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目标Chronic-plus-binge乙醇喂养激活中性粒细胞和加剧肝损伤小鼠。本研究调查最近过度饮酒如何影响周围中性粒细胞和肝脏损伤在酗酒者,mir - 223,其中一个最丰富的小分子核糖核酸(microrna)中性粒细胞,调节中性粒细胞功能和ethanol-fed小鼠肝损伤。
设计三百酗酒者(n = 140)或没有(n = 160)最近过度饮酒和45名健康对照组被录取。老鼠的乙醇饮食10天紧随其后的是一个狂欢的乙醇。
结果与健康对照组相比或酗酒者最近喝酒,酗酒者与最近过度饮酒有更高水平的循环中性粒细胞,这与血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。microrna的阵列分析显示,酗酒者升高血清mir - 223水平与健康对照组相比。在chronic-plus-binge乙醇喂养小鼠模型,mir - 223水平增加血清和中性粒细胞。基因删除mir - 223基因ethanol-induced加重肝脏损伤,中性粒细胞浸润,活性氧(ROS)和调节肝脏表达白介素(IL) 6和吞噬氧化酶(phox) p47phox。机械的研究显示,mir - 223直接抑制il - 6表达和随后抑制p47phox中性粒细胞的表达式。删除的p47phox基因改善ethanol-induced肝损伤和ROS生产中性粒细胞。最后,mir - 223表达下调,而il - 6和p47phox表达式是调节外周血中性粒细胞从酗酒者与健康对照组相比。
结论mir - 223是一个重要的监管机构阻止嗜中性粒细胞浸润和可能在酒精性肝病的一种新型治疗这个疾病的治疗目标。
- 炎症
- 乙醇
- 细胞因子
- 脂肪肝
- 白细胞
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
Chronic-plus-binge乙醇喂养协同诱发肝脏嗜中性粒细胞浸润高程,外周血中性粒细胞和肝损伤的老鼠。
中性粒细胞对肝损伤小鼠喂食了chronic-plus-binge乙醇。
有什么新发现吗?
酗酒者与最近的过度饮酒的水平明显高于循环中性粒细胞,血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)最近与那些没有饮酒与健康对照组。
循环中性粒细胞与积极与血清ALT和AST水平只有在酗酒者最近喝酒但不是在最近的那些没有饮酒或健康对照组。
mir - 223,最丰富的microRNA在中性粒细胞,中性粒细胞中表达下调的酗酒者最近过度饮酒与健康对照组相比。
mir - 223基因的基因缺失加剧肝嗜中性粒细胞浸润,中性粒细胞活性氧(ROS)生产和肝损伤chronic-plus-binge ethanol-fed老鼠。
mir - 223抑制interleukin-6-p47phoxros在中性粒细胞通路,从而防止饮酒导致的肝损伤。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
医生应该注意最近的饮用历史回顾完整的血细胞计数结果酗酒者。外围的重要高程中性粒细胞可能表明最近喝酒在这些科目。
mir - 223中扮演着一个关键的角色在限制嗜中性粒细胞浸润和可能在酒精性肝病的一种新型治疗这个疾病的治疗目标。
介绍
酒精性肝病(ALD),慢性肝病的主要原因,包括一系列的疾病从简单的脂肪肝性脂肪肝,肝硬化和肝癌。1 - 3脂肪肝的发展在几乎所有的科目与酗酒,肝病肝嗜中性粒细胞浸润发生在只有20 - 40%的这些科目。一旦开发,肝病可以发展为肝硬化和肝癌。1,3,4人们普遍认为肝脏嗜中性粒细胞浸润ALD促进发展的一个重要因素。5,6然而,引发嗜中性粒细胞浸润和中性粒细胞的作用机制ALD发病机理的仍然是难以捉摸的。过去,机械研究中性粒细胞的角色ALD有限是因为微不足道的肝在广泛使用的慢性中性粒细胞浸润随意ethanol-feeding模型。