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目标肝细胞癌(HCC)是全世界癌症死亡的第二大原因。改变microtubule-associated蛋白(地图)曾被观察到在肝细胞癌。然而,这些改变底层的机制仍然知之甚少。我们的目的是研究地图的角色蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1) hepatocarcinogenesis和早期HCC复发。
设计PRC1肝癌样本评估由微阵列表达,免疫印迹和免疫组织化学分析。分子和细胞技术包括siRNA-mediated和慢病毒vector-mediated击倒被用来阐明PRC1的功能和机制。
结果PRC1表达式与早期HCC复发和病人的结果。在肝细胞癌,PRC1施加一种致癌效应通过促进癌症扩散,具备干细胞、转移和tumourigenesis。我们进一步证明PRC1的表达和分布由Wnt3a信号动态监管。PRC1击倒受损转录因子(TCF)转录活动,减少Wnt目标表达式和核β-catenin水平降低。机械化,PRC1与β-catenin破坏复杂的相互作用,调节Wnt3a-induced膜销毁封存的复杂,抑制腺瘤息肉病杆菌(APC)稳定和促进β-catenin释放APC复杂。体内,PRC1高表达与核β-catenin和Wnt目标表达式。PRC1充当主监管机构先前确定的一组48 Wnt-regulated recurrence-associated基因在肝细胞癌(WRRAGs)。因此,PRC1控制WRRAGs的表达和功能,如FANCI SPC25, KIF11 KIF23通过Wnt信号。
结论我们认为PRC1小说Wnt目标函数在一个积极的反馈循环,强化Wnt信号促进早期HCC复发。
- 细胞增殖
- 细胞信号传导
- 致癌作用
- 肝细胞癌
- 肝转移
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
在人类肝细胞癌(HCC)早期复发仍然是潜在的治疗肝切除术后死亡的主要原因。
胞质分裂的蛋白质调节器1 (PRC1)调节反平行的微管交联促进微管的形成架构支持细胞形状和调节胞质分裂。PRC1据报道在乳腺癌和调节膀胱肿瘤。
Wnt-β-catenin网络是非常复杂的。异常的监管规范化Wnt-β-catenin信号通路与多种疾病有关,包括癌症、纤维化和退化。有两种类型的肝癌β-catenin信号被激活。在这两种情况下,核β-catenin发现与特定转录输出。第一类型,这是由于CTNNB1激活突变和肝癌大多是高度分化的一个预后良好:这些肿瘤中的谷氨酰胺合成酶过表达,这是一个非常具体的和高度敏感的标志β-catenin突变。第二种类型的肿瘤是Wnt-activated,主要不是CTNNB1-mutated:它们对应于肝细胞癌预后较差。
有什么新发现吗?
PRC1调节在肝癌,特别是在早期复发性肝细胞癌。
PRC1有致癌作用在促进癌症扩散,具备干细胞、转移和tumourigenesis。
PRC1直接Wnt信号目标,及其细胞骨架动态受Wnt3a本地化活动。
PRC1 Wnt信号必须调节肿瘤形成和癌症干细胞自我更新。
PRC1强化Wnt信号通过促进Axin1破坏膜封存的复杂,从而减少但稳定β-catenin APC稳定。
Wnt-regulated recurrence-associated基因在肝细胞癌(WRRAGs)发现,和PRC1监管WRRAGs通过Wnt信号的表达。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
的PRC1-coordinated WRRAG集群可能有用的预测早期肝癌复发的风险,作为一个指示器的Wnt信号活动。
丰富的临床证据涉及异常的关键角色规范Wnt /β-catenin信号在肝细胞癌起始和发展,突显出潜在的目标这个途径这通常难以治愈的皮肤癌症的治疗干预。在这项研究中,PRC1成为新的治疗目标,其microtubule-binding域可以使用小分子靶向抑制剂。特定的小分子抑制剂或活化剂与定义的目标和机制将提供治疗导致肝癌和研究工具操纵Wnt通路在精确的时间和空间的方式。
介绍
肝细胞癌(HCC)是全世界癌症死亡的第二大原因。1,2早期肝癌复发主要负责穷人生存的肝癌患者,是改善预后的主要障碍。3 - 5尽管最近报告阐明信号相关监管机构早期HCC复发,6,7底层通信网络在很大程度上仍是个未知数。在管制在肝癌的生长因子信号级联,证据表明规范化Wnt信号通路8 - 11在hepatocarcinogenesis起着关键的作用。12-20
