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目标蛋白酶是关键调解人的痛苦和肠神经信号改变,尽管这些重要的肠道介质的类型和来源不明。我们假定的肠道上皮细胞的主要来源trypsin-like IBS患者的活动,这个活动信号初级传入和肠神经,引起内脏过敏症。
设计Trypsin-like活动确定了组织的IBS患者和上层清液Caco-2细胞的刺激。这些上层清液也被应用到文化的初级传入纤维。胰蛋白酶的mRNA亚型(PRSS1,2和3)被一发现,trypsin-3蛋白表达被免疫印迹分析和免疫组织化学研究。电生理记录和Ca2 +成像在回应trypsin-3进行鼠标初级传入和人体黏膜下神经元,分别。结直肠扩张内脏运动的反应被记录在小鼠接种intracolonically trypsin-3。
结果我们表明,刺激肠道上皮细胞释放trypsin-like活动专门从基底外侧。这个活动能够激活感觉神经元。在IBS患者的冒号,trypsin-like活动增加与上皮细胞相关。我们发现,trypsin-3是唯一形式的胰蛋白酶调节刺激肠道上皮细胞和组织从肠易激综合症患者。Trypsin-3能够信号对人体粘膜下肠神经元和鼠标感觉神经元,而使体内内脏过敏,所有由protease-activated receptor-2-dependent机制。
结论在肠易激综合症、肠上皮细胞产生和释放活性蛋白酶trypsin-3,就是能信号肠神经元和诱导内脏过敏症。
- 腹部疼痛
- 肠易激综合症
- 胰蛋白酶
- 肠道神经——交互
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来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
从IBS患者结肠组织发布“trypsin-like”活动。
一般蛋白酶和胰蛋白酶特别能信号肠神经元。
Protease-activated受体2的激活可以激活鼠标感觉神经元和粘膜下神经元。
体内,protease-activated受体2激活引起内脏过敏。
有什么新发现吗?
的起源和本质的一个主要负责trypsin-like活动组织蛋白酶从IBS患者解开:胰蛋白酶3。
肠上皮细胞的主要来源是胰蛋白酶从IBS患者结肠组织的活动。
在所有的现有形式的胰蛋白酶,trypsin-3蛋白酶负责IBS tissues-associated胰蛋白酶活性增加。
Trypsin-3肠道上皮细胞通透性增加。Trypsin-3也信号对人体粘膜下神经元,鼠标感觉神经元,导致内脏过敏,所有通过protease-activated receptor-2-dependent机制。
Trypsin-3可以视为内生protease-activated的受体激动剂受体2在IBS的背景下。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
Trypsin-3可以作为一个标记上皮功能障碍的患者肠易激综合症。
特定抑制剂trypsin-3可以开发新的治疗方案治疗IBS的过敏症状。
介绍
肠易激综合症是最常见的功能性胃肠道疾病。1IBS患者患有腹部疼痛、痉挛和排便习惯改变。而病理生理学仍然知之甚少,有越来越多的证据表明,神经元支配hyperexcitable肠肠易激综合症患者,包括肠神经元和外在主要感觉传入纤维。大量研究表明,一个组织内的介质存在IBS患者构成这些神经元的变化,其中,蛋白酶似乎特别重要。2 - 4
研究报道,蛋白酶抑制剂完全抑制神经元激活肠易激综合症引起的组织上层清液。3,4然而,起源和蛋白酶的性质,可以负责从IBS患者神经元过度活跃的组织仍不清楚。的起源和性质的识别这些蛋白酶将潜在的治疗方法和药物开发的一个重要步骤在肠易激综合症。在这里,我们假设肠道上皮细胞可能是一个重要来源的蛋白酶诱导神经元的信号,和潜在的过敏症状与肠易激综合症有关。因此,我们一直在调查公布的蛋白水解活性人工培养肠上皮细胞和测试它们对感觉神经元激活的影响。在人类中,三个丝氨酸蛋白酶(prs)基因编码胰蛋白酶原:PRSS1编码trypsinogen-1(阳离子胰蛋白酶),PRSS2编码trypsinogen-2(阴离子胰蛋白酶)和PRSS3编码trypsinogen-3,至少两个亚型与重叠的成熟肽序列,曾被指定为mesotrypsinogen和胰蛋白酶原IV,功能特征。成熟的蛋白质的PRSS3基因使用trypsin-3蛋白的命名法,这种基因的共同所有记录。在这里,我们已经确定,刺激(通过脂多糖(LPS)或肾上腺素)肠上皮基底外侧的专门发布trypsin-3,信号能够通过protease-activated人类肠神经元和感觉神经元受体(PAR) 2(标准2)端依赖机制。此外,trypsin-3能够诱导上皮通透性增加体外和体内内脏过敏,当交在结肠。最后,IBS患者的组织,我们确定,绝大多数trypsin-like与上皮细胞相关蛋白水解活性,在trypsin-3调节与健康对照组的水平。我们的数据表明在IBS肠道上皮细胞产生和释放活性蛋白酶,即trypsin-3能够信号黏膜下神经元,初级传入纤维和诱导内脏过敏症。
材料和方法
病人
结肠组织取自IBS患者和健康对照组在金斯敦总医院(加拿大安大略省)(伦理批准6004988,2013年至2016年收集),南特(伦理批准dc - 2008 - 402 2012年至2016年收集)和图卢兹(伦理审批dc - 2015 - 2443绞痛项目收集了在2015年和2016年)医院(法国)(见在线补充表S1)。肠易激综合症患者由罗马III标准定义的。下行结肠活检收集在结肠镜检查过程中被用于随机免疫组织化学和mRNA表达。免疫组织化学,新鲜活检在最佳切削温度(10月)复合涂层(Dako)和存储在−80°C。mRNA表达,互补DNA(互补)样品产生RNA提取使用。黏膜下神经成像,大肠的样本是从non-pathologic区切除术6接受结肠切除术的患者的结肠癌。
