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摘要
背景胰腺癌的特征是纤维炎性间质的积累。在这种基质反应中，髓系细胞是主要的种群。不同的髓系亚群与肿瘤的促进和抗肿瘤免疫的暴露相关。
客观的本研究的目的是确定骨髓细胞耗竭对胰腺癌发生和发展的影响，并了解胰腺癌微环境中骨髓细胞与T细胞介导的免疫之间的关系。
方法将原发性小鼠胰腺癌细胞移植到cd11b -白喉毒素受体(DTR)小鼠。另外，iKras*胰腺癌小鼠模型被杂交到CD11b-DTR小鼠中。CD11b+白喉毒素治疗在肿瘤起始期或已形成肿瘤时，细胞(主要是髓系细胞群)被消耗殆尽。
结果骨髓细胞的衰竭阻止了KrasG12D引发胰腺癌。在预先形成的肿瘤中，髓系细胞衰竭会阻止肿瘤生长，在某些情况下，还会诱导依赖CD8的肿瘤消退+T细胞。我们发现髓系细胞抑制CD8+t细胞抗肿瘤活性通过诱导程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)在肿瘤细胞中的表达表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)依赖的方式。
结论我们的研究结果表明，骨髓细胞通过EGFR/ mapk依赖于肿瘤细胞PD-L1表达的调节来支持胰腺癌的免疫逃避。切断髓细胞和肿瘤细胞之间的对话足以恢复由CD8介导的抗肿瘤免疫+T细胞，这一发现对胰腺癌免疫疗法的设计具有重要意义。
- 胰腺癌
- 巨噬细胞
- 基因调控
- 信号转导
- 免疫反应
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
骨髓细胞，包括巨噬细胞和未成熟的骨髓细胞/骨髓源性抑制细胞(MDSCs)，在胰腺癌的进展过程中积累。
巨噬细胞促进胰腺癌的发生、生长和转移。
MDSC或巨噬细胞亚群的减少导致CD8的浸润和激活增加+T细胞。
程序性细胞死亡1 (PD-1)/ pd -配体1 (PD-L1)免疫检查点抑制CD8+t细胞在胰腺癌中的抗肿瘤反应。
新的发现是什么?
髓系细胞是发生癌变期间胰腺上皮细胞中持续的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传递所必需的，尽管致癌性Kras表达。
髓细胞在肿瘤细胞中调节PD-L1的表达，然后抑制CD8介导的抗肿瘤免疫反应+细胞。
PD-L1在胰腺癌细胞中的表达受MAPK信号级联调控，并可被MAPK激酶(MEK)抑制剂阻断。
MEK抑制剂治疗降低了PD-L1的瘤内表达，并使肿瘤对PD-1阻断敏感。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
我们的数据表明，多种途径可以汇聚在一起，促进胰腺癌的免疫逃避。这些发现支持联合治疗模式的作用，破坏由恶性和非恶性细胞精心安排的不同免疫抑制途径。为此，我们的数据表明，用MEK抑制剂抑制MAPK信号级联可以减少肿瘤细胞PD-L1的表达，并允许抗肿瘤免疫反应的发展。总之，我们的研究结果支持MEK抑制和免疫治疗相结合作为胰腺癌的一种新的治疗策略。
简介
胰腺导管腺癌(PDA)及其前体病变，胰腺上皮内瘤变(PanIN)，以富含炎性细胞浸润的结缔组织间质积累为特征。1虽然间质中有丰富的免疫细胞，但它们大多属于免疫抑制亚群，如调节性T细胞(Tregs)、T辅助(Th)17细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和多个未成熟髓样细胞/髓样来源抑制细胞(MDSCs)亚群。2 - 4相反,CD8+T细胞很少出现，当它们出现时，它们表达高水平的免疫检查点受体，如程序性细胞死亡-1 (PD-1)，这可能表明一种疲惫的状态。5我们之前已经证明了CD4细胞的损耗+基因工程胰腺癌小鼠模型中的T细胞导致CD8增加+t细胞浸润和激活，从而防止致癌kras驱动PanIN的形成。3.CD4细胞耗竭+T细胞导致几种髓系细胞类型的浸润减少，包括巨噬细胞和未成熟髓系细胞(MDSCs)，表明不同免疫亚群之间的交叉调节。胰腺癌微环境中巨噬细胞和MDSCs普遍存在2两种细胞都有促进肿瘤的能力。6 - 8CD11b-白喉毒素受体(DTR)小鼠可诱导CD11b缺失+细胞，包括巨噬细胞和MDSCs，对白喉毒素(DT)的管理。9在这里，通过将CD11b-DTR小鼠与胰腺癌小鼠模型iKras*小鼠杂交，10我们开始确定髓系细胞在胰腺癌发生、发展和维持中的作用。
我们的结果表明，骨髓细胞在胰腺癌发生的多个阶段都是必需的。在胰腺癌发展过程中，骨髓细胞的早期衰竭可以防止急性胰腺炎中PanIN的形成。在晚期，髓系细胞对肿瘤生长至关重要。根据先前的文献，我们表明髓细胞有助于维持免疫抑制网络。我们通过激活表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号，确定髓系细胞是肿瘤细胞中免疫检查点配体pd -配体1 (PD-L1)表达的驱动因素。因此，MAPK激酶(MEK)抑制增加了肿瘤对PD-1/PD-L1阻断的脆弱性，从而可能揭示新的治疗策略。
