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肝脏病学
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BMP-9干扰肝脏再生,促进肝纤维化
免费的
  1. 卡佳Breitkopf-Heinlein1,
  2. Christoph迈耶1,
  3. 考特尼康尼锡2,
  4. Haristi Gaitantzi1,
  5. 安娜莉莎Addante3,
  6. 玛丽亚•托马斯4,
  7. 伊丽莎Wiercinska5,
  8. 陈蔡1,
  9. 气李1,6,
  10. Fengqi广域网1,
  11. 老人Hellerbrand7,
  12. 据称一个Valous8,
  13. 马克西米利安Hahnel9,
  14. 基督教Ehlting9,
  15. 约翰内斯·G波德9,
  16. 斯蒂芬妮Muller-Bohl10,
  17. 乌苏拉Klingmuller10,
  18. 任何人Altenoder1,
  19. Iryna Ilkavets1,
  20. 玛丽-何塞Goumans11,
  21. 卢卡斯J C Hawinkels11,
  22. 该大学12,
  23. 马蒂亚斯•维兰德2,
  24. 卡罗琳Mogler13,
  25. 马提亚P艾伯特1,
  26. 布兰卡Herrera3,
  27. Hellmut奥古斯汀2,14,15,
  28. Aranzazu桑切斯3,
  29. 史蒂文·杜利1,
  30. 彼得十Dijke11
  1. 1医学院医学系二世曼海姆,海德堡大学,曼海姆、德国
  2. 2的血管肿瘤和转移,德国海德堡癌症研究中心(DKFZ-ZMBH联盟),海德堡、德国
  3. 3生物化学和分子生物学系II,教员的药店,马德里大学、圣卡洛斯医院卫生研究所(IdISSC),马德里、西班牙
  4. 4博士Margarete Fischer-Bosch临床药理学和图宾根大学学院,斯图加特、德国
  5. 5德国红十字会血液服务Baden-Wurttemberg-Hessen和输血医学研究所和Immunohaematology,歌德大学,法兰克福、德国
  6. 6胃肠病学和肝脏病学,北京你安医院,隶属于首都医科大学,北京,中国
  7. 7内科,雷根斯堡大学医院,雷根斯堡、德国
  8. 8应用肿瘤免疫临床合作单位,国家肿瘤中心的疾病,德国癌症研究中心,海德堡、德国
  9. 9大学医院的海因里希·海涅大学,杜塞尔多夫、德国
  10. 10部门的信号转导系统生物学,DKFZ-ZMBH联盟,德国癌症研究中心(DKFZ),海德堡、德国
  11. 11分子细胞生物学和癌症基因组学中心,莱顿大学医学中心,莱顿、荷兰
  12. 12约翰霍普金斯大学医学院的分子生物学和遗传学等,巴尔的摩美国
  13. 13慕尼黑工业大学病理学研究所,慕尼黑、德国
  14. 14血管生物学和肿瘤血管生成(CBTM)医学院曼海姆,海德堡大学,曼海姆、德国
  15. 15德国癌症协会,海德堡、德国
  1. 对应到Katja Breitkopf-Heinlein博士医学系二世,部分分子肝脏病学,医学院曼海姆,海德堡大学Theodor-Kutzer-Ufer 1 - 3,曼海姆d - 68167,德国;katja.breitkopf在{}medma.uni-heidelberg.de

文摘

客观的骨形成蛋白(BMP) 9日的成员将增长factor-β家族细胞因子在肝脏结构性产物。系统性水平在许多器官和组织行为包括骨头和内皮细胞,但对健康和疾病的肝脏功能。

设计BMP-9水平及其受体在原发性肝细胞进行分析。直接影响BMP-9对肝星状细胞(hsc)和肝细胞在体外研究,以及BMP-9的作用是检查在急性和慢性肝损伤模型小鼠。

结果静和激活肝星状细胞被确定为主要产BMP-9肝细胞类型。BMP-9刺激培养肝细胞抑制增殖,上皮间充质转变和保存重要的代谢酶,如细胞色素P450的表情。急性肝损伤引起的部分肝切除术或单一注射四氯化碳(三地4)和脂多糖(LPS)小鼠肝BMP-9差别导致瞬态对这些基因的mRNA的表达。相应地,LPS刺激的差别导致了对这些BMP-9培养的肝星状细胞中表达。部分肝切除术后应用BMP-9显著增强肝损害和干扰增生性反应。BMP-9-deficient小鼠慢性肝损伤小鼠或adenovirally overexpressing选择性BMP-9拮抗剂activin-like激酶1-Fc导致减少胶原的沉积和随后的纤维化。

结论组成型表达的低水平的BMP-9稳定健康的肝脏肝细胞功能。HSC激活,内生BMP-9水平提高体外和体内高水平的BMP-9导致增强损伤急性或慢性损伤。

  • 肝星状细胞
  • 肝纤维化
  • 肝细胞
  • 细胞因子
  • 生长因子

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl - 2016 - 313314

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    本研究的意义

    已知在这个问题上是什么?

    • 骨形成蛋白(BMP) 9是转化生长因子(TGF)成员-β家族细胞因子,是由肝脏产生并不断分泌到血液中。

    • BMP-9抗增殖作用和稳定成熟的(健康)血管但是促进血管生成在不同的肿瘤。

    • BMP-9诱发肝癌细胞上皮间充质转变及其蛋白质含量与攻击性的肝细胞癌患者样本。

    • BMP-9是I型受体的高亲和性配体activin-like激酶1。

    有什么新发现吗?

    • 肝星状细胞(hsc)是BMP-9细胞来源,并在纤维发生的活化肝星状细胞表达和分泌越来越多。

    • BMP-9抗增殖作用和稳定主要(健康)肝细胞包括维护细胞分化和代谢酶的表达与细胞色素P450氧化酶类。

    • 低水平的BMP-9促进肝伤口愈合和再生在急性肝损伤小鼠模型。

    • 缺乏或抑制BMP-9在慢性肝损伤(CCl重复注射4老鼠)显著改善纤维发生。

    它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?

    • 瞬态抑制BMP-9本身或结合现有治疗策略可以极大地改善肝伤口愈合和再生能力在急性以及慢性肝损伤。

    介绍

    属于骨形成蛋白(bmp)转化生长因子(TGF) -β家族细胞因子。1目前,大约20家不同的每个位置已确定,分为亚科,根据相似的氨基酸序列。我国分泌糖蛋白参与一系列大型的生物活性包括增殖、分化和存活,因此扮演重要的角色在胚胎中,组织再生和癌症。1 - 4我国启动信号从细胞表面结合两种不同类型的丝氨酸/苏氨酸激酶受体(I和II)。形成活动中的复杂的诱导信号转导途径通过磷酸化的小母亲反对decapentaplegic (SMAD)蛋白,并通过SMAD-independent通路通过增殖蛋白激酶(细胞外signal-regulated激酶,p38增殖蛋白激酶,c-Jun n端激酶)。5,6我国可以在以自分泌或旁分泌的方式和结果高度依赖上下文。7 - 10