最近开发了chronic-plus-binge乙醇喂养模型模拟acute-on-chronic饮酒导致的肝损伤有显著的肝脏嗜中性粒细胞浸润。7号到9号每周乙醇热潮也引起肝浸润的转变在慢性胃内的巨噬细胞和中性粒细胞ethanol-fed老鼠。10通过使用这些模型,最近的一些研究表明,急性乙醇热潮促进肝脏嗜中性粒细胞浸润导致恶化长期ethanol-fed小鼠的肝损伤。7,11中性粒细胞浸润的贡献在饮酒导致的肝损伤动物模型是一个重要的观察有重要临床意义。中性粒细胞是人类的主要循环白细胞,占60 - 70%或∼3 - 6×109总白细胞的细胞/ L(白细胞)。相反,只有10 - 15% (∼1 - 2×109循环白细胞的细胞/ L)小鼠中性粒细胞。,这是合理的中性粒细胞可能扮演更重要的角色在ALD发病机理的人类比啮齿动物,鉴于循环中性粒细胞比例就越高。在目前的研究中,我们分析了300年haematogram酗酒者的高度,发现循环中性粒细胞与血清转氨酶相关性,特别是最近140年酗酒过度饮酒。我们的观察表明,中性粒细胞可能导致早期肝损伤在这些科目。
肝脏嗜中性粒细胞浸润的一个特点,酒精性脂肪肝,对细菌感染的功能也会加剧肝细胞损伤,肝脏炎症和纤维化通过生成活性氧(ROS),释放蛋白酶和促炎介质的生产。5,12ROS在中性粒细胞生产由multimeric跨膜酶控制复杂的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX),生成过氧化物(O2•−)和过氧化氢(H2O2)从分子氧利用NADPH作为电子供体。13,14哺乳动物的氮氧化物家族包含七个亚型:NOX1-5 DUOX1 DUOX2。在肝脏,主要ROS-producing氮氧化物NOX1, NOX2 NOX4。13,14此外,一些NOX-associated分子由稳定氮氧化物NOX激活所需蛋白质和对接胞质因素,包括吞噬氧化酶(phox)单位:p47phox(也称为中性粒细胞胞质因子- 1:NCF-1), p67phox(p40 NCF-2)phox(NCF-4),第22位phox和gp91phox。13,14新出现的证据表明,活性氧产量可能是一个重要的机制,中性粒细胞诱导组织损伤包括肝损伤和纤维化。14日至17日然而,氮氧化物及其相关蛋白是如何监管的中性粒细胞仍然是模糊的。
小分子核糖核酸(microrna,小非编码RNA分子19-25核苷酸)发挥重要作用在各种细胞功能诱导RNA沉默和涉及基因表达的转录后调控。近年来,大量研究表明,microrna参与各种肝脏疾病的发病机制,21页包括“肾上腺脑白质退化症”。22例如,microrna的子集已确定调节脂多糖(LPS)介导的肝细胞和枯否细胞炎症信号级联的啮齿动物长期用乙醇。22日至26日mir - 182被发现在高水平表达,与酒精性肝炎患者的疾病严重程度相关。29日这些以前的研究主要集中在肝脏和肝细胞中的microrna。22日在当前的研究中,我们进行microrna的微阵列分析血清microrna的酗酒者,发现血清mir - 223水平,最丰富的microrna在中性粒细胞,30 -在酗酒者与健康对照组相比显著升高。mir - 223的作用是检查mir - 223−−/老鼠用chronic-plus-binge乙醇喂养的典范。我们的数据表明,mir - 223起着重要的作用在调节中性粒细胞功能和肝损伤通过抑制白介素(IL) 6-p47phox通路在ethanol-fed老鼠和酗酒者。
材料和方法
人类主题队列
45健康对照组在Roudebush招募了退伍军人管理局医疗中心(印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)。三百年慢性过度饮酒者是从费尔班克斯招募毒品和酒精治疗中心(印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)。基于时间线的信息返回的问卷,我们二分过度饮酒者酗酒者与最近过度饮酒(入学前10天内过度饮酒)酗酒者最近没有饮酒(前10天内没有饮用招生)(表1)。研究对象的详细信息在网上描述补充材料。这项研究是印第安纳大学普渡大学机构审查委员会批准的,研究和发展委员会Roudebush VA,和费尔班克斯毒品和酒精治疗中心。所有参与者提供书面知情同意。
