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摘要
客观的绝大多数结直肠癌病例是由腺瘤性大肠息肉病引起的异常Wnt/β-catenin信号传导(APC)或CTNNB1突变。然而，人类结肠肿瘤的一个子集，相互排斥APC而且CTNNB1突变，基因融合RSPO2或RSPO3,导致这些R-spondin基因的表达增强。这表明棕榈油激活可以替代最常见的突变，成为肠癌的另一种驱动因素。RSPO3参与肿瘤生长最近在RSPO3-融合阳性异种移植模型。目前的研究确定了仅RSPO3的增加实际上在多大程度上以直接的、因果的方式作为肠癌的驱动因素，并同时解决了RSPO3的体内活动。
设计我们生成了一个条件Rspo3转基因小鼠模型Rspo3转基因基因在Cre活性上表达。Cre由与Lgr5就-GFP-CreERT2老鼠。
结果在体内Rspo3表达，小鼠迅速发展广泛的增生性，腺瘤和腺癌病变遍及整个肠道。RSPO3诱导Lgr5的扩增+干细胞，Paneth细胞，非Paneth细胞标签保持细胞和Lgr4+细胞，从而促进肠干细胞和生态位室。后Wnt/β-catenin信号传导略有增加Rspo3表达和突变体喀斯特把与Rspo3在增生性生长中。
结论我们提供的体内证据表明，RSPO3刺激隐窝干细胞和小生境隔间，并推动快速肠道肿瘤的发生。这证实了RSPO3是肠癌的有效驱动因素，并提出了RSPO3作为结直肠癌患者治疗的候选靶点RSPO3融合。
- 癌症
- 肠干细胞
- 信号
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本研究的意义
关于这个问题我们已经知道了什么?
Wnt/β-catenin信号通路过度激活APC或CTNNB1突变是大多数结直肠癌病例的基础。
人类结肠肿瘤的一个子集包含基因融合RSPO2或RSPO3，与这些基因的表达增强有关。
R-spondin蛋白促进Wnt/β-catenin信号通路。
抑制RSPO3减少现有的生长RSPO3异种移植模型中的-融合阳性肿瘤。
新的发现是什么?
Rspo3RSPO3的表达导致肠腺瘤和腺癌的快速发展，这表明RSPO3是肠癌的有效致病因素。RSPO3驱动广泛的隐窝增生和扩展多种隐窝成分，包括Lgr5+干细胞，Paneth细胞，非Paneth细胞标签保持细胞和Lgr4+细胞。
rspo3诱导的表型与Wnt/β-catenin信号的适度增加有关。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
RSPO3刺激隐窝干细胞和小生境细胞，并积极推动肿瘤发生的能力，提出了RSPO3作为结直肠癌患者治疗的有用候选靶点RSPO3融合。
简介
虽然在大多数结直肠癌病例中，Wnt/β-catenin通路通过腺瘤性大肠息肉病的突变而解除调控(APC)或β-连环蛋白(CTNNB1),两项研究报告了R-spondin家族成员的基因融合RSPO2而且RSPO3在人类结肠肿瘤的一个子集中，伴随着这些基因的增强表达。1，2R-spondins是肠道中由LGR5和LGR4代表的富含亮氨酸的含有重复的g蛋白偶联受体(LGR)结合后增强Wnt/β-catenin信号传递的分泌蛋白。LGR5主要标记隐窝底部的循环干细胞，为肠上皮的持续更新提供燃料，而LGR4存在于整个隐窝，在循环干细胞、瞬时扩增细胞和潘氏细胞上。3.，4潘氏细胞通过为干细胞提供支持生态位，在肠隐窝中发挥关键作用。5除了循环干细胞外，还发现了更多的静态+4干细胞的共表达Lgr5就和潘氏细胞标记物。6 - 8这些标签保持细胞(LRCs)作为潘氏细胞前体和“储备”干细胞，能够在损伤后获得循环能力。7，8