    BMP-9和BMP-10代表最近发现了BMP的家人。而大多数activin-like bmp信号通过I型受体激酶(碱性)2,ALK-3或ALK-6 BMP-9和ALK1 BMP-10显示最高的亲和力。11,12然而,细胞仍应对BMP-9没有ALK1通过ALK2信号。11,13BIAcore实验揭示了高亲和力的BMP-9 ALK1 ActRIIB和低亲和力结合ALK2和其他类型II受体BMPRII ActRIIA。14,15而BMP-10似乎主要表达在发展中心,16BMP-9优先表达在肝脏。17日至19日本构的低级循环BMP-9表达式结果可检测水平在健康个体。17,20.功能区分BMP-9和其他每个位置等,它不绑定到BMP-co-receptor hemojuvelin或可溶性bmp拮抗剂的大脑21,22这BMP-9多元prodomains生物活性。23似乎在接触它的受体BMP-9总是变成一个活跃的构象,即使它仍然是其prodomains复合体。24有趣的是,BMP-9和BMP-10可以直接绑定到ALK1 ActRIIB和类似的高亲和力。14ALK1-Fc,细胞外的领域ALK1融合到Fc免疫球蛋白的一部分,作为一种有效的和特定的BMP-9 BMP-10配体陷阱。25我们最近发现,BMP-9徒protumorigenic肝癌细胞。6,26然而,可能的功能以初级非转换BMP-9肝细胞(高碳钢)没有更仔细的研究。因此,我们旨在更好地描述函数BMP-9在健康和患病的肝脏。的数据表明,尽管生理水平BMP-9似乎稳定上皮表型的薄壁组织,高水平的BMP-9抵消与伤口愈合和/或再生的细胞项目;因此,在急性损伤BMP-9水平下降是暂时性的。相应地,我们发现肝伤口愈合体内BMP-9时更有效抑制(通过ALK1-Fc)或缺席(BMP-9-deficient动物)。我们的数据表明,BMP-9代表肝脏内稳态的重要因素,表明瞬态抑制BMP-9可能是一个新选项来提高肝患者的伤口愈合和再生过程。

    材料和方法

    腺病毒

    AdLacZ和AdId1如前所述。27建设AdBMP-9 AdFc和AdALK1-Fc adenoviral结构,人类编码序列被clonase重组反应垫/桌子(表达载体),生成和腺病毒是根据制造商的协议。

    细胞因子

    重组人类BMP-9 BMP-2 BMP-6和小鼠肝细胞生长因子(HGF)从研发系统(Wiesbaden-Nordenstadt、德国)和重组人类TGF-β1和血小板衍生生长因子(PDGF - b)是来自Peprotech(美国落基山)。

    抗体

    免疫印迹:兔单克隆anti-Smad3(磷S423 + S425)抗体(EP823Y) (ab52903)是用于检测phospho-Smad1/3 (Abcam)。兔多克隆抗体(检测磷酸化Ser465/467)是用于检测phospho-Smad2(细胞信号技术)。兔多克隆抗体为α平滑肌肌动蛋白(αSMA)从Abcam (ab7817)和甘油醛3 -磷酸dehydrogenease兔多克隆抗体(GAPDH)和单克隆鼠标anti-actinβ-actin取自圣克鲁斯。

    免疫组织化学:ki - 67鼠anti-mouse从Dako获得的抗体。单克隆鼠标对αSMA DAKO (M0851),和一个单克隆兔子anti-cleaved caspase-3 (Asp175;5 a1e)是细胞信号技术。

    老鼠

    所有实验动物协议进行符合欧洲共同体的政策,并通过当地委员会。BMP-9-deficient老鼠产生如前所述12和保持在C57BL / 6背景。

    细胞隔离和文化

    鼠标高碳钢孤立从雄性C57BL / 6小鼠(8日至13日周大)胶原酶灌注所描述。28高碳钢的可行性是大约95%。主要高碳钢在三种媒体:培养介质1:威廉姆斯的媒介E补充10%胎牛血清(FCS), 2毫米谷酰胺,1%的青霉素、链霉素和100海里地塞米松。没有FCS介质2:介质1。中3:威廉姆斯的媒介E补充只有2毫米青霉素和链霉素谷酰胺和1%。新孤立高碳钢镀在collagen-coated 3.5厘米在4×10的密度板5细胞/菜中1和5%孵化有限公司2在37°C为4个小时。介质1替换为介质2血清饥饿和细胞周期同步。第二天,介质2改为3。

    肝星状细胞(hsc)是独立于雌性Balb / c小鼠链霉蛋白酶/胶原酶消化后通过单步执行密度梯度离心法Nycodenz (Nyegaard有限公司,奥斯陆,挪威),本质上是如前所述的老鼠。27简而言之,Balb / c小鼠(ca。20 g) anesthetised和无菌条件下腹腔被打开了。肝脏是通过门静脉灌注汉克斯缓冲平衡盐溶液没有Ca2 +和毫克2 +。完成灌注后,肝脏被转移到一个漏斗和灌注与链霉蛋白酶4分钟,其次是与胶原酶灌注7分钟。肝脏被分离和细胞悬液提交与Nycodenz密度梯度离心法,洗几次。细胞被resuspended杜尔贝科的修改鹰FCS介质(DMEM) + 10%。平均纯度由紫外线自体荧光≥95%。然后,细胞在DMEM培养,补充了4毫米谷酰胺,10% FCS和青霉素(100国际单位/毫升)/链霉素(100µg /毫升)。第一个变化的介质进行播种后1 - 2小时删除任何non-adherent细胞碎片。与肝星状细胞刺激实验,FCS一夜之间减少到0.5%的浓度。

    LX-2是人类HSC线,在DMEM培养补充2% FCS, 4毫米谷酰胺和青霉素(100国际单位/毫升)/链霉素(100µg /毫升)。

    划痕试验(LX-2)

    在12-well LX-2细胞培养板直到confluency来确定他们的伤口缝合能力。的细胞培养介质没有FCS过夜。使用吸管,单层挠仔细,紧随其后的是刺激与重组BMP-9(浓度在5、10、50 ng / mL)。照片拍摄后立即(t = 0小时)和24小时(每抓7图片)。剩下的直径的未经处理的条件设置为1和治疗条件表示为未经处理的褶皱。

    同时隔离的四个从小鼠肝脏肝细胞类型

    经过隔离的主要高碳钢和肝星状细胞(协议如前所述)从男C57B / 6小鼠,剩下的细胞比例进一步处理隔离肝正弦内皮细胞(LSECs)和枯氏细胞(;)使用磁性微Miltenyi (CD146微LSEC和CD11b KC)如前所述。29日

    人类主要HSC隔离和迁移试验

    主要描述人类肝星状细胞分离和培养。30.体外活化的肝星状细胞通过细胞培养在裸露的组织培养菜肴。

    肝星状细胞的迁徙活动量化使用Cultrex 96细胞迁移试验(美国马里兰州盖瑟斯堡Trevigen)所描述。31日简单地说,肝星状细胞被刺激或不是BMP-9 24小时。随后,细胞在DMEM trypsinised和播种没有FCS的上层舱提供96 -微孔板(10×103细胞/)。下室充满DMEM补充10% FCS评估定向迁移。孵化后5小时37°C,细胞迁移是由荧光分析的量化EMax标(MWG生物技术,Ebersberg,德国)。

    免疫印迹分析

    细胞总蛋白质是收获在冰radioimmunoprecipitation分析裂解缓冲(1×三羟甲基氨基甲烷缓冲液,1%诺乃清洁剂P40、0.5%钠脱氧胆酸盐和0.1%钠dodecylsulfate)在刚添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂(罗氏,曼海姆,德国)。蛋白质浓度测定用Bio-Rad蛋白质化验(Biorad,慕尼黑,德国)。蛋白质分离4% -12%十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(NuPAGE英杰公司)和转移到硝化纤维素膜(皮尔斯,罗克福德,伊利诺斯州,美国)。孵化与主抗体在一夜之间发生在4°C。辣根peroxidase-linked二级抗体(圣克鲁斯,海德堡,德国)。细胞膜与Supersignal超发达(皮尔斯,汉堡,德国)和化学发光检测与富士胶片数字化拉斯维加斯1000图像检测系统。