老鼠
10到12个月大的雌性老鼠。C57BL / 6 j, mir - 223−−/老鼠,p47/ phox−−(也称为NCF-1−−/)小鼠和弹性蛋白酶−−/老鼠从杰克逊实验室购买(美国缅因州巴尔港)。这项研究是该研究所ACUC委员会的批准。
结果
循环中性粒细胞水平与血清ALT和AST在最近的酗酒者和酗酒
chronic-plus-binge乙醇喂养模型的最新数据显示,酗酒提升循环和肝中性粒细胞的水平,导致慢性肝损伤ethanol-fed老鼠。7测试酗酒对循环的影响在人类中性粒细胞和肝损伤,我们仔细分析了haematogram 300酗酒者和肝板。我们发现水平和循环中性粒细胞的百分比,血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和胆红素高在酗酒者比健康对照组(表1),暗示某种程度的肝损伤在这些科目。我们进一步对分这些主题为酗酒者没有最近喝酒(代表慢性饮酒)与最近过度饮酒和酗酒者(代表chronic-plus-binge饮酒)(表1)。有趣的是,和循环中性粒细胞百分比水平,血清ALT, AST和胆红素在后者要高得多。此外,循环中性粒细胞水平呈正相关,血清ALT和AST水平酗酒者与最近喝酒,但是没有这样的相关性被发现在最近的酗酒者没有饮酒与健康对照组(图1)。
外周血中性粒细胞水平与积极与酗酒者的血清ALT和AST水平最近过度饮酒。45健康对照组和300酗酒者被录取,酗酒者是分层分为两组:酗酒者(n = 140)和没有(n = 160)最近的过度饮酒表1)。循环中性粒细胞水平之间的相关性分析和血清ALT和AST水平进行。显著的相关性(p值)标记在图中。
人们普遍认为,女性比男性更容易受到“肾上腺脑白质退化症”;2然而,没有全面的研究,比较了男性和女性酗酒者之间的早期阶段“肾上腺脑白质退化症”。详细的人口统计学、临床特征、haematograms和肝板结果被性别分层(223男性和77女性)和网上所示补充表S2-S4。中性粒细胞的水平与血清ALT、AST水平呈正相关,只有在男性酗酒者与最近喝酒。这种相关性分析数据时没有被观察到在雌性可能由于样本量较小(见在线补充图S1)。有趣的是,血清AST和ALT水平较低的女性酗酒者,尽管两性比较中性粒细胞计数(见在线补充表S4)。招募更多的女性酗酒者都需要进一步的研究来探讨性别差异对早期退化。
调节血清mir - 223水平,从酗酒和ethanol-fed小鼠中性粒细胞
通过筛选血清microrna的微阵列分析,我们发现,血清mir - 223水平,最丰富的microrna在中性粒细胞,30 -显著升高与健康对照组相比,酗酒者。海拔血清mir - 223在酗酒者进一步验证通过测量血清mir - 223 (图2血清mir - 223)。海拔也观察到在两个模型的乙醇喂养与pair-fed组(图2B和在线补充图S2A)。
血清mir - 223水平,从酗酒和ethanol-fed小鼠中性粒细胞。从健康对照组(A)血液样本收集和过度饮酒者。血清mir - 223水平进行了测量,实时定量PCR。(B) C57BL / 6 j小鼠pair-fed或美联储的ethanol-containing饮食10天+ 1暴(E10d + 1 B)。小鼠安乐死9小时postgavage,血清mir - 223测量收集。(C)各种类型的细胞被分离从天真C57BL6 / J肝脏和受到RT-qPCR mir - 223。(D-F)小鼠受到控制和乙醇喂养(B)所述,mir - 223和pri -鼠标外围,mir - 223水平测量肝中性粒细胞。价值观代表意味着±SEM (n = 6日至14日)。* p < 0.05;* * p < 0.01; ***p<0.001. HSC, hepatic stellate cells.