RSPO2而且RSPO3融合是互斥的APC而且CTNNB1这表明RSPO的增加可以替代这些最常见的突变，成为肠道肿瘤发生的另一种驱动因素。1此外，所有的棕榈油-融合阳性的结肠肿瘤被描述为其中一种突变喀斯特或BRAF，这些突变经常同时发生APC以及突变设置。1RSPO3参与已有肿瘤的生长最近在RSPO3-融合阳性的异种移植物模型，其中抗rspo3治疗抑制肿瘤生长。9，10RSPO3的增加是否真的具有作为肠癌的因果驱动因素的效力仍有待确定。在这里，我们证明了RSPO3是一种致癌驱动因素，迅速引起肠癌和广泛的隐窝增生，同时刺激干细胞和支持性小生境细胞。
结果
Rspo3表达诱导广泛的肠道增生和肿瘤发生
为了研究RSPO3增加的体内后果，我们生成了一个条件Rspo3转基因小鼠模型。用过的Rspo3通过β-catenin荧光素酶报告试验，转基因被验证为编码分泌和生物活性的RSPO3蛋白补充图S1A)。在生成鼠标模型时，Rspo3编码序列插入方向相反，两侧有两对方向相反、同源的序列液态氧网站和背后无处不在的CAGGS启动器(图1并在网上查看补充图印地)。此设计支持条件Rspo3对Cre活性的表达。Cre是通过交叉我们的Rspo3invf / +(Rspo3发票)老鼠到Lgr5就-GFP-CreERT2老鼠(Lgr5就)11诱导型Cre的活化ERT2除非另有说明，2月龄时通过注射他莫昔芬实现重组酶。单转基因Lgr5和Rspo3发票动物作为对照，并作为双转基因Lgr5;Rspo3小鼠处理。高效表达感定向转基因Rspo3经他莫昔芬注射后，在双转基因Lgr5;Rspo3动物中被证实，仅存在于整个小肠和大肠中(见在线补充图S1D)。相应地，我们确认了仅在双转基因小鼠中观察到的RSPO3蛋白表达补充图S1E)。
简化的原理图表示Rspo3发票小鼠模型。的Rspo3编码序列插入在反向方向的两对反向方向之间液态氧网站和后面的CAGGS启动器。Cre活性引起的反转Rspo3用其中一个同源基因转化为意义取向LoxP或Lox511成对，导致中间两个转基因Rspo3产品。后续切除的其余序列之间的同源液态氧网站现在在同一方向上提供了一种具有意义导向的产品，不可逆Rspo3表达式。中间和锁定Rspo3重组产物编码Rspo3信使rna。
转基因Rspo3在双转基因动物中，表达后几周内可引起腹部肿大和直肠脱垂，促使其在诱导后2个月内进行分析。Lgr5;Rspo3小鼠的肠道出现拉长和膨胀，显微镜分析显示由广泛上皮增生引起的粘膜增厚(图2A, B).这种强大的表型仅在所有双转基因动物中观察到。增生性病变从隐窝向上延伸至管腔，与先前存在的绒毛结合，表现为多发微腺瘤结节，典型表现为潘氏细胞脱位、高有丝分裂率和局部坏死改变(图2B, C)。这些病变遍及整个小肠、盲肠和近端结肠(见网上)补充图S2A)。此外，大多数动物患上腺瘤(图2D)，有些甚至发展为腺癌，表现为局部浸润(图2E)。平均每只Lgr5;Rspo3小鼠检测到2.5(±2.3)个肿瘤，主要是腺瘤，大多数发生在空肠、回肠和盲肠(图2F, G)。25日龄注射他莫昔芬时，表型和肿瘤发病率(平均2.6±2.4，见在线补充图S2B)与2月龄时注射的小鼠相当。这些数据提供了证据Rspo3驱动快速的肠道肿瘤和广泛的增生性生长。
Rspo3诱导广泛的肠道增生和肿瘤发生。(A) Rspo3小肠H&E染色发票对照组和(B-E) Lgr5;Rspo3小鼠，包括(C)增生性、(D)腺瘤性和(E)腺癌性生长的代表性例子，(C -E)下面板显示框区增大。(F) Lgr5;Rspo3动物(n=16)的肿瘤发生率(F)每只小鼠的肿瘤数量，表示中位数的线，(G)肿瘤分布(每个区域检测到的肿瘤的百分比)。
RSPO3膨胀Lgr5+干细胞和潘氏细胞