材料与方法
鼠标菌株
通过将CD11b-DTR小鼠(B6.FVB-Tg(ITGAM-DTR/EGFP)34Lan/J, Jackson实验室)与iKras* (p48Cre;TetO-KrasG12DR26;rtTa-IRES-EGFP)10或iKras*p53* (p48Cre;TetO-KrasG12DR26;rtTa-IRES-EGFP; p53R172H / +老鼠)11我们生成了iKras*;CD11b-DTR和iKras*;p53*;CD11b-DTR小鼠。为了诱导致癌Kras的表达，在5%蔗糖溶液中以0.2 g/L的浓度在饮用水中施用强力霉素(doxy) (Sigma-Aldrich)。12缺乏完全转基因补体的动物被用作对照，并与实验动物平行处理。CD11b-DTR小鼠也与朋友病毒B (FVB)/NJ或C57BL/6J小鼠(Jackson实验室)回交进行同基因皮下实验。所有小鼠都被安置在密歇根大学综合癌症中心的特定无病原体设施中。所有的动物研究都得到了大学动物使用和护理委员会的批准。
体内实验
为了诱导胰腺炎，4-6周龄的小鼠连续2天以75µg/kg体重的剂量腹腔注射青色素(Sigma-Aldrich) 8小时(i.p)。DT (Enzo Life Science)每4天以25 ng/g的浓度ip给药。建立皮下肿瘤模型，2×106从iKras*p53*肿瘤中提取的原发性小鼠胰腺癌细胞系ikkras *1、ikkras *2和ikkras *3，11，134×10565671个细胞(FVB/NJ株)14或7940B细胞(C57BL/6J株)15来源于KPC肿瘤(P48-Cre;loxP-stop-loxP (LSL)喀斯特G12D；p53液氧/ +)注射到遗传背景相容的CD11d-DTR小鼠体内。用数字卡尺测量肿瘤直径，用公式length×width计算肿瘤体积2/ 2。对CD8+抗cd8单克隆抗体(BioXcell #BE0061;克隆2.43;200µg/只)，每周两次。纯化抗mpd -1抗体(BioXcell #BE0033-2;克隆J43)用于体内PD-1阻断剂，剂量为200 μg/i.p。注射，如有需要，每3天重复一次。MEK抑制剂(MEKi) GSK1120212 (Selleckchem)在10%(2-羟丙基)-β-环糊精溶液中每日(1 mg/kg, i.p)给药。
细胞培养
原发性人胰腺癌细胞系1319、UM2、UM5、UM18和UM19来自密歇根大学确诊为PDA的患者。14，16共同培养实验，1-2×105细胞被镀在6孔反孔培养皿中(孔径0.4µm;康宁公司)。骨髓(BM)细胞取自小鼠胫骨和股骨。用氯化铵-钾(ACK)溶解缓冲液(Lonza)清除红细胞。Anti-mIL6和重组人白细胞介素(IL -6)购自研发系统。MEKi抑制剂GSK1120212和EGFR抑制剂erlotinib购自Selleckchem。
统计分析
所有统计分析均采用Graphpad Prism 6软件。所有数据均以均数±标准差(SEM)表示。组间比较采用非配对双尾Student 's t检验或双向重复测量方差分析，以p<0.05为差异有统计学意义。
详细的协议和标准程序包括在补充的方法．
结果
CD11b+骨髓细胞是Kras所必需的G12D驱动PanIN地层
研究CD11b的作用+在胰腺癌的骨髓细胞中，我们生成了p48Cre;TetO-KrasG12D; Rosa26rtTa-IRES-EGFPCD11b-DTR (iKras*;CD11b-DTR)小鼠(图1A).多西环素在成年小鼠中诱导致癌Kras表达。如前所述，为了促进PanIN的形成，我们诱发了急性胰腺炎。10，17，18我们还在胰腺炎诱导前1天使用DT来消耗髓细胞(图1B;4 - 8老鼠/群组;胰腺在1天或1周后收获)。CD11b耗竭+细胞经流式细胞术确认补充图S1A)。使用这种实验方法，我们在急性胰腺炎诱导后第1天检测到腺泡-导管化生(ADM)，组织学上和细胞共同表达腺泡标记物淀粉酶和导管标记物细胞角蛋白19 (CK19)(见图1C和在线补充图印地上面一行)．一周后，我们发现iKras*小鼠的胰腺组织学与其他组相比存在明显差异。对照组和CD11b-DTR小鼠经历了组织修复，iKras*小鼠表现出广泛的纤维化和ADM(见图1C和在线补充图印地)。偶尔周期性的酸-希夫(PAS)染色，表明也观察到低级别PanINs(见在线)补充图就是S1C)。相比之下，尽管表达了致癌Kras，但iKras*;CD11b-DTR小鼠也经历了组织修复图1C和在线补充图印地)。总之，这些发现表明CD11b发挥了关键作用+在Kras突变激活的背景下，骨髓细胞抑制急性胰腺炎症后的组织修复。
