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肝脏病学
原文
通过骨桥蛋白和高迁移率群盒-1轴的信号传导驱动肝损伤的纤维化反应
  1. 埃琳娜Arriazu1，
  2. 小东通用电气1，2，
  3. Tung-Ming梁1，
  4. 费尔南多·玛格达勒诺1，2，
  5. Aritz Lopategi1，
  6. Yongke陆1，
  7. 日本首相Kitamura1，
  8. 拉奎尔Urtasun1，
  9. 尼尔Theise3.，
  10. 丹尼尔·安托万4，
  11. 娜塔莉亚尼托1，2
  1. 1医学部肝病科，西奈山的伊坎医学院，纽约，纽约美国
  2. 2病理科，伊利诺伊大学芝加哥分校，芝加哥,伊利诺斯州美国
  3. 3.消化疾病科，西奈山贝斯以色列医疗中心，纽约，纽约美国
  4. 4利物浦大学药物安全科学、分子和临床药理学医学研究委员会中心，利物浦、英国
  1. 对应到Natalia Nieto博士，伊利诺伊大学芝加哥分校病理学系，840 S. Wood St.， Suite 130 CSN, MC 847，芝加哥，IL 60612;nnieto在}{uic.edu

摘要

客观的肝纤维化与主要由活化的肝星状细胞(hsc)产生的胶原- i沉积相关;然而，肝细胞损伤和HSC前成纤维反应之间的联系尚不清楚。本研究显示骨桥蛋白(OPN)和高迁移率基团盒-1 (HMGB1)在肝纤维化中的显著诱导作用。由于OPN被确定为HMGB1的上游，我们假设OPN可能通过增加HMGB1上调胶原蛋白i的表达来参与肝纤维化的发病机制。

设计和结果丙型肝炎病毒(HCV)长期进展患者的肝脏OPN和HMGB1免疫染色增强，与纤维化阶段相关，而非进展患者的情况相似。与健康外植体相比，hcv诱导纤维化患者肝细胞细胞质OPN和HMGB1表达显著，而核HMGB1缺失。在CCl中发生了明显的肝纤维化和HMGB1的诱导4又Opn消息灵通的在野生型中转基因较少，在野生型中几乎不存在Opn−−/老鼠。Hmgb1肝细胞消融(Hmgb1Δ消息灵通的)保护小鼠免受CCl侵害4-诱导肝纤维化。与分泌OPN + HMGB1的肝细胞共培养，并用重组OPN (rOPN)或HMGB1 (rHMGB1)挑战增强了hsc中胶原蛋白i的表达，这种表达被中和抗体(Abs)和HMGB1削弱Opn或Hmgb1消融。rOPN诱导造血干细胞中HMGB1的乙酰化，这是由于NADPH氧化酶活性的增加和组蛋白脱乙酰酶1/2的相关降低导致胶原蛋白i的上调。最后，rHMGB1通过受体向晚期糖基化终产物发出信号，并激活PI3K-pAkt1/2/3通路上调胶原蛋白i。

结论在肝纤维化过程中，OPN的增加诱导HMGB1, HMGB1作为下游警报，驱动造血干细胞中胶原蛋白i的合成。

  • 基础科学
  • 肝星状细胞
  • 肝纤维化
  • 肝细胞
  • 信号

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http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-310752

数据来自Altmetric.com

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    本研究的意义

    关于这个问题我们已经知道了什么?

    • 骨桥蛋白(OPN)和高迁移率基盒-1 (HMGB1)在人和小鼠肝脏中均有表达。

    • 我们先前证实了肝纤维化中OPN增加的机制;然而，OPN是否能增加HMGB1尚未确定。

    • 如果除了我们之前确定的促纤维化机制外，OPN靶向HMGB1激活肝星状细胞(hsc)的细胞外基质沉积仍然未知。

    新的发现是什么?

    • OPN和HMGB1表达与人和小鼠纤维化阶段相关。

    • 使用体内和体外的功能损失或增益方法，我们证明OPN是HMGB1的上游。

    • 细胞外OPN促进造血干细胞中细胞内HMGB1的乙酰化，这是由于NADPH氧化酶活性的增加和组蛋白脱乙酰酶1/2的相关降低导致胶原蛋白i的上调。

    • 细胞外HMGB1通过受体为晚期糖基化终产物向hsc发出信号，激活PI3K-pAkt1/2/3途径以增加胶原i沉积。

    在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?

    • 识别关键介质以及更好地理解它们引发的促进纤维化的信号通路对于预防疾病进展和设计新疗法至关重要。这项研究加强了HMGB1在肝纤维化进展中的作用，这是一种与肝无菌损伤相关的分子模式。OPN和HMGB1在造血干细胞产生胶原蛋白i中的作用揭示了新的信号机制，可以靶向治疗获益。

    简介

    纤维发生包括细胞外基质(ECM)沉积的定性和定量变化，其中胶原- i纤维显著积聚，主要由活化的肝星状细胞(hsc)产生，广泛扭曲正常的肝脏结构。瘢痕组织的渐进式增加未能降解是纤维化演变为肝硬化和肝细胞癌的主要原因。迄今为止，广泛的研究集中在确定涉及肝纤维化发病机制的关键因素;然而，受伤的肝细胞、造血干细胞和纤维化反应之间的确切联系仍然不清楚。

    我们之前的研究表明，骨桥蛋白(OPN)是一种对氧化应激敏感并高度诱导肝损伤的基质结合蛋白，通过促进ECM沉积在肝纤维化的发病机制中发挥核心作用。1 - 3机制研究首次揭示OPN通过整合素α上调造血干细胞产生i型胶原蛋白vβ3.PI3K-pAkt1/2/3-NFκB信号通路的参与和激活;3.第二，OPN通过增加胆道上皮细胞转化生长因子(TGF) β的产生，推动导管反应，从而导致门脉周围瘢痕形成;1然而，OPN下游的其他介质，可能具有促纤维化潜能，可以参与增加造血干细胞的病理性胶原- i沉积。

    高迁移率基盒-1 (HMGB1)是一种结合DNA小槽的核非组蛋白染色体蛋白，参与DNA复制、修复和能量稳态。4最初，人们认为HMGB1主要作为一种结构蛋白。然而，在细胞损伤和翻译后修饰(PTMs)时，HMGB1从细胞核转位到细胞质，并在大多数细胞中通过溶酶体途径分泌。5HMGB1信号通过晚期糖基化终产物(RAGE)受体，toll样受体(TLRs)-2/4/9, Mac-1, syndecan-1，磷酸蛋白-酪氨酸磷酸酶-ζ/β和CD24。6

    我们实验室最近的工作表明，HMGB1在酒精性肝病的肝脏环境中具有有害作用。7当从损伤或坏死细胞中释放时，由于膜完整性的丧失8或者当肝细胞对乙醇产生反应时，7HMGB1可以引发有害反应。因此，HMGB1现在被认为是损伤相关分子模式(DAMPs)家族的一员，它将损伤传递给邻近细胞。

    尽管酒精和纤维化患者的血浆和肝脏中这种警报素增加，7，9目前尚不清楚它是否在肝纤维化中起直接作用。我们初步的体内观察表明，OPN在肝细胞和造血干细胞中位于HMGB1的上游。到目前为止，OPN是否通过旁分泌和/或自分泌方式增加HMGB1来调节造血干细胞中的胶原- i沉积尚未得到证实。因此，我们假设OPN通过上调HMGB1参与了肝纤维化导致瘢痕形成的发病机制。使用体内和体外功能丧失或功能获得的方法，我们专注于解剖肝细胞和HSC中的OPN和HMGB1轴如何调节HSC前成纤维行为。总的来说，数据表明，细胞内OPN增加HMGB1的表达，细胞外OPN诱导HMGB1的乙酰化，这是由于NADPH氧化酶(NOX)活性的增加和组蛋白去乙酰化酶(HDACs) 1/2的相关降低导致胶原蛋白i的上调。因此，OPN在造血干细胞中具有自分泌和旁分泌作用。此外，由于RAGE激活PI3K-pAkt1/2/3信号通路，细胞外HMGB1旁分泌上调了hsc中胶原蛋白i的表达;因此，有助于肝纤维化的发病机制。