微管(MTs)发挥重要作用在细胞周期中,走私、信号和迁移。改变MT-associated蛋白(地图)证实了癌症,而这些变化通常与不良预后相关。发散的角色规范Wnt通路在调节太细胞骨架促进细胞运动建议,21这意味着地图可能参与Wnt信号通过与Wnt交互组件。支持这个建议观察,许多Wnt通路组件,包括APC, Axin1 GSK3β,与MTs相关联。21然而,分子之间的相互作用是鲜为人知的地图和Wnt信号。
蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1,也称为Ase1(酵母)/ MAP65(植物)是参与了胞质分裂22在MT在真核生物组织中扮演关键角色;23,24然而,它在致癌作用尚不清楚。这里,我们证明了分子之间的相互作用的Wnt通路和PRC1 HCC患者的细胞系和异种移植。从力学上看,Wnt信号刺激PRC1表达和调节细胞骨架本地化。反过来,固PRC1调节细胞膜的破坏复杂并促进稳定β-catenin APC退化。因此,我们已经确定了PRC1作为小说调节器连接Wnt信号激活促进肝癌复发。
材料和方法
组织,抗体微阵列
HCC患者的组织是我们的机构审查委员会批准的(IRB),和所有组织研究SingHealth组织提供的存储库。书面知情同意参与获得病人,和相关的临床和组织病理学研究人员提供的数据是匿名的。这项研究在网上列出的抗体补充表S1。微阵列进行了如前所述。7
动物研究
稳定转染HCCLM3细胞resuspended在磷酸盐(PBS)和皮下植入左右两翼(5×106细胞每侧)雄性BALB / c裸小鼠。肿瘤体积是监测和计算如前所述。25
额外的材料和方法在网上提供补充信息。
结果
PRC1是调节早期HCC及其表达与肝细胞癌复发
基于微阵列的数据挖掘结果数据库之前,7PRC1表达显著调节肝细胞癌肿瘤细胞与基质正常肝(NN)结直肠癌肝转移患者或匹配相邻组织学正常的肝脏(MN)组织(p < 0.001;图1一个,左面板)。PRC1表达的一个子集,这些样本进一步验证了在线实时PCR(见补充图S1A)。此外,PRC1表达显著调节肿瘤的早期(< 2年)复发性疾病患者(HCC-R)与患者的样本相比没有明显的证据在5年内复发(HCC-NR) (p < 0.001;图1一个,右面板)。PRC1表达的一个子集HCC-NR样品也验证(见在线补充图印地)。此外,数据挖掘从肝癌RNA-seq数据匹配和邻近组织公开可用的癌症基因组图谱数据库确认PRC1表达在肿瘤与正常组织相比显著升高(p < 0.001;图1B)明显高于PRC1表达水平检测到肿瘤表现出更频繁的血管侵犯(见在线补充图就是S1C)和在那些得分作为高档癌症(见在线补充图S1D)。
蛋白质的胞质分裂1 (PRC1)是调节调节器肝细胞癌(HCC)和早期HCC复发有关。(A)微阵列分析PRC1表达在正常(NN),与正常(MN),复发性肝癌(HCC-R)和临时肝癌(HCC-NR)组织。(B) PRC1基因表达在癌症基因组图谱,TCGA RNA-seq数据库。(C)代表免疫组织化学染色(包含IHC) PRC1表达式在肝癌和匹配正常(MN)组织,和高倍率的图像代表包含IHC染色在MN PRC1 HCC-R和HCC-NR组织。(D) PRC1表达强度得分25病人组织,其中一些包括MN组织(n = 10)。(E)总生存期(OS)和(F)患者的无病生存期(复发)显示高或低PRC1表达式。
同样,通过免疫组织化学评估(包含IHC)发现,PRC1调节肝细胞癌肿瘤(T)与MN组织(图1C)。此外,PRC1相比HCC-NR HCC-R组织中高度表达,MN组织(图1C, D)。此外,我们研究了PRC1 10肝癌细胞系的表达,它们显示的表达升高PRC1在线与MN组织相比补充图S1E)。
此外,肝细胞癌患者临床特点提供了网上补充表S2)高于中位数PRC1表达表现出显著缩短总生存期(p < 0.0001;图1E)和recurrence-free生存时间(p = 0.0019;图1比PRC1低表达患者F)。更重要的是,单变量和多变量分析表明,PRC1复发性肝细胞癌的表达作为一个独立的预后因素(见在线补充表S3)。我们的数据表明,升高PRC1表达诱导增强的致癌能力和与肝癌复发的风险增加相关。
PRC1在肝细胞癌的致癌特性
解决PRC1在肝细胞的功能,我们首先利用siRNAs沉默PRC1表达式在肝癌细胞(见在线补充图S2A)。PRC1击倒显著抑制四肝癌细胞的生长动力学(图2)和抑制其增殖取决于BrdU公司(图2B)。此外,在Huh-7 PRC1击倒,Hep3B HCCLM3细胞数量显著增加TUNEL-positive细胞(见在线补充图开通,C)和激活caspase-3/7-positive凋亡细胞(见在线补充图S2D)。
消耗的蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1)抑制恶性细胞肝细胞癌(HCC)的属性。(A)的生长曲线和(B) BrdU扩散试验的四个肝癌细胞株后沉默PRC1或应用争夺控制,n = 5。(C) transwell迁移和入侵检测使用四肝癌细胞株后沉默PRC1或应用争夺控制,n = 3。(D)软琼脂集落形成试验后稳定争夺治疗或PRC1击倒三肝癌细胞株,n = 3。(E)形象和代表(F)异种移植的生长曲线与稳定PRC1-silenced或争夺control-treated HCCLM3细胞,n = 8。异种移植在左右两翼都贴上标签,分别指示shScramble或shPRC1。