CD11b+髓细胞是致癌kras驱动的胰腺上皮内瘤变(PanIN)形成所必需的。(A) iKras*;CD11b-白喉毒素受体(DTR) (p48Cre;TetO-KrasG12D；Rosa26rtTa-IRES-EGFPCD11b-DTR (p48Cre;TetO-Kras .;G12D；Rosa26rtTa-IRES-EGFP; p53R172H / +CD11b-DTR)小鼠模型。(B)实验设计显示。给iKras*和iKras*;CD11b-DTR小鼠多西环素水诱导Kras*表达3天，然后连续2天腹腔注射青色素诱导胰腺炎。小鼠也接受白喉毒素(DT)注射以消耗CD11b+胰腺炎诱导前1天骨髓细胞;每个时间点N = 4-8只小鼠。(C) H&E和(D)野生型对照、CD11b-DTR、iKras*和iKras*的phosph-ERK1/2染色;CD11b-DTR胰腺在胰腺炎诱导后1天和1周。比例尺50 μm。
MAPK信号通路是Kras的下游效应(有关综述，请参阅参考文献)。19和20)。MAPK活性升高，通过磷酸化细胞外信号调节激酶1/2 (p-ERK1/2)染色检测，发生在胰腺炎和胰腺癌期间。研讨会此外，MAPK的激活是PanIN形成的必要条件。24我们在急性胰腺炎诱导后第1天检测到所有组织中p-ERK1/2升高。一周后，iKras*胰腺中p-ERK1/2水平仍然升高，但在对照组和CD11b-DTR胰腺中已降低至无法检测到。类似地，在iKras*;CD11b-DTR胰腺中，p-ERK1/2水平较低(见图1D和在线补充图S1D)。因此，MAPK的持续激活和瘤前病变的形成需要髓系细胞的存在，尽管有致癌Kras的表达。
CD11b+骨髓细胞是胰腺癌生长所必需的
为了进一步研究骨髓细胞在胰腺癌中的作用，我们选择了一组原发性小鼠胰腺癌细胞系。细胞系来源于KPC25以纯FVB/NJ(65671系)或C57BL/6J背景(7940B系)培养的肿瘤，以允许同基因移植。此外，来自我们高度自交系群体的iKras*p53*衍生肿瘤系(iKras* 1-3)用于同窝伙伴移植(图2一个)。11，13为了维持体内移植的ikkras *p53*细胞中突变Kras的表达，持续给予强力霉素。在第一组实验中，菌株匹配的CD11b-DTR或野生型(WT)小鼠在皮下注射PDA细胞(图2A).然后每天测量各组的肿瘤体积(n= 4-6)。与DT处理的WT小鼠或对照处理的CD11b-DTR小鼠相比，DT处理的CD11b-DTR小鼠表现出明显的肿瘤生长抑制作用(图2B)不同的菌株。组织学分析强调了来自dt处理的CD11b-DTR小鼠的肿瘤中存在分化良好的肿瘤和大坏死核(与对照组的小坏死区域或不存在坏死区域相比)(图2C).因此，CD11b .+髓系细胞对于移植的PDA肿瘤的植入和生长非常重要。
骨髓细胞是胰腺癌生长和维持所必需的。(A)显示皮下肿瘤生长的实验设计。白喉毒素(DT)在皮下肿瘤种植前1天给予。(B)皮下肿瘤生长曲线。数据表示均值±SEM, n= 4-6。采用双向方差分析(ANOVA)进行统计学差异分析。(C)显示对照和dt处理的CD11b-DT受体(DTR)小鼠皮下肿瘤的H&E染色。比例尺50µm。(E)显示皮下肿瘤进展和维持的实验设计。在肿瘤可测量后给予DT以消耗髓系细胞。 (F) Changes in tumour size (%) post-DT treatment are shown. Data represent mean±SEM, n=6–8. Statistical difference was analysed by two-way ANOVA between two groups. (H) H&E staining of subcutaneous 65 671 tumours is shown. Scale bar 50 µm. (G) Percentage of CD45+CD11b+骨髓细胞，CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD45+CD11b+Gr1一起+流式细胞术检测皮下肿瘤中MDSCs的表达。数据表示均值±SEM;每个点代表一个肿瘤(n= 5-6)。统计学差异由双尾学生t检验确定。MDSCs，骨髓来源抑制细胞。
然后，我们进行了第二组实验，在肿瘤细胞植入后6-8天进行DT治疗，当时肿瘤直径为5-8毫米(见图2D和在线补充图S2A)。CD11b+细胞耗竭以细胞系依赖的方式导致生长停滞或肿瘤消退(图2E)。虽然组织学分析显示某些细胞系的肿瘤结构没有改变(图2F), CD11b+流式细胞术显示肿瘤细胞已耗尽(图2G)和F4/80免疫染色(见在线补充图开通)。尽管CD11b没有改变Ki67阳性的增殖肿瘤细胞的数量+细胞衰竭(参见在线补充图S2C)，我们确实观察到凋亡细胞显著增加，通过裂解caspase 3和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)染色测量(见图3A-D和在线补充图S2D)。这一观察使我们研究了肿瘤细胞死亡的机制，并由此导致CD11b发生肿瘤消退+骨髓细胞衰竭。