    材料与方法

    老鼠

    C57BL/6J野生型(WT)和Opn−−/(B6。Cg -Spp1tm1Blh/J)小鼠来自Jackson实验室(Bar Harbor, Maine, USA)。Opn+ /−所有实验均采用小鼠杂交和同窝小鼠。的Opn肝细胞过表达OPN的转基因小鼠(Opn消息灵通的由Mochida博士(埼玉医科大学，埼玉，日本)捐赠。10用上述C57BL/6J WT相同品系和存根号进行杂交10代。的Hmgb1fl / fl小鼠由Billiar博士(University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, USA)捐赠。在这些小鼠中Hmgb1loxP等位基因是通过插入产生的loxP内含子1和2内，外显子2侧Hmgb1。11的Hmgb1fl / fl老鼠是用铝青铜。Cre小鼠(杰克逊实验室)产生肝细胞特异性Hmgb1fl / fl铝青铜。Cre老鼠(简写为Hmgb1Δ消息灵通的)．所有的动物都按照美国国家科学院(National Academy of Sciences)编写并由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)出版的《实验动物护理和使用指南》(Guide for the care and Use of Laboratory animals)中概述的标准得到了人道的照顾。

    统计分析

    数据分析采用双因素方差分析。所有体外实验均至少进行四次，重复三次。所有图中都有一个代表性的污点。所有体内实验每组8只，重复2次。

    结果

    OPN和HMGB1共定位及其表达与慢性hcv诱导纤维化患者的纤维化进展相关

    由于我们假设OPN和HMGB1可以上调人肝纤维化中的胶原- i沉积，我们确定了这两种蛋白的诱导与瘢痕形成之间是否存在相关性。为此，我们分析了经鉴定的对照组和临床证实的丙型肝炎病毒(HCV)患者存档的石蜡包埋人肝活检中OPN和HMGB1的表达。后者是成对的活检标本，其中一些显示hcv诱导纤维化的进展(进展者)，另一些则没有(非进展者)。HCV患者的肝脏活检显示，与健康的外植体相比，OPN和HMGB1的表达同时诱导(图1A, B)，而在非进展者中，随着时间的推移，它们的表达保持相似(图1A)，两种蛋白均随着进展者纤维化阶段的增加而增加(图1B).计算机辅助形态测量评估显示OPN和HMGB1表达与慢性HCV感染患者纤维化分期之间的相关性(图1C).免疫荧光分析证明这两种蛋白在慢性HCV感染患者中同时存在(图1D)。因此，这些结果表明，在慢性hcv诱导的纤维化患者中，OPN和HMGB1共定位及其表达与纤维化进展相关。

    Osteopontin (OPN) and high-mobility group box-1 (HMGB1) colocalise and their expression correlates with fibrosis progression in patients with chronic HCV-induced fibrosis. H&E staining, OPN and HMGB1 immunohistochemistry (IHC) in paraffin-embedded archived human liver biopsies from a deidentified control and from a patient with clinically proven hepatitis C virus (HCV)-induced fibrosis that did not progress in disease stage (stage 2) over 3 years show similar expression of OPN (yellow arrows, insets) and HMGB1 (green arrows, insets) (A). H&E staining, OPN and HMGB1 IHC from a patient with clinically proven HCV-induced fibrosis that progressed from stage 2 to 3 in 3 years show increased expression of OPN (yellow arrows, insets) and HMGB1 (green arrows, insets) (B). Total OPN and HMGB1 morphometry analysis according to fibrosis stage. Results are expressed as fold-change of the healthy liver explants, which are assigned a value of 1; n=10/group, ***p<0.001 for stages 1, 2, 3 or 4 vs 0 (C). Immunofluorescence shows colocalisation of OPN (red) and HMGB1 (green) in a patient with chronic HCV-induced fibrosis at stage 3 (D). DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; IOD, integrated optical density.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图1
    图1

    骨桥蛋白(OPN)和高迁移基盒-1 (HMGB1)共定位，其表达与慢性hcv诱导纤维化患者的纤维化进展相关。H&E染色，OPN和HMGB1免疫组化(IHC)石蜡包埋存档的人肝活检，来自鉴定对照组和临床证实的丙型肝炎病毒(HCV)诱导纤维化患者，3年没有进展到疾病阶段(2期)，OPN(黄色箭头，插图)和HMGB1(绿色箭头，插图)表达相似(a)。临床证实的hcv诱导纤维化患者的OPN和HMGB1 IHC在3年内从2期发展到3期，OPN(黄色箭头，插图)和HMGB1(绿色箭头，插图)的表达增加(B)。根据纤维化阶段，总OPN和HMGB1形态测定分析。结果以健康肝脏外植体的折叠变化表示，赋值为1;n=10/组，1、2、3或4期与0期相比，***p<0.001 (C)。免疫荧光显示慢性hcv诱导纤维化3期患者的OPN(红色)和HMGB1(绿色)共定位(D)。IOD，积分光密度。

    OPN和HMGB1共定位及其在CCl中的表达相关4小鼠肝损伤

    为了确定OPN是否位于HMGB1的上游，并分析OPN是否诱导HMGB1从而导致肝损伤的纤维化反应，我们使用了CCl4肝纤维化模型与基因操作Opn使用WT,Opn−−/而且Opn消息灵通的Tg小鼠和之前一样。3.免疫组化(IHC)分析显示CCl4又Opn消息灵通的Tg小鼠肝脏OPN明显升高(图2A)和HMGB1 (图2B，上)与注射矿物油(MO)的WT小鼠的表达比较;HMGB1免疫染色明显降低Opn−−/用形态测定法和western blot (图2B,中间)。此外，血清HMGB1在CCl中翻倍4又Opn消息灵通的与WT小鼠的Tg比较(未显示)。由于HMGB1核质穿梭对驱动下游事件至关重要，7HMGB1定位通过计算机辅助形态测量分析进行量化。在CCl中，核与总HMGB1的比例显著降低，而细胞质与总HMGB1表达的比例增加4又Opn消息灵通的Tg与WT相比，在Opn−−/老鼠(图2B,底部)。免疫荧光分析显示OPN和HMGB1在CCl中共定位，并诱导表达4-注射WT小鼠(图2C).与HNF4α共定位显示，OPN和HMGB1在肝细胞中的表达显著增加(核染色)12（图2D，上面和中间)。同样，HMGB1在造血干细胞中的表达增强，尽管程度小于肝细胞，如与desmin共定位所示(图2D,底部)。此外，慢性CCl中胶原- i沉积更大4又Opn消息灵通的Tg与WT相比要小得多Opn−−/免疫组化(IHC)和形态学分析(图2E).这些体内实验结果提示OPN可能促进HMGB1释放。

    Osteopontin (OPN) and high-mobility group box-1 (HMGB1) colocalise and their expression correlates in carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver injury in mice. Wild-type (WT), Opn−/− and OpnHep Tg mice were injected with mineral oil (MO) or CCl4 for 1 month. OPN (A) and HMGB1 (B, top) immunohistochemistry (IHC) and morphometry analysis in livers from CCl4-injected mice show increased OPN (yellow arrows, insets) along with HMGB1 (green arrows, insets) expression, which is greater in CCl4-injected OpnHep Tg than in WT and less in Opn−/− mice. Western blot analysis for HMGB1 in livers from MO-injected WT and CCl4-injected WT, Opn−/− and OpnHep Tg mice. The results from the western blot analysis are corrected by calnexin (loading control) (B, middle). Quantification of nuclear, cytoplasmic, nuclear-to-total and cytoplasmic-to-total HMGB1 expression (B, bottom). Immunofluorescence shows colocalisation of OPN and HMGB1 as well as induction in CCl4-injected WT mice (C, top), which was quantified by morphometry (C, bottom). Immunofluorescence demonstrates colocalisation of OPN and HMGB1 with HNF4α (hepatocyte marker, nuclear) along with induction by CCl4 treatment (D, top and middle). There is also colocalisation of HMGB1 with desmin (hepatic stellate cell (HSC) marker, cytoplasmic) along with induction by CCl4 treatment (D, bottom). Collagen-I IHC and morphometry assessment in livers from MO-injected or CCl4-injected WT, Opn−/− and OpnHep Tg mice (E). In all panels, the results are expressed as fold-change of the WT mice injected MO, which are assigned a value of 1 and are mean values±SEM; n=8/group. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for CCl4-injected mice versus MO-injected mice; ●p<0.05, ●●p<0.01 and ●●●p<0.001 for OpnHep Tg or Opn−/− versus WT mice. CV, central vein; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; IOD, integrated optical density; PV, portal vein.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    骨桥蛋白(OPN)和高迁移率基盒-1 (HMGB1)共定位，它们在四氯化碳(CCl)中的表达相关4)所致小鼠肝损伤。野生型(WT),Opn−−/而且Opn消息灵通的Tg小鼠分别注射矿物油(MO)和氯化铬(CCl)41个月。来自CCl的肝脏的OPN (A)和HMGB1 (B，上)免疫组织化学(IHC)和形态测定分析4-注射小鼠显示OPN(黄色箭头，插图)和HMGB1(绿色箭头，插图)表达增加，在CCl中更明显4又Opn消息灵通的小于WT中的Tg，小于in中的TgOpn−−/老鼠。Western blot检测mo注射WT和CCl肝脏中HMGB1的表达4又WT,Opn−−/而且Opn消息灵通的Tg老鼠。western blot分析结果用calnexin(加载对照)校正(B，中)。核、细胞质、核对总和细胞质对总HMGB1表达的定量(B，下)。免疫荧光显示OPN和HMGB1的共定位以及CCl的诱导4-注射WT小鼠(C，上)，通过形态测量法进行量化(C，下)。免疫荧光显示OPN和HMGB1与HNF4α(肝细胞标记物，核)共定位，并伴有CCl诱导4处理(D，上，中)。HMGB1也与desmin(肝星状细胞(HSC)标记物，细胞质)共定位，并伴有CCl诱导4治疗(D，下)。注射mo或CCl肝脏中胶原i免疫组化和形态测量的评估4又WT,Opn−−/而且Opn消息灵通的Tg小鼠(E)。在所有小组中，结果以注射MO的WT小鼠的折叠变化表示，赋值为1，为平均值±SEM;n = 8 /组。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.0014-注射小鼠与mo注射小鼠;●p < 0.05,●●p < 0.01,●●●p < 0.001Opn消息灵通的Tg或Opn−−/与WT小鼠相比。CV，中央静脉;DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole;IOD，积分光密度;PV，门静脉。