mir - 223是最丰富的microrna的中性粒细胞,30 -但其在肝细胞的表达,non-parenchymal在肝脏细胞和白细胞是难以捉摸的。这里,我们发现中性粒细胞mir - 223的最高水平,这大约是15倍采样高于肝细胞、肝星状细胞和枯否细胞(图2C)。因此,我们主要关注mir - 223在中性粒细胞在我们当前的研究。见图2D, E, mir - 223的表达在外周血和肝后调节中性粒细胞chronic-plus-binge乙醇喂养。体外孵化的中性粒细胞与乙醇或其代谢产物乙醛,没有增加mir - 223的水平,表明upregulation mir - 223不是由于直接影响乙醇或其代谢物(见在线补充图S2B-C)。此外,主要的表达mir - 223 (pri - mir - 223)显著调节肝和外围中性粒细胞ethanol-fed老鼠比pair-fed控件(图2F),这表明转录调控参与中性粒细胞upregulation mir - 223的表达。
mir - 223−−/老鼠更容易chronic-plus-binge-induced肝损伤
定义的角色mir - 223在退化,野生型(WT)和mir - 223−−/、老鼠受到chronic-plus-binge喂食。见图3mir - 223−−/小鼠血清ALT和AST水平升高了一对或乙醇喂养后,与WT同行相比。相比之下,长期(10天)或独自狂欢乙醇喂养没有提升血清ALT和AST WT和mir - 223−−/老鼠(见在线补充图S3A)。
mir - 223基因的缺失加剧chronic-plus-binge ethanol-induced肝损伤,海拔和肝循环中性粒细胞。野生型老鼠和mir - 223 (WT)−−/老鼠受到E10d + 1 b或一对喂食,和老鼠安乐死postgavage 9小时。(一)血清ALT, AST和肝甘油三酯(TG)水平测定。(B)和中性粒细胞的数量比例是由血液学分析仪(两个上层板)。Gr1一起的百分比+CD11b+循环中性粒细胞被流式细胞分析仪分析(下图)。(C)肝组织受到anti-MPO抗体免疫染色。MPO的数量+细胞数。(D)肝组织受到实时PCR分析Ly6G(中性粒细胞的标志)。(E)肝脏白细胞分离并受流仪分析。中性粒细胞的百分比(Gr1一起+CD11b+)细胞进行了分析。价值观代表意味着±SEM (n = 4到10)。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。
有趣的是,尽管血清ALT和AST水平高chronic-plus-binge ethanol-fed mir - 223−−/小鼠肝甘油三酯水平较低相比,这些老鼠ethanol-fed WT老鼠(图3A)。小的肝脂肪变性程度ethanol-fed mir - 223−−/老鼠可能是由于高水平的il - 6(见下面的结果),细胞因子,改善脂肪变性,比WT老鼠。34
上面的数据图3建议mir - 223缺乏加剧饮酒导致的肝损伤。我们下一个测试是否过度mir - 223改善饮酒导致的肝损伤通过注入pre - mir - 223慢病毒通过尾静脉。如在线补充图S3B, ethanol-fed小鼠pre - mir - 223慢病毒注射血清ALT水平较低比控制慢病毒注入。注射前mir - 223慢病毒导致的增加的表达mir - 223在骨髓中性粒细胞和肝脏。有一个趋势mir - 223表达的增加血液中性粒细胞从pre - mir - 223慢病毒注入老鼠但没有达到统计学差异(一种可能性小的增加是由于基底水平高的中性粒细胞mir - 223)。
见图3B,比例和水平的循环后中性粒细胞增加chronic-plus-binge喂养mir - 223的水平较高−−/老鼠比WT老鼠。这一发现也证实了流仪分析CD11b+Gr-1+中性粒细胞(图3B)。此外,来自网络的数据补充图S4表明较高的中性粒细胞在ethanol-fed mir - 223−−/老鼠可能是由于从骨髓嗜中性粒细胞释放的增加,而不是增加增殖或减少中性粒细胞凋亡。最后,淋巴细胞和单核细胞的比例和水平降低与更大的减少chronic-plus-binge乙醇喂养后mir - 223−−/老鼠比WT老鼠(见在线补充图S5A)。
mir - 223−−/老鼠更容易chronic-plus-binge feeding-mediated诱导肝脏嗜中性粒细胞浸润和减少枯氏/巨噬细胞