我们通过绿色荧光蛋白(GFP)染色检测隐窝细胞的发生Lgr5就- - -GFP-CreERT2表达细胞和表示潘氏细胞的溶菌酶。在Lgr5对照组小鼠中，我们观察到GFP在隐窝底干细胞中以随机方式表达，如已报道的(图3上面的面板)。11在Lgr5;Rspo3动物的肠道中，我们注意到Lgr5- gfp的扩张+增生性及肿瘤性病变的干细胞带(图3A).与此同时，我们观察到的Paneth细胞丰度明显增加Rspo3Lgr5;Rspo3小鼠(图3B). Paneth细胞脱位，向腔内更高的方向呈现，高于Lgr5+细胞。更具体地说，在腺瘤中，观察到Paneth细胞分散在整个肿瘤中，而lgr5阳性细胞主要存在于这些病变的下部。值得注意的是，Paneth细胞明显地出现在腺癌病变的侵袭前部，Lgr5也是如此+细胞虽然不太一致。即使在大肠近端，RSPO3也诱导了溶菌酶阳性潘氏细胞的出现，而这种细胞通常在小鼠大肠中是不存在的(图3C).根据观察到的异常生长和隐窝扩张Rspo3细胞增殖明显增强，sox9阳性细胞数量(图4A, B).在一些Paneth细胞中检测到核β-catenin，但转基因几乎没有影响Rspo3表达式(图4C)，表明在我们的Lgr5;Rspo3模型中Wnt/β-catenin信号通路相对温和的增加Apc突变小鼠模型。事实上，我们确实在年龄和背景匹配的肿瘤中检测到清晰的核β-连环蛋白Apc最小值老鼠(见网上补充图S3A)。总之，RSPO3在小鼠肠道中引起增生性、腺瘤性和腺癌性生长，并伴随着隐窝室的扩张，包括Lgr5+干细胞，潘氏细胞和增生性祖细胞。
Rspo3诱导Lgr5干细胞和Paneth细胞的扩增。小肠代表性增生性和肿瘤性病变(A) GFP和(B)溶菌酶免疫组化染色。(C)溶菌酶染色显示增厚的近端结肠(中间图)和盲肠-结肠过渡的腺瘤(下图)的Paneth细胞化生。
Rspo3 -诱导病变具有高度增殖性。免疫组化染色(A) Ki67， (B) Sox9， (C) β-catenin具有代表性Rspo3全身的病变。在Paneth细胞中，除了轻度核检测外，插入物显示主要的膜性β-catenin表达。
RSPO3引起额外隐窝细胞类型的扩增
在ApcLgr5细胞的缺失+干细胞已被报道为发展中的腺瘤的起源细胞。12，13我们进行了谱系追踪实验，以检查可能的Lgr5+干细胞的衍生Rspo3 -引起病变。将Lgr5;Rspo3小鼠与mTmG Cre报告小鼠杂交，在Cre介导的转换后，能够检测到后代中强烈的GFP信号，与来自mTmG Cre报告小鼠的较弱GFP染色有很好的区别Lgr5就-GFP-CreERT2录音带。在没有转基因的Lgr5;mTmG小鼠中Rspo3，绿色荧光带嗨染色从隐窝向上进入绒毛(图5A).然而，在Rspo3表达整体发生的GFP嗨细胞似乎减少，出现频率较低，只在小病灶，留下绝大多数Rspo3-引起的增生及无法追踪的肿瘤(图5A).在谱系追踪方面也观察到了类似的减少Rspo3用Rosa26-LacZ小鼠作为Cre报告子表达(图5B).尽管Cre的随机表达和次优效率可能导致lgr5衍生谱系追踪的代表性不足，但这对于表达和缺乏转基因的小鼠都是如此Rspo3，因此不能解释的相对减少Lgr5就- cred驱动的沿袭跟踪Rspo3表达的小鼠。这表明Lgr5 .+细胞不是唯一的起源细胞，在细胞的发育过程中必须有其他的细胞类型Rspo3借病变。
Rspo3扩展其他隐窝细胞类型。(A)转基因或非转基因Lgr5小鼠小肠GFP免疫染色Rspo3。绿色荧光蛋白高细胞显示mTmG报告活性，与GFP不同中期细胞来源于Lgr5就-GFP-CreERT2录音带。(B)转基因或非转基因Lgr5;R26-LacZ小鼠的X-gal染色Rspo3．原位杂交显示Lgr4而且Lgr5就mRNA表达(C)Rspo3 -Lgr5诱导腺瘤;Rspo3小鼠和(D)人异种移植RSPO3-融合阳性的结肠癌。(E)重复注射BrDU 2周后，溴脱氧尿苷(BrDU)-溶菌酶双免疫染色在Lgr5单一和Lgr5;Rspo3双转基因空肠中的代表性例子。箭头表示溶菌酶阳性标记保留细胞(LRCs)(黑色)和溶菌酶阴性标记保留细胞(灰色)。(F)空肠中保留BrDU的细胞定量，溶菌酶阴性或溶菌酶阳性(BrDU后2周)，显示三个独立实验的平均值和SDs。*p<0.05， **p<0.01，学生t检验。