    Continued.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图2
    图2

    继续说。

    Hmgb1肝细胞消融部分预防CCl4-诱导小鼠肝纤维化

    由于人类和小鼠的数据表明肝细胞来源的HMGB1可能在肝纤维化中起作用，为了确定阻断肝细胞来源的HMGB1的作用，Hmgb1Δ消息灵通的对照组长期注射MO或CCl4．H&E染色、病理评分和血清丙氨酸转氨酶+天门冬氨酸转氨酶活性显示CCl的坏死、炎症、肝细胞球囊变性和纤维化减少4又Hmgb1Δ消息灵通的与对照组相比(图3A)。在由胆总管结扎(BDL)诱导的第二个肝纤维化模型中观察到类似的结果(见在线)补充图S1)．Hmgb1肝细胞的缺失经免疫组化证实Hmgb1Δ消息灵通的并控制同窝伙伴(图3B,顶部)。IHC显示CCl中胶原蛋白i表达较少4又Hmgb1Δ消息灵通的与对照组相比(图3B,顶部)。Hmgb1消融不影响OPN的表达，证实OPN位于HMGB1的上游(图3B,顶部)。这些蛋白的阳性染色强度用形态测定法定量(图3B,中间)。同样的,Hmgb1消融不改变RAGE表达(图3B，底部)或任何其他已知的HMGB1受体mRNA(未显示)。因此,Hmgb1肝细胞消融部分预防CCl4-诱导小鼠肝纤维化。

    Hmgb1 ablation in hepatocytes partially prevents carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver fibrosis in mice. Hmgb1ΔHep and control littermates were injected mineral oil (MO) or CCl4 for 1 month. H&E staining (A, top), the pathology scores (A, middle) and serum alanine aminotransferase (ALT) plus aspartate aminotransferase (AST) activities (A, bottom) show lower necrosis, inflammation, hepatocyte ballooning degeneration and fibrosis in Hmgb1ΔHep compared with control littermates. High-mobility group box-1 (HMGB1); green arrows, insets and collagen-I immunohistochemistry (IHC) and morphometry analysis show reduced HMGB1 and collagen-I deposition in livers from CCl4-injected Hmgb1ΔHep compared with control littermates. IHC and western blot analysis demonstrate similar expression of osteopontin (OPN) and receptor for advanced glycation end-products (RAGE) in these mice (B). The results are expressed as fold-change of the MO-injected control littermates, which are assigned a value of 1 and are mean values±SEM; n=8/group. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for CCl4-injected versus MO-injected mice; ●p<0.05, ●●p<0.01 and ●●●p<0.001 for Hmgb1ΔHep versus control littermates. CV, central vein; IOD, integrated optical density; PV, portal vein; WT, wild type.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    Hmgb1肝细胞消融部分阻止四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝纤维化。Hmgb1Δ消息灵通的对照组注射矿物油(MO)或氯化铬(CCl)41个月。H&E染色(A，上)、病理评分(A，中)和血清谷丙转氨酶(ALT) +天冬氨酸转氨酶(AST)活性(A，下)显示肝细胞坏死、炎症、球囊变性和纤维化降低Hmgb1Δ消息灵通的与对照组相比。高迁移率群箱-1 (HMGB1);绿色箭头、插图和i型胶原免疫组化(IHC)和形态测量分析显示，CCl减少了HMGB1和i型胶原在肝脏中的沉积4又Hmgb1Δ消息灵通的与对照组相比。免疫组化和western blot分析显示，在这些小鼠中骨桥蛋白(OPN)和晚期糖基化终产物受体(RAGE)表达相似(B)。结果以注射mo的对照组的折叠变化表示，赋值为1，为平均值±SEM;n = 8 /组。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.0014-注射小鼠和mo注射小鼠;●p < 0.05,●●p < 0.01,●●●p < 0.001Hmgb1Δ消息灵通的与对照组相比。CV，中央静脉;IOD，积分光密度;PV，门静脉;WT，野生型。

    Continued.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图3
    图3

    继续说。

    OPN也是hsc中HMGB1的上游，它们都在体外以自分泌方式调节胶原蛋白i的表达

    我们之前证明了hsc表达OPN1这项研究揭示了造血干细胞也产生HMGB1。接下来，我们提出了hsc来源的OPN是否可以对hsc中HMGB1的表达起自分泌作用，并最终影响胶原蛋白i的合成。新鲜分离的小鼠WT和Opn−−/评估hsc OPN、HMGB1和胶原蛋白i的表达。Opn−−/与WT型造血干细胞相比，细胞内HMGB1以及细胞内和细胞外胶原蛋白i减少了90% (图4左)。相反，用腺病毒感染过表达OPN的WT造血干细胞显示HMGB1增加(图4A，右)和胶原蛋白i3.与对照LacZ腺病毒感染的造血干细胞比较。为了确定HMGB1是否可以影响OPN水平，WT和Hmgb1−−/分析小鼠胚胎皮肤成纤维细胞(mef) OPN、HMGB1和胶原蛋白i的表达。Hmgb1−−/显示类似的细胞内OPN，但与WT mef相比，细胞内+细胞外胶原蛋白i表达减少90% (图4B).这些数据表明，在hsc中，OPN也是HMGB1的上游，它们都以自分泌方式在体外调节胶原蛋白i的表达。

    Osteopontin (OPN) is also upstream of high-mobility group box-1 (HMGB1) in hepatic stellate cells (HSCs) and they both regulate collagen-I expression in an autocrine fashion in vitro. Primary HSCs from wild-type (WT) and Opn−/− mice were cultured for 5 days. Western blot analysis of intracellular OPN, HMGB1 and collagen-I plus extracellular collagen-I expression (A, left). Rat HSCs were infected with Ad-LacZ or Ad-OPN for 48 h. Western blot analysis of intracellular OPN and HMGB1 in rat HSCs infected with Ad-LacZ or Ad-OPN (A, right). Mouse embryonic skin fibroblasts (MEFs) from WT and Hmgb1−/− mice were cultured for 1 day. Western blot analysis of intracellular OPN, HMGB1 and collagen-I plus extracellular collagen-I expression (B). Hepatocytes are a major source of OPN and HMGB1 signalling to HSCs to increase collagen-I production. Primary rat HSCs were cultured alone for 5 days and then cocultured with primary hepatocytes from mineral oil (MO)-treated or CCl4-treated Opn−/−, Hmgb1ΔHep and their matching control littermates for 1 day in the presence or absence of non-immune IgG or a neutralising antibody (Ab) to HMGB1 or OPN, respectively. Western blot analysis of intracellular and extracellular collagen-I is shown (C). In all panels, the results are corrected by the specific loading control and are expressed as fold-change of the control, which are assigned a value of 1 and are mean values±SEM; n=3/group. Experiments were performed in triplicate four times. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for Ad-OPN or CCl4 versus Ad-LacZ or MO; ●p<0.05, ●●p<0.01 and ●●●p<0.001 for Opn−/−, Hmgb1−/−, HMGB1 Ab or OPN Ab versus WT or IgG; °p<0.05, °°p<0.01 and °°°p<0.001 for the Opn−/− and Hmgb1ΔHep coculture versus the WT and the control littermate cocultures.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图4
    图4