基于transwell化验,PRC1击倒显著抑制的迁移和入侵能力四个肝癌细胞系(图2C);这些结果表明,PRC1也调节细胞转移。来验证这些观察,我们生成的细胞表现出稳定PRC1击倒(shPRC1)通过lentivirus-mediated shRNA交货(见在线补充图S2E),我们进一步验证结果HCCLM3,与高转移细胞株的潜力。在伤口愈合迁移试验,shPRC1 HCCLM3细胞显示关闭延迟伤口愈合与shScramble HCCLM3细胞(见在线控制补充图S2F),从而证实了体外PRC1促进肿瘤转移的能力。此外,根据软琼脂集落形成试验,shPRC1细胞表现出明显减少殖民地数量和规模相比各自shScramble控制细胞(图2D)。此外,在皮下异种移植小鼠模型中,shPRC1 HCCLM3细胞表现出明显推迟肿瘤生长与shScramble控制细胞(图2E、F)。我们的数据表明,PRC1作为肝细胞癌的致癌推动力。
PRC1表达和细胞骨架分布在肝细胞癌由Wnt信号
识别潜在的转录监管机构PRC1我们分析了PRC1启动子(≈2 kb地区)使用推广软件。我们发现一个潜在的TCF4结合位点在这个地区,表明Wnt信号可能驱动PRC1表达式。为了证明这一点,我们首先沉默在肝癌细胞内源性β-catenin和TCF4表达。同时压制β-catenin TCF4明显减毒PRC1表达式(见在线补充图S3A, B)。然后,Wnt3a治疗的剂量滴定表明很低剂量的Wnt3a (1.5625 ng / mL)触发Wnt信号激活我们的细胞。免疫印迹PRC1和Wnt通路组件表明Wnt3a促进了Wnt coreceptor LRP6的磷酸化水平和增加的活跃β-catenin (ABC) (图3A)。伴随的感应PRC1表达式,Wnt3a诱导其他已知Wnt目标,包括生存素和细胞周期蛋白D1 (图3A)。此外,PRC1 mRNA表达的诱导Wnt3a确认和戏剧性的被消耗β-catenin或TCF4 (图3B)。
蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1)表达和细胞骨架分布受Wnt信号在肝细胞癌(HCC)细胞。(A) PRC1和Wnt通路组件表达Wnt3a后三肝癌细胞系(1.5625 ng / mL)刺激24 h。(B)的相对PRC1基因表达水平后沉默β-catenin或TCF4紧随其后Wnt3a一夜之间(1.5625 ng / mL)刺激。(C) PRC1启动子分析来识别TCF4-binding网站(TCF4 BS),检测到的引物的中华人民共和国1 ',或消极的控制区域,检测引物的负”。实时PCR分析的相对fold-enrichment PRC1或生存素启动子片段2 h后Wnt3a (1.5625 ng / mL)感应芯片通过使用一个anti-TCF4抗体或免疫球蛋白,n = 5。(D)表达的免疫印迹分析PRC1 HCCLM3细胞和Wnt通路组件处理不同Wnt信号抑制剂。(E)细胞分离分析PRC1 Wnt3a治疗后细胞分布及相关标记(1.5625 ng / mL) serum-starved HCCLM3细胞。(F)免疫荧光染色的PRC1(绿色)和α-tubulin(红色)在serum-starved HCCLM3细胞有或没有Wnt3a治疗(1.5625 ng / mL, 8 h) (G)代表共焦Z-stack PRC1免疫荧光染色的图片(绿色)和pan-cadherin(膜标记红色)在serum-starved HCCLM3细胞有或没有Wnt3a治疗(1.5625 ng / mL, 8 h)。白色的箭头表示colocalisation pan-cadherin PRC1膜的标志。
我们进一步分析了PRC1启动子并设计引物PRC1针对TCF4-binding站点地区,负,针对随机区域不显示TCF4绑定,芯片分析(图3C)的引物检测TCF4绑定生存素启动子作为一个积极的控制。26实时PCR和DNA凝胶芯片产品的化验显示为2 h Wnt3a刺激诱导大于两倍浓缩在TCF4绑定HCCLM3 PRC1启动子的细胞(见图3C和在线补充图S3C)。此外,我们研究了四个各种Wnt通路的抑制剂的影响组件,包括Dvl-PDZ域抑制剂二世(阻塞Dvl2 LRP6)的绑定,XAV939(抑制Tankyrase,从而稳定Axin1),锂(抑制GSK3β)和iCRT3(扰乱β-catenin-TCF4交互)(见在线补充图S3D)。结果证实,Wnt信号诱导的表达PRC1与其他已知的Wnt目标HCCLM3细胞(图3D)。