髓系细胞耗竭诱导肿瘤细胞死亡并增强肿瘤浸润CD8+T细胞。(A)展示了实验设计。(B)裂解caspase 3的免疫组化和(D) TUNEL(红色)和细胞角蛋白19 (CK19)(绿色)在对照和白喉毒素(DT)治疗的皮下肿瘤中的免疫荧光染色。比例尺50µm。裂解caspase 3的定量分析+每张幻灯片的面积(%)和TUNEL+每高功率场(HPF, 400×)的单元数见(C)。数据表示平均值±SEM, n=3。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(E)显示对照和dt处理的iKras*1和iKras*2皮下肿瘤中CD8(红色)、GFP(绿色)、CD3(灰色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光共染色。比例尺25µm。黄色箭头表示CD3+CD8+T细胞。(F) CD3的定量+CD8+每个HPF的t细胞数量。数据表示均值±SEM, n= 3-5。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(G)实时荧光定量pcr显示γ干扰素，干扰素β1而且perforin-1在对照组和dt治疗的皮下肿瘤中表达。数据表示均值±SEM;每个点代表一个样本(n= 4-7)。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。DAPI 4’,6-diamidino-2-phenolindole。
瘤内CD8升高+CD11b后t细胞浸润和活化+电池耗尽
肿瘤细胞死亡的增加伴随着CD11b的缺失+髓系细胞可能是由于几种不同的机制，包括髓系细胞释放的支持肿瘤细胞存活的因子减少，或者激活抗肿瘤免疫反应。我们发现CD11b-DTR小鼠骨髓细胞的减少导致几种巨噬细胞标记物的表达减少，包括精氨酸酶1（__arg1)，巨噬细胞清道夫受体1（Msr1),甘露糖受体C型1（Mrc1)(在线补充图S3A)，与髓系细胞耗竭一致。这些标记物中的每一个都与巨噬细胞相关，巨噬细胞可以在肿瘤微环境中促进免疫抑制(综述，见参考文献)。代谢途径)。因此，我们认为髓系细胞衰竭可能降低PDA的免疫抑制，从而恢复有效的免疫监测。经分析，我们发现CD8+在iKras*1和iKras*2肿瘤中，肿瘤内的t细胞浸润均增加(图3E,F)，当髓系细胞耗尽，但流式细胞术显示iKras*3肿瘤中髓系细胞减少(图4B).由于iKras*3肿瘤中t细胞浸润的减少是意外的，我们随后评估了CD8的空间定位+T细胞的CD8共免疫染色+绿色荧光蛋白(GFP)用于标记PDA肿瘤细胞。在对照肿瘤中，我们观察到CD8+T细胞主要局限于肿瘤周围。相反，在dt处理的CD11b-DTR小鼠中，CD8+T细胞在恶性细胞中被发现补充图S3B比较CD8的定位+T细胞，红色箭头所示，在肿瘤的边界，在顶部面板的肿瘤块中有少量的细胞与GFP混合+肿瘤细胞和CD8+底部的单元格)．因此，整体CD8的数量+iKras*3 PDA肿瘤中的T细胞减少，这一变化主要反映了肿瘤周围的减少，与CD8的实际增加相掩盖+肿瘤内的T细胞。与CD8升高的概念一致+t细胞活化，我们还观察到t细胞活化标志物的表达增加，包括干扰素γ（干扰素γ)，干扰素β1而且perforin-1 (Prf-1)后CD11b+细胞耗竭(图3G). CD8的增加+t细胞浸润和激活伴随着Treg种群的减少(在线)补充图S3C)。因此，骨髓细胞耗竭对胰腺癌的免疫微环境具有复杂的影响，改变了免疫抑制和激活之间的平衡。
CD8+T细胞衰竭挽救骨髓细胞衰竭小鼠肿瘤进展。(A)展示了实验设计。(B) CD3百分比+CD8+流式细胞术检测的对照组、白喉毒素(DT)处理或DT和抗cd8处理的ikkras *3皮下肿瘤中的T细胞。数据表示均值±SEM;每个点代表一个肿瘤(n=4)。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(C)显示从对照、DT和/或抗cd8处理的CD11b-DT受体(DTR)小鼠中提取的iKras*1和iKras*3皮下肿瘤的肿瘤大小变化(%)。数据表示均值±SEM, n=6。采用双向方差分析对组间差异进行统计学分析。(D)在对照组、DT和/或抗cd8处理的ikkras *1皮下肿瘤中显示细胞角蛋白19 (CK19)和裂解的caspase 3的H&E染色和免疫组化。比例尺50µm。(E) cleaved caspase 3的定量分析+显示每张幻灯片的面积(%)。数据表示均值±SEM, n=3。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(F)实验设计:iKras*;p53*;CD11b-DTR小鼠在胰腺炎诱导后保持doxy水，并监测肿瘤形成情况。在超声检测出胰腺肿瘤后，给予小鼠DT或联合抗cd8治疗。肿瘤大小由超声成像确定。(G)在对照、DT与抗cd8处理小鼠或不抗cd8处理小鼠的肿瘤中显示裂解的caspase 3 (CC3，红色)、GFP(绿色)和DAPI(蓝色)的共免疫荧光染色。比例尺50µm。图描述了每高倍场凋亡肿瘤细胞的定量(HPF, 200X)。数据表示均值±SEM，每只小鼠3个HPF。 Statistical difference was determined by two-tailed Student’s t-tests. DAPI, 4',6-diamidino-2-phenolindole.