    骨桥蛋白(OPN)也是肝星状细胞(hsc)中高迁移率基团盒-1 (HMGB1)的上游，它们都在体外以自分泌方式调节胶原蛋白i的表达。来自野生型(WT)和Opn−−/小鼠培养5天。Western blot分析细胞内OPN、HMGB1和胶原蛋白i +细胞外胶原蛋白i的表达(左A)。分别用Ad-LacZ和Ad-OPN感染大鼠造血干细胞48 h。Ad-LacZ或Ad-OPN感染大鼠造血干细胞细胞内OPN和HMGB1的Western blot分析(右图A)。小鼠胚胎皮肤成纤维细胞(MEFs)Hmgb1−−/小鼠培养1天。Western blot检测细胞内OPN、HMGB1和胶原蛋白i +细胞外胶原蛋白i的表达（B).肝细胞是OPN和HMGB1向造血干细胞发出信号以增加胶原蛋白i产生的主要来源。原代大鼠造血干细胞单独培养5天，然后与矿物油(MO)处理的原代肝细胞或CCl共培养4治疗Opn−−,Hmgb1Δ消息灵通的在HMGB1或OPN的非免疫IgG或中和抗体(Ab)存在或不存在的情况下，分别对与其匹配的对照窝仔进行1天。细胞内和细胞外胶原- i的Western blot分析如图所示(C)。在所有面板中，结果均经特定负荷对照校正，并表示为对照的折叠变化，赋值为1，为平均值±SEM;n = 3 /组。实验分为3个重复，共4次。对于Ad-OPN或CCl， *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.0014相对于Ad-LacZ或MO;●p < 0.05,●●p < 0.01,●●●p < 0.001Opn−−/，Hmgb1−−/， HMGB1 Ab或OPN Ab vs WT或IgG;°p<0.05，°°p<0.01，°°°p<0.001Opn−−/而且Hmgb1Δ消息灵通的共培养对比WT和对照窝仔共培养。

    肝细胞是OPN和HMGB1向造血干细胞发出信号以增加胶原蛋白i产生的主要来源

    由于人类和小鼠免疫组化研究表明，肝细胞是OPN和HMGB1的主要来源，为了进一步确定它们的旁分泌参与了造血干细胞产生胶原i的上调，从mo处理过的原代肝细胞或CCl共培养4-处理小鼠和造血干细胞的建立。首先，在OPN或HMGB1中和抗体(Abs)的存在下共培养;其次，与mo处理过的肝细胞或CCl共培养4治疗Opn−−/，Hmgb1Δ消息灵通的和它们各自的对照仔。Western blot分析显示，与来自CCl的WT肝细胞共培养的hsc细胞内和细胞外胶原蛋白i增加4-处理的小鼠(图4C，左边和右边，两个印迹中的3车道);因此，造血干细胞对肝细胞来源的因子有反应。这些介质被确定为OPN和HMGB1，因为与中和抗体一起孵育可以阻止造血干细胞中胶原蛋白i的诱导(图4C，左边和右边，两个印迹中的4车道)。此外，与原代小鼠肝细胞共培养4治疗Opn−−/或Hmgb1Δ消息灵通的小鼠降低了造血干细胞的细胞内和细胞外胶原i，并使CCl变钝4-介导的i型胶原蛋白增加(图4C左和右，在两个印迹8车道)。因此，肝细胞来源的OPN和HMGB1靶向造血干细胞并驱动其促纤维化行为。

    rOPN诱导HSC中HMGB1的表达和易位，并促进胶原蛋白i的产生

    接下来，我们研究了以rOPN作为上游信号，作为共培养模型或旁分泌效应的替代品，是否也可以复制在造血干细胞中观察到的HMGB1和胶原蛋白i表达的增加。原代大鼠造血干细胞培养4天(静止)或7天(激活)，并用rOPN刺激后HMGB1和胶原蛋白i表达增加(图5左)。对HMGB1的影响在蛋白水平上Hmgb1在rOPN挑战后mRNA保持相似(未显示)，环己亚胺抑制蛋白质合成阻止了hsc中rOPN对HMGB1的增加(图5右)。

    Recombinant osteopontin (rOPN) induces high-mobility group box-1 (HMGB1) expression and translocation in hepatic stellate cells (HSCs) and drives the increase in collagen-I production. Primary rat HSCs cultured for 4 days (quiescent) or 7 days (activated) were treated with rOPN for 6 h. Western blot analysis for intracellular HMGB1 and for intracellular plus extracellular collagen-I (A, left). Western blot analysis for HMGB1 in primary rat HSCs treated with 50 nM rOPN for 6 h in the presence or absence of 100 µM cycloheximide (A, right). Primary rat HSCs cultured for 7 days were treated with rOPN for 6 h. Western blot analysis of nuclear plus cytoplasmic HMGB1 and intracellular collagen-I (B). In (A and B), the results are expressed as fold-change of the corresponding control, which are assigned a value of 1 if signal is present and are mean values±SEM; n=3/group in experiments performed in triplicate four times. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for rOPN versus control; ●●●p<0.001 for cycloheximide cotreated versus rOPN. Primary mouse HSCs treated with 50 nM rOPN for 6 h. Immunofluorescence analysis for HMGB1 (green) and collagen-I (red) (C). HMGB1 structure and schematic representation of the lysine residues targeted in the HMGB1 constructs (D). Rat HSCs were transfected with a series of constructs driving HMGB1 localisation followed by 0–50 nM rOPN treatment for 6 h. The constructs were (1) pGFP, an empty vector as a negative control; (2) wild-type (WT).Hmgb1.GFP containing nuclear localisation signals 1 (NLS1) and NLS2 to overexpress HMGB1 and (3) Hmgb1.NLS1/2(8K→8A).GFP containing all eight lysines in the two NLS mutated to alanines, which cannot be acetylated and result in nuclear localisation. Immunofluorescence for collagen-I (yellow arrows) and GFP fluorescence (HMGB1 localization: white arrows point at nuclear HMGB1 and white arrowheads point at cytosolic HMGB1) were visualised by confocal microscopy (E) and quantified by morphometry assessment (F). In (F), the results are expressed as fold-change of the control WT.Hmgb1.GFP, which are assigned a value of 1 and are mean values±SEM; n=3/group in experiments performed in triplicate four times. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for rOPN versus control; ●●p<0.01 and ●●●p<0.001 for Hmgb1(8K→8A).GFP versus WT.Hmgb1.GFP. IOD, integrated optical density.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    重组骨桥蛋白(rOPN)在肝星状细胞(hsc)中诱导高迁移率基盒-1 (HMGB1)表达和易位，并驱动胶原蛋白i生成的增加。培养4天(静止)或7天(活化)的原代大鼠造血干细胞用rOPN处理6小时。Western blot检测细胞内HMGB1和细胞内+细胞外胶原蛋白i(左A)。在存在或不存在100 μ M环己亚胺的情况下，用50 nM rOPN处理6小时的原代大鼠造血干细胞中HMGB1的Western blot分析(右)。培养7 d的原代大鼠造血干细胞用rOPN处理6 h。核+细胞质HMGB1和细胞内胶原- i的Western blot分析(B)。(A和B)中，结果以相应对照的fold-change表示，如果有信号则赋值为1，为平均值±SEM;N =3/组，重复3次。与对照组相比，rOPN *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001;●●●环己亚胺与rOPN共治疗p<0.001。原代小鼠造血干细胞用50 nM rOPN处理6 h。HMGB1(绿色)和胶原蛋白i(红色)的免疫荧光分析(C)。HMGB1结构和HMGB1构建物中靶向赖氨酸残基的示意图(D)。用一系列驱动HMGB1定位的构建物转染大鼠造血干细胞，然后进行0-50 nM rOPN处理6小时。构造为(1)pGFP，作为阴性对照的空载体;(2)野生型。Hmgb1.含有核定位信号1 (NLS1)和NLS2的gfp过表达HMGB1和(3)Hmgb1.NLS1/2 (8 k→8)。GFPcontaining all eight lysines in the two NLS mutated to alanines, which cannot be acetylated and result in nuclear localisation. Immunofluorescence for collagen-I (yellow arrows) and GFP fluorescence (HMGB1 localization: white arrows point at nuclear HMGB1 and white arrowheads point at cytosolic HMGB1) were visualised by confocal microscopy (E) and quantified by morphometry assessment (F). In (F), the results are expressed as fold-change of the control WT.Hmgb1。GFP，赋值为1，为平均值±SEM;N =3/组，重复3次。与对照组相比，rOPN *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001;●●p < 0.01,●●●p < 0.001Hmgb1(8 k→8)。GFPversus WT.Hmgb1。GFP。IOD，积分光密度。