老鼠
雄性C57BL / 6小鼠(6 - 10周,查尔斯河实验室,威明顿市,密歇根州,美国,或者Janvier圣Quentin-Fallavier法国)和男性持平2不足或野生型小鼠的同胞。5小鼠自由获取食物、水和受到12小时光/暗周期。动物协议遵循加拿大动物保护协会的建议,在皇后大学动物保健委员会批准协议(2016 - 1644),卡尔加里大学(协议m08068 - 70)和图卢兹(协议PI-U1220-NV19)。
内脏过敏的大鼠模型
岁成人Wistar鼠(8 - 9周,哈伦实验室,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国),男性(240 - 300克)和女性(175 - 220 g)作为新生儿公开有限层理压力6或天真Sprague-Dawley老鼠(年龄7 - 8周,250 - 275克)和免费的食物和水在12小时光/暗周期地适应实验开始前1周。根据协议实验是美国国立卫生研究院的指导方针# 09026 - 11和# 9906 - 020年批准的机构动物保健和使用委员会的退伍军人事务大洛杉矶医疗体系的赞助下办公室的实验动物Welfare-Assurance合规(A3002-01)。
两种方法被用来诱导内脏过敏:避免重复水压力(是),(10天,1小时/天)7并通过腹腔内注射cortagine管理。8内脏敏感性评估如前所述。7,8
成像
节和实时成像进行蔡司共焦LSM710 ApoTome。2显微镜,分别。
从背根神经节感觉神经元的文化
背根神经节(DRG)神经元从老鼠被孤立。3细胞被清洗和孵化与汉克的平衡盐溶液(hbs) + Ca2 +普朗尼克Fluo-4-AM(表达载体)和20% f - 127(英杰公司)在30分钟37°C紧随其后30分钟前在室温下成像。9上层清液从顶端或底隔间Caco-2细胞文化,刺激或不是由有限合伙人(大肠杆菌ATCC13027),血清型K235 pre-incubated与丝氨酸蛋白酶抑制剂砰- 175 (Futhan)(50μg /毫升)或胰蛋白酶抑制剂亮抑酶肽(100μM)(所有从Calbiochem) 15分钟。额外的录音是由DRG神经元后添加trypsin-3 (10 nM、研发)或其车辆(Brij35 hbs + 0.025%)存在与否的具体标准1英国(SCH79797 Tocris Bio-Techne)或标准4(ml - 354, Tocris Bio-Techne)拮抗剂(所有10µM 5分钟)。神经元被添加高K+(50毫米)解决方案的记录。在475 nm Fluo-4很兴奋,荧光发射收集在490/515 nm。(Ca的变化2 +]我是反映在Fluo-4荧光强度。
人体粘膜下神经成像
从降结肠隔离粘膜下神经节,我们使用前面描述的方法。10,11结肠是放置在一个寒冷的含氧无菌哈佛商学院(σ),切断肠系膜边境和固定平面向上面临的粘膜。冰冷的哈佛商学院是改变每5分钟。粘膜下神经丛从粘膜和潜在的圆形切割肌肉,切成小块(∼1.5×1.5毫米)和消化37°C的一个酶的解决方案(1毫克/毫升;σ)和胶原酶(1.25毫克/毫升;σ)45分钟。暂停离心机,神经节被镀到96孔板(格林尼),充值heat-inactivated neurobasal介质(表达载体)补充10%胎牛血清的边后卫,1% antibiotic-antimycotic解决方案(σ)和神经生长因子25 ng / mL,并保持在一个孵化器在37°C O不断加油为95%2-5%的公司2。11Ganglia是培养3天前执行2 +成像实验。12组织含有10µM Fluo-4点(分子探针,英杰公司)为30分钟37°C,然后冲洗与哈佛商学院和显微镜舞台上转移。录音是在室温监控Ca2 +后通量增加trypsin-3井(0.5 - 10 nM),具体存在与否的标准1(SCH79797)标准2(GB83、轴突Medchem,荷兰)或标准4(ml - 354)拮抗剂(所有µM 10点15分钟)。神经元被添加high-K确认+(75毫米)的解决方案的最后记录。在475 nm Fluo-4很兴奋,荧光发射收集在525/50 nm。(Ca的变化2 +]我是反映在Fluo-4荧光强度。
票面价值2在人类黏膜下神经元受体掩饰
Trypsin-3 (10 nM)被添加到独立于结肠的粘膜下组织活检在neurobasal培养基培养和补充10% heat-inactivated的边后卫,1% antibiotic-antimycotic解决方案2小时。丛洗在磷酸缓冲盐(PBS),固定在4%多聚甲醛和免疫染色加工,使用鸡antineurofilament 200 kDa (1:50 0, NF200 ab134306-Abcam),来确定神经元和神经纤维,和鼠标anti-PAR2美国西雅图抗体(1∶SAM-11-LifeSpan生物科学)。13主要抗体孵化(隔夜在4°C)随后孵化与适当的荧光标记的二次抗体室温(2小时)。组织是安装在显微镜Citifluor下滑(Citifluor,莱斯特,英国)。票面价值2参与特异性研究存在的标准2拮抗剂GB83(10μM),14添加trypsin-3前30分钟。
肠上皮细胞培养
Caco-2细胞成长为融合Transwell板块(2×10层5细胞每)(康宁)。15在21天文化(transepithelial 350Ω电阻厘米2),15培养基被OptiMEM所取代(技术)和细胞受到24小时trypsin-3基底外侧(0.5 -10海里),在(PAR的存在与否2)拮抗剂(GB88)。Paracellular渗透率测量通道的dextran-Fluorescein异硫氰酸酯(FITC) (3000 kDa,σ)从顶端到基础培养基,如前所述。16