鉴于RSPO3是一种分泌蛋白，它很可能不仅以自分泌的方式作用于表达LGR5和LGR4受体的相邻细胞，而且还以旁分泌的方式起作用。Lgr4已报道在整个隐窝室表达，存在于隐窝基底柱状细胞、Paneth细胞和瞬时扩增细胞上。4Lgr4原位杂交显示Lgr4+细胞在整个细胞中大量出现Rspo3-诱导的病变，证明这些细胞的有效扩张Rspo3表达式(图5C). Lgr4的丰度+细胞与更稀疏的Lgr5形成对比+细胞局限于病变基底(图3 b而且5C).重要的是，LGR4的可比分布格局+和LGR5就+细胞观察到异种移植RSPO3-融合阳性的人类结肠肿瘤。在这些患者源性肿瘤中，LGR5就表达有限且集中，然而LGR4在整个肿瘤中大量表达，证实了LGR4+人体环境中的细胞(图5D)。
除了循环干细胞外，最近还发现了更多共表达的静止干细胞Lgr5就和潘氏细胞标记物。与隐窝底干细胞相反，这些细胞具有标签保留性，这一特征也适用于潘氏细胞。此外，这些位于+4位置的静止细胞作为潘氏细胞前体和“储备”干细胞，在特定情况下获得循环干细胞的能力。7，8为了研究RSPO3对这些静止细胞的影响，我们进行了重复的溴脱氧尿苷(BrDU)注射，并允许标签保留1周或2周，这是我们在给定条件下所能达到的最大值Rspo3 -诱导发病率。随后，对BrDU和溶菌酶进行双染色，以区分非Paneth细胞和Paneth细胞的lrc。转基因Rspo3BrDU注射后1周和2周，表达明显增强了总lrc的存在(见在线补充图S3B和图5E, F)。此外，在这些lrc中，溶菌酶阴性的lrc尤其增强Rspo3表达，表明非潘氏细胞LRCs的相对增加，或者，可能获得干细胞活性的假定潘氏细胞前体。
这些数据都表明了这一点Rspo3诱导仅部分源自Lgr5的病变+细胞，但同时导致Lgr4大量扩增+细胞，保持标记的潘氏细胞及其假定的静止前体。
RSPO3施加隐窝相关基因表达谱
对空肠组织Lgr5和Rspo3进行RNAseq分析发票单转基因对照小鼠和Lgr5;双转基因Rspo3动物(每个基因型n=8)。基因表达谱的无监督聚类显示Lgr5紧密聚类;Rspo3组织(见在线补充图S4)。Lgr5和Rspo3发票单个转基因对照聚集在一起，表明它们的相似性，并证明将它们作为对照。我们发现587个差异表达基因，其中255个增加，332个减少(图6A，过滤后p<0.05，折叠变化>1.5)。基因本体论分析显示，最显著富集分子和细胞功能Rspo3表达与细胞生长、增殖、运动和信号传导有关(图6B). Wnt/β-catenin信号通路是第二显著上调的信号通路，而磷脂酶基因表达增加Pla2g5，Pla2g2a，Pla2g2f, Pla2g4c而且Pla2g12a除轴突引导通路(图6B和网上看补充图S5A)。仔细观察肠道中与细胞增殖、生长和Wnt/β-catenin信号传导有关的单个基因，我们发现上调基因中有一个广泛的基因组。除了12个上调的Wnt信号相关基因外，我们还观察到隐窝干细胞标记物转录增加Ascl2，Hopx，Cdca7，Tnfrsf19而且Msi1和潘氏细胞相关基因Lyz1而且Pla2g2a（图6C)， Also, enhancedLgr4与上述Lgr4的扩增相对应+细胞。相反，非隐窝细胞系分化标记下调，其中姐姐而且Muc2，最显著的下调功能涉及代谢和相关信号通路(见在线补充图S5B-D)。这些表达数据与我们发现的异常细胞生长和隐窝增生相符，包括Lgr4的扩增+同时也表明Wnt/β-catenin信号显著增加。
Rspo3诱导隐窝相关基因表达谱。(A)每个样本归一化表达值的热图(每个基因型2log, n=8)，包括转基因后的差异表达基因Rspo3表达(过滤后p<0.05，折叠变化>1.5)。(B)基因本体分析显示最显著增强的分子和细胞功能(上表)和信号通路(下表)Rspo3表达式。灰色点表示每个信号通路的基因比例。(C) Wnt通路和隐窝相关基因富集Rspo3表达式。(D) Lgr5对照或Lgr5的Lgr5- gfp和Paneth细胞的相对RNA表达水平;qPCR测定的Rspo3转基因小鼠。柱状图表示在独立实验中，每个基因型分类的三只小鼠的SDs的平均值。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001，学生t检验。