    Continued
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图5
    图5

    继续

    由于HMGB1在应对各种应激源和ptm时经历了核质穿梭，7接下来，我们研究了rOPN是否能促进HMGB1从细胞核转位到细胞质，并最终影响造血干细胞合成胶原i。Western blot分析rOPN刺激的造血干细胞核蛋白和细胞质蛋白，证实细胞质HMGB1的增加与胶原蛋白i相关(图5B)。这些结果也通过原代小鼠造血干细胞中HMGB1和胶原蛋白- i的免疫荧光验证(图5C)。

    为了进一步证实在rOPN治疗后，HMGB1易位驱动胶原- i沉积，大鼠造血干细胞被转染了驱动HMGB1定位到细胞核或细胞质的构建物，并评估胶原- i表达。这些结构包括:(1)pGFP，一个空的载体，用作阴性对照;(2) WT。Hmgb1.GFP，包含核定位信号(NLS) 1和2，以过度表达HMGB1，并允许对刺激做出反应，可以将蛋白质驱动到细胞质和(3)Hmgb1.NLS1/2 (8 k→8)。GFP，containing all eight lysines in the two NLS mutated to alanines that cannot be acetylated therefore resulting in HMGB1 nuclear localisation13(请参阅图5D)。

    在没有刺激的情况下，用WT转染造血干细胞。Hmgb1.GFP或Hmgb1.NLS1/2 (8 k→8)。GFPvectors showed green fluorescence only in the nucleus corresponding to HMGB1 nuclear localisation (white arrows) compared with HSCs transfected with the pGFP vector, which showed diffuse green fluorescence corresponding to GFP only. Treatment with rOPN increased collagen-I expression in WT.Hmgb1.仅gfp转染的造血干细胞(红色染色);然而，在WT转染的造血干细胞中，rOPN诱导了更多的胶原蛋白i表达(黄色箭头)。Hmgb1.显示细胞质HMGB1的绿色荧光蛋白(白色箭头)(图5E，顶部和中间面板，图5F).这些结果表明，rOPN诱导HMGB1细胞质定位导致胶原蛋白i表达增加。此外，转染与Hmgb1.NLS1/2 (8 k→8)。GFPvector revealed that forced nuclear localisation of HMGB1 decreases the HSCs response to rOPN as less collagen-I was observed compared with the WT.Hmgb1. gfp转染的造血干细胞(图5E，中间和底部面板，图5F).总的来说，这些实验揭示了rOPN诱导HMGB1和胶原蛋白i在静止和激活的造血干细胞中的表达，并促进HMGB1从细胞核转位到细胞质，从而促进造血干细胞产生胶原蛋白i;然而，在rOPN治疗下HMGB1在造血干细胞中的动员机制仍然不明确。

    rOPN激活NOX，抑制HDACs1/2，促进HMGB1乙酰化和易位，并在造血干细胞中上调胶原蛋白i

    HMGB1核质穿梭发生在应激源和/或PTMs的反应中，7我们研究了rOPN是否可以在hsc中触发一个特定的PTM，从而增加HMGB1。免疫沉淀和免疫印迹显示在rOPN存在时HMGB1显著乙酰化(图6A).电喷雾电离-液相色谱-质谱法7我们分析了在rOPN处理下HSCs中修饰的HMGB1残基，发现8个赖氨酸簇(28 - 30,180和182-185)显著乙酰化，半胱氨酸23和45很少氧化，丝氨酸35没有磷酸化(图6B且未显示);然而，这些特定的PTMs是如何发生的仍然未知。

    Recombinant osteopontin (rOPN) activates NADPH oxidase (NOX) and inhibits histone deacetylases (HDACs) 1/2 promoting high-mobility group box-1 (HMGB1) acetylation and translocation along with collagen-I upregulation in hepatic stellate cells (HSCs). Rat HSCs were treated with rOPN for 6 h. Immunoprecipitation of intracellular HMGB1 and immunoblotting for acetylated lysines (A). Identification of the HMGB1 isoforms in HSCs lysates and in the cell culture medium. Spectra of whole protein electrospray ionisation–liquid chromatography–mass spectrometry of the HMGB1 isoforms. A schematic representation of each isoform is on each spectra (grey boxes); n=3/group (B). Rat HSCs were treated with rOPN for 2 h. Western blot analysis for PCAF and p300 (C). Rat HSCs were treated with rOPN for 1 and 2 h. Western blot analysis for HDACs1-6 (D). NOX activity in rat HSCs treated with rOPN for 6 h alone or pretreated for 0.5 h with apocynin or diphenyleneiodonium (DPI), the two NOX inhibitors. The percentage of dihydroethidium (DHE)-positive cells was measured by flow cytometry as an indirect measurement of O2.− production (E). Rat HSCs were treated with rOPN for 6 h in the presence or absence of apocynin or DPI. Western blot analysis of HDACs1/2 along with intracellular and extracellular collagen-I (F). The results from the western blot analysis are corrected by the specific loading control and are expressed as fold-change of the controls, which are assigned a value of 1 and are mean values±SEM; n=3/group in experiments performed in triplicate four times. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for rOPN versus control; •p<0.05 and ••p<0.01 for cotreated versus rOPN. HDACs, histone deacetylases.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    重组骨桥蛋白(rOPN)激活NADPH氧化酶(NOX)，抑制组蛋白脱乙酰酶(HDACs) 1/2，促进高迁移率基团盒-1 (HMGB1)乙酰化和易位，以及胶原蛋白i在肝星状细胞(hsc)中的上调。rOPN处理大鼠造血干细胞6 h。细胞内HMGB1的免疫沉淀和乙酰化赖氨酸的免疫印迹(A)。hsc裂解物和细胞培养基中HMGB1异构体的鉴定。HMGB1异构体的全蛋白电喷雾电离-液相色谱-质谱谱。每种异构体的示意图在每个谱图上(灰框);n=3/组(B)。用rOPN处理大鼠造血干细胞2 h。Western blot检测PCAF和p300 (C)。用rOPN处理大鼠造血干细胞1和2 h。Western blot分析HDACs1-6 (D). rOPN单独处理6 h或罗布酚或二苯碘铵(DPI)两种NOX抑制剂预处理0.5 h大鼠造血干细胞的NOX活性。采用流式细胞术检测二氢乙二烯(DHE)阳性细胞的百分率，间接测定O2．−(E)在罗布桃苷或DPI存在或不存在的情况下，用rOPN处理大鼠造血干细胞6小时。Western blot分析HDACs1/2以及细胞内和细胞外胶原- i (F)。Western blot分析结果通过特定负荷对照进行校正，并表示为对照的fold-change，赋值为1，为平均值±SEM;N =3/组，重复3次。与对照组相比，rOPN *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001;•p<0.05，•p<0.01。HDACs，组蛋白脱乙酰酶。

    Continued
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图6
    图6

    继续

    乙酰化通常由于组蛋白乙酰转移酶(HATs)增强和/或HDACs活性降低而发生;因此，我们测量了HATs和HDACs的活性。净化海港计划的活动大致相同;然而，与对照的hsc相比，ropn处理的hsc中HDACs活性下降(未显示)。虽然PCAF (p300/ cbp相关因子)和p300已被描述为乙酰化HMGB1;14然而，western blot分析显示，与对照组相比，ropn刺激的造血干细胞中PCAF和p300的表达相似(图6C).接下来，我们分析了rOPN胁迫下HSCs中HDACs的表达是否发生变化。Western blot分析显示，与对照组相比，ropn刺激的造血干细胞中HDACs1/2减少，而HDACs3-6保持相似(图6D).因此，rOPN可能通过抑制HDACs1/2乙酰化HMGB1，这可能有助于HMGB1的细胞质积累。然而，HDACs1/2的抑制是如何发生的仍不清楚。