胰蛋白酶活性
基媒体集中使用Vivaspin 3 * 500(·达奇尔的距离)。胰蛋白酶活性测定在基底和顶端介质衬底N-p-Tosyl-GPR-amino-4-methylcoumarin盐酸盐(0.1毫米)在50毫米三,CaCl 10毫米2。基质降解是由荧光的变化计算(激励:355 nm,排放:460海里),测量在30分钟37°C上标NOVOstar (BMG Labtech)。OCT-included活检分段控制,IBS患者低温恒温器(8μm厚度)和PBS洗,Tween-20 2%。一夜之间,所有样本被孵化在37°C与衬底N-p-Tosyl-GPR-amino-4-methylcoumarin盐酸盐(50μg / mL,σ)0.3%的低熔点琼脂糖。核是沾Topro3(表达载体)。与ImageJ图像分析软件。
反转录,传统和定量PCR
总RNA提取Nucleospin RNA /蛋白质工具包(Macherey-Nagel GmbH)。DNAse-treated RNA是反向转录使用Maxima第一链cDNA合成装备反向transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)(热科学)。结果cDNA样本放大通过常规PCR Taq DNA聚合酶(美国表达载体)和sequence-specific底漆对(见在线补充表S2)。17qPCR, cDNA放大了SYBR格林大师我工具包(罗氏)和sequence-specific底漆对(见在线补充表S2)在480年LightCycler仪器(罗氏)。稳定性的分析三个标准的看家基因(HPRT1,GAPDH和真沸点通过使用RefFinder排名)HPRT1总体最稳定的看家基因在我们的实验条件。因此,目标基因的mRNA表达的相对水平2-DDCt计算的方法17通过使用hHPRT1参考基因。常规PCR和qPCR负控制包括逆转录样本,酶没有添加到反应。扩增子的身份PRSS1,2和3证实了自动化的DNA测序(欧陆坊MWG操纵子,GmbH)。
免疫印迹分析
从Caco-2细胞蛋白提取与Nucleospin RNA /蛋白质工具包(Macherey-Nagel)按照制造商的指示。上层清液的蛋白质被三氯乙酸/丙酮沉淀,由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(12%)和转移到硝酸纤维素(生命科学)。膜是孵化antitrypsin-3抗体(1/100,ab107430-Abcam)一夜之间在4°C和二级抗体结合合(1/3000,w4018-Promega),然后观想通过化学发光(Chemidoc XRS Bio-Rad)。
在细胞培养和免疫荧光活检
细胞培养是固定使用甲醛(4%)在10分钟后跟洗0.1甘氨酸(2×10分钟)。疣状与执行antitrypsin-3 (1/500 ab107430-Abcam), anti-occludin(1/100 711500生命技术),antizonula occludens(佐薇)1(1/100,617300英杰公司)和670年phalloidin (PHDN1-cytoskeleton),将肌动蛋白网络。人类结肠活检中包括10月和组织cryosections(5µm厚度)削减了低温恒温器(徕卡微系统公司GmbH)。组织切片与抗体costained trypsin-3和上皮细胞制造商EpCAM / CD326 (1/500 VU1D9-Cell信号)。细胞和组织切片然后孵化与适当的二次抗体共轭AlexaFluor 488或555(分子探针)。幻灯片是安装与延长黄金抗衰落试剂4 ',6 ' -diamidino-2-phenylindole (DAPI)(分子探针),复染色细胞核。在上皮细胞的平均荧光强度对应trypsin-3-immunoreactivity,分隔的EpCAM costaining,量化了ImageJ软件。16
从疼痛的DRG神经元电生理记录
鼠标按解剖从T9 L1,并开始分离,镀上盖玻片和培养一夜之间,所述。4神经元与活跃trypsin-3孵化前20分钟(10海里)电生理研究中,不相上下2拮抗剂GB83(10μM)14添加trypsin-3前30分钟。全细胞穿孔修补current-clamp录音都用两性霉素B (240 g / mL,σ)小直径神经元(< 40 pF电容)。兴奋性的变化被量化测量基强度和数量的动作电位卸货基强度的两倍。录音进行使用Multiclamp 700 b, Digidata 1440 a,数字化的存储和处理使用pClamp 10.2软件(美国加州森尼维耳市,所有分子设备)。录音灌注室是不断与外部解决方案(∼2毫升/分钟)在室温(23°C)。使用的标准解决方案(更易/ L);吸管的解决方案:K-gluconate 110、氯化钾30 4 - (2-hydroethyl) 1-piperazineethane磺酸(玫瑰)10,MgCl21和CaCl22;与1 M KOH pH值调整到7.25;140年外部解决方案:氯化钠,氯化钾5玫瑰10,MgCl葡萄糖10日21和CaCl22;与3 M氢氧化钠pH值调整为7.3 - -7.4。
结直肠扩张
重组人类trypsinogen-IV购买和激活到trypsin-3后肠激酶商业建议。然后,老鼠提交intracolonic trypsin-3管理局(10 U /鼠标),其次是结直肠扩张(0、1、3、6和9个小时的时间点,如前所述。3在另一组实验中,小鼠intracolonically管理随着剂量的trypsin-3(0.1, 1或10 U /鼠标),其次是结直肠扩张3小时后。对照组的老鼠与车辆管理intracolonically (10% v / v绝对乙醇和10% v / v渐变- 80)。18类似的实验被重复2有缺陷的小鼠和野生型的同胞。3
统计分析