    HC扩散测量

    自主要高碳钢单层培养只显示基底增殖活性很低,一个更加敏感的试验检测细胞DNA含量的变化被Huard进行描述et al。32短暂,新鲜孤立高碳钢镀在collagen-coated 3.5厘米板密度为1.25×105细胞/菜如上所述。第二天,介质2改为介质3和细胞被刺激(40 ng / mL),胶质瘤BMP-9 (5-50 ng / mL)或两者的结合48小时。在每个试验中,从一个动物细胞被使用,和治疗进行了一式三份。细胞被洗两次与磷酸缓冲盐(PBS)和被冻结在−20°C。DNA分析内容,盘子是孵化2毫升/ Sybr绿色我工作的解决方案(Sybr绿色我10 000×(表达载体,达姆施塔特,德国),在PBS稀释1:2500,补充0.1% (v / v)卫100×1小时在黑暗中。荧光强度测量使用无限F200 Pro板读者(Tecan、Mannedorf、瑞士)λ激= 485海里,λ发射= 535海里。四个实验进行统计分析,个人数据被缩放的均值各自的实验。

    HSC增殖实验

    人类肝星状细胞(3和5之间的通道隔离从四个不同的捐助者)或LX-2细胞培养有或没有BMP-9 72小时(5 ng / mL),然后被胰蛋白酶脱落的细胞数。

    测定RNA表达

    从细胞或组织总RNA分离和等量反向转录成互补。高通量定量实时聚合酶链反应(rt - PCR)分析:总RNA分离使用RNeasy迷你工具包包括列从组织基因组DNA消化与RNase-free DNase组(试剂盒、希尔登,德国)和使用高纯从培养细胞RNA隔离包从罗氏公司(德国曼海姆)。RNA是反向转录cDNA使用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(罗氏)。对于定量rt - PCR,我们使用要么Fluidigm Biomark高通量的定量(q) PCR芯片平台(Fluidigm,旧金山,加利福尼亚,美国)预先设计基因表达分析与应用生物系统公司根据制造商的指示33,34执行或普通Sybr Green-based rt - PCR (40 PCR循环在7900年ABI棱镜ht系统)。给出用于rt - pcr引物表1和2。信使rna表达水平正常化是合适的看家基因表示的图的传说。

    把这个表:
    表1

    鼠标用于实时PCR引物序列(总是在5′≥3′方向)

    把这个表:
    表2

    序列的引物用于实时PCR(总是在5′≥3′方向)

    小天狼星红染色和量化

    小天狼星红染色进行1小时(0.1 g天狼星红苦味酸/ 100毫升;Sigma-Aldrich)如前所述。35样本成像使用Aperio滑动扫描整个幻灯片图像分析与Aperio透视仪紧随其后。量化的积极的方面,积极的像素计数V.9.1算法使用(像素区域/毫米2/−2.44827×10−7)。3生物副本/条件被用来量化天狼星red-positive区域。数据显示为阳性区域的像素数量和面积的像素数量(=积极性)。

    BMP-9 ELISA

    老鼠BMP-9发达的ELISA。Nunc maxisorp板块(Nunc、丹麦)涂上鼠标反BMP-9抗体(1μg在PBS /毫升,研发系统,阿宾顿,英国)O / N在rt,所有步骤之间,盘子洗了PBS含有0.05% Tween-20(默克公司)。Tween-20盘子被封锁,5%,0.05%的叠氮化钠PBS 1小时,其次是孵化与血浆样本(50μL稀释1%的牛血清白蛋白(BSA) (PAA、德国)/ PBS)或一个标准(鼠标BMP-9重组、研发系统)在室温下2小时(RT)。执行检测与生物素化的山羊反BMP-9抗体(0.2μg /毫升1% BSA / PBS 2小时,RT), streptavidin-horse萝卜过氧化物酶和底物试剂包(所有研发系统)如前所述。36,37

    创新领导力4动物实验

    雄性Balb / c小鼠(每组5动物)重20 - 25 g和8周大CCl用于4时间进程实验。肝损伤是引起腹腔内注射CCl 1.6克/公斤体重4(同4与矿物油混合1:8)。雄性C57BL / 6小鼠被用于慢性肝损伤,获得三个CCl腹腔内注射4每周4周。在第七天(后1周和三个创新领导力4注射),动物收到10的静脉注射9病毒颗粒在50µL盐水(AdFc或AdALK1-Fc)。动物牺牲后4周和肝脏样品在液氮快速冻结或缓冲福尔马林固定在4%组织学。与野生型相同的协议进行了实验与BMP-9 KO小鼠,但只有两个每周注射一段总共8周。

    急性损伤的动物实验(有限合伙人和创新领导力4)

    雄性C57BL / 6小鼠被用于急性肝损伤的研究。老鼠收到一腹腔内注射脂多糖(LPS)(1µg / g体重),三地4(1.6克/公斤体重)或PBS(控制)。此外,一群动物收到重组BMP-9 (100 ng /鼠标)每24小时单独或结合有限合伙人/创新领导力4注射。老鼠牺牲在《纽约时报》表示的数据,和收集血液和肝脏。

    部分肝切除术

    2/3部分肝切除术(PH)实验用老鼠进行了描述。38另外一半的老鼠获得重组BMP-9每24小时如上所述。老鼠牺牲在《纽约时报》表示的数据,和收集血液和肝脏。

    免疫组织化学

    Formalin-fixed,石蜡包埋组织部分脱蜡、水化通过分级乙醇系列和孵化60°C 60分钟。抗原暴露了使用柠檬酸缓冲(0.01 M柠檬酸钠pH值6)在95°C水浴20分钟紧随其后在蒸馏水冷却。组织一些滴满是“双重内源性酶块”在潮湿的气氛中,持续15分钟。部分用PBS洗净后,首先他们孵化稀释抗体在一夜之间在4°C。添加了相应的二次抗体1小时在rt,部分覆盖着200µL 3′-diaminobenzidine(涂)衬底。色彩在显微镜下发展监测和反应是停在在蒸馏水中浸泡5分钟。部分被复染色迈耶haemalaun解决方案几秒钟和冲洗水,其次是通过提升乙醇脱水。在二甲苯清算了,部分安装与马林石油。

    患者样本

    冷冻人类肝纤维化组织提供的样本银行国家肿瘤中心疾病(NCT、海德堡、德国)按照规定组织的银行和海德堡大学的伦理委员会批准(Ethikvotes # 206/207年:2005)。

    对人类cryosections免疫组织化学染色

    免疫组织化学染色进行自动化应用一种iVIEW民建联检测设备(美国图森Ventana /罗氏公司)使用主要Bmp-9抗体(1:50 0、生物rad)与苏木精复染色。所有幻灯片被至少一个委员会认证评估外科病理学家。

    统计数据

    双面的,不成对学生的学习任务是用来识别团体间的显著差异。分类的意义决定如下:p < 0.05 = *;p < 0.01 = * *;p < 0.001 = * * *。

    结果

    肝星状细胞是源和目标BMP-9的老鼠的肝脏

    BMP-9分子解剖肝的功能,我们首先分析了细胞类型的健康的肝脏表达BMP-9 mRNA的最高水平。为此,我们孤立的四个不同的肝细胞类型(HC, HSC, LSEC和KC)同时直接从肝脏健康的雄性小鼠和细胞溶解细胞RNA净化。成功的浓缩的单个细胞类型的分析验证了特定程控标记(见网上的表达水平补充图S1)。肝星状细胞表达的最高水平BMP-9信使rna (图1BMP-9受体表达的)。分析显示与每个细胞类型异构表达式模式表达至少两个高亲和性受体中的一个:ALK1或ActRIIB。肝星状细胞和LSECs也表达了类似的水平ALK2,BMP-9的另一个I型受体亲和力较低,以及endoglin的受体BMP-9-signalling(见在线补充图S2)。