髓细胞调节CD8+t细胞免疫对抗胰腺癌
然后，我们测试了髓系细胞是否通过抑制PDA中的t细胞介导的免疫反应来促进肿瘤生长。为此目的，移植肿瘤的动物被细分为队列，并使用抗mcd8、DT或两者的组合进行治疗(图4A) CD8耗竭+用流式细胞术检测肿瘤中的T细胞(图4B)我们发现CD8+t细胞耗竭本身对肿瘤生长没有影响(图4C).相反，DT治疗阻止了肿瘤生长，但这种效果依赖于CD8+当CD8+T细胞在接受DT治疗的小鼠中减少(图4一部)。
为了确定移植模型中获得的结果是否可以扩展到自发性肿瘤，通过高分辨率超声监测iKras;p53*或iKras*;p53*;CD11b-DTR小鼠的癌症形成。一旦发现肿瘤，通过高分辨率超声估计肿瘤体积，然后对动物进行DT治疗或不治疗，并测量肿瘤体积随时间的变化(图4F).我们发现经DT治疗的iKras*;p53*;CD11b-DTR小鼠中有50%发生肿瘤消退(图4F).肿瘤组织免疫染色显示，骨髓细胞衰竭时，上皮区(使用iKras*系统中存在的谱系追踪标记GFP定义)的凋亡增加了10倍(图4我们考虑了这种增加是否可能是由于巨噬细胞无法清除死亡细胞或活性抗肿瘤CD8所致+T-cell-mediated反应。为了区分这些可能性，我们进行了CD8+t细胞衰竭和CD11b+细胞衰竭，观察到上皮细胞凋亡几乎完全挽救(图4G).因此，我们的数据支持CD11b的作用+骨髓细胞“保护”肿瘤细胞不受t细胞反应的影响。
接下来，我们研究了髓系细胞调节CD8的机制+PDA中的t细胞免疫监测。在许多实体恶性肿瘤中已报道的一种机制是PD-1/PD-L1免疫检查点的激活。29，30.髓系细胞已知表达pd - l1 - PD-1的配体，它在活化的T细胞上表达，并限制肿瘤内的持续激活。因此，我们首先检测了PDA肿瘤中髓系细胞中PD-L1的表达。我们在基因兼容的CD11b-DTR小鼠中使用植入的iKras*p53*肿瘤系，对CD45进行了分类+CD11b+Gr-1+MDSCs, CD45+CD11b+F4/80+巨噬细胞,CD45-绿色荧光蛋白−基质细胞，CD3+CD8+T细胞和绿色荧光蛋白+CD45−肿瘤细胞。定量PCR分析显示Pdcdlg1编码PD-L1的基因在MDSCs、基质细胞、巨噬细胞中表达，在较低水平上也可由肿瘤细胞表达(见图5A和在线补充图S3D)。Pdcdlg2PD-1的另一种免疫检查点配体也在巨噬细胞中被检测到，但在肿瘤细胞中未被检测到补充图S3D和未显示的数据)．DT治疗导致的损失Pdcdlg1在肿瘤细胞中表达，但在残余骨髓细胞或基质细胞中不表达(图5A).免疫组化同样显示骨髓细胞耗竭时肿瘤细胞上的PD-L1蛋白减少(图5B).在这些肿瘤中，DT治疗导致- 2而且干扰素γ表达和减少Pdcd1表达，提示CD8激活和增殖增加+T细胞(见在线补充图S3E)。然后我们用流式细胞仪检测了PD-L1在KPC肿瘤中的表达。髓细胞衰竭再次导致65671例肿瘤上皮细胞中PD-L1表达减少(图5C)，尽管在7940B肿瘤的上皮细胞中没有(数据未显示)，表明在小鼠肿瘤系之间存在差异。
髓系细胞通过表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调节胰腺癌细胞程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)的表达。(A)定量实时(qRT) pcr用于Pdcdlg1CD45在流式排序中的表达−绿色荧光蛋白−基质细胞和CD45+CD11b+Gr-1+MDSCs;Pdcdlg1胰腺上皮内瘤变(PanIN)细胞、iKras*3体外细胞和流式分类GFP的表达+CD45−皮下iKras*3肿瘤细胞。数据表示均值±SEM, n=3。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(B)显示对照和白喉毒素(DT)治疗的皮下肿瘤中PD-L1的免疫组化。比例尺25µm。(C) CD45百分比−EpCAM+肿瘤细胞和CD45−EpCAM+PD-L1+流式细胞术显示了从dt处理的野生型小鼠或CD11b-DT受体(DTR)小鼠中提取的皮下肿瘤65671个肿瘤细胞。数据表示均值±SEM;每个点代表一个肿瘤(n=6)。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(D)展示了共培养实验的实验设计。(E) Western印迹显示单独培养的UM2中EGFR、MAPK、AKT、STAT3信号通路成分，与骨髓(BM)细胞共培养，并随后进行载体、厄洛替尼或MAPK激酶(MEK)抑制剂(MEKi)治疗。(F) qRT-PCR显示PDCDLG1PD-L1在原代人胰腺导管腺癌(PDA)细胞系UM2中表达和western印迹检测，UM2单独培养，与BM细胞共培养，并在载体、厄洛替尼或MEKi治疗后进行。数据表示均值±SEM, n=3。统计学差异由双尾学生t检验确定。(G) qRT-PCR用于PDCDLG1显示了原代人PDA细胞系UM5单独培养、与BM细胞共培养以及载体或MEKi处理后PD-L1水平的表达和western印迹。数据表示均值±SEM, n=3。统计学差异由双尾学生t检验确定。AKT，蛋白激酶B (PKB)，又称AKT;MDSCs，骨髓来源的抑制细胞;qRT，定量实时。