数据表示为±SEM,除了RT-qPCR,疣状和原位zymography量化的病人活检,每个点代表一个病人。统计分析了使用参数t,双向或单向方差分析和Bonferroni测试后(参见图传说)。GraphPad棱镜V.5.0软件被用于分析。接受了统计学意义,p < 0.05。
结果
上皮蛋白水解活动信号感觉神经元
文化媒体Caco-2细胞的顶端舱与LPS刺激与否,感应非常小的振幅Ca2 +反应在有限数量的鼠标感觉神经元(图1A、B)。同样,基底间的文化媒体如果对Ca Caco-2细胞几乎没有影响2 +在DRG神经元信号(图1A、B)。然而,培养基从基底室LPS-stimulated Caco-2细胞诱导显著增加反应神经元的数量(图1),在他们的振幅响应(图1B)。这是完全抑制增加pre-incubation大众化的胰蛋白酶抑制剂(砰的一声或亮抑酶肽)(图1A、B)和的影响LPS-stimulated上层清液利用PAR的DRG神经元没有被观察到2−−/老鼠(图1C)。这些实验表明LPS刺激肠道上皮细胞释放蛋白水解活性特别是基底室,这个活动可以感觉神经元的信号,通过PAR的激活2。
从肠道上皮细胞条件培养液激活背根神经节(DRG)感觉神经元释放trypsin-like丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶抑制剂的影响砰的一声或胰蛋白酶抑制剂亮抑酶肽反应神经元的百分比(A)和Fluo-4(ΔF / F0Ca)测量2 +水平(B)刺激顶端或基底上层清液从控制或脂多糖(LPS)治疗Caco-2细胞单层膜。(C)比例的感觉神经元的drg的野生型(wt)或标准2敲除小鼠(KO)应对顶端或基底上层清液从控制或LPS-treated Caco-2细胞单层膜。数据表示为±SEM和比较使用单向方差分析Bonferroni紧随其后的测试后(n = 6, 2井每本实验条件)* * * * * p < 0.01, p < 0.001。
胰蛋白酶活性来源于肠道上皮细胞在人类冒号
剩余胰蛋白酶活性被释放在肠道上皮细胞Caco-2文化上层清液,在基底和顶端隔间。基底这胰蛋白酶活性显著增加,但不是顶舱Caco-2刺激后细胞由有限合伙人(图2A)。因此,上皮胰蛋白酶活动遵循相同的模式上面描述的上皮蛋白水解介质激活初级传入纤维。
肠上皮细胞释放trypsin-like活动。(一)Trypsin-like活动以顶端和基底上层清液从控制或脂多糖(LPS)治疗Caco-2细胞。组装的数据用4 - 6井每七个独立的实验测试。代表共焦显微照片的原位zymography化验在结肠组织切片从健康对照组和肠易激综合症患者(比例尺:50μm), (B)从控制(Ctrl)或水avoidance-induced高度敏感大鼠(比例尺:20μm), (C)证明trypsin-like活动的水平。图表示的平均荧光强度量化每组6到12个病人。数据表示为±SEM和使用学生的学习任务比较。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.005。
使用原位zymography,我们下一个调查在胰蛋白酶活性位于人体结肠组织。非常低的胰蛋白酶活性检测结肠组织中从健康对照组(图2B,左面板),而在IBS患者,增加活动检测(图2B,中间面板),这是观察到主要在上皮细胞,具有类似活动基地和隐窝的尖端(图2B,中间面板)。上皮胰蛋白酶活动在组织从所有IBS组显著增加(IBS-C IBS-D和IBS-M) (图2B,右面板)。过敏症是诱导大鼠通过提交他们。从大鼠结肠组织了过敏症(图中未显示)被用于原位zymography。胰蛋白酶活性也增加高度敏感大鼠的结肠上皮与天真的控件(图2C)。
Trypsin-3上皮胰蛋白酶的主要形式,在肠易激综合症
然后我们检查了胰蛋白酶的形式存在于人体肠道上皮细胞和/或组织从肠易激综合症患者。我们发现这三个人类胰岛素基因:PRSS1,PRSS2和PRSS3形式存在于肠上皮细胞(图3人体结肠组织中的A、B), (图3然而,B)。PRSS3trypsin-3蛋白mRNA(代码)表达在上皮细胞是调节有限合伙人曝光,或增加肾上腺素后基底外侧(图3)。皮质醇曝光对PRSS1肠道上皮细胞没有影响,2或3 mRNA表达(见在线补充图S1)。在人类结肠癌、PRSS3是主要形式的胰蛋白酶检测(图3观察B)和没有区别PRSS1和PRSS2表达在IBS的组织与健康对照组(见在线补充图S2A, B)。然而,PRSS3在组织表达显著调节IBS-C (constipation-predominant IBS),与健康对照组相比,虽然IBS-D PRSS3表达的变化不显著(diarrhoea-predominant IBS)或IBS-M (mixed-IBS),与健康对照组相比图3C)。我们进一步调查的剪接变体PRSS3结肠组织中表达,我们确定PRSS3变体1表达的主要记录在肠道上皮细胞和结肠组织样本(见在线补充图S2C)。类胰蛋白酶(扩增子mRNA表达TPSAB1,TPSB2和TPSD1),这三个类胰蛋白酶基因中没有检测到Caco-2细胞刺激与有限合伙人(见在线补充图S2D)。
基因表达的胰蛋白酶原相对基因表达PRSS1(阳离子胰蛋白酶:trypsin-1前身),PRSS2(阴离子胰蛋白酶:trypsin-2前身)PRSS3(trypsin-3前体)的控制、脂多糖(LPS)治疗或epinephrine-treated Caco-2细胞单层膜。数据表示为均值±SEM和使用单向方差分析比较Bonferroni的测试后紧随其后。* * * * p < 0.05, p < 0.001。(B)分析rt - pcr产物的琼脂糖凝胶电泳进行RNA提取人类结肠活检(健康控制),孤立的结肠隐窝或Caco-2细胞。扩增子与特定寡核苷酸而被放大PRSS1、PRSS2 PRSS3和HPRT1。(C)相对mRNA的表达PRSS3在结肠活检从健康控制和IBS不同亚型:IBS-C(便秘),IBS-D(腹泻),IBS-M(混合)。数据表示为±SEM和使用学生的学习任务比较。* * p < 0.01 vs控制(Ctrl)。