    Hepatic stellate cells (HSCs) are source and target of bone morphogenetic protein (BMP)-9. (A) Four different liver cells types (hepatocytes (HCs), HSCs, liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) and Kupffer cells (KCs)) were simultaneously isolated from healthy mouse livers, directly lysed and total RNA was purified. BMP-9 expression levels were determined by real-time PCR. Data are expressed as average values±SD (derived from n=8 isolations). Because no housekeeping gene was equally expressed in all cell types, the ΔCt for BMP-9 versus the average Ct of all four samples per experiment was calculated and expressed as % of total expression. (B) BMP-9 mRNA levels during in vitro activation (up to 6 days of culture) of primary mouse HSCs. Significant changes are indicated in relation to the 1-day time point. Ct values for BMP-9 were normalised to the housekeeping gene Ppia. (C) BMP-9 secretion from in vitro activated HSCs, measured by ELISA using samples from the conditioned medium of cultured primary mouse HSCs. Significant changes are indicated in relation to the 1-day time point. (D) Scratch assay, performed with LX-2 cells (human HSC cell line). (E) Migration assay, performed with primary human HSCs (average±SD of n=7 cell isolations). LX-2 (F) or primary human HSCs (passage 3–5) (G) were cultured with or without BMP-9 (5 ng/mL) for 72 hours and cells were counted. As positive internal control, LX-2 cells were stimulated with platelet derived growth factor (PDGF)-BB (20 ng/mL) as indicated. The graphs show the average cell numbers (for LX-2 (F): n=3 experiments; for (G) primary cells from four different donors were used) ±SD. (H) Expression of HSC activation markers (Col1a1, fibronectin (fn), PDGF-B (pdgfb), Pparγ (pparg) and αSMA) was determined by real-time PCR in primary mouse HSCs (average of n=3 cell isolations±SD) 24 hours after stimulation as indicated. (I) Primary human HSCs (passage 3–5, derived from three different donors) were stimulated with BMP-9 (5 ng/mL) for 72 hours and expression of Col1a1 was determined by real-time PCR. Statistical differences were classified as follows: *p<0.05; **p<0.001; ***p<0.0001. ALK, activin-like kinase; Ppia, peptidylprolyl isomerase A; αSMA, α smooth muscle actin; TGF, transforming growth factor; ut, untreated.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    肝星状细胞(hsc)源和目标的骨形成蛋白(BMP) 9。(一)四种不同的肝细胞(肝细胞(高碳钢)、肝星状细胞、肝正弦内皮细胞(LSECs)和枯氏细胞(;))同时健康老鼠的肝脏隔绝,直接细胞溶解和总RNA被净化。BMP-9实时PCR表达水平测定。数据表示为平均值±SD(来自n = 8分解动作)。因为没有看家基因也同样表达了在所有的细胞类型,ΔCtBMP-9和所有四个样品的平均Ct /实验总表达式的计算和表达为%。(B)BMP-9mRNA水平在体外激活文化(6天)的主要鼠肝星状细胞。重大的改变与天时间点表示。Ct值BMP-9管家基因是正常Ppia。(C) BMP-9从体外激活肝星状细胞分泌,以ELISA使用样本的条件培养基培养初级小鼠肝星状细胞。重大的改变与天时间点表示。(D)分析,执行与LX-2细胞(HSC人类细胞系)。(E)迁移试验,主要与人类肝星状细胞(平均±SD (n = 7细胞分解动作)。LX-2 (F)或主要人类肝星状细胞(通过3 - 5)(G)培养有或没有BMP-9 (5 ng / mL)为72小时,细胞数。作为积极的内部控制,LX-2细胞与血小板衍生生长因子(PDGF)刺激bb (20 ng / mL)表示。图表显示,平均细胞数(LX-2 (F): n = 3实验;(G)的主要细胞从四个不同的捐赠者±SD使用)。(H)的表达HSC活化标记(Col1a1,纤连蛋白(fn)、PDGF-B (pdgfb) Pparγ(pparg)和αSMA)是由实时PCR在初级小鼠肝星状细胞(平均n = 3细胞分解动作±SD)刺激后24小时。(我)主要人类肝星状细胞(通道3 - 5,来自三个不同的捐助者)刺激了BMP-9 (5 ng / mL) 72小时和表达Col1a1是由实时PCR。统计差异分类如下:* p < 0.05;* * p < 0.001;* * * p < 0.0001。碱性,activin-like激酶;Ppia,peptidylprolyl异构酶;αSMAα平滑肌肌动蛋白;转化生长因子,转化生长因子;ut,未经处理的。

    培养肝星状细胞是自发激活和分化成myofibroblasts。39因此,我们分析了BMP-9表达式动力学(RNA和蛋白质分泌)在体外激活。,mRNA表达和蛋白质的分泌BMP-9显著增加在文化和维持在高位至少1周(图1B、C)。此外,BMP-9直接增强伤口缝合的潜在(由划痕试验)人类HSC细胞系,LX-2 (图1D)和刺激的迁移主要培养人肝星状细胞(图1E)。而BMP-9加强培养的肝星状细胞的增殖(LX-2以及主要人类肝星状细胞;图1F, G),它没有调节效应标志物的表达与体外活化过程(图1H,我与TGF-β)。刺激作为积极控制这些实验并导致预期(upregulation显著变化Col1a1,纤连蛋白和Pdgfb的差别,对这些Pparγ)。一致,主要培养小鼠肝星状细胞的BMP-9中和ALK1-Fc没有改变的表达激活标记,表明细胞在体外激活即使没有BMP-9 (图1H)。

    BMP-9企稳上皮主要高碳钢的属性

    BMP-9被描述为一个血管静止因素,稳定成熟的内皮细胞的分化表型。20.主要高碳钢和肝癌细胞系BMP-9响应。6,18,26主要鼠标高碳钢刺激文化与重组BMP-9 upregulation显示典型的包括BMP-target基因Id1、hepcidin (hamp1)或Smad6(图2A)。BMP-9抑制基线以及HGF-induced HC扩散(图2B)。主要高碳钢培养单层迅速失去上皮表型和获得间充质属性(上皮间充质转变(EMT)40,41)。所示图2C, BMP-9剂量依赖性逆转culture-provoked upregulation间叶细胞的标记胶原蛋白我和纤连蛋白,上皮的差别以及对这些标记钙粘蛋白。此外,TGF-β-mediated EMT转录因子的诱导蜗牛42网上被BMP-9抑制(见补充图S3)。同样,BMP-9增强RNA表达的23 37测试酶和其他蛋白质参与代谢活动的高碳钢(图2D)。为了进一步调查的角色BMP-9稳定高碳钢的上皮表型,我们孤立主要高碳钢BMP-9 KO小鼠的肝脏,并测量了三间充质三上皮标记基因的表达水平。所示的结果图2E表明没有BMP-9高碳钢表达水平明显高于间质和低水平的上皮标记,而从野生型肝细胞分离。