    HDACs活性可以通过激活NOX和随后产生的活性氧来抑制。15为了确定rOPN是否能激活hsc中的NOX并抑制HDACs1/2，我们测量了NOX活性和O2．−并发现NOX活性和O2．−的水平。当罗布麻素或二苯碘鎓(DPI)氯阻断NOX诱导时，两种NOX抑制剂(图6E)，它们阻止了ropn介导的HDACs1/2的降低和hsc中胶原蛋白i表达的增加(图6F).总的来说，这些结果证明了rOPN激活NOX诱导O生成的概念2．−，抑制HDACs1/2表达，允许HMGB1乙酰化，并上调造血干细胞合成胶原i。

    rHMGB1信号通过PI3K-pAkt1/2/3通路上调hsc中胶原蛋白i的表达

    由于人类和小鼠的数据以及共培养研究表明，肝细胞产生和分泌HMGB1，被确定为OPN的下游，我们接下来询问细胞外HMGB1本身是否也可以向hsc发出信号并增加胶原蛋白i的合成。为了解决这个问题，研究人员用rHMGB1挑战造血干细胞，rHMGB1不会改变OPN的表达，但会增加细胞内和细胞外的胶原蛋白i (图7A).由于胶原蛋白i的产生高度依赖于蛋白激酶的激活，为了更好地理解rHMGB1如何上调造血干细胞中胶原蛋白i的合成，我们分析了一系列蛋白激酶的表达，以确定它们被rHMGB1激活的可能性。在对已知激活胶原i合成的蛋白激酶(如ERK1/2, PI3K, Akt, p70RSK, p38, JNK)的表达和磷酸化状态进行评估后，我们发现rHMGB1时间依赖性地增加了PI3K，并诱导其下游靶蛋白Akt1/2/3的磷酸化(图7B).为了证实它们确实参与了rHMGB1对造血干细胞产生胶原- i的影响，将细胞与PI3K抑制剂wortmannin或LY294002预孵育，然后用rHMGB1挑战。Western blot分析显示，在rHMGB1预处理后，细胞中胶原i的生成减少，从而证实了PI3K和pAkt1/2/3在rHMGB1对造血干细胞中胶原i表达的影响中所起的作用(图7C).因此，细胞外HMGB1本身也通过PI3K-pAkt1/2/3信号通路上调hsc中的胶原- i。

    rHMGB1 signals via receptor for advanced glycation end-products (RAGE) to upregulate collagen-I expression through the PI3K–pAkt1/2/3 pathway in hepatic stellate cells (HSCs). Rat HSCs were treated with 50 nM rHMGB1 for 6 h. Western blot analysis for intracellular plus extracellular OPN and collagen-I (A). HSCs were challenged with rHMGB1 up to 6 h and western blot analysis was performed for PI3K, pAkt1/2/3 and Akt1/2/3 (B). Western blot for pAkt1/2/3, pAkt1/2/3 and intracellular plus extracellular collagen-I in HSCs treated with rHMGB1 in the presence or absence of wortmannin or LY294002 (two PI3K inhibitors) (C). Rage ablation was performed in HSCs by transduction with shRNA lentiviral particles and isolation of stable clones expressing the shRNA via puromycin dihydrochloride selection. Cells were treated with rHMGB1 for 6 h followed by western blot analysis for RAGE, PI3K, pAkt1/2/3, Akt1/2/3 intracellular and extracellular collagen-I (D). The results from the western blot analysis are corrected by the specific loading control and are expressed as fold-change of the controls, which are assigned a value of 1 and are given as mean values±SEM; n=3/group in experiments performed in triplicate four times. *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 for rHMGB1 versus control; •p<0.05, ••p<0.01 and •••p<0.001 for cotreated or Rage ablated versus rHMGB1 or Gfp. Wild-type (WT) mice were injected CCl4 for 1 month along with non-immune IgG or RAGE neutralising Ab. H&E staining and collagen-I immunohistochemistry (IHC) and morphometry analysis showing that neutralisation of RAGE protects mice from liver fibrosis (E). The results are expressed as fold-change of the IgG group, which are assigned a value of 1 and are given as mean values±SEM; n=3/group. ••p<0.01 for RAGE Ab versus IgG. CV, central vein; PV, portal vein.
    " data-icon-position="" data-hide-link-title="0">图7
    图7

    在肝星状细胞(hsc)中，rHMGB1信号通过晚期糖基化终产物受体(RAGE)通过PI3K-pAkt1/2/3通路上调胶原蛋白i的表达。用50 nM rHMGB1处理大鼠造血干细胞6 h。Western blot分析细胞内+细胞外OPN和胶原蛋白i (A)。用rHMGB1刺激造血干细胞达6小时，Western blot分析PI3K, pAkt1/2/3和Akt1/2/3 (B)。Western blot检测在wortmannin或LY294002(两种PI3K抑制剂)存在或不存在rHMGB1处理的造血干细胞的pAkt1/2/3, pAkt1/2/3和细胞内+细胞外胶原蛋白i (C)。愤怒通过转导shRNA慢病毒粒子，并通过二盐酸嘌呤霉素选择分离稳定表达shRNA的克隆，对造血干细胞进行消融。用rHMGB1处理细胞6小时，然后进行western blot分析RAGE、PI3K、pAkt1/2/3、Akt1/2/3细胞内和细胞外胶原- i (D)。western blot分析的结果通过特定加载控制进行校正，并表示为对照的折叠变化，赋值为1，以平均值±SEM表示;N =3/组，重复3次。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001;•p<0.05，••p<0.01，•••p<0.001愤怒与rHMGB1或绿色荧光蛋白．野生型(WT)小鼠注射CCl4H&E染色、i型胶原免疫组化(IHC)和形态测量学分析显示，RAGE中和可保护小鼠免于肝纤维化(E)。结果以IgG组的折叠变化表示，赋值为1，并以平均值±SEM表示;n = 3 /组。••RAGE Ab与IgG相比p<0.01。CV，中央静脉;PV，门静脉。

    rHMGB1信号通过RAGE在hsc中通过PI3K-pAkt1/2/3通路上调胶原蛋白i的表达

    最后，由于HMGB1结合多个受体，其中RAGE16和TLRs2/4/917日至19日已被描述在肝纤维化的设置中发挥作用，我们评估了HMGB1对胶原- i的影响是否由受体介导。为此，我们烧了愤怒或Tlrs2/4/9使用shRNA慢病毒颗粒或siRNA策略。成功消融后(图7D，未显示)，用rHMGB1处理hsc，并评估胶原蛋白i的表达。愤怒(图7D)而不是TLRs2/4/9(见在线补充图S2)对于rHMGB1对hsc中胶原蛋白i表达的影响至关重要，因为western blot分析显示，rHMGB1处理后，胶原蛋白i表达上调，但RAGE表达没有改变，但rHMGB1处理后则没有改变愤怒消融(图7D).为了确定PI3K - pAkt1/2/3信号通路是否以rage依赖的方式被激活，我们分析了这些蛋白的表达，发现当rHMGB1处理后PI3K和pAkt1/2/3没有被激活愤怒被烧蚀(图7D).总的来说，这些结果表明rHMGB1通过RAGE信号并激活PI3K-pAkt1/2/3通路上调hsc中的胶原蛋白i。最后，为了在体内证实RAGE在肝纤维化中上调胶原蛋白i的作用，WT小鼠长期注射CCl4与注射不相关的同型匹配对照单克隆抗体(图7E)。

    讨论

    由于肝纤维化的发病率在全球范围内不断上升，因此迫切需要确定新的靶点和设计新的治疗方法来预防疾病的发病和/或进展。迄今为止，该领域的大多数研究都集中在确定与肝纤维化发病机制有关的事件;然而，受伤的肝细胞、造血干细胞和瘢痕之间的确切联系仍有待确定。因此，我们的目标是分析OPN是否靶向HMGB1，以及肝细胞和造血干细胞中这两种蛋白的上调是如何通过调节瘢痕形成来促进肝纤维化的发病机制的。