我们确认的存在33-kDa trypsin-3蛋白在肠道上皮细胞及其LPS-induced upregulation在这些细胞(图4一)以及epinephrine-induced upregulation(数据没有显示)。在Caco-2细胞,trypsin-3与质膜colocalising与肌动蛋白(图4B)。我们确认的分泌trypsin-3 Caco-2文化上层清液的细胞,在顶端浮在表面的低水平(基底或LPS刺激),但在更高水平Caco-2细胞的基底室与LPS刺激后(图4C)。
肠上皮细胞移植trypsin-3分泌炎症条件和肠易激综合症。(A)相对trypsin-3量化由蛋白质免疫印迹分析提取的控制或脂多糖(LPS)治疗Caco-2细胞。(B)共焦显微照片的控制和LPS-treated Caco-2细胞单层证明trypsin-3-immunoreactivity(绿色)和肌动蛋白细胞骨架(红色),规模酒吧:25μm。(C)相对trypsin-3蛋白质从顶端和基底上层的量化控制或LPS-stimulated Caco-2细胞单层膜。(D)代表共焦显微照片的结肠组织片控制(ctrl)和肠易激综合症患者(比例尺:20μm)。(E)从控制或cortagine-induced高度敏感大鼠结肠组织(比例尺:20μm),显示trypsin-3-immunoreactivity D和E(绿色),上皮细胞标记(EpCAM-positive细胞,红色)和核复染色(青色)D (D)平均荧光强度trypsin-3-immunoreactivity量化特别是在上皮细胞(EpCAM-positive)。(F)共焦显微照片显示结肠隐窝的横向视图标签为trypsin-3(绿色),EpCAM(红色)和原子核(青色),规模酒吧:25μm。代表概要文件底部的面板显示的两极分化trypsin-3-immunoreactivity对肠上皮细胞的基底外侧。数据表示为均值±SEM和分析学生的学习任务和D,和单向方差分析后跟Bonferroni测试后的C。
在人类和老鼠的组织,上皮trypsin-3略高于健康对照组,但检测水平显著调节组织从肠易激综合症患者(图4D)和过敏的老鼠(cortagine-treated) (图4E)。所有IBS子组(IBS-D IBS-C和IBS-M)表达了明显更多的trypsin-3与健康对照组相比图4D,较低的面板)。我们还发现trypsin-3上皮表达分化对这些组织的基底膜(图4F)。这表明trypsin-3会释放体内肠道上皮细胞的基底膜,在体外研究发现。综上所述,我们在蛋白质水平证实trypsin-3匹配胰蛋白酶活性检测到从IBS患者肠道上皮细胞和组织。
Trypsin-3上皮通透性增加,人类和小鼠神经元信号,引起内脏过敏
添加trypsin-3(1和10 nM)的基底室Caco-2层引起的通过增加dextran-FITC (图5)。这也引起了减少染色和杂乱无章的上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1 occludin,与控制(trypsin-3车辆)条件(图5B)。Trypsin-3增加鼠标DRG神经元的兴奋性与控制(图6a - c)。神经元的平均基强度下降了30%,意味着动作电位数量两倍基强度增加了39% (p < 0.05), n = 23日与控制神经元。Trypsin-1(10海里),凝血酶(50 nM)也增加了神经元兴奋性(图6C)与trypsin-3类似的水平(10海里)。
Trypsin-3细胞通透性增加肠道上皮细胞。(A)葡聚糖通过从顶端到基础培养基Caco-2 trypsin-3曝光后细胞层(0.5,1到10 nM)基底外侧隔间。组装4口井的数据从三个独立的实验/测试。(B)代表共焦显微照片Caco-2细胞层trypsin-3曝光后基底外侧间室(0.5,1到10海里)显示出细胞结occludin的immunodetection(上)和zonula occludens(佐薇)1(底部)绿色,比例尺:50μm。数据表示为±SEM和分析了单向方差分析Bonferroni紧随其后的测试后,* * * p < 0.001。
Trypsin-3唤起不相上下2端依赖兴奋过度的疼痛的背根神经节神经元和钙信号在人类黏膜下神经元。(A)代表当前夹的痕迹记录显示基强度和动作电位放电两倍(左面板)基强度控制神经元,神经元与trypsin-3孵化(10 nM)(中间面板)或神经元与PAR孵化2拮抗剂GB83(10μM)之前trypsin-3(右面板)。(B)意味着数据基强度和动作电位基强度两倍数量的控制,和trypsin-3有或没有GB83(10μM)。* * * p < 0.05和p < 0.01和控制相比,# #和trypsin-3相比p < 0.01。(C)代表数据显示的效果胰蛋白酶和凝血酶基强度和动作电位放电相似大小和trypsin-3观察,b所示的标准2拮抗剂阻断胰岛素而不是凝血酶对神经元兴奋性的影响。* p < 0.05与控制相比,#与trypsin-1相比p < 0.05。单向方差分析Bonferroni测试后。(D)代表灰度图像的人工培养的黏膜下神经节加载Fluo-4和Ca2 +三个神经元的反应(色标数字灰色图像)trypsin-3(10海里)。细胞之间的匹配颜色代表编号和痕迹。的身份证实了人类神经元high-K的应用+解决方案(75毫米)。酒吧规模:20μm。(E)的平均振幅trypsin-3(0.5 -10海里)全身(Ca2 +]我提高粘膜下神经元存在与否的标准2拮抗剂GB83。数据表示为±SEM和分析了单向方差分析Bonferroni紧随其后的测试后(n = 6科目/组),* * * p < 0.05, p < 0.01°°p < 0.01。