因为Wnt信号可以调节也受PRC1太细胞骨架,我们进一步研究了Wnt3a信号的潜在影响PRC1通过细胞分离和共焦显微镜检测细胞分布。细胞分离试验,我们发现Wnt3a动态诱导PRC1招聘的细胞膜,细胞质和细胞骨架,但不是核分数(图3E)。这种现象达到顶峰大约8 h post-Wnt3a治疗。在costaining内生PRC1和太α-tubulin标志或膜标记pan-cadherin,我们证实Wnt3a动态诱导的浓缩在MTs PRC1 (图3F)和细胞膜(图3克)。发现Wnt3a动态调节PRC1细胞骨架分布表明PRC1可能在Wnt信号过程中发挥作用。
PRC1击倒损害Wnt /β-catenin信号在肝细胞癌
调查的潜在作用PRC1 Wnt信号,我们首先确定内生Wnt在肝癌细胞/ TCF活动。出乎意料,PRC1击倒显著抑制内源性Wnt / TCF荧光素酶记者活动,特别是在HCCLM3细胞(图4A)。另外,外生Wnt3a-enhanced Wnt / TCF活动完全压制了沉默PRC1(见在线补充图S4A)。我们进一步研究了17个报道Wnt目标表达式使用由具体实时PCR引物(见在线补充表S4)。Wnt3a刺激,PRC1击倒显著抑制9的表达出11 Wnt目标,包括5个6 HCC-related Wnt目标(图4B)。免疫印迹分析证实了这些结果,表明沉默PRC1明显抑制Wnt信号通过抑制内源性和外源性ABC和Wnt目标表达式在HCCLM3和Huh-7细胞图4C和在线补充图S4B)。
损失的蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1)损害Wnt /β-catenin信号在肝细胞癌(HCC)。(A)的改变内源性Wnt / TCF记者活动四肝癌细胞株后沉默PRC1β-catenin基因表达或应用控制的争夺,n = 3。(B)之间的差异争夺控制治疗和沉默PRC1 Wnt目标表达上8 h后Wnt3a (1.5625 ng / mL)的感应HCCLM3细胞根据实时PCR, n = 5。(C)水平的免疫印迹分析PRC1,β-catenin在细胞活化和Wnt目标应用的争夺控制或压制PRC1有或没有Wnt3a治疗在一夜之间(12.5 ng / mL)。(D)免疫印迹分析(核纤层蛋白B1:核蛋白质标记,α-tubulin:胞质蛋白标记),和(E)免疫荧光染色后核β-catenin应用争夺控制或压制PRC1 HCCLM3细胞有或没有Wnt3a治疗(1.5625 ng / mL) 8 h。β-Catenin用红色标签,膜标记pan-cadherin绿色标签。的平均强度β-catenin细胞核染色,显示的白色圆形线,确定使用LSM510共焦显微镜,n = 30。(包含IHC) (F)免疫印迹和免疫组织化学染色,PRC1β-catenin,在异种移植肿瘤存活素和Axin2表达HCCLM3 shScramble或shPRC1稳定转染细胞。
基于观察到的消声效果PRC1β-catenin激活水平,我们进一步研究了PRC1β-catenin核易位的影响。从核提取和免疫荧光结果表明PRC1击倒受损的核积累β-catenin (图4D, E)。shPRC1稳定廉价的细胞,Wnt信号活动也明显减弱(见在线补充图4 c, D)。此外,shPRC1 HCCLM3异种移植显示低表达水平的ABC,β-catenin, Wnt目标存活素和Axin2 shScramble异种移植基于免疫印迹和包含IHC检测(图4F)。
我们的研究结果证实,PRC1 Wnt信号激活的肝细胞癌是至关重要的。
Wnt信号上游GSK3β/β-catenin PRC1目标
的发现沉默PRC1减少了ABC表明PRC1可能β-catenin上游水平。为了验证这个假设,我们研究Wnt / TCF活动后overexpressing持续激活β-catenin(*β-catenin,窝藏突变在特定磷酸化网站)(见在线补充图S5A顶面板),或与抑制剂iCRT3治疗后,块β-catenin-TCF交互(见在线补充图S5A,下半部分)。两个*β-catenin过度和iCRT3治疗废除PRC1损耗的影响在Wnt / TCF活动(见在线补充图S5A)。我们进一步研究了HepG2细胞表达β-catenin窝藏一个氨基端删除。27有趣的是,在HepG2细胞PRC1损耗并没有改变Wnt目标表达式或内源性Wnt / TCF活动(见在线补充图S5B),也没有显著的抑制增殖,迁移和入侵HepG2细胞(见在线补充图S5C)。我们的研究结果表明,PRC1β-catenin的上游。