    Effects of bone morphogenetic protein (BMP)-9 on primary mouse hepatocytes in vitro. (A) Induction of mRNA expression of classical BMP-target genes (Id1, hepcidin and Smad6) was analysed by real-time PCR. Data are expressed as average values±SD. Ct values for the target genes were normalised to the housekeeping gene β-actin. Significant changes are indicated in relation to the corresponding time point of the untreated (ut) samples. (B) Using a Sybr Green I-based assay DNA levels in hepatocytes were determined within 48 hours of culture with the indicated stimulations. Addition of hepatocyte growth factor (HGF) (40 ng/mL) potently triggered DNA synthesis which was attenuated by co-treatment with BMP-9 (5 and 50 ng/mL). (C) Real-time PCR results showing that with prolonged culture of primary hepatocytes, the cells continuously induce expression of mesenchymal proteins like collagen 1a1 and fibronectin and reduce expression of the epithelial cadherin (E-Cadherin). In the presence of BMP-9, these regulations were significantly inhibited. Data are expressed as in panel A. (D) Hepatocytes were cultured in the presence or absence of BMP-9 (5 ng/mL) for either 24 hours (0≥24 hours), 48 hours (0≥48 hours) or first for 24 hours without and then another 24 hours with BMP-9 (24 hours≥48 hours) and the mRNA expression levels of 37 proteins involved in drug metabolisation processes were investigated by real-time PCR using Fluidigm analyses. The heatmap illustrates changes of ADME gene expression signatures in hepatocytes upon BMP-9 treatment and shows that approximately 60% of analysed genes are higher expressed (threshold 1.5-fold, marked with big asterisk) at least at one time span upon BMP-9 stimulation. (E) Expression of mesenchymal and epithelial marker genes were analysed by real-time PCR in freshly isolated hepatocytes from wild-type versus BMP-9 KO mice. Statistical differences were classified as follows: *p<0.05; **p<0.001; ***p<0.0001.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    骨形成蛋白(BMP) 9对小鼠肝细胞体外。(一)古典BMP-target感应mRNA表达的基因(Id1、hepcidin Smad6实时PCR)进行了分析。数据表示为平均值±SD。Ct值目标基因正常化看家基因β肌动蛋白。重大变化表示与未经处理的相应时间点(ut)样本。(B)使用Sybr绿色我测定肝细胞DNA含量测定在48小时内的文化暗示刺激。的肝细胞生长因子(HGF) (40 ng / mL)有说服力地引发DNA合成由co-treatment减毒与BMP-9(5和50 ng / mL)。(C)实时PCR结果显示,长期的文化主要的肝细胞,这些细胞不断诱导间充质蛋白的表达胶原蛋白1 a1和纤连蛋白和减少上皮钙粘蛋白的表达(钙粘蛋白)。在BMP-9的存在,这些法规明显抑制。数据表示为面板a (D)肝细胞培养的存在与否BMP-9 (5 ng / mL)为(0)≥24小时,24小时48小时(0)≥48小时或24小时没有和另一个24小时BMP-9(≥24小时48小时)和37个蛋白的信使rna表达水平参与药物使用Fluidigm metabolisation过程进行了实时PCR分析。ADME基因表达特征的热图说明改变肝细胞在BMP-9治疗和显示,大约有60%的基因高表达分析(阈值1.5倍,标有星号)至少一个时间跨度在BMP-9刺激。(E)间充质和上皮标记基因的表达被实时PCR分析刚从野生型和BMP-9 KO小鼠分离出肝细胞。统计差异分类如下:* p < 0.05;* * p < 0.001;* * * p < 0.0001。

    BMP-9表达式是暂时性的条件下降低急性肝损伤

    评估BMP-9水平是否会改变体内肝损伤的条件下,肝BMP-9信使rna表达水平确定在三个不同的急性肝损伤动物模型:单CCl注射4或有限合伙人和肝再生肝脏切除2/3 (PH)。有一个以上的差别瞬态对这些BMP-9表达后不久出现伤害在所有三个模型(图3a - c)。在以后的时间点,BMP-9表达在CCl有限合伙人或升高4注入(图3a - c)。此外,有限合伙人治疗表达下调BMP-9表达式在培养的肝星状细胞(图3D)。

    Transient downregulation of BMP-9 expression on acute liver damage. To cause conditions of acute liver damage followed by wound-healing/regeneration processes, mice were either injected once (intraperitoneally) with CCl4 (A) or with lipopolysaccharide (LPS) (B) or underwent partial hepatectomy (PH) (C). At the indicated time points, the animals were sacrificed, the livers were preserved and total RNA was isolated. Levels of BMP-9 or PCNA were determined by real-time PCR and are plotted as average of normalised values±SD. For the zero-hour time points, livers of age matched, untreated animals were used. The arrows indicate the time points of lowest BMP-9 expression in each model. (D) Primary mouse hepatic stellate cells (HSCs) were cultured for 8 days (ut). LPS (100 ng/mL) was either added for 24 hours (from day 7 to day 8; ‘acute’) or constantly (from day 1 to day 8; ‘chronic’) and total RNA was isolated. Levels of BMP-9 mRNA were determined by real-time PCR and are expressed as average of normalised values±SD. β2M,β2 microglobulin (housekeeping gene); BMP-9, bone morphogenetic protein 9; Ppia, peptidylprolyl isomerase A (housekeeping gene); PCNA, proliferation cell nuclear antigen; ut, untreated.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    的差别瞬态对这些骨形态发生蛋白9表达对急性肝损伤。引起的急性肝损伤愈合/再生过程,老鼠要么CCl(腹腔)注射一次4(A)和脂多糖(LPS) (B)或接受部分肝切除术(PH) (C)在表示时间点,动物被牺牲,肝脏保存和总RNA是孤立的。水平的BMP-9或PCNA实时PCR测定并绘制正常化±SD值的平均。零时的时间点,肝脏的年龄匹配,未经处理的动物。箭头表示最低的时间点BMP-9在每个模型表达式。(D)主要鼠肝星状细胞(hsc)是培养8天(ut)。有限合伙人(100 ng / mL)要么是增加了24小时(每天7到8;“急性”)或不断(从第一天到第8天;“慢性”)和总RNA是孤立的。水平的BMP-9信使rna表达测定实时PCR和正常化±SD值的平均。β2M,β2微球蛋白(管家基因);BMP-9,骨形态形成蛋白9;Ppia,peptidylprolyl异构酶(管家基因);PCNA增殖细胞核抗原;ut,未经处理的。

    对应于观测BMP-9高碳钢(抗增殖的影响图2B)的下降BMP-9表达在PH值(图3C)以及CCl后注入4(图3A)正好与之前描述增强HC扩散的时间点,这山峰PH值后24 - 48小时之内38亚兰和48 - 72小时后注射。43符合这一点,迅速增殖细胞核抗原的表达水平调节单一注射后的有限合伙人,从而反对BMP-9水平在早期的时间点(8小时;图3B)。我们接下来检查结果的差别的平衡对这些内生BMP-9表达式由外生BMP-9早期诱导后时间点的伤害。的确,注入重组BMP-9导致肝损伤的一个重要增强LDH的循环水平增加,反映的AST和ALT PH值后2天(图4A)。此外,整体扩散显著降低在BMP-9-treated动物(图4B),尽管增强了proproliferative细胞因子mRNA的表达CTGF和VEGF(图4C)。

    High levels of bone morphogenetic protein (BMP)-9 lead to enhanced tissue damage reduced proliferation and enhanced CTGF and VEGF expression 2 days after partial hepatectomy (PH). PH (n=6–8 animals per group) was performed and recombinant BMP-9 (4 ng per g body weight) or equal amounts of phosphate buffered saline (PBS) were injected intraperitoneally. every 24 hours. (A) After 2 days, the animals were sacrificed, blood was preserved and levels of LDH, AST and ALT were determined. All differences between the PBS and BMP-9 groups were statistically significant (p<0.05). (B) Proliferation was determined by immunostaining for Mki67. One representative picture per group is shown. The graph shows the average amount of positive staining per surface area (as calculated from five randomly chosen areas per mouse using ImageJ software). (C) Levels of VEGF and CTGF mRNA in total liver lysates (day 2 after PH) were determined by real-time PCR and are expressed as average of normalised values±SD. CTGF, connective tissue growth factor; Ppia, peptidylprolyl isomerase A (housekeeping gene); VEGF, vascular endothelial growth factor.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    高水平的骨形成蛋白(BMP) 9导致增强组织损伤降低扩散和增强CTGF和VEGF表达式部分肝切除术后2天(PH)。PH值(n = 6 - 8动物每组)和执行重组BMP-9(体重4 ng / g)或等量的磷酸缓冲盐(PBS)腹腔内注入。每24小时。(一)2天后,动物们都牺牲了,血液被保留和LDH水平,AST和ALT测定。所有PBS和BMP-9组之间的差异具有统计学意义(p < 0.05)。(B)增殖是由Mki67疣状。一个代表每组显示图片。图表显示了阳性染色的平均每表面积(计算五个随机选择的领域/鼠标使用ImageJ软件)。(C)水平VEGF和CTGF信使rna在肝脏总溶解产物(PH值后第二天)由实时PCR和表示为±SD正常化值的平均水平。CTGF结缔组织生长因子;Ppia,peptidylprolyl异构酶(管家基因);VEGF血管内皮生长因子。