Trypsin-3能够引起Ca2 +人类黏膜下神经元(瞬变图6D)剂量依赖性的方式(图6E)。
Trypsin-3管理intracolonically, Tween-based生理盐水(为了允许通过Trypsin-3通过肠道屏障)在结直肠扩张,引起内脏痛觉过敏与基线相比措施(图7a - c)。这是明显的1小时,持续6小时(图7A)。没有影响与车辆本身和trypsin-3效应被认为是存在剂量依赖的相关性(图7B)。
结直肠trypsin-3引起内脏过敏。(一)动能内脏运动的响应(VMR) intracolonic trypsin-3管理局(10 U /鼠标)1、3、6和9小时后其管理。(B)内脏运动的响应intracolonic trypsin-3管理局(0.1,1或10 U /鼠标)或车辆,3小时后intracolonic政府在野生型或标准2−−/老鼠(C)。数据表示为±SEM和分析了双向方差分析Bonferroni紧随其后的检测后每组(n = 10)。* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。
机制trypsin-3-induced肠效果
trypsin-3在鼠标感觉神经元的影响被封锁的标准2拮抗剂GB83,也封锁了trypsin-1但没有效果对凝血酶的影响,不相上下1/标准4受体激动剂(图6C)相提并论。1或票面价值4对手没有显著影响(Ca trypsin-3-induced上升2 +]我(见在线补充图S3A)。在人类结肠黏膜下神经元,trypsin-3-induced上升(Ca2 +]我完全废除了pre-incubation相提并论2拮抗剂GB83 (图6E),但不是pre-incubation修改的标准1(SCH79797)或标准4(ml - 354)拮抗剂(见在线补充图S3B)。在票面价值2有缺陷的老鼠,trypsin-3-induced内脏过敏也显著抑制30毫米汞柱压力(图7C)。整个曲线下的面积trypsin-3-induced内脏运动的响应的函数增加膨胀压力显著低于票面价值2有缺陷的小鼠与野生型相比(p < 0.05,图中未显示),从而证实trypsin-3的肠效应的概念,包括体内内脏过敏,是由标准2激活。
我们进一步研究在人类结肠黏膜下神经元,trypsin-3-induced潜在水平的变化2表达式,作为标记的标准2激活。在基底(如果)条件下,标准2染色是集群似乎在黏膜下神经细胞的质膜(图8,上半部分)。trypsin-3刺激后,票面价值2表达发生了根本的变化,成为细胞内扩散或集群(图8中间面板)。这表明PAR2被trypsin-3激活,已内化到粘膜下层的神经元。暴露在票面价值2拮抗剂GB83抑制trypsin-3-induced票面价值的变化2染色(图8,下半部分)。
![Trypsin-3 evokes PAR2-dependent hyperexcitability of nociceptive dorsal root ganglia neurons and calcium signals in human submucosal neurons. (A) Representative traces of current clamp recordings showing the rheobase and the action potential discharge at twice the rheobase in control neurons (left panel), neurons incubated with trypsin-3 (10 nM) (middle panel) or neurons incubated with the PAR2 antagonist GB83 (10 μM) before trypsin-3 (right panel). (B) Mean data of the rheobase and the action potential number at twice rheobase for the control, and trypsin-3 with or without GB83 (10 μM). *p<0.05 and **p<0.01 compared versus control, ##p<0.01 compared versus trypsin-3. (C) Representative data showing the effect of trypsin and thrombin on the rheobase and action potential discharge is similar in magnitude to that observed with trypsin-3, shown in B. The PAR2 antagonist blocks the trypsin but not the thrombin effect on neuronal excitability. *p<0.05 compared with control, #p<0.05 compared with trypsin-1. One-way analysis of variance with Bonferroni's post-test. (D) Representative gray scale images of cultured human submucosal ganglia loaded with Fluo-4 and Ca2+ responses of three neurons (colour-coded numbers in the gray