此外,我们使用Wnt抑制剂XAV939,据报道,稳定Axin1通过抑制Tankyrase活动。28XAV939剂量依赖性稳定Axin1和增加Tankyrase表达式,也得罪HCCLM3细胞内源性Wnt / TCF活动(见在线补充图S5D)。然而,沉默PRC1改善Axin1稳定和Wnt / TCF活动抑制XAV939(见在线补充图S5D);这一发现表明,PRC1调节Axin1可能在Tankyrase水平。siScramble治疗相比,除了沉默PRC1没有改变内源性Wnt / TCF活动HCCLM3细胞处理氯化锂(GSK3β抑制剂)或生理盐水(一种常用的控制)(见在线补充图S5E)。这个结果进一步表明,PRC1 GSK3β上游可能行为。
PRC1调节β-catenin破坏复杂
以前,我们证明了PRC1目标Wnt信号从Axin1 GSK3β/β-catenin(见在线补充图S5),这表明PRC1调节破坏复杂。进一步解决这一监管机制和确定PRC1是否破坏的复杂,我们进行了内源性免疫沉淀反应(IP)化验使用anti-PRC1抗体。出乎意料,PRC1-associated IP复杂,我们发现破坏的主要成分复杂,包括Axin1 APC, GSK3ββ-catenin,但没有检测到coreceptor LRP6 (图5A)。接下来,我们构造的长篇PRC1三截断突变体融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)如前所述。23他们暂时称为PRC1-FL, -ΔC(缺乏糖基),cc(卷曲螺旋领域缺乏MT-binding域和糖基,这是重要的本地化PRC1 MTs)-ΔCC(缺乏卷曲螺旋域)(见在线补充图S6A)。瞬时表达这些构造证明只有PRC1-CC表达式受损PRC1 MTs本地化(见在线补充图S6B)。基于GFP-Trap IP,我们发现所有PRC1结构除了PRC1-CC构造与Axin1 / APC / GSK3β破坏复杂(见在线补充图S6C),从而证明PRC1与破坏复杂的交互通过MT-binding域。基于免疫荧光三染色,我们发现内生太中华人民共和国colocalised与复杂的核心脚手架protein-Axin1 MT-like结构破坏和APC或GSK3β点状的结构在Wnt3a治疗(图5B)。我们还发现核colocalisation PRC1 Axin1,表示一个可能的核PRC1 Wnt信号的作用。进一步研究PRC1核作用,我们建立两个携带突变的突变体在PRC1核本地化信号(NLS),名叫NLS-2A和NLS-3A在线补充图S6D)。免疫荧光染色的瞬时表达式NLS突变体显示明显减毒核PRC1本地化NLS-2A并完全枯竭的核PRC1本地化的NLS-3A HCCLM3(见在线补充图S6E)。我们进一步采用siRNA针对PRC1 mRNA 3′未翻译区(UTR)地区耗尽内生PRC1(见在线补充图S6F),然后我们cotransfected两NLS突变体与Wnt记者PRC1-depleted细胞。正如所料,FL-PRC1表达式可以挽救减毒Wnt记者在线活动(见补充图S6G),而NLS-2A NLS-3A表达式也拯救减毒Wnt在线活动(见补充图S6G)。这表明PRC1监管Wnt信号主要以外的细胞核。
蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1)与β-catenin破坏复杂,调节固膜破坏复杂的肝细胞癌(HCC)。(A)内源性coimmunoprecipitation破坏分析复杂的蛋白质和LRP6,使用免疫球蛋白或被推倒anti-PRC1抗体,在Wnt3a-treated (1.5625 ng / mL, 4 h) HCCLM3细胞。,短曝光;勒,长时间的曝光。(B)免疫荧光costaining PRC1(绿色)和Axin1 GSK3β或APC(红色)与微管(由Alexa染色萤石647鼠标anti-β-Tubulin,红色)在Wnt3a-treated HCCLM3细胞(1.5625 ng / mL, 8 h治疗后血清饥饿一夜之间)。白色的箭头显示colocalisation在微管(MTs)。(C)表达的免疫印迹试验Axin1 / APC / GSK3β破坏复杂蛋白质膜提取物HCCLM3细胞转染与争夺或PRC1 siRNA有或没有Wnt3a刺激(1.5625 ng / mL, 4 h,无血清饥饿);Na / K-ATPase(膜标记),α-tubulin(细胞质标记)和核纤层蛋白B1(核标记)也显示。(D)膜标记的免疫荧光costaining pan-cadherin Axin1, GSK3β和APC HCCLM3细胞转染与争夺或PRC1 siRNA有或没有Wnt3a刺激(1.5625 ng / mL, 8 h后血清饥饿隔夜)表示的膜封存Axin1 scaffold-mediated破坏复杂。荧光强度(FI)在每个像素沿着紫色线穿过膜计算显示与膜蛋白marker-pan-cadherin colocalisation破坏蛋白质。