    体内缺乏BMP-9改善肝纤维化CCl重复注射4

    分析长期BMP-9影响,我们BMP-9干扰信号,使用一种腺病毒表达的可溶性形式BMP-9 I型受体,ALK1 (AdALK1-Fc)。与我国相比,TGF-β首先结合II型受体(TβRII)。TGF-β/ TβRII复杂的同事只有此后I型受体。TGF-β孤独的直接关联到任何I型受体(ALK1或ALK5)很低(审查44)。因此,ALK1-Fc蛋白质selectically BMP-9目标,不抑制TGF-β信号。来验证这个,也确认ALK1-Fc没有抵消其他每个位置的影响,我们进行了免疫印迹分析磷酸化SMADF蛋白质(见在线补充图S4A, B)。由BMP-9 SMAD-1磷酸化被有效地抑制ALK1-Fc(见在线补充图自己)。此外,CCl慢性4治疗小鼠接受AdALK1-Fc强烈减少循环CCl BMP-9相比之下,那些接受的水平4和一个控制病毒AdFc(见在线补充图自己)。

    使用这种方法,我们接下来研究的后果BMP-9中和条件下慢性肝损伤。肝纤维化小鼠被CCl重复注射实验诱导4。一群动物担任CCl溶剂控制4+生理盐水),另一组获得了控制病毒(三地4+ AdFc)和BMP-9中和在第三组注射腺病毒表达ALK1-Fc(三地4+ AdALK1-Fc)。动物收到CCl重复注射44周纤维化发展,由AdALK1-Fc显著降低(图5A、B)。在分析RNA水平胶原蛋白在这些动物的肝脏中,我们找到了相应的简化表达式AdALK1-Fc组(图5C)。BMP的目标基因的表达Id1也强烈减少,暗示BMP-9诱导Id1表达纤维发生期间,这是符合我们之前的观察,肝星状细胞移植Id1在激活期间表达。27数据进一步证明BMP-9表达式(就像这样TGF-β)随肝纤维化的发展。虽然这BMP-9水平上升被AdALK1-Fc强烈阻止,TGF-β水平仍然高企(图5C)。免疫染色的裂解caspase-3显示整体细胞凋亡率显著降低AdALK1-Fc-treated动物(图5D)。这些结果证实的健壮性小鼠遗传CCl BMP-9的损耗4全身的肝纤维化模型,缺乏BMP-9信号BMP-9基因敲除小鼠导致温和纤维化的发展,与控制(图6A)。如AdALK1-Fc设置,upregulation CClαSMA蛋白显著减少了4对待BMP-9 KO小鼠与野生类型(图6B、C)。也在这里,BMP-9CCl mRNA表达引起的4在野外和类型TGF-βmRNA表达还是增强即使没有BMP-9尽管减少纤维化(图6D)。按照天狼星红染色结果所示图6,感应的Col1a1 KO小鼠显著降低(图6D)的变化纤连蛋白和肌间线蛋白表达式CCl之间没有显著差异4对待野生类型和BMP-9 KO小鼠,但在这两种情况下基底BMP-9 KO小鼠中表达增强(见在线补充图S5B)。AdALK1-Fc方法相比,upregulation BMP-target的基因Id1仍然还发生在缺乏BMP-9 (图6D),这可能是由于适应性的BMP信号网络,有时间开发在KO小鼠但不是AdALK1-Fc-treated动物。HepcidinCCl,另一个BMP-target基因,没有改变4一般,但几乎没有BMP-9 KO小鼠(见在线补充图没有BMP-9 S5B),表明hepcidin似乎普遍低表达。Smad6表达式在KO小鼠与野生类型不变,虽然有减少的倾向的表达上皮标记钙粘蛋白KO小鼠,在整个肝脏溶菌产物差别无统计学相关(见在线补充图S5B)。正如所料,肝损伤标记AST和ALT的显示一个明确的趋势减少CCl的血清4对待网上KO小鼠与野生型相比补充图S5B)进一步证明减少BMP-9 KO小鼠肝损伤。CCl整体扩散4对待KO小鼠由疣状对Ki67动物与野生型相比显著降低(图6E)。

    Sequestration of bone morphogenetic protein (BMP)-9 reduces fibrogenesis in vivo. An activin-like kinase 1 (ALK1)-Fc overexpressing adenovirus (AdALK1-Fc) was injected intraperitoneally (once) to mice which additionally received three injections of CCl4 per week for a total of 4 weeks. An adenovirus equal to AdALK1-Fc but lacking the receptor sequence (AdFc) was used as control. (A) CCl4 led to a massive deposition of fibrous matrix within the liver as determined by Sirius red staining which was significantly reduced by co-application of AdALK1-Fc (the graph shows the quantification of the staining intensities). (B) Immunohistochemical stainings for α smooth muscle actin (αSMA) (representative pictures). (C) Real-time PCR analyses using total liver lysates showing that CCl4-mediated fibrogenesis was accompanied by increased expressions of BMP-9, Id1, collagen I and TGF-β mRNAs. All three were reduced significantly by AdALK1-Fc. (D) Immunohistochemical stainings for cleaved caspase-3 (reddish-brown colour), representative pictures and quantification of staining intensities of whole section scans from n=5 animals per group (graph). The arrows point to individual positive cells located along a fibrotic septum. In the AdALK1-Fc group, the amount of cleaved caspase-3 positive staining was significantly reduced.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    封存的骨形成蛋白(BMP) 9减少体内纤维发生。activin-like激酶1 (ALK1) fc overexpressing腺病毒(AdALK1-Fc)腹腔注射(一次)老鼠CCl另外收到三注射4每周总共4周。腺病毒等于AdALK1-Fc但缺乏受体(AdFc)被用来控制序列。(一)创新领导力4导致大量沉积肝脏内的纤维矩阵由天狼星红染色由co-application显著降低AdALK1-Fc(图表显示染色强度的量化)。(B)免疫组织化学染色对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)(代表图片)。(C)实时PCR分析总CCl肝脏溶菌产物显示使用4介导的纤维发生伴随着增加的表情BMP-9,我Id1、胶原蛋白和TGF-β信使rna。所有三个被AdALK1-Fc显著减少。(D)免疫组织化学染色对裂解caspase-3(红褐色的颜色),代表整个部分扫描的图片和量化的染色强度从n = 5每组动物(图)。箭头指向个人阳性细胞位于纤维隔膜。AdALK1-Fc组,裂解caspase-3阳性染色明显减少。