images) to trypsin-3 (10 nM). Matched colours are represented between cell numbering and traces. The identity of human neurons was confirmed by application of high-K+ solution (75 mM). Scale bar: 20 μm. (E) Average amplitude of trypsin-3 (0.5–10 nM)-induced [Ca2+]i rises in submucosal neurons in the presence or absence of the PAR2 antagonist GB83. Data are expressed as mean±SEM and were analysed by one-way analysis of variance followed by Bonferroni's post-test (n=6 subjects per group), *p<0.05, **p<0.01, °°p<0.01.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/66/10/1767/F6.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
Trypsin-3原因掩饰的标准2在人类黏膜下神经元。代表图像表明PAR的表达2在人类黏膜下神经元的变化存在trypsin-3(10海里)。上半部分显示了PAR的集群染色2(红色箭头),粘膜下神经细胞的质膜(星号、NF200、绿色)。Trypsin-3(2小时)引起的掩饰的标准2(红色)在神经元(星号、NF200、绿色)。票面价值2染色出现弥漫性或在神经元集群(箭头)。Pre-incubation GB83(10μM trypsin-3之前30分钟)抑制了掩饰的标准2表示在质膜(红色箭头)的神经元(星号、NF200、绿色)。右面板显示合并后的图像。酒吧规模:20μm。
讨论
蛋白水解活动增加,特别是胰蛋白酶活性与IBS患者结肠组织发布的。它被认为是参与超兴奋性的外在和内在的肠神经元,内脏过敏。2 - 4然而,缺乏知识的起源和蛋白酶的性质(s)负责这个胰蛋白酶活动阻碍了进一步研究蛋白酶作为潜在的分子靶点治疗肠易激综合症。目前的研究提供了第一手的表达和功能的描述一种上皮的胰蛋白酶:trypsin-3及其在IBS的潜在重要性。Trypsin-3提出作为新的治疗开发有价值的目标,进一步突出上皮生物学在IBS的重要性。
胰蛋白酶蛋白水解活性增加IBS患者的组织(图2B)和活组织检查上层清液。3几个潜在来源占这可能增加。第一,微生物群可以胰蛋白酶活性的主要来源,事实上,这种活动被发现在IBS患者的粪便。19然而,当蛋白酶的性质存在于人类的粪便被调查,只有宿主蛋白酶识别。19第二,特别是胰酶和胰蛋白酶的腔的存在可以解释胰蛋白酶活性。但对于两个来源(微生物群或胰腺),似乎难以置信的腔的蛋白酶能穿透黏液层,穿过上皮屏障,到达附近肠神经元,剩下的活跃在这些神经元可能诱发多动症。因此,我们试图探讨粘膜组织来源胰蛋白酶活性在这项研究中,利用原位zymography。我们观察到非常低的胰蛋白酶活性在结肠组织中从健康对照组,但这个活动在组织从IBS患者明显增加,并与肠上皮细胞(图2B)。因此,我们认为是肠道上皮细胞作为一个潜在的胰蛋白酶活性的重要来源。我们证明LPS-stimulated肠道上皮细胞释放胰蛋白酶活动,特别是基底外侧,和这个活动能够感觉神经元的信号标准2端依赖机制。两极分化分泌的胰蛋白酶LPS-treated肠道上皮细胞的活动构成重大突破在我们的理解在肠上皮介质神经元信号的作用。首先,它表明,强调肠上皮细胞(LPS-induced或epinephrine-induced压力)可以trypsin-like酶过表达和释放活跃。其次,它表明,这个版本是面向mucosa-submucosa,肠神经元和初级传入神经终端在哪里找到。我们的结果进一步表明,胰蛋白酶的分化表达蛋白质也会发生在病人的体内组织,所观察到的存在trypsin-3蛋白在上皮的基底外侧层组织从肠易激综合症患者(图4F)。
当调查胰蛋白酶的形式可以通过肠道上皮细胞,表达我们的成绩单证明存在三个胰蛋白酶基因:PRSS1,PRSS2和PRSS3。然而,只有PRSS3信使rna调节LPS-stimulated或epinephrine-stimulated肠道上皮细胞(图3),组织从肠易激综合症患者(见在线补充图S2,图3C)。有趣的是,PRSS3 mRNA在IBS患者显著调节(同意一项研究的结果20.),但在我们的研究中,这种超表达显著只有IBS-C子群(图3C),这表明只有这个条件与转录调节trypsin-3相关联。蛋白质的产物PRSS3、trypsin-3匹配相同的超表达模式在肠道上皮细胞和组织从肠易激综合症患者(图4),是调节在IBS的子组:IBS-C, IBS-D IBS-M。综上所述,我们的研究结果清楚地指出存在的增加trypsin-3 IBS患者的组织。然而,微分调节机制可能与肠易激综合症患者亚组,与一些(IBS-C)提交转录调控和他人(IBS-D IBS-M)提交转录后调节。此外,我们在这里显示的剪接变体来自已知的四种不同的选择PRSS3转录(1 - 4),PRSS3变体1表达的主要记录在结肠组织或肠道上皮细胞(见在线补充图S2C)。有趣的是,我们发现的蛋白质产品PRSS3,trypsin-3表示所有沿结肠隐窝(图4D),这表明潜在的大多数上皮细胞表达的蛋白质。组成型表达低trypsin-3中检测出组织从健康对照组(图4D)。然而,这可能不是活跃因为很低的trypsin-like活动中检测出组织从健康对照组(图2B)。