然后，我们试图研究PD-1/PD-L1免疫检查点通路的抑制是否足以概括骨髓细胞衰竭的影响。因此，我们用抗mpd -1抗体(克隆J43)或同型对照治疗荷瘤小鼠，并在治疗的第3天收获它们(见在线补充图S4A)。PD-1阻断剂不能抑制iKras*2细胞的肿瘤生长补充图S4A)，根据目前的临床数据。31事实上，我们确实在iKras*1和3细胞系中观察到反应(见在线补充图S4A)可能表明这些系的免疫原性稍强。因此，我们观察到肿瘤内CD8的增加+iKras*1和3细胞中的T细胞(参见在线补充图S4B)，但在iKras*2细胞中没有补充图S4A和数据未显示)。此外，的水平干扰素γ，干扰素β1,Prf-1而且Gzmb -CD8标记+在PD-1阻断时，iKras*3肿瘤中的t细胞激活增加，但在iKras*2肿瘤中没有补充图自己)。在两个同基因模型(7940B和65671)中，即使使用抗mpd -1进行长期治疗，随着时间的推移对肿瘤生长也没有影响补充图S4D和图6此外，我们观察到抗pd -1治疗导致的代偿性增加细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4（Ctla4)表达，从而激活另一个免疫检查点，并最终绕过PD-1阻断(见在线补充图S4E)。
体内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)失活下调了肿瘤细胞程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)的表达．(A)展示了实验设计。(B) mapk激酶(MEK)抑制剂(MEKi)治疗后肿瘤大小(%)的变化。数据表示均值±SEM, n= 4-6。采用双向方差分析(ANOVA)分析两组间的统计学差异。(C)流式细胞仪检测CD45百分比−EpCAM+PD-L1+肿瘤细胞和CD45+CD11b+PD-L1+测量了从载体或meki处理小鼠中提取的皮下65671个肿瘤和ikkras *3肿瘤中的髓系细胞。数据表示均值±SEM;每个点代表一个肿瘤(n= 4-6)。采用双尾学生t检验进行统计学差异分析。(D) Western blotting显示经vehicle或MEKi治疗后皮下iKras*3肿瘤中PD-L1和磷酸化erk1 /2水平。数据表示均值±SEM, n=3。(E)共免疫荧光染色显示在载体或meki处理的皮下肿瘤中E-cadherin(绿色)、PD-L1(红色)、phosph-ERK1/2(品红色)和DAPI(蓝色)。比例尺50µm。(F)共免疫荧光染色显示GFP(绿色)，PD-L1(红色)，phosph-ERK1/2(品红)和DAPI(蓝色)在载体或meki处理的皮下iKras*3肿瘤中。洋红色箭头表示绿色荧光蛋白+PD-L1+phosph-ERK1/2+肿瘤细胞;绿色箭头表示绿色荧光蛋白+PD-L1−phosph-ERK1/2−肿瘤细胞。比例尺50µm。(G) meki和/或抗pd -1治疗后肿瘤大小(%)变化的实验设计和图表。数据表示均值±SEM, n= 4-6。采用双因素方差分析分析两组间的统计学差异。DAPI 4’,6-diamidino-2-phenolindole。
骨髓细胞诱导表达PD-L1通过EGFR/MAPK信号传递到肿瘤细胞中
虽然iKras*肿瘤细胞在体内表达PD-L1水平升高，但体外培养细胞导致PD-L1快速下调Pdcdlg1表达式(见网上)补充图S4F)。这一发现与我们的观察结果一致，即PD-L1在CD11b缺失的肿瘤中表达下调+骨髓细胞。为了了解这一生物学现象，我们进行了一系列共培养实验。首先，我们分离出CD11b+F4/80+TAMs是CD11b的一个主要子集+细胞浸润肿瘤。我们还从肿瘤中分离出T细胞。然后，我们使用反孔板将TAMs和T细胞与iKras*肿瘤细胞单独或联合培养．而肿瘤细胞则表现出极低的表达Pdcdlg1，我们发现与巨噬细胞、T细胞或两者联合培养，诱导Pdcdlg1肿瘤细胞中的表达(见在线补充图S5A)。
接下来，我们使用四种原发性胰腺癌细胞系1319、UM2、UM18和UM19研究了这些发现是否与人类肿瘤相关。首先，我们将这些细胞单独或与BM细胞一起在转运孔中培养。我们发现BM细胞诱导了两者的表达上调Pdcdlg1而且Pdcdlg2在三种人类肿瘤细胞系中(见在线)补充图S5B)。此外，还观察到对共同培养的BM细胞的相互作用，其中三个系同时诱导巨噬细胞分化和替代极化(见在线)补充图S5C)。
