和物质支持。SGK:研究概念和设计、分析和解释数据,关键的修订手稿的重要知识内容,获得资金,监督学习。
资金这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIP) (2007 - 0056817)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准首尔国立大学的伦理委员会和首尔市政府首尔国立大学Boramae医疗中心。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。