很少有人了解trypsin-3的生理或病理生理功能。工作的E Radisky报道,trypsin-3目标多种内源性人类规范的抑制剂,因此蛋白酶web呈现trypsin-3作为把关人。21,22我们证明了积极trypsin-3能够信号初级传入神经和粘膜下肠神经元。在这两种情况下,我们的数据表明,trypsin-3信号标准2在神经元。这一发现与先前的研究报告,标准是一致的2可以通过trypsin-3被激活。23尽管我们发现符合先前的证据表明蛋白酶在IBS神经元通过激活组织信号标准2,3,4,24具体证据trypsin-3在IBS上层清液不能直接测试trypsin-3抑制剂尚未公布。然而,我们所做的证明标准2出现在人类暴露后黏膜下神经元,是内化trypsin-3 (图8)。这清楚地表明,标准2可以激活人体黏膜下神经元,trypsin-3 PAR的潜在内生兴奋剂吗2在这个人类的细胞类型。先前的报道表明,标准2激活肽诱导低Ca2 +信号在人类黏膜下神经,导致作者得出这样的结论:标准2是最低限度激活人体黏膜下神经元。25然而,最近的研究强调了复杂支护结构,特别是药理学的事实,这些受体可以在多个站点,裂解引发不同的胞内信号通路。13,14,26规范标准2激活导致β-arrestin-dependent受体掩饰已经被很好地记录下来了。14在目前的研究中,我们提供的证据表明,这种信号发生在人类黏膜下神经元响应trypsin-3曝光。我们也报告,其他部分(PAR1和标准4)不涉及trypsin-3-induced信号人类黏膜下鼠标感觉神经元或神经元,至少在神经元的响应的振幅trypsin-3(见在线补充图S3)。有趣的是,在生成的数据标准2缺乏老鼠证明标准的含义2,但trypsin-3-induced内脏过敏没有完全抑制的标准2有缺陷的小鼠(图7C),这表明其他机制比标准2有关。一个可能的解释可能是一个标准2独立trypsin-3屏障功能的影响。这种效应可能是直接:trypsin-3诱导紧密连接蛋白的乳沟,或间接,trypsin-3降低内源性蛋白酶抑制剂,维持蛋白水解体内平衡和屏障功能。深入分析有必要完全破译trypsin-3内脏过敏行动机制。
我们的数据也证明增加表达trypsin-3在老鼠cortagine-induced内脏过敏(图4E)和显示intracolonic trypsin-3概括内脏过敏管理局(图7)。在这些研究中,我们使用一个障碍断路器允许trypsin-3访问固有层体内重建假设条件,trypsin-3信号从上皮细胞基底外侧的方面。这个trypsin-3痛觉过敏的效果观察到浓度低至1 U /鼠标。这个活动与IBS患者的上层清液中发现,3在上层清液LPS-treated肠道上皮细胞。在一起,这些数据表明,基底上皮trypsin-3释放可能足以激活神经元,并参与内脏过敏症状。另一个可能的途径为trypsin-3内脏过敏的参与是影响屏障功能。事实上,我们的研究结果表明,基底trypsin-3暴露在肠道上皮细胞导致渗透性增加和减少表达和组织或紧密连接蛋白(图5)。在这一点上,它是不可能确定的相对贡献trypsin-3-induced增加渗透率及其行动神经元信号的起源过敏症状。可能都参与生成内脏过敏,可以突出trypsin-3相关目标治疗肠易激综合症。
总之,这些结果指向colonocytes作为小说来源的蛋白酶激活疼痛的和IBS患者的肠神经参与屏障功能障碍。我们表明,上皮蛋白酶监管可能在IBS产生深远的影响,尤其是当考虑腔的信号。从概念上讲,大多数在IBS模型都聚焦于上皮细胞的能力释放血清素和屏障功能的作用。在这里,我们表明,在肠上皮蛋白水解体内平衡也是一个重要信号通路在IBS腔的刺激可能是一个重要的触发导致粘膜蛋白水解变化。因此,上皮trypsin-3可能是一个潜在的新目标IBS的治疗干预。
确认
作者感谢图像CPTP的核心设施,Toulouse-Purpan,苏菲Allart为首,ANINFIMIP EquipEx设施由E奥斯瓦尔德教授和支持法国政府通过未来的投资计划(anr - 11 - eqpx - 0003)。我们还要感谢博士埃里克·埃斯皮诺萨(CPTP INSERM U1043,图卢兹,法国)的捐赠的人类原发性肥大细胞和穆里尔女士Quaranta (IRSD INSERM U1220,图卢兹,法国)人类结肠隐窝的隔离。负责人wafez作者也感谢早穆萨维从高度敏感大鼠和曼迪Biraud提供组织,和托尼·杜兰特帮助病人的样本。
引用
脚注
CR-F, AD-S、CC、CD和NV同样起到了推波助澜的作用。
贡献者JOJ CR-F AD-S, CC, CL,数控和J-PM获得数据,进行统计分析,参与文稿起草。聚乙烯醇缩丁醛、锰、EC、SK、医生、DB,欧美,ML, SV和洛杉矶提供了技术支持和/或材料。SV、CD和NV参与研究的概念和设计,分析和解释数据,起草的手稿。CD和NV就监督学习和获得资金。
资金这项工作得到了国家de la矫揉造作的(R12177BB NV),该地区Midi-Pyrenees (CRF),欧洲研究委员会(erc - 2012 - stg - 20111109) (NV)。图卢兹医院疝气项目CC的博士后昏聩voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、比利时)。国立卫生研究院(NIH)赠款DK088937 (ML), NIH P30 DK41301(胃肠道功能和疾病模型的核心),NIH R01 DK57238和NIH P50 DK064539(两次)也支持这项研究的部分。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准法国人的伦理委员会,加拿大人的道德委员会。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。