    这项研究为临床证实的hcv诱导纤维化患者中OPN和HMGB1表达与纤维化进展的共定位和相关性提供了令人信服的证据。

    为了确定OPN是否位于HMGB1的上游，并分析OPN是否靶向HMGB1，通过尚未建立的机制，促进肝损伤的纤维化反应，我们使用了CCl4肝纤维化模型与基因操作Opn在老鼠身上。除了OPN和HMGB1共定位的增加，在肝细胞中相当显著，它们的表达与小鼠肝纤维化的程度相关。重要的是，慢性CCl的纤维化明显更大4又Opn消息灵通的Tg与WT相比，在Opn−−/老鼠。3.此外，我们观察到衰老Opn消息灵通的Tg小鼠肝脏OPN和HMGB1表达增强，发生自发纤维化3.在缺乏纤维原性刺激的情况下补充图S3)。总的来说，这些体内实验结果表明，OPN位于HMGB1的上游，OPN的增加可能驱动HMGB1，在小鼠肝纤维化的发病机制中起着重要作用;然而，HMGB1作为纤维原性旁分泌和/或自分泌DAMP的具体机制尚不清楚。

    我们之前已经建立了OPN在体内促进肝纤维化的两种机制。由于人类和小鼠的共定位研究也表明肝细胞来源的HMGB1可能在肝纤维化中发挥作用，接下来我们评估了肝细胞中阻断HMGB1对肝纤维化发展的影响。我们证明了选择性消融Hmgb1在肝细胞中部分阻止了CCl4在BDL模型中也得到了验证。

    为了进一步确定肝细胞来源的OPN和HMGB1在造血干细胞产生胶原i的上调中的旁分泌作用，建立了肝细胞与造血干细胞的共培养。这些实验表明，肝细胞是OPN和HMGB1的主要来源，并在增加造血干细胞产生胶原i的过程中发挥旁分泌作用。通过中和Abs对OPN或HMGB1的阻断作用和肝细胞特异性消融进一步证明了这一点Opn或Hmgb1在共同文化中。在这两种情况下，造血干细胞中的胶原- i合成显著减少，但当Hmgb1被切除。因此，肝细胞来源的OPN和HMGB1靶向造血干细胞并驱动其促纤维化行为。

    一旦确定了肝细胞来源的OPN和HMGB1的作用，我们接着询问造血干细胞中的细胞内OPN和HMGB1是否也可以发挥自分泌作用，推动瘢痕形成。因为我们之前已经证明了hsc表达OPN1本研究揭示了在OPN处理下HMGB1的诱导，接下来我们烧蚀了这两个蛋白。(1)调控的自分泌效应分析OpnHMGB1的产生和(2)调节的表达Hmgb1胶原- i合成的表达表明，细胞内OPN也是HMGB1的上游，并调节胶原- i的表达。

    接下来，为了剖析OPN和HMGB1对造血干细胞促纤维化行为的旁分泌作用的分子机制，我们用rOPN或rHMGB1处理造血干细胞。我们之前的研究表明，rOPN通过结合α来上调造血干细胞中胶原蛋白i的产生vβ3.整合素，激活PI3K-pAkt1/2/3-NFκB信号通路，促进胆道上皮细胞导管反应，增加TGF-β的产生。1，3.然而，根据我们的数据，我们也认为OPN的下游靶点，如HMGB1，可能参与增加胶原- i沉积，从而通过调节瘢痕形成来促进肝纤维化的病理生理学。

    细胞外OPN在静止和激活的造血干细胞中诱导HMGB1和胶原蛋白i的表达，并促进HMGB1从细胞核转位到细胞质，驱动造血干细胞产生胶原蛋白i，这在转染实验中得到了证实，该实验使用了调节HMGB1亚细胞定位以响应刺激的结构。在rOPN处理下防止hsc中HMGB1乙酰化的结构表明PTM在这种情况下对i型胶原产生的关键作用。事实上，对潜在PTMs的分析显示，在OPN处理下，HMGB1在8个赖氨酸簇(28 - 30,180和182-185)中广泛乙酰化，这可以解释HMGB1的细胞质增加，因为乙酰化阻止HMGB1核再入。为了了解这种修饰是如何发生的，接下来我们测量了HATs和HDACs的活性以及这些蛋白质的表达。OPN降低HDACs1/2活性并乙酰化HMGB1，从而促进HMGB1细胞质定位和增加。此外，OPN激活NOX并刺激O2．−最终抑制了HDACs1/2的表达，允许HMGB1乙酰化，并上调了hsc中胶原蛋白i的表达。由此可见，细胞外OPN可旁分泌促进hsc衍生HMGB1的自分泌作用，驱动i型胶原沉积。

    最后，人类和小鼠的数据以及共培养研究表明，肝细胞是HMGB1的主要来源，HMGB1被确定为OPN的下游。值得注意的是，虽然肝细胞分泌大量的HMGB1，7造血干细胞分泌这种物质，但程度要小得多。接下来，我们证明了细胞外HMGB1本身也通过RAGE信号和激活PI3K-pAkt1/2/3通路向hsc发送信号，从而上调hsc中的胶原蛋白i。因此，RAGE在hmgb1介导的肝纤维化过程中对胶原蛋白i合成的影响中起主要作用。

    虽然HMGB1在其他肝脏疾病中也有报道，20 - 25HMGB1在肝纤维化中的作用迄今尚未得到充分评估。因此，我们已经确定，在肝纤维化发作期间，OPN的增加，以及HMGB1的增加，会导致瘢痕形成。正如本研究中提出的(见在线补充图S4)中，该警报蛋白的显著上调对造血干细胞具有重要的旁分泌和自分泌作用，因此可以靶向预防或减缓纤维化过程。

    总的来说，这项研究通过加强肝脏OPN和HMGB1(一种无菌DAMP)在肝纤维化发病中的作用，挑战了我们目前对肝脏疾病驱动机制的观点，并验证了一种新的假设，即在纤维化发生过程中，OPN的增加，以及HMGB1的增加，作为一种旁分泌和自分泌信号，引发瘢痕形成。开发高效的肝纤维化治疗方法必须针对驱动与肝细胞损伤相关的早期纤维化的分子机制，以便快速干预。重要的是，HMGB1具有与其他蛋白质不同的优势，由于其半衰期较长，为临床干预提供了更广泛的时间框架。26因此，它是预防纤维化进展的一个有吸引力的靶点。OPN和HMGB1也可能参与肝纤维化发生的其他事件，如坏死、炎症和肠道通透性增加。最后，由于它们在肝细胞中产生的程度，肝细胞来源的OPN和HMGB1对瘢痕形成的总体贡献可能远比造血干细胞更相关。它们在其他肝细胞或其他器官中的产生是否也与肝纤维化相关或可能协同，以及HMGB1的特异性PTMs是否也可以调节HMGB1在肝脏环境中的有害作用，这仍然是一个悬而未决的问题。

    致谢

    作者非常感谢David T Denhardt博士(Rutgers大学，New Brunswick, New Jersey, USA)慷慨赠送2A1和2C5 Abs, Marco E. Bianchi (San Raffaele大学，Milan, Italy)提供Hmgb1Timothy R. Billiar(匹兹堡大学，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)Hmgb1fl / fl和Satoshi Mochida(埼玉医科大学，埼玉，日本)提供Opn消息灵通的Tg老鼠。我们也非常感谢涅托实验室的所有过去和现在的成员，他们在整个项目过程中提出了有益的意见和建议。共聚焦显微镜在西奈山伊坎医学院的显微镜共享资源设施进行。