    Bone morphogenetic protein (BMP)-9 knockout mice develop less fibrosis upon CCl4 challenge in vivo. Wild-type or BMP-9 KO mice were injected intraperitoneally with CCl4 or mineral oil for 8 weeks. (A) In the wild-type animals, CCl4 led to a massive deposition of fibrous matrix within the liver as determined by Sirius red staining which was significantly reduced in BMP-9 KO mice (the graph shows the quantification of the staining intensities). (B) Immunohistochemical stainings for α smooth muscle actin (αSMA) (representative pictures and quantification). The photo on the left shows the result of the negative control (no primary antibody added). (C) Investigation of αSMA protein expression by immunoblot analysis (representative western blot plus quantitative densitometric analysis of samples from n=5–10 mice per condition). (D) Expression levels of BMP-9, TGF-β, Collagen I (Col1a1) and Id1 were investigated by real-time PCR in whole liver samples and were normalised to the housekeeping gene Gusb. Data are expressed relative to untreated samples (assigned an arbitrary value of 1) and are mean±SEM. of at least seven animals. (E) Immunohistochemical detection of Ki67 in liver sections. For quantification, positive cells from a total of 16 fields of sections from at least four animals per group were counted and are presented as average±SD.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    Bone morphogenetic protein (BMP)-9 knockout mice develop less fibrosis upon CCl4 challenge in vivo. Wild-type or BMP-9 KO mice were injected intraperitoneally with CCl4 or mineral oil for 8 weeks. (A) In the wild-type animals, CCl4 led to a massive deposition of fibrous matrix within the liver as determined by Sirius red staining which was significantly reduced in BMP-9 KO mice (the graph shows the quantification of the staining intensities). (B) Immunohistochemical stainings for α smooth muscle actin (αSMA) (representative pictures and quantification). The photo on the left shows the result of the negative control (no primary antibody added). (C) Investigation of αSMA protein expression by immunoblot analysis (representative western blot plus quantitative densitometric analysis of samples from n=5–10 mice per condition). (D) Expression levels of BMP-9, TGF-β, Collagen I (Col1a1) and Id1 were investigated by real-time PCR in whole liver samples and were normalised to the housekeeping gene Gusb. Data are expressed relative to untreated samples (assigned an arbitrary value of 1) and are mean±SEM. of at least seven animals. (E) Immunohistochemical detection of Ki67 in liver sections. For quantification, positive cells from a total of 16 fields of sections from at least four animals per group were counted and are presented as average±SD.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    骨形成蛋白(BMP) 9基因敲除小鼠发展CCl少的纤维化4挑战体内。野生型或BMP-9CCl KO小鼠腹腔注射4或矿物油为8周。(A)的野生动物,是创新领导力4导致大量沉积肝脏内的纤维矩阵由天狼星红染色明显减少BMP-9KO小鼠(图表显示染色强度的量化)。(B)免疫组织化学染色对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)(代表图片和量化)。左边的照片显示的结果负控制(没有初级抗体添加)。(C)调查αSMA通过免疫印迹分析蛋白表达(代表免疫印迹+定量光密度分析的样本n = 5 - 10老鼠每条件)。(D)的表达水平BMP-9, TGF-β,胶原蛋白I (Col1a1)和Id1进行了实时PCR在整个肝脏样本和正常的看家基因Gusb。数据是表示相对于未经处理的样品(1)分配一个任意值,均值±SEM。至少有七种动物。(E)免疫组织化学检测肝脏Ki67的部分。量化,阳性细胞从共有16个领域的部分至少四个每组动物数和平均±SD。

    因此,两个不同的实验方法都支持这样的结论:高水平的BMP-9促进三地4诱导肝纤维发生在老鼠身上。

    潜在的BMP-9在人类肝纤维化中的作用

    解决这个问题如果我们的结果与老鼠转移到人类的情况,我们进行免疫染色对BMP-9 cryosections从正常和人类肝脏纤维化(图7)。我们发现阳性染色正常肝之,non-parenchymal细胞和墙壁的大血管,尤其是在HSC的活化(早期的纤维发生)。这种模式非常适合的假设也在人类肝脏肝星状细胞位于正弦曲线和较大的血管壁上BMP-9合成主要是积极的。胆管上皮细胞出现,而负的。符合这一点,在中度纤维化阳性染色发现在这些地区肝星状细胞的激活可以预期。在完全建立纤维septae,染色似乎没那么强烈,但仍然存在。

    Representative examples of immunohistochemical stainings against bone morphogenetic protein (BMP)-9 in cryosections from (A) normal and (B) fibrotic human livers. BD, bile duct.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    代表性的例子免疫组织化学染色对骨形成蛋白(BMP) 9 cryosections从正常(A)和(B)人类肝脏纤维化。BD,胆管。

    搜索时公开阵列数据与人类肝脏样本,我们发现两组调查正常肝样品与HBV-mediated损坏(见在线补充图S6A, B)。BMP-9本身是显著调节急性肝衰竭患者的样本(GSE38941),但不显著改变随着纤维化阶段(GSE84044)。的受体endoglin显著增强的样本纤维化阶段2和4 (GSE84044),但不是在急性肝衰竭队列(GSE38941)。然而,BMP-9受体的表达ALK1显著调节两个组别,表明损伤条件下ALK1-positive细胞的数量,从而BMP-9刺激增长的敏感性和响应性。因此当地海拔BMP-9可能直接影响到细胞的相声,例如,激活肝星状细胞和LSECs之间。

    讨论

    尽管BMP-9由表达健康的肝脏,观察17,19了解其生理功能仍非常有限(审查,请参阅45)。而抑制BMP-9 / ALK1信号已经在癌症作为潜在的抗血管生成策略讨论46和临床应用rhBMP-9最近被视为一个潜在的有前途的新方法,促进骨折愈合,47其可能的角色在急性或慢性肝损伤只是不够了。在目前的工作,因此我们解决这一点和调查BMP-9表达水平,细胞反应和体内的后果BMP-9信号在体外肝细胞以及各种急性和慢性肝损伤小鼠模型。

    HSC的结果表明,(1)是主要的BMP-9-producing肝细胞类型,(2)BMP-9表达式进一步增加当肝星状细胞激活导致更高的水平在纤维发生,(3)中和BMP-9改善纤维发生和(4)BMP-9企稳高碳钢的上皮特性和控制他们的体外和体内增殖早期急性损伤后时间点。

    Profibrogenic BMP-9作用

    发现,肝脏是主要的器官产生BMP-9(至少在健康的条件下)似乎毫无疑问,17,19但确切的肝细胞分泌BMP-9颇有争议的报道。米勒等19发现高BMP-9表达鼠肝脏和指定non-parenchymal细胞(HSC、LSEC和KC),但不像生产高碳钢细胞类型。另一项研究使用人类样本证实肝BMP-9的最高表现,但在分析商业获得多样化的人类肝细胞RNA样本类型(胆管细胞,高碳钢,肝星状细胞和LSECs),他们发现胆管细胞BMP-9表达最高,其次为高碳钢和唯一,而在肝星状细胞和LSECs低表达。17我们的结果证实了米勒的数据等19显示最高BMP-9转录表达在肝星状细胞(图1),高碳钢,相比之下,表达很低,几乎检测不到的水平。尽管我们没有发现证据的直接增强体外激活(没有明显的诱导aSMA,胶原蛋白我,纤连蛋白或PdgfbBMP-9 mRNA表达的刺激,也没有减少Pparγ;图1H I),显然这些细胞产生BMP-9在静止条件下,进一步加强对体外成纤维细胞的激活(图1B、C)。这项发现暗示肝脏纤维发生可能伴随着增强BMP-9体内的存在。一致,BMP-9及其直接目标基因Id1强烈纤维化肝脏转录水平的调节CCl不断接受注射的老鼠4(图5 c和6D)。我们进一步增强文档HSC BMP-9迁移和扩散。在此基础上,增加BMP-9从激活肝星状细胞分泌,在高水平的BMP-9在肝损伤的肝纤维化发展可以预期,确实是纤维组织化学染色观察到人类肝脏样本(图7)。分析如果BMP-9表达升高确实功能与纤维发生慢性损伤的条件下(CCl重复注射4),我们使用两种不同的方法:首先,我们adenovirally中也是一种可溶性BMP-9受体ALK1(通过AdALK1-Fc),从而中和BMP-9结合蛋白质。因为无论是TGF-β还是其他的每个(BMP-10除外)施加高亲和力独自ALK1(在缺乏II型受体),ALK1-Fc选择性中和BMP-9(见在线补充图S4)。在第二种方法中,我们使用BMP-9 KO小鼠。CCl重复注射4几个星期以来,所有小鼠肝纤维化发展。BMP-9中和时(通过ALK1-Fc)或没有(KO小鼠),纤维化程度明显减少(图5和6)。这些数据表明,在慢性肝损伤,BMP-9加剧肝纤维发生体内。底层机制很可能涉及增强激活肝星状细胞的迁移和增殖(图1d),至少在AdALK1-Fc模型还感应Id1的我们之前已经确认为一个fibrosis-regulating因素。27CCl KO小鼠治疗4,Id1表达式仍显著调节(图6D)可以适应过程的结果可能会发生在这些老鼠。因为LSECs可以直接控制HSC激活48和BMP-9受体ALK1高度表达的新孤立LSECs(见在线吗补充图S2), profibrogenic BMP-9的影响,我们观察到的结果也可能是细胞肝星状细胞和LSECs之间的串扰。符合这一假设,我们发现显著增强ALK1表达在纤维化的人类样本来源于公开可用的数组数据与人类肝脏样本(GSE38941 GSE84044;在线补充图S6A, B)暗示的敏感性肝细胞与纤维发生BMP-9刺激应该增加。