固膜的破坏复杂在Wnt刺激减少细胞质的可用性破坏复合物,从而导致β-catenin积累。18调查PRC1能否调节固膜破坏的复杂,我们纯化膜分数,确定Wnt3a诱导的膜浓缩破坏复杂的组件包括GSK3βAxin1, APC和PRC1,而沉默PRC1受损这些蛋白质的膜浓缩Wnt3a感应(图5C)。此外,免疫荧光和荧光强度分析表明Wnt3a确实引发了膜浓缩Axin1及其APC和GSK3β有关。相比之下,沉默PRC1明显减少了这些蛋白质的膜封存(图5D)。
PRC1促进β-catenin稳定通过抑制APC函数
在Wnt信号失活,APC促进免费β-catenin磷酸化的捕获和退化。调查PRC1β-catenin稳定的影响,我们进行了环己酰亚胺追逐化验。正如所料,沉默PRC1促进β-catenin的动荡。出人意料地,沉默PRC1促进了APC的稳定(图6),但没有其他的破坏复杂的组件。此外,Wnt3a刺激引发细胞质β-catenin稳定(1.0 - -2.2倍;在网上看到的补充图S7A),但沉默PRC1明显抑制Wnt3a-mediatedβ-catenin稳定(0.9 - -0.7倍;在网上看到的补充图S7A)。这些结果表明,加速退化引起的β-catenin PRC1损耗可能导致APC的稳定。
蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1)促进β-catenin稳定和活动通过抑制APC稳定和阻塞β-catenin绑定。(A)免疫印迹和量化分析的影响的损耗PRC1β-catenin或APC HCCLM3稳定细胞处理放线菌酮(CHX)在不同的时间点。SE,短曝光。(B)免疫印迹(SE)和(C) coimmunoprecipitation化验的影响沉默PRC1 Wnt3a-induced上(1.5625 ng / mL)的动态分离β-catenin HCCLM3 APC降解复杂的细胞。免疫荧光染色β-catenin和(D)泛素或(E) APC复杂scramble-treated PRC1-silenced HCCLM3细胞治疗MG132 2 h。(F)顶部/ FOP Wnt TCF活动和BrdU HCCLM3细胞增殖检测处理表示siRNAs, n = 4。
进一步证明PRC1调节APC /β-catenin复杂活动的动态过程,我们进行了内生Co-IP化验HCCLM3细胞刺激Wnt3a (图6B, C)。在Wnt3a刺激,APC迅速退化(图6B)。相比之下,耗尽PRC1受损APC退化,甚至稳定APC,最终导致了磷酸化和β-catenin退化(图6B)。使用一个anti-APC Co-IP抗体进一步表明沉默PRC1加快了捕获和磷酸化的β-catenin APC复杂(图6C)。此外,使用一个anti-β-catenin co-IP抗体表明沉默PRC1增强的绑定β-catenin APC和泛素结扎β-TrCP组成的复杂和泛素(图6C)。这进一步验证了免疫荧光染色观察,这表明PRC1击倒明显增加的colocalisationβ-catenin与泛素(图6D)和APC复杂(图6E)。确认是否PRC1身体封锁APCβ-catenin绑定,我们短暂表达了PRC1-FL HCCLM3细胞构造,然后执行co-IP使用anti-APC抗体。PRC1-FL表达式可以绑定APCβ-catenin剂量依赖性的方式(见在线补充图S7B)。
确保APC执行其肿瘤抑制功能HCCLM3细胞,我们沉默APC(见在线补充图S7C)和Wnt调查/ TCF活动和细胞增殖。沉默APC提升Wnt / TCF荧光素酶活性和细胞增殖,而沉默PRC1诱导相反的效果(图6F)。同时沉默APC和PRC1可能大大救援PRC1击倒的抑制作用(图6F),这表明PRC1强化Wnt信号主要通过抑制APC函数。
PRC1 Wnt信号调节的致癌效应,PRC1表达式同事高Wnt活动在肝癌组织中
致癌基因的激活Wnt信号在肝细胞癌中很常见。在肝细胞癌调查Wnt3a信号功能,软琼脂集落形成试验和修改后的伤口愈合试验被用于HCCLM3细胞。Wnt3a显著提升集落形成和迁移,但PRC1击倒完全阻塞Wnt3a-induced集落形成(图7)和迁移(图7B)。
损失的蛋白质调节器的胞质分裂1 (PRC1)损害致癌Wnt信号功能,和PRC1表达与高Wnt效力在肝细胞癌(HCC)患者组织。(一)软琼脂集落形成试验(n = 3,wnt3a剂量:1.5625 ng / mL)和(B)修改后的伤口愈合试验(伤口关闭/扩散CCK8化验)HCCLM3细胞稳定转染与争夺或PRC1成分有或没有wnt3a (1.5625 ng / mL)刺激1%胎牛血清(的边后卫)媒介。相对伤口愈合决心使用ImageJ软件国立卫生研究院(NIH),美国),n = 5和相对扩散CCK8化验检测到的与伤口愈合试验相同的条件。(C) PRC1击倒抑制oncosphere HCCLM3和Huh-7形成细胞和抑制Wnt3 (1.5625 ng / mL)全身oncosphere形成。代表球体形成图片所示。μm酒吧,规模500人。Sphere-forming细胞24-well板块也计算在内,n = 3。球体(> 100μm)使用ImageJ软件计算和分析。(D)免疫组织化学染色(包含IHC)和(E)的量化PRC1和存活素表达病人组织中积极或消极的核β-catenin表达式(n = 25)。(F)相关Wnt目标PRC1基于包含IHC存活素和微阵列分析。(G)免疫印迹和相关性分析PRC1和存活素表达的14个人配对肝癌病人组织。