在我们研究髓系细胞调节PDA细胞中PD-L1表达的机制时，我们发现人PDA细胞系与bm来源的细胞共培养导致肿瘤细胞中EGFR磷酸化的增加，这表明EGFR信号的激活(图5E).据报道，EGFR信号通路可诱导非小细胞肺癌细胞中PD-L1的表达;32然而，它在PDA中的作用以前没有报道过。因此，我们研究了胰腺癌细胞中是否存在类似的效应。为了做到这一点，人类原发性胰腺癌细胞(UM2, UM5, 1319和UM18)使用跨孔系统与bm来源的细胞共同培养。然后，去除BM细胞，用载体对照或EGFR抑制剂厄洛替尼(erlotinib)治疗肿瘤细胞。图5D).尽管大多数胰腺癌细胞表达Kras的突变形式，但这些细胞中MAPK信号的激活仍然部分依赖于EGFR信号通路，EGFR信号通路在胰腺癌发生中起着关键作用。22，33厄洛替尼治疗导致p-EGFR和下游信号成分p-ERK1/2水平轻微下降，并降低了p-EGFR的表达Pdcdlg1与脑转移瘤来源细胞共培养后的RNA和蛋白质(图5E, F).确定MAPK信号通路是否在EGFR下游激活22是负责感应的PD-L1，我们使用MEKi GSK1120212进行了一组类似的实验。正如预期的那样，MEKi治疗导致p-ERK1/2水平急剧降低(图5E)，并降低了所有细胞系中PD-L1的表达，与其基础水平的PD-L1表达无关(见图5F, G和在线补充图S6B S6C)。有趣的是，尽管MAPK/ERK和PI3K/AKT(蛋白激酶B，也称为AKT)之间的反馈机制此前在乳腺癌和结直肠癌中被描述过，34，35MEKi治疗仅导致p-AKT的适度上调，但p-Stat3的强烈上调令人惊讶图5E和在线补充S6B)，通过增加IL-6的表达(见在线补充图S6D)。
除了EGFR配体，MAPK信号也可以被其他分泌因子激活。我们之前已经证明IL-6在PanINs中激活MAPK信号，36髓细胞是这种细胞因子的来源。37然而，重组人IL-6的处理对UM2系的MAPK信号(测量为p-ERK)没有明显的影响，尽管它导致了p-Stat3的增加，这是一种直接的下游信号传导效应。相反，当BM细胞和肿瘤细胞共同培养时(见在线补充图S5A)，抗il6抗体的使用对p-ERK水平只有适度的影响，而它确实降低了p-Stat3水平。在这两种情况下，我们没有观察到任何变化Pdcdlg1表达式(见网上)补充图s S6B, S6C, S6F)。因此，至少在体外情况下，IL-6在MAPK信号的调控或蛋白的表达中不发挥关键作用Pdcdlg1表达式。
PD-L1的表达在体内受MAPK信号通路的调控
为了验证MAPK信号通路在胰腺癌细胞中调控PD-L1表达的机制，我们用MEKi或载体(图6A). MEK抑制导致65671中肿瘤生长减少和iKras3中肿瘤消退* (图6B).流式细胞术分析显示，表达pd - l1的肿瘤细胞在65671例中减少(CD45−EpCAM+PD-L1+细胞)和iKras*3系(CD45百分比−绿色荧光蛋白+PD-L1+细胞)。表达pd - l1的髓系细胞在65 671例中也减少(CD45+CD11b+PD-L1+细胞)，但在iKras中保持不变*3 (图6C). iKras*3来源肿瘤的Western blot分析证实MEKi治疗后PD-L1减少(图6D);然而，由于这是在大量肿瘤组织上进行的，因此不清楚哪些细胞受到了影响。因此，我们随后对65671和iKras*3来源的肿瘤进行了共免疫染色。在两组样本中，我们观察到肿瘤上皮细胞(在65671个细胞中通过与E-cadherin共表达，在iKras*3系中通过谱系示踪剂EGFP表达)表达了高水平的p-ERK和膜PD-L1 (图6E, F). MEKi治疗时，p-ERK和PD-L1水平降低。有趣的是，iKras*3样本中的一部分肿瘤细胞对MEKi具有耐药性，这些细胞中的p-ERK水平在治疗中没有变化。此外，这些单个细胞也保留了PD-L1的表达(图6F)。此外，为了测试肿瘤细胞上PD-L1表达的降低是否会使它们对抗pd -1阻断反应更强，我们用MEKi和抗mpd -1治疗了65671来源的肿瘤队列。联合治疗对肿瘤生长和可能的肿瘤消退表现出更大的抑制作用，与单独抑制PD-1没有效果相比，MEKi自身的生长略有下降(图6综上所述，我们的数据揭示了MAPK信号与PD-1/PD-L1免疫检查点之间的一种新的相互作用，可以用于治疗。
讨论
胰腺癌的发生和发展伴随着炎性微环境的积累，其中包括免疫抑制淋巴细胞和骨髓细胞类型的普遍存在。2，6肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用是复杂的，尚不完全清楚。如果免疫疗法要成功地应用于胰腺癌(一种对当前免疫治疗策略表现出显著抗性的疾病)，对这种生物学的理解是必要的。38在目前的研究中，我们研究了以CD11b表面标记物表达为特征的一大类髓系细胞在调节PDA进展和生长中的功能。
不同髓系细胞亚群的相对丰度在胰腺癌发生过程中发生变化，早期TAMs积累，随后粒细胞和未成熟髓系细胞积累增加。6，39肿瘤来源的粒细胞-巨噬细胞集落刺激(GM-CSF)因子是胰腺癌发展过程中MDSC招募所必需的;反过来，MDSCs抑制CD8+依赖t细胞的反应。40，41类似地，Gr-MDSCs (CD11b .+Gr-1高Ly6Cint)通过抑制t细胞增殖和激活后诱导t细胞死亡来促进胰腺癌的发生。6巨噬细胞在癌变开始时诱导ADM并促进肿瘤生长。7，42，43在晚期肿瘤中，巨噬细胞同样是必需的，它们需要促进转移。44