为了评估隐窝相关基因mRNA水平的升高是否仅仅反映了隐窝细胞的扩张，还是也与细胞水平上的基因表达差异有关，我们用流式细胞术对Lgr5-GFP干细胞和Paneth细胞进行了分类6Lgr5单转基因对照和Lgr5;Rspo3双转基因小鼠。Lgr5和溶菌酶的表达分别局限于分类后的Lgr5- gfp和Paneth细胞群，证实了分类后细胞的正确身份。基因表达定量PCR分析显示干细胞标记物表达增强Lgr5就，Ascl2而且Prom1Lgr5排序+转基因干细胞Rspo3转基因Paneth细胞溶菌酶表达水平升高。有趣的是，Wnt靶向基因轴蛋白2，Cd44，Lef1而且Sox9不仅在Lgr5中上调+干细胞，但也在潘氏细胞中，就像这种情况一样Lgr4也这些数据表明，RSPO3通过扩大相关细胞的群体，并在细胞水平上刺激这些干性相关基因的表达，促进Wnt靶基因、干细胞和Paneth细胞基因的表达。
RSPO3改变类器官形态，使rspo1独立生长
在研究Lgr5;Rspo3转基因小鼠肠道类器官的生长时，我们注意到，在播种后不久，绝大多数Lgr5;Rspo3转基因类器官典型地表现为大囊肿或球体，正如在其他Wnt激活培养条件中所描述的那样5与对照类器官的外观明显不同(图7A, B). Lgr5;Rspo3球不会随着时间的推移保持这种囊性表型，而是在几天后显示隐窝出芽和分化。Lgr5发育隐窝区;Rspo3类器官形态异常，管腔开放且相对较大(图7A, B和网上看补充图S6)。此外，对照类器官在培养基Lgr5的外源RSPO1耗损后迅速死亡;Rspo3类器官存活下来并保持了它们在RSPO1存在时观察到的典型形态表型(图7C)，表明转基因RSPO3对外源RSPO1的功能替代。Ki67染色证实Lgr5;Rspo3类器官在无外源RSPO1的情况下具有良好的增殖能力(图7D)。
RSPO3改变类器官形态，允许rspo1独立生长。(A)从对照组和Lgr5;Rspo3转基因小鼠中生长的类器官，在播种后2天(上)和5天(下)，显示出球形生长增加，隐窝形成异常和开放的管腔Rspo3表达式。(B)培养中总类器官球体的百分比，柱状图表示最少三次实验中SDs的平均值。*p<0.05， **p<0.01，学生t检验。(C)来自对照小鼠的类器官随着外源RSPO1的消耗而分解，而Lgr5;Rspo3类器官存活下来并表现出与外源RSPO1相似的表型。(D) Ki67染色显示对照与Lgr5的无增殖和有增殖;分别为无外源RSPO1的Rspo3类器官。
突变体喀斯特增强rspo3诱导的增生性，但不影响肿瘤生长
所有人类结肠肿瘤RSPO2或RSPO3融合转录本在两者中都有突变喀斯特或BRAF。1探讨突变体的相关性喀斯特在增强的RSPO3环境下，我们将Lgr5; RSPO3小鼠与喀斯特G12V老鼠。F1杂交后代25日龄注射他莫昔芬，激活Cre，使其表达Rspo3以及突变体喀斯特等位基因。表达两者的三种转基因小鼠Rspo3和变异喀斯特(Lgr5;Rspo3;Kras基因型)似乎比相应的Lgr5;Rspo3对照组更病态，尽管Lgr5;Rspo3;Kras和Lgr5;Rspo3队列之间的生存率没有显著差异(见在线补充图S7)。Lgr5;Kras小鼠没有发病的迹象，因此，肠道的显微镜分析显示没有表型改变(图8A).然而，突变喀斯特活化与转基因结合Rspo3表达显示增生性表型严重程度增加(图8A)表示突变体喀斯特和RSPO3协同刺激增生性生长。相比之下，Lgr5;Rspo3和Lgr5;Rspo3;Kras组(图8B).仅限于Lgr5;Rspo3;Kras队列，我们观察到3例腺瘤病，在这些病例中，动物在整个小肠中表现出多个腺瘤性病变，相互融合，阻碍了准确的定量。