Wnt信号调节肝癌干细胞自我更新(CSC)。29日因此,我们试图进一步确定PRC1调节肝脏二者。我们研究了在oncospheres PRC1形成的影响。HCCLM3-shScram oncospheres形成细胞。相比之下,oncosphere形成明显的减毒shPRC1 HCCLM3细胞(图7 ciiii)。此外,Wnt3a显著提升oncosphere HCCLM3-shScram形成的细胞(图7 ci、iii和iv),但未能促进oncosphere形成shPRC1 HCCLM3细胞(图7 ciii- v)。类似的结果Huh-7-shScram和shPRC1 Huh-7细胞(图7 cvi),从而表明PRC1促进肝脏通过Wnt信号CSC自我更新。
评估的潜在相关性PRC1 Wnt活动体内表达,我们首先研究PRC1的表达,包含IHCβ-catenin和Wnt target-Survivin。包含IHC连续25个独立HCC患者的肿瘤标本(其临床特点提出了在网上看到补充表S5)表明,肿瘤显示核β-catenin表达表现出更高水平的PRC1和存活素表达(p < 0.001),而与肿瘤缺乏核β-catenin表达式(图7D, E)。然后,PRC1表达式基于包含IHC与生存素表达明显相关(r = 0.8384, p < 0.001)和微阵列分析(r = 0.8655, p < 0.001) (图7F)。此外,免疫印迹成对肿瘤和MN组织14日执行(包括七成对早期复发性肝细胞癌组织和七成对临时HCC组织;在网上看到的补充表S6和图7G)表明,PRC1早期复发肝癌组织中高度表达与临时的。PRC1表达式通过免疫印迹还与生存素表达显著相关(r = 0.7788, p = 0.0010, n = 14) (图7克)。这个结果意味着PRC1表达式与Wnt信号通路的激活体内。
识别WRRAGs和PRC1调节WRRAGs通过Wnt信号
评估Wnt信号在早期HCC复发的作用,我们发现潜在WRRAGs通过分析确定的基因在我们的早期肝癌复发基因数据库(褶皱变化(FC) > 1.6, p < 0.05)7和Wnt报道/ TCF4-regulated基因数据库(在HepG2 FC > 1.5, p < 0.05)和LS174T细胞。30.48候选人被确定。令人惊讶的是,其中43的表达(∼90%)与PRC1表达式(r > 0.7, p < 0.05,图8一个)。
识别和描述Wnt-regulated recurrence-associated基因(WRRAGs);胞质分裂的蛋白质调节器1 (PRC1)通过Wnt信号调节WRRAG表达式和函数。(A)的维恩图分析筛选48 WRRAGs。48基因排列结果显示他们与PRC1皮尔逊相关性(r)基因的表达。从0.85到1.00 r表示相关性很强的相关性,和一个从0.80到0.85 r显示出很强的相关性。红色的实心圆圈表示基因验证recurrence-associated基因recurrence-free生存分析的基础上,和靶心符号表明基因选择Wnt3a目标分析和体外功能研究。(B) 18岁的褶皱变化表达式(负控制),FANCI, SPC25, KIF11 KIF23 Wnt3a治疗引起的(1.5625 ng / mL) 8 h HCCLM3细胞争夺或PRC1 siRNA对待。(C)的可拆卸的效率siRNAs针对GAPDH, PRC1, FANCI, SPC25, KIF11 KIF23 HCCLM3细胞相对于争夺控制40小时后处理。(D) BrdU扩散试验和(E)伤口愈合HCCLM3细胞迁移试验(1%的边后卫)处理,GAPDH, PRC1, FANCI, SPC25 KIF11或KIF23核。(F)拟议的工作模型PRC1职能的Wnt通路在肝细胞癌(HCC)。 Wnt3a signalling induces the expression and microtubule (MT) enrichment of PRC1, which can promote the membrane sequestration of the destruction complex, suppress APC stability, accelerate active β-catenin release from the APC complex and promote HCC metastasis and proliferation.