    BMP-9函数作为稳定器的HC上皮属性

    完善,孤立的高碳钢在文化迅速失去上皮细胞和功能性质,他们自发地接受对一种间充质细胞去分化的过程。40,41这个过程,这对EMT的特性,进一步加强在TGF-β的存在。40EMT,高碳钢许多酶和基因的表达下调表达所需的合适的肝脏的代谢功能。这些发现的结论是,只有两极分化(上皮)高碳钢外源性物质或内源性物质能够有效地处理。另一方面,条件下损伤或恶性转化的高碳钢,EMT使细胞增殖并成为能动的。BMP-9施加显著的抗增殖和anti-EMT活动主要体外培养小鼠高碳钢(见图2B、C和在线补充图S3)。此外,BMP-9导致增强和保存的重要药物的新陈代谢酶的表达,特别是细胞色素P450氧化酶类(图2D)和BMP-9 KO高碳钢上皮和间叶细胞标志物表达显著低于野生型细胞(图2E)。这些研究表明基底存在BMP-9健康肝脏实质细胞的维护功能。然而,自从BMP-9基因敲除小鼠是可行的和肥沃的,没有明显的表型,12这些基本的肝脏功能BMP-9似乎很大程度上可有可无的或可以被其他补偿,目前不确定因素或机制。

    我们观察到BMP-9充当抗增殖和稳定因素主要高碳钢适合其之前报道性质的“静止的因素”(健康)上皮细胞。20.然而,我们也和其他报道EMT-promoting BMP-9对肝癌细胞的影响。6,26这,一起发现BMP-9中和剂已经在临床试验中作为抗血管生成与癌症增长战略,46使我们得出结论,至少在高碳钢和内皮细胞,BMP-9产生完全相反的功能在恶性和良性的条件。从力学上看这些对立的功能是如何调节和控制尚不清楚,但可能与不同表达水平的个人受体和辅助因子,或可能带来的相声BMP-9信号与其他通路。

    在急性肝损伤,BMP-9需要暂时性的表达下调

    然后我们调查了肝BMP-9表达水平的三种不同的急性肝损伤小鼠模型/再生,即PH值和单注射CCl有限合伙人或4。在这些模型中,我们发现瞬态减少BMP-9表达水平在早期的时间点(图3a - c)。

    考虑到几乎任何一种肝损伤与增加gut-derived细菌毒素如血液中有限合伙人,调查我们可以想见,这种效应的急性肝损伤BMP-9表达可能是由于抑制LPS对肝星状细胞的影响,代表BMP-9的主要来源(图1),符合这一假设有限合伙人BMP-9水平的差别导致了对这些治疗在肝组织体内(图3B)和强烈抑制BMP-9表达水平在肝星状细胞(图3D)体外。类似;正弦内皮细胞、肝星状细胞也表达了LPS受体Toll样受体(TLR) 4和应对有限合伙人治疗炎性信号。54我们进一步发现,这种下降抵消BMP-9体内PH值导致显著提高肝损伤后2天(图4)。按照上述抗增殖效果BMP-9高碳钢,这些动物显示Mki67-positive水平的降低细胞(图4B)。这是伴随着显著调节proproliferative细胞因子的表达式VEGF和CTGF信使rna (图4C),这可能是一种补偿BMP-9抗增殖作用的机制。

    这些数据支持这一概念,快速减少BMP-9表达式(可能通过有限合伙人)急性损伤后可能需要允许瞬态HC核扩散和可塑性,功能必不可少的最佳的伤口愈合。正在进行的研究旨在进一步分析BMP-9的相互作用与有限合伙人及其可能在调节肝脏的炎症过程中的作用。

    慢性损伤的条件下(CCl重复注射4)、缺席或中和BMP-9减少纤维发生,在这种情况下整体扩散也降低(图5D)表明抗增殖BMP-9对高碳钢的影响可能比在慢性急性损伤过程中相当重要。这个假设是我们观察到的快速支持减少BMP-9表达式在急性损伤的三种模式(图3两者都与HC扩散的发作(图3B),类似于以前Mogler发表的结果等29日和Hoehme等43。

    乍一看,这似乎矛盾BMP-9一方面优化HC两极分化和功能,但另一方面高水平的BMP-9似乎普遍提高肝损伤。我们认为BMP-9作为稳定器的功能parenchyma-although可能有益的健康形势可能成为阻碍的条件下的损伤,在行为扩散和可塑性等本质上是必要的,至少是暂时性的。此外,它似乎很可能BMP-9可能间接影响其他BMP-9-responsive HSC激活和纤维发生了作用于肝细胞类型,像LSEC,我们都表现出表达更高水平的测试比HSC BMP-9受体(见在线补充图S2)。例如,capillarisation LSECs,功能与肝损伤包括纤维发生有关,55,56可能是受到高水平的BMP-9的影响。

    总之,我们的数据表明,增加水平的条件下BMP-9伤害肝脏纤维发生铺平了道路,而缺乏或抑制BMP-9支持伤口愈合和肝再生之路。如果这个概念可以进一步证实在人类,中和BMP-9可能成为重要的治疗方法的效率最大化antifibrotic药物的肝脏,甚至其他器官。一定程度的破坏,甚至是唯一的,瞬态抑制内源性BMP-9活动可能足以允许更好的肝再生和愈合。

    确认

    作者感谢亚历山德拉•穆勒,凯蒂•阿布拉莫维奇和夫人艾米奈Tuezen(在曼海姆大学医院)和伊戈尔·利伯曼(博士Margarete Fischer-Bosch临床药理研究所斯图加特,德国)优秀技术援助和安妮Dropmann(在曼海姆大学医院)提供TGF-β1引物序列。

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    脚注

    • 厘米,CK、HG、AA共享第二作者。SD,输配电共享的资深作者。

    • 贡献者KB-H, SD和输配电的研究计划和负责的整体内容。实验通过KB-H,芝加哥商品交易所,CK, HG, AA,太,电子战,QL,弗兰克-威廉姆斯,CH, MH, SM-B,是的,MG, LJACH, SL, MW, CMo, CC、CE和黑洞。报告的数据和写作手稿是由KB-H,芝加哥商品交易所,HG,电子战,CH,导航,日本国债,SM-B,英国,是的,LJACH,厘米,迈普,黑洞,哈,,SD和输配电。

    • 资金这项研究是由荷兰癌症基因组学中心和itn fp7 -人- 2012之下完成(SD、AA、输配电、BH)。这项研究进一步支持了罗伯特•博世基金会斯图加特,德国,和德国研究基金会;合同授予数字:“He2458/18-1”和“Do373/8-1”以及美国联邦教育部和研究资助“虚拟肝脏”和“LiSyM”(SD)。QL支持的是一位中国奖学金委员会和CC的奖学金从吴斤任分钟医院,中国。支持厘米德意志Forschungsgemeinschaft (Me4532/1-1)。AA是ESR ITN(早期研究员)。KB-H进一步支持的“Forderprogramm ZIM des BMWi”(KF3431901AJ4)和项目“Entwicklung冯Alternativmethoden苏珥Vermeidung冯Tierversuchen”授予的“Ministerium毛皮科学大幅减退和Kunst巴登-符腾堡州”。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 伦理批准国家肿瘤中心组织银行的疾病(NCT、海德堡、德国)按照规定组织的银行和海德堡大学的伦理委员会批准(Ethikvotes # 206/207年:2005)。

    • 出处和同行评议不是委托;外部同行评议。