    参考文献

    1. ↵
      1. 王X，
      2. Lopategi一个，
      3. 通用电气X，等
      ．骨桥蛋白诱导导管反应导致肝纤维化．肠道2014；63：1805- - - - - -18．doi: 10.1136 / gutjnl - 2013 - 306373
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    2. ↵
      1. 梁TM，
      2. 王X，
      3. KitamuraN，等
      ．骨桥蛋白延缓肝纤维化的消退．实验室投资2013；93：1082- - - - - -9．doi: 10.1038 / labinvest.2013.104
      OpenUrl CrossRef PubMed
    3. ↵
      1. UrtasunR，
      2. Lopategi一个，
      3. 乔治J，等
      ．骨桥蛋白是一种氧化应激敏感细胞因子，通过整合素α (V)β(3)接合和PI3K/pAkt/NFκB信号通路上调胶原蛋白i．肝脏病学2012；55：594- - - - - -608．doi: 10.1002 / hep.24701
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    4. ↵
      1. 康沪江，
      2. 李H，
      3. 崔沪江，等
      ．非组蛋白核因子HMGB1在结肠癌中磷酸化并分泌．实验室投资2009；89：948- - - - - -59．doi: 10.1038 / labinvest.2009.47
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    5. ↵
      1. TairaJ，
      2. 智库Y，
      3. KuwanoK，等
      ．蛋白磷酸酶2A在核浆穿梭和高迁移率群盒分泌过程中去磷酸化磷酸丝氨酸1．J物化学2013；154：299- - - - - -308．doi: 10.1093 / jb / mvt056
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    6. ↵
      1. 比安奇我，
      2. 曼AA
      ．高迁移率组盒1 (HMGB1)蛋白在先天免疫和适应性免疫之间的十字路口．Immunol牧师2007；220：35- - - - - -46．doi: 10.1111 / j.1600 - 065 x.2007.00574.x
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    7. ↵
      1. 通用电气X，
      2. 安东尼DJ，
      3. 陆Y，等
      ．高迁移率群盒-1参与酒精性肝病(ALD)的发病机制．生物化学2014；289：22672- - - - - -91．doi: 10.1074 / jbc.M114.552141
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    8. ↵
      1. ScaffidiP，
      2. MisteliT，
      3. 比安奇我
      ．坏死细胞释放染色质蛋白HMGB1引发炎症．自然2002；418：191- - - - - -5．doi: 10.1038 / nature00858
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    9. ↵
      1. Albayrak一个，
      2. UyanikMH，
      3. Cerrah年代，等
      ．HMGB1是揭示慢性肝炎纤维化的新的间接标志物和治疗的新靶点吗?病毒Immunol2010；23：633- - - - - -8．doi: 10.1089 / vim.2010.0080
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    10. ↵
      1. Mochida年代，
      2. YoshimotoT，
      3. Mimura年代，等
      ．在肝细胞中表达骨桥蛋白的转基因小鼠作为自身免疫性肝炎的模型．生物化学生物物理Res公社2004；317：114- - - - - -20.．doi: 10.1016 / j.bbrc.2004.02.180
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    11. ↵
      1. 黄H，
      2. Nace吉瓦，
      3. 麦当劳卡，等
      ．肝细胞特异性高迁移率群框1缺失加重肝脏缺血/再灌注损伤:细胞内高迁移率群框1在细胞保护中的作用．肝脏病学2014；59：1984- - - - - -97．doi: 10.1002 / hep.26976
      OpenUrl CrossRef PubMed
    12. ↵
      1. YamanishiK，
      2. 美国能源部N，
      3. 住田米，等
      ．肝细胞核因子4 α是小鼠大脑抑郁和生理稳态相关的关键因子．《公共科学图书馆•综合》2015；10：e0119021．doi: 10.1371 / journal.pone.0119021
      OpenUrl CrossRef PubMed
    13. ↵
      1. BonaldiT，
      2. TalamoF，
      3. ScaffidiP，等
      ．单核细胞高乙酰化染色质蛋白HMGB1，使其重定向到分泌．EMBO J2003；22：5551- - - - - -60．doi: 10.1093 / emboj / cdg516
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    14. ↵
      1. PashevaE，
      2. Sarov米，
      3. BidjekovK，等
      ．CBP体外乙酰化HMGB-1和-2蛋白:酸性尾巴的作用．生物化学2004；43：2935- - - - - -40．
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    15. ↵
      1. 他米，
      2. 张B，
      3. 魏X，等
      ．NADPH氧化酶活性介导的HDAC4/5-HMGB1信号通路参与脑缺血/再灌注损伤．细胞Mol医学2013；17：531- - - - - -42．doi: 10.1111 / jcmm.12040
      OpenUrl CrossRef PubMed
    16. ↵
      1. 古德温米，
      2. HerathC，
      3. 贾Z，等
      ．晚期糖基化终产物增加实验性肝纤维化．J胃肠醇2013；28：369- - - - - -76．doi: 10.1111 / jgh.12042
      OpenUrl CrossRef PubMed
    17. ↵
      1. 三浦K，
      2. 杨l，
      3. 范RooijenN，等
      ．toll样受体2和棕榈酸通过小鼠炎症小体激活共同促进非酒精性脂肪性肝炎的发展．肝脏病学2013；57：577- - - - - -89．doi: 10.1002 / hep.26081
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    18. ↵
      1. Vespasiani-GentilucciU，
      2. Carotti年代，
      3. PerroneG，等
      ．NAFLD患者肝脏toll样受体4表达与门脉炎症和纤维化相关．肝脏Int2015；35：569- - - - - -81．
      OpenUrl CrossRef PubMed
    19. ↵
      1. 三浦K，
      2. 小玉Y，
      3. 井口年代，等
      ．toll样受体9通过诱导白细胞介素-1 β促进小鼠脂肪性肝炎．胃肠病学2010；139：323- - - - - -34. e7．doi: 10.1053 / j.gastro.2010.03.052
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    20. ↵
      1. Tsung一个，
      2. Klune小，
      3. 张X，等
      ．肝脏缺血诱导HMGB1的释放涉及toll样受体4依赖性活性氧的产生和钙介导的信号通路．J实验医学2007；204：2913- - - - - -23．doi: 10.1084 / jem.20070247
      OpenUrl 摘要/免费的全文
    21. ↵
      1. martin murphyBV，
      2. 霍尔特国会议员，
      3. 居C
      ．损伤相关分子模式分子在对乙酰氨基酚诱导小鼠肝损伤中的作用．Toxicol列托人2010；192：387- - - - - -94．doi: 10.1016 / j.toxlet.2009.11.016
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    22. ↵
      1. 李X，
      2. 王路，
      3. 王LW，等
      ．顺铂通过抑制核HMGB1释放来预防急性肝衰竭．Mol科学2013；14：11224- - - - - -37．doi: 10.3390 / ijms140611224
      OpenUrl CrossRef PubMed
    23. ↵
      1. Majumdar米，
      2. RathoR，
      3. 乔拉Y，等
      ．高水平的循环HMGB1作为病毒性戊型肝炎患者急性肝衰竭的生物标志物．肝脏Int2013；33：1341- - - - - -8．
      OpenUrl CrossRef PubMed 科学网
    24. ↵
      1. 王W，
      2. 太阳l，
      3. 邓Y，等
      ．抗高迁移率基团盒1抗体与肿瘤坏死因子-α抗体的协同作用d-(+)-半乳糖胺盐酸盐/脂多糖诱导的急性肝衰竭．2月J2013；280：1409- - - - - -19．doi: 10.1111 / febs.12132
      OpenUrl CrossRef PubMed
    25. ↵
      1. 安东尼DJ，
      2. 威廉姆斯DP，
      3. Kipar一个，等
      ．在对乙酰氨基酚肝毒性过程中，饮食限制抑制细胞凋亡和HMGB1氧化并促进炎症细胞的募集．摩尔地中海2010；16：479- - - - - -90．doi: 10.2119 / molmed.2010.00126
      OpenUrl PubMed
    26. ↵
      1. 王H，
      2. 布鲁姆O，
      3. 张米，等
      ．HMG-1作为小鼠内毒素致死性的晚期中介物．科学1999；285：248- - - - - -51．doi: 10.1126 / science.285.5425.248
      OpenUrl 摘要/免费的全文

    补充材料

    • 补充数据

      此网页文件由BMJ出版集团从作者提供的电子文件制作而成，并没有对内容进行编辑。

    脚注

    • EA和XG的贡献相当。

    • 贡献者EA和XG进行了体外和体内实验，并编辑了手稿。T-ML、FM、AL、YL、NK、RU进行了部分实验并对手稿进行了编辑。NT提供了人体样本并编辑了手稿。DJA对HMGB1异构体进行了分析，并编辑了手稿。NN指导了该项目，起草并编辑了手稿，并获得了资金。

    • 资金西班牙Asociación Española para el Estudio del Hígado (EA)的短期Bancaja奖学金和博士后奖学金。巴斯克政府(西班牙)(AL)、庆应义塾大学医学院(日本)(NK)和西班牙纳瓦拉政府(RU)博士后奖学金。威康信托基金研究奖学金(DJA)和医学研究理事会药物安全科学中心(DJA和NN)的支持。英国再生医学平台(UKRMP) (DJA和NN)。美国公共卫生服务部门从国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所(NN)拨款R01 DK069286、R56 DK069286和R56 DK069286- 06s1。美国公共卫生服务资助P20 AA017067, P20 AA017067- 01s1, P20 AA017067- 03s1和U01 AA021887来自国家酒精滥用和酒精中毒研究所(NN)。

    • 相互竞争的利益没有宣布。

    • 病人的同意获得的。

    • 伦理批准IRB。

    • 出处和同行评审不是委托;外部同行评审。

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