建立WRRAGs和PRC1之间的联系,我们随机选择5个基因,即,TOP2A FANCI, BIRC5, KIF23 KIF11,在强烈相关基因(r = 0.85 - -1.00)和三个基因,即,MKI67 SPC25和CDKN3强烈相关的基因在延长无复发生存分析方面(r = 0.80 - -0.85)(见在线补充图S8)。所有选定的表达升高WRRAGs低下显著相关,recurrence-free生存(见在线补充图S8)。
来验证这些WRRAGs潜在Wnt目标可能受PRC1,四个基因,即,FANCI KIF23, KIF11 SPC25,被选为Wnt3a感应和功能化验HCCLM3细胞。Wnt3a显著诱导四种基因表达与18岁控制(图8B),但PRC1击倒显著减毒Wnt3a-induced这些基因的表达(图8B),这表明PRC1潜在调节WRRAGs通过Wnt信号表达式。
为了进一步验证这些WRRAGs函数,由siRNAs我们撞倒了他们的基因表达(图8C)。随后,BrdU核扩散和伤口愈合迁移化验了功能性研究证实FANCI、KIF11和KIF23促进细胞增殖(图8D),所有四个基因促进细胞转移(图8E)。
综上所述,我们的数据表明,Wnt信号调节PRC1的表达和细胞骨架本地化加强Wnt信号通过促进固膜的破坏复杂,抑制APC和阻塞β-catenin绑定APC复杂,这表明Wnt / PRC1-positive监管回路,使得肝癌转移和复发(图8F)。
讨论
肝细胞癌的预后仍不理想,我们的知识潜在的细胞和分子途径推动其发病机理是有限的。在这项研究中,我们证实PRC1显著调节肝细胞癌肿瘤,其表达与HCC早期复发密切相关。我们进一步证明PRC1扮演着致癌的角色与规范化Wnt信号在肝癌细胞和PRC1 hepatocarcinogenesis期间可以确定二者的命运。
规范化Wnt信号通路(Wnt /β-catenin)控制许多生物过程,包括细胞命运的决心,干细胞增殖和维护。33节规范Wnt配体结合使卷曲(FZD)和LRP5/6 coreceptor复杂激活下游Wnt信号。8异常的激活规范Wnt信号经常被观察到肝细胞癌。11,33,34高核β-catenin35和原癌基因表达36,37与血管侵犯和减少recurrence-free生存,暗示Wnt信号激活的参与促进肝癌复发。高谷氨酰胺合成酶(GS)染色据报道在肝细胞癌与β-catenin突变。38使用GS染色,没有可检测复发和临时hcc的区别(见在线补充数据S9A B表S7),这表明β-catenin突变不是早期复发的重要因素,这证实了Hoshida的结果等,39证明β-catenin突变在子类中没有发现相关的肝细胞癌复发的风险更大。本研究的一个重要发现是发现PRC1小说通过增效Wnt信号早期肝细胞癌复发的监管机构。这一发现可能部分解释高核β-catenin复发性肝癌的观察与野生型β-catenin。39此外,肝癌细胞系检测报告中没有回应同样Wnt3a和/或PRC1抑制。这可能是由于不同成分的Wnt受体的突变模式和/或Wnt下游组件。
另一个有趣的发现是识别PRC1地图可以加强Wnt信号通过细胞骨架本地化。这个概念是由许多Wnt通路组件的观察,如APC, Dvl GSK3β,可以在本地法案通过与细胞骨架的协会。21此外,MACF1,多区域蛋白associates MTs和肌动蛋白丝,存在破坏所需的复杂和易位的膜结合LRP6轴蛋白。40MTs招聘是证据确凿的PRC1的函数在有丝分裂和一定程度上的间期通过捆绑的反平行的MTs。我们注意到刺激Wnt通路也会造成破坏的招聘在肝癌细胞复杂MTs。此外,驱动蛋白马达WRRAG列表中包括Wnt激活的控制下在肝癌也发挥重要作用在滑动反平行的MTs主轴伸长。因此,我们推测,太监管机构可能协调调节Wnt信号通过太本地化。事实上,一些驱动蛋白在WRRAGs曾被卷入Wnt信号。41因此,进一步的研究努力识别潜在的药物靶点扰乱PRC1太本地化提高肝癌治疗可以提供一种新的治疗策略。
确认
作者感谢SingHealth组织存储库(STR)组织样本。
引用
脚注
贡献者JC,乔丹、HX XZ、广告和SK进行实验和JC,乔丹,HX, XZ,广告,SK, BKPG, LLO, WH和速度分析数据。XZ参与sh-stable克隆的生成。KS和VPS进行生物信息学分析和统计分析。JC, BKPG LLO, WH和时速设计项目,JC,公里/小时写了手稿。
资金这项工作是支持由新加坡国立医学研究理事会(LLO和公里)和SingHealth基金会(JC)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。