使用抗csf1受体(CSF1R)抗体预防巨噬细胞招募可减少tam的总数及其免疫抑制能力。有趣的是，CSF1R信号的阻断分别导致T细胞和肿瘤细胞上的免疫检查点分子CTLA4和PD-L1的上调，这是肿瘤微环境中增强的免疫刺激的结果。PDA快速适应免疫压力的能力表明胰腺癌需要联合治疗，事实上，CSF1R抑制联合抗pd -1治疗导致肿瘤消退。45虽然TAMs主要以促肿瘤的方式起作用，但它们的生物活性可以被重定向。用激动剂抗体靶向巨噬细胞中的表面抗原CD40导致肿瘤浸润的巨噬细胞成为杀瘤细胞并导致肿瘤消退。46在CD40激动剂治疗中，趋化因子(C-C Motif)配体2 (CCL2)和IFNγ的全身释放最近被证明可以将巨噬细胞从促肿瘤状态重定向到有利于纤维化反应降解和胰腺重塑的状态。15
鉴于这一广泛的工作，我们努力研究在基因工程胰腺癌小鼠模型和同基因移植模型中消耗大量骨髓细胞亚群(包括巨噬细胞和MDSCs)的影响。我们使用了基于CD11b- dtr小鼠的遗传方法，允许耗尽所有CD11b+DT处理后的细胞亚群。在癌变的开始阶段，我们观察到髓系细胞的耗竭足以阻止PanIN的形成。在癌变的后期，骨髓细胞是肿瘤生长所必需的。此外，我们的体内研究结果表明，PD-L1免疫检查点配体在肿瘤细胞表面的表达依赖于髓细胞的存在，髓细胞的缺失可以恢复CD8+t细胞介导的免疫反应
PD-L1的表达可被多种细胞因子激活。47-50在活的有机体内，CD8+T细胞可以驱动其在黑色素瘤细胞中的表达。51同样，我们发现T细胞在体外共培养系统中驱动胰腺癌细胞中PD-L1的表达。我们发现骨髓细胞也能促进胰腺癌细胞中PD-L1的表达．此外，在体内，髓系细胞的衰竭导致肿瘤细胞上PD-L1的丢失(见方案)图7)．这一发现并不一定反映骨髓细胞对肿瘤细胞的直接影响，因为骨髓细胞耗竭会导致肿瘤微环境中的其他变化，如treg的减少。有趣的是，骨髓细胞衰竭对其他细胞类型(如基质细胞)中PD-L1的表达没有影响。我们进一步表明，EGFR/MAPK信号通路是肿瘤细胞中PD-L1表达的关键调节因子。这一发现与PD-L1在egfr突变的非小细胞肺癌中表达的观察结果相一致。32在我们的系统中，髓系细胞是肿瘤细胞MAPK激活所必需的。这一发现背后的机制尚未完全确定，但很可能涉及通过配体激活EGFR。事实上，浸润性巨噬细胞已被证明是乳腺癌中EGFR配体的来源52特别是肿瘤胰腺中的HB-EGF。53基于这些观察，问题出现了MEK抑制是否可以通过降低PD-L1的表达来调节肿瘤，并使其对抗pd -1治疗更敏感。事实上，联合MEK和PD-1抑制在胰腺癌同基因移植模型中比单独治疗更有效。
描述我们工作模型的图表。的CD11b+髓细胞通过阻断CD8来保护肿瘤细胞的活力+t细胞介导的胰腺癌抗肿瘤反应。(一)CD11b+髓细胞阻断抗肿瘤CD8+T细胞的免疫反应部分通过激活程序性细胞死亡-1 (PD-1)/ pd -配体1 (PD-L1)检查点。(B) CD11b+骨髓细胞减少逆转免疫抑制，使CD8成为可能+t细胞效应功能，从而阻止肿瘤生长。
这些发现可能具有重要的治疗意义。PD-L1在胰腺癌细胞中表达的观察5使得利用这种分子进行治疗成为可能。然而，虽然PD-1/PD-L1靶向癌症在其他癌症类型中显示出有益的反应，但它本身对胰腺癌无效。31使用组合策略更有希望。PD-1和CTLA4联合靶向比单独靶向更有效。5我们的数据表明，PD-1靶向也应该结合靶向致癌Kras的效应物之一MAPK信号通路进行探索。此外，随着肿瘤细胞和髓系细胞亚群之间相互作用的进一步探索，可能会发现适合联合治疗的新的潜在治疗靶点。
一个值得未来研究的意外发现是Stat3对MEK抑制的激活。IL-6/Stat3信号通路已被证明促进胰腺癌的发生17，37因此，将MEK抑制与Stat3激活联系起来的最终反馈机制可能会引起人们的关注，但也可能为联合靶向胰腺癌提供新的机会。
致谢
作者感谢Jörg Zeller博士、魏延博士和郑斌博士的科学讨论。他们感谢克里斯汀·朗的有益讨论和手稿编辑;Dawson Knoblock提供技术援助和有益的讨论，Kevin T Kane提供实验室支持。CK19抗体来源于Iowa Developmental Hybridoma Bank。
参考文献
脚注
贡献者YZ、AV-D、EM、FMM、KF和DL进行实验并分析数据;DMS建立了原代人细胞系;ADR辅助超声成像;YZ、GLB和MPdM设计了研究，解释了数据并撰写了手稿。MPdM指导了这项研究。
资金该项目由密歇根大学生物学学者计划、密歇根大学癌症中心支持基金(NCI P30CA046592)、美国癌症协会学者基金、Elsa U Pardee基金会和NCI- 1r01ca151588 -01资助。EM得到了密歇根大学细胞和分子生物学培训资助(NIH T32 GM007315)和密歇根大学胃肠培训资助(NIH T32 DK094775)的支持。GLB由美国国立卫生研究院资助K08 CA138907。
相互竞争的利益没有宣布。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
数据共享声明本研究的细胞系、组织样本、试剂、原始数据和研究设计将根据要求免费与任何研究人员共享。