肝中性粒细胞通过免疫组织化学方法检测,实时定量PCR和流量仪分析。见图3C和在线补充图S5B, myelopeoxidase (MPO)+中性粒细胞在肝脏在WT和mir - 223高−−/老鼠chronic-plus-binge喂养后,mir - 223的更多−−/老鼠。肝的表情Ly6G(标记为中性粒细胞)也显著增加乙醇喂养后,等upregulation mir - 223高出两倍−−/老鼠老鼠比WT (图3D)。最后,流仪分析表明肝Gr1一起的百分比+CD11b+中性粒细胞在mir - 223高−−/老鼠老鼠的价格相比WT (图3E)。
与肝中性粒细胞的海拔,F4/80的数量+枯氏细胞/巨噬细胞和肝的表达F4/80减少WT和mir - 223−−/老鼠chronic-plus-binge喂养后更大的减少mir - 223−−/老鼠(图4A、B)。这个更大的减少巨噬细胞ethanol-fed mir - 223−−/老鼠可能是由于细胞凋亡增加,证明了凋亡TUNEL数就越高+F4/80+mir - 223细胞−−/老鼠比WT老鼠(见在线补充图S6)。
巨噬细胞和肝促炎介质的表达在ethanol-fed和pair-fed野生型(WT)和mir - 223−−/老鼠。WT老鼠和mir - 223−−/老鼠受到E10d + 1 b或一对喂食,和老鼠安乐死postgavage 9小时。(A和B)肝组织受到anti-F4/80抗体免疫染色。代表照片所示面板(比例尺:100μm)。F4/80数量计入面板b肝F4/80信使rna被实时PCR检测和显示在面板b . (C和D)肝组织受到实时PCR分析。价值观代表意味着±SEM (n = 5 - 10)。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。
微分调节肝促炎介质在WT和mir - 223−−/老鼠贴chronic-plus-binge喂养
肝的表达多种促炎介质检查,所示图4C, D。这些结果总结如下。首先,chronic-plus-binge喂养导致几个肝促炎介质的upregulation WT老鼠,这与先前的发现是一致的。7第二,肝的表达几个介质(如肿瘤坏死factor-α(TNF-α)IL-1β,单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)和巨噬细胞炎性protein-2 (MIP-2))在pair-fed mir - 223高−−/老鼠比pair-fed WT同行,但减少mir - 223−−/老鼠后chronic-plus-binge挑战。第三,肝il - 6的表达升高mir - 223−−/和WT乙醇后小鼠喂养mir - 223的更高水平−−/老鼠比WT老鼠。
mir - 223−−/老鼠更容易chronic-plus-binge feeding-induced ROS生产在肝脏和中性粒细胞
肝脂质过氧化水平包括malonaldehyde (MDA)和4-hydroxynonenal (4-HNE)被免疫组织化学检查。中的数据图5A、B显示肝脏MDA的水平和4-HNE表达在WT和mir - 223−−/老鼠chronic-plus-binge喂养后升高,mir - 223与更大的增加−−/老鼠。
mir - 223−−/老鼠更容易chronic-plus-binge ethanol-induced氧化应激在肝脏和循环中性粒细胞。WT老鼠和mir - 223−−/老鼠受到E10d + 1 b或一对喂食,和老鼠安乐死postgavage 9小时。(A和B)肝组织受到免疫染色的anti-malonaldehyde (MDA)或anti-4-hydroxynonenal (HNE)抗体。代表图像所示所示面板相对染色是量化和面板B(比例尺:200μm)。(C和D)肝和外围被孤立和刺激中性粒细胞有或没有佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)。活性氧(ROS)水平衡量流动仪分析。ROS水平计算和显示。价值观代表意味着±SEM (n = 4 - 8)。* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001。
接下来,我们使用流式细胞分析仪分析研究活性氧释放循环和肝脏中性粒细胞从pair-fed ethanol-fed老鼠。见图5C,在pair-fed组,佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)刺激ROS水平明显高于肝中性粒细胞从mir - 223−−/老鼠比WT老鼠。Chronic-plus-binge喂养进一步增加PMA-stimulated ROS水平从WT老鼠但没有进一步增加中性粒细胞mir - 223−−/老鼠。