鉴于突变体之间的协同效应喀斯特和变异ApcWnt/β-catenin信号通路14我们对转基因小鼠的肠道进行免疫组化β-catenin染色Rspo3有无突变喀斯特（图8C).在Lgr5;Rspo3和Lgr5;Rspo3;Kras肠中均未观察到β-catenin的核易位。相应的，qPCR分析显示RSPO3增加了Axin2, Cd44, Sox9而且Rnf43，而是突变体的共表达喀斯特等位基因来自Lgr5就- - -GFP-CreERT2细胞没有进一步提高表达水平(图8D).这些数据共同表明，在该小鼠模型中，当Lgr5表达时+细胞突变喀斯特在增生性生长中与RSPO3协同，但在促进Wnt信号或肿瘤发生中不协同。
突变体喀斯特而且Rspo3增殖性生长协同作用，但不是肿瘤生长。(A) Lgr5;Kras, Lgr5;Rspo3和Lgr5;Rspo3;Kras小鼠小肠H&E染色，显示三重转基因小鼠的增生表型增强。最右边的面板显示了Lgr5;Rspo3;Kras小鼠中观察到的腺瘤病的代表性例子。(B) Lgr5;Rspo3和Lgr5;Rspo3;Kras小鼠中观察到的腺瘤(左图)和腺癌(右图)数量，显示中位数的线。开放三角形表示腺瘤病病例，其中肿瘤数量估计≥20。(C) Lgr5、Rspo3和Lgr5、Rspo3、Kras小鼠小肠代表性肿瘤病灶的β-catenin免疫染色。结果表明，突变体对细胞核β-catenin检测无影响喀斯特．(D)空肠中Wnt靶基因的相对表达(每个基因型n=8)。**p<0.01， ***p<0.001，学生t检验。
讨论
认识到…的突出作用APC而且CTNNB1许多小鼠研究已经调查了激活相关Wnt/β-catenin信号通路的影响，显示出增殖和致瘤表型。12，15至21基因融合导致增强RSPO3已提出的表达式作为一个可能的替代这些最常见的APC或CTNNB1诱发肠癌的突变途径。1我们展示了转基因Rspo3表达诱导增殖表型类似于其他Wnt激活小鼠模型。此外，我们提供了体内证据，表明RSPO3刺激干细胞和小生境隔间，并推动快速肠道肿瘤的发生。根据Wnt/β-catenin促进R-spondin活性的报道，转基因Rspo3表达增强了Wnt信号通路，从多基因表达分析和囊性类器官形态可以明显看出。我们证实RSPO3增强了Lgr5中Wnt/β-catenin信号通路+干细胞和潘氏细胞。尽管如此，我们在rspo3诱导的病变中几乎没有观察到β-catenin的核易位，这表明Wnt信号的增益相对较低，特别是与Apc突变小鼠模型。在这方面，研究替代信号因子的参与可能是有趣的，五个磷脂酶基因的集体增加提出了这些有趣的候选。其中,Pla2g2a最近被描述为重要的调节干细胞利基因子。22
因此，虽然RSPO3将Wnt/β-catenin信号传导提高到相对适度的水平，但它有效地推动了肿瘤的发生。重要的是，我们的数据还表明，RSPO3导致Lgr5的扩张+干细胞，潘氏细胞，Lgr4+细胞和lrc。RSPO3能够通过促进干细胞和小生境细胞的Wnt信号传导并引起它们的扩张来刺激干细胞和小生境细胞，这可能为RSPO3提供了致瘤潜力。毕竟，对干细胞及其生态位细胞的持续过度刺激为异常的、不受控制的组织生长提供了坚实的基础。最近的研究发现，抗rspo3治疗现有的rspo3融合阳性的肿瘤异种移植可抑制肿瘤生长并降低干细胞标记物的表达。9，10我们证明RSPO3对茎干的刺激超越了对Lgr5的刺激+干细胞本身，包括Lgr4的刺激+细胞，潘氏细胞及其推测的前体。除了提供Lgr5+具有干细胞支持生态位的干细胞，确定这些替代的、扩展的细胞类型是否作为细胞来源有助于rspo3驱动的肿瘤发生是有兴趣的。在这方面，从Lgr5中观察到非常有限的谱系追踪+细胞在rspo3诱导的病变，表明病变来源于替代细胞类型。支持的是，静止的潘氏细胞前体已被描述为在组织损伤时获得循环干细胞特性，作为储备干细胞库，更多分化的肠细胞类型已被证明在特定情况下充当肿瘤起始细胞。8，19，23
综上所述，我们证明了RSPO3刺激Lgr5+干细胞，Lgr4+通过引起细胞的扩张以及促进相关基因(包括Wnt/β-catenin信号基因)的表达，可以抑制细胞、Paneth细胞及其假定的静止前体。考虑到R-spondins是分泌蛋白，这意味着RSPO3可能潜在地影响大肠癌患者中广泛的干细胞和小生境细胞类型RSPO3融合。不幸的是，迄今为止，除了人类结肠肿瘤的一部分含有潘氏细胞外，关于替代干细胞、潘氏细胞及其前体在人类结肠中的发生和功能的知识并不多，而且它们在腺瘤中的存在与发生其他结肠腺瘤的风险增加有关。16，24，25我们提供了体内证据，表明RSPO3刺激肠道干细胞和小生境区室，并推动肿瘤的快速发生，提出RSPO3作为大肠癌携带者的一个有前途的候选治疗靶点RSPO3融合。
材料与方法
生成Rspo3发票转基因小鼠模型
详细的说明了生成的Rspo3的条件表达式Rspo3Cre激活后，生成FVB.129P2-Gt(Rosa)26Sor6 (CAG-Rspo3) Nki/A (MGI:5697338，缩写为Rspo3发票)转基因创始人菌株在在线补充信息中提供。不久,Rspo3将编码序列以反义方向插入两组非同源序列之间液态氧位点以头对头的方向，3 '到CAGGS启动子的一个Rosa26基因靶向盒。26获得的Rspo3发票构造(图1并在网上查看补充图S1A)通过电穿孔法导入129株衍生的IB10 E14ES细胞，选择胚胎干(ES)细胞注入129/Ola囊胚。方正菌株回交5次至129/Ola，随后回交9代以上至FVB。
小鼠品系和治疗
所有小鼠品系均保持杂合。的Rspo3发票通过与小鼠杂交，为小鼠提供诱导型CreLgr5就-GFP-CreERT2转基因小鼠11在FVB背景。单双转基因子代在2月龄时腹腔注射他莫昔芬(200 μ L 10 mg/mL玉米油)激活Cre, 1-2个月后分析，除非另有说明。BrDU通过腹腔注射100 μ L (10 mg/mL磷酸盐缓冲盐水(PBS))，连续2天6次，在他莫昔芬后2周给药。双转基因Lgr5就- - -GFP-CreERT2；Rspo3发票将小鼠与mTmG小鼠杂交(回交与FVB)，27Rosa26-LacZ老鼠,28而且喀斯特LSL G12Vgeo老鼠。29第25天注射他莫西芬，1-2个月后进行分析。
组织学和免疫组化
肠子采用福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)，然后按照常规方案进行H&E染色。培养的类器官在4%的PFA中固定，在石蜡包埋之前用低熔点琼脂糖包埋。在连续切片上进行免疫组化，使用抗原检索、抗体和在线显示补充表SI。对于BrDU/溶菌酶阳性细胞的定量，使用Aperio ImageScope软件精确区分每个细胞的单染或双染。每只小鼠计算25个gfp阳性的空肠隐窝，然后对三个实验进行平均。X-gal染色按照在线补充信息进行。
RNA原位杂交
RNA原位杂交使用RNAscope 2.0高清(HD) Brown进行FFPE(高级细胞诊断(ACD))，并遵循制造商的说明进行微小的调整。前处理(1)10 min RT，前处理(2)煮沸15 min，前处理(3)10 min 40°C杂化炉。探针Mm Lgr4 318321、Mm Lgr5 312171、Hs Lgr4 460551和Hs Lgr5 311021 (ACD)在40℃下杂交2小时。来源的异种移植瘤切片RSPO3-融合阳性的人结肠肿瘤来自Crown BioScience。
全组织RNA分离、cDNA合成及表达分析