图5D显示ROS水平循环中性粒细胞。PMA-stimulated ROS水平明显高于pair-fed mir - 223−−/老鼠比pair-fed WT老鼠。乙醇喂养中ROS含量进一步增加WT和mir - 223−−/老鼠在mir - 223水平较高−−/老鼠比WT老鼠。
ROS水平也以肝巨噬细胞,远低于那些在中性粒细胞。乙醇喂养PMA-stimulated减少ROS mir - 223的巨噬细胞−−/老鼠(见在线补充图S7)。
mir - 223间接会使p47phox通过抑制il - 6在中性粒细胞
理解机制更大的ROS mir - 223−−/老鼠和WT老鼠,我们检查肝NADPH-associated分子的表达,包括五种吞噬氧化酶(phox)单位:p47phox,p67phox,p40phox,第22位phox和gp91phox。14见图6,chronic-plus-binge喂养肝p47增加phoxmir - 223的表达−−/老鼠与pair-fed组相比,尽管这类喂养没有改变肝p47phox表达WT老鼠。有趣的是,基底的肝p47水平phox表达在pair-fed mir - 223高−−/老鼠比pair-fed WT老鼠。相比之下,肝其他phox基因的表达(p40 p67,第22位和gp91)不改变或高架柱乙醇喂养。此外,肝脏表达Nox1 Nox3 chronic-plus-binge喂养后,Nox4调节mir - 223的更高水平−−/老鼠与WT小鼠相比图6B)。
mir - 223调节活性氧(ROS)相关基因在肝脏从ethanol-fed老鼠。WT老鼠和mir - 223−−/老鼠受到E10d + 1 b或一对喂食,和老鼠安乐死postgavage 9小时。肝组织受到ROS-associated基因的实时PCR分析。价值观代表意味着±SEM (n = 4)。* p < 0.05;* * * * * p < 0.01, p < 0.001。
因为p47phox主要表现在中性粒细胞和起着关键作用生成氧化破裂的中性粒细胞,35,36我们进一步检查p47phox在这项研究中中性粒细胞。见图7,p47phox信使rna表达的中性粒细胞ethanol-fed mir - 223−−/老鼠高与WT老鼠。了解gp47的机制phoxmir - 223调节−−/中性粒细胞,我们检查了mir - 223目标序列;然而,没有发现p47目标序列phox基因,这表明mir - 223可能间接调节gp47phox。因为据报道,il - 6是mir - 223的目标基因37,38和肝il - 6基因表达在ethanol-fed mir - 223高度升高−−/老鼠(图4C),我们提出,mir - 223间接抑制p47phox在中性粒细胞il - 6的差别通过对这些基因的表达。首先,我们证实il - 6是一个mir - 223目标基因在网上补充图S8,表明(UTR) 3′端非翻译区地区的il - 6基因包含mir - 223绑定地区和mir - 223转染抑制活性的IL-6-3′UTR基因记者。第二,il - 6表达更高的中性粒细胞从ethanol-fed mir - 223−−/老鼠老鼠的价格相比WT (图7A)。第三,体外治疗调节p47明显il - 6phox表达式在中性粒细胞(图7B)。
mir - 223调节中性粒细胞通过针对IL-6-p47传播phox轴ethanol-fed老鼠和酗酒者与最近喝酒。(一)WT老鼠和mir - 223−−/老鼠受到E10d + 1 b或一对喂食,和老鼠安乐死postgavage 9小时。循环中性粒细胞分离和接受实时PCR分析。(B)循环中性粒细胞被孤立,il - 6 (50 ng / mL)添加到培养基为6小时,p47和表达phox是由实时PCR分析。(C) WT p47/ phox−−老鼠受到E10d + 1 b喂食,和老鼠安乐死postgavage 9小时。测量血清ALT和AST(左面板)。肝脏中性粒细胞分离和治疗有或没有佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)和活性氧(ROS)测量和计算(右面板)。(D)循环中性粒细胞分离得到健康对照组和酗酒者最近喝酒,紧随其后的是实时PCR分析。(E)总结图描绘mir - 223作为调制器控制肝脏嗜中性粒细胞浸润和chronic-plus-binge乙醇肝损伤后饮用。价值观代表意味着±SEM (n = 4-16)。* p < 0.05;* * p < 0.01。
p47的功能phox在使用p47 chronic-plus-binge喂养模型检查/ phox−−老鼠。见图7p47 C,删除phox基因减少chronic-plus-binge-induced肝损伤(ALT)高程,而删除的弹性蛋白酶,中性粒细胞的蛋白水解酶,并不影响的肝损伤模型(见在线补充图S9A)。有趣的是,只有在p47 ALT水平相对较低/ phox−−老鼠,而血清AST水平不降低与WT老鼠相比,这些老鼠(图7C)。看来在chronic-plus-binge喂养模型中,急性乙醇填喂法直接造成肝细胞线粒体损伤和线粒体AST升高,而中性粒细胞升高的贡献主要是ALT升高。因此,p47的删除phox基因不影响血清AST水平,但抑制中性粒细胞,从而导致更低的ALT水平。此外,相比之下,ethanol-fed WT老鼠,外围中性粒细胞的数量保持不变和肝中性粒细胞高ethanol-fed p47/ phox−−老鼠(见在线补充图S9B)。PMA-stimulated ROS生产完全是在中性粒细胞减少ethanol-fed p47/ phox−−老鼠(图7C)。PMA-stimulated巨噬细胞的活性氧产量,降低了8倍相比,在中性粒细胞,也废除了ethanol-fed p47/ phox−−老鼠。进一步定义p47的角色phox在免疫细胞包括中性粒细胞导致肝损伤,我们生成通过骨髓移植嵌合体小鼠。如在线补充图与p47 S9C、WT老鼠phox缺乏骨髓与WT小鼠血清ALT相比低得多与WT老鼠骨髓chronic-plus-binge乙醇喂养。
上述数据表明,il - 6和p47 mir - 223控制phox基因表达在小鼠中性粒细胞。检查潜在影响il - 6和p47 mir - 223phox循环中性粒细胞在人类的酗酒者,血液中性粒细胞分离从另一群16与最近的过度饮酒和酗酒者12健康对照组。见图7D, mir - 223的表达较低,而il - 6和p47phox表达高循环中性粒细胞从酗酒者与健康对照组进行比较。
讨论
最近的研究表明,狂欢乙醇喂养的水平循环和肝中性粒细胞增加,导致慢性肝损伤ethanol-fed老鼠。7在目前的研究中,通过分析血液病学的300年酗酒者和肝配置文件,我们表明,血清ALT和AST水平更高的酗酒者最近喝酒与那些没有最近喝酒或健康对照组相比,小鼠与结果一致显示chronic-plus-binge喂养的高程的影响血清ALT和AST。7的一个关键特性从chronic-plus-binge喂养的小鼠模型是外围的高程和肝中性粒细胞。7,39,40有趣的是,在最近的酗酒者与饮酒,循环外围中性粒细胞是大幅增加,占大约80%的总白细胞计数,均明显高于那些没有最近饮酒与健康对照组(大约60 - 67%的白细胞总数)。虽然我们无法获得肝活检检查肝嗜中性粒细胞浸润由于道德问题,我们发现循环中性粒细胞水平呈正相关很好与酗酒者的血清ALT和AST水平最近喝酒。这些发现表明,过量饮酒可能导致增加肝脏嗜中性粒细胞浸润,导致肝损伤在这些科目。
通过筛选血清microrna,我们发现血清mir - 223水平,这是众所周知的,调节中性粒细胞功能,30 -在酗酒者明显高于健康对照组相比。与这些人类的数据协议,血清mir - 223水平也升高后chronic-plus-binge乙醇喂养小鼠。mir - 223的作用在退化在mir - 223进行测试−−/老鼠。有趣的是,pair-fed mir - 223−−/小鼠表型,基线的轻微但明显高于血清ALT水平,中性粒细胞计数和外围的肝脏炎症介质的表达,与pair-fed相比WT老鼠。这可能是因为,mir - 223−−/老鼠循环外周血中性粒细胞升高,标志着骨髓粒细胞增生,这是介导通过upregulation Mef2c mir - 223目标基因的转录因子促进髓系祖细胞增殖。41很可能观察到的基线表型在这些老鼠是次要的增加循环嗜中性粒细胞水平。重要的是要注意,无论是慢性乙醇喂养还是急性乙醇单独填喂法增强基线血清AST和ALT水平mir - 223−−/老鼠。升级的肝损伤和肝嗜中性粒细胞浸润只观察chronic-plus-binge乙醇喂养时使用。这些结果表明,mir - 223的治疗意义可能适用的条件,导致肝中性粒细胞增加,如chronic-plus-binge模型中,但不是在慢性乙醇喂养或急性独自狂欢当肝脏嗜中性粒细胞浸润不明显。7