为了进行RNA测序分析，使用TRIzol试剂(Ambion Life Technologies)从空肠组织中分离RNA，然后使用MinElute Cleanup Kit (Qiagen)进行纯化。使用TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 (Illumina)生成Illumina TruSeq mRNA文库，使用Illumina Hiseq2000平台(Illumina)对样品进行51 bp单端测序。一切都是按照制造商的常规规程进行的。使用Limma's Voom进行归一化，并使用匠心通路分析对表达数据进行分析。
为了RT-PCR和qPCR目的，使用TissueLyser LT (Qiagen)和RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)从空肠组织中分离RNA，然后使用Maxima第一链cDNA合成试剂盒(Fisher Scientific)进行cDNA生成。RT-PCR采用MyTaq Red DNA聚合酶，qPCR采用SensiFAST SYBR Hi-ROX Kit(均为GCBiotech公司)。引物在网上有显示补充表他们。表达水平归一化使用Actb．
隐窝分离、培养和用于流式细胞分选的细胞制备
分离小肠隐窝，按描述进行培养，6，30.使用的小鼠在25天大的时候服用了他莫西芬。用狭窄的巴斯德移液管分离培养的类器官，将其接种到Matrigel(康宁)中，并在没有外源性RSPO1或有外源性RSPO1的情况下维持指定的时间。RSPO1添加为10%的条件培养基，来源于经RSPO1表达载体转染的HEK293T细胞。31
用于流式细胞分选，分离的隐窝用TrypLE (Life Technologies)和2000 U/mL Dnase (Sigma)孵育10分钟，37°C。分离的细胞通过40 μm过滤器，在4℃下用bv421偶联的ter119、bv421偶联的cd31、bv421偶联的cd45和apc偶联的CD24(均为BioLegend)染色30分钟。如前所述，使用FACS AriaIII (BD Bioscience)进行排序。6简而言之，单个活的上皮细胞(DAPI−与血统−)基于CD24、GFP和侧散射(side scatter, SSC)进行筛选。潘氏细胞(CD24嗨SSC嗨)和Lgr5-GFP嗨干细胞被分三次进行分类。
分类细胞的表达分析
RNA按照Trizol试剂方案(Invitrogen)分离，加入1µL Glyco-blue (15 mg/mL Ambion)。使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒(Applied Biosystems)将RNA转化为cDNA，并使用TaqmanPreAmp Master Mix (Applied Biosystems)进行预扩增步骤。定量PCR使用TaqMan探针和测定(应用生物系统公司)。一切都是按照制造商的说明进行的。对表达水平进行校正Actb表达式。
致谢
作者感谢荷兰癌症研究所的动物设施，动物病理学部门(E Riem, J van Ooij, L de Vrije和J van der Meer)和微阵列设施(I de Rink)的服务和技术援助，以及H te Riele教授博士提供的FFPE材料Apc最小值老鼠。作者还感谢A Vendel-Zwaagstra进行了TOP/FOP β-catenin报告实验，并感谢R Fodde教授进行了深入的讨论和支持合作实验。
参考文献
脚注
贡献者ERMB和JH:构思、设计、监督项目并撰写文稿。小鼠研究:ERMB、NCT、JH、MB。组织学:J-YS、ERMB、NCT、JH。基因表达分析:ERMB、MB、GJI、ms。类器官研究:ERMB和MAJK。
相互竞争的利益没有宣布。
伦理批准所有的动物实验都经过动物伦理委员会的批准，并根据荷兰法律进行。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。
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