机械的研究表明,mir - 223中性粒细胞功能通过抑制IL-6-p47的变弱phoxros通路,从而防止退化(参见总结图7E)。在几个NADPH氧化酶类及其相关基因与ROS生产、p47的表达phox在肝脏有最高的折叠upregulation ethanol-fed mir - 223−−/老鼠的价格相比WT老鼠。一项研究报道,p47的删除phox基因废除慢性ethanol-feeding-induced肝损伤通过减少活性氧的生产枯氏细胞。42从我们目前的研究结果表明小说p47的角色phox在促进中性粒细胞饮酒导致的肝损伤。首先,chronic-plus-binge模型与显著减少肝脏嗜中性粒细胞浸润,但枯氏细胞。第二,中性粒细胞生成的五倍高8倍比巨噬细胞ROS水平。第三,p47phox表达高度从ethanol-fed mir - 223肝中性粒细胞升高−−/老鼠的价格相比WT老鼠。删除的p47phox在中性粒细胞基因完全废除ROS生产。因此,我们相信p47phox在中性粒细胞在促进活性氧的生产中起着主导作用和肝损伤chronic-plus-binge ethanol-feeding模型。
与肝中性粒细胞增加ethanol-fed mir - 223−−/小鼠肝F4/80+巨噬细胞明显减少,相比与pair-fed WT老鼠。巨噬细胞的数量的减少几个肝macrophage-associated差别也符合对这些细胞因子和趋化因子(如TNF-α、MCP-1 MIP-1β和MIP-2) ethanol-fed mir - 223−−/老鼠和pair-fed组。最近的一项研究报道,mir - 223模拟减毒巨噬细胞凋亡的转染表达下调forkhead盒O3的表达(FOXO3),43一个重要的巨噬细胞凋亡的诱导物。44因此,它是可能的,mir - 223肝巨噬细胞的敏感性增加−−/老鼠ethanol-induced凋亡FOXO3表达升高。最后,尽管mir - 223可以发挥重要的作用在调节巨噬细胞在几种类型的疾病,45,46激活的巨噬细胞可能扮演更重要角色在chronic-plus-binge ethanol-induced肝损伤,因为肝巨噬细胞显著减少在这个模型中。
本研究的另一个有趣的发现是,mir - 223表达不同的监管从人类的酗酒者和中性粒细胞ethanol-fed老鼠虽然两组血清mir - 223水平升高。我们证明了在酗酒者,mir - 223在中性粒细胞是表达下调,而在chronic-plus-binge ethanol-fed老鼠,mir - 223在中性粒细胞是调节。目前,这个相反的调节机制在人类和小鼠仍然未知。此外,我们假设upregulation中性mir - 223的老鼠可能起到补偿作用在保护反对饮酒导致的肝损伤;中性mir - 223的差别而对这些酗酒者可能会加剧alcohol-mediated激活中性粒细胞和肝损伤在这些科目。因此,mir - 223可能是小说的调制策略肾上腺白质退化症患者通过治疗调节中性粒细胞的功能。事实上,注入pre - mir - 223慢病毒减少chronic-plus-binge ethanol-induced肝损伤。因为中性mir - 223改善肝损伤通过抑制中性粒细胞的证明在这项研究中,肝mir - 223促进肝细胞凋亡;47因此,neutrophil-specific交付mir - 223可能需要为了产生更好的治疗结果“肾上腺脑白质退化症”的治疗。
引用
脚注
贡献者毫升计划并进行了动物和细胞培养研究和写论文;YhG YH、ZZ TR, YqG, HC, YC, MX和DF进行实验和分析数据;骨髓PZ设计和分析数据;RAR进行临床研究;SL计划并进行临床研究,分析了临床数据和编辑报纸;BG设计整个项目,监督学习和写论文。
资金这项工作得到了校内项目国家酒精滥用与酒精中毒研究所,国家卫生研究院(BG),由1 i01cx000361-01退伍军人事务部研究和管理和w81xwh - 12 - 1 - 0497来自美国国防部(SL)。毫升是优秀青年医学人才的培训计划的支持下,上海市卫生局(XYQ2013093);YqG支持中医的发展三年行动计划在上海(ZYSNXD-CC-ZDYJ015)。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准印第安纳大学普渡大学机构审查委员会,研究和发展委员会Roudebush VAMC,和费尔班克斯毒品和酒精治疗中心。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。