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客观的大量分子异质性胰腺导管腺癌(PDA),一些有效的治疗方法和高死亡率使这种疾病个体化治疗的主要推进发展模式。的p16-cyclin D-cyclin-dependent激酶4/6-retinoblastoma (RB)蛋白质(到)途径,细胞增殖的调节器,在PDA管制。我们的目标是开发一种新颖的基于目标到PDA个性化治疗策略。
设计敏感的CDK4/6抑制剂pd - 0332991 (palbociclib)相关的蛋白质和基因组数据在19个主要patient-derived PDA行识别反应的生物标记物。体内疗效pd - 0332991和联合疗法的决心在皮下,intrasplenic和原位肿瘤模型来自基因组测序病人标本和转基因模型。从力学上看,单药治疗和联合治疗的上下文中进行了肿瘤细胞和细胞外基质(ECM)的信号。预后相关性的伴侣生物标志物,RB蛋白,在独立的评估和验证PDA患者组(> 500标本)。
结果Subtype-specific体内pd - 0332991为基础的疗法的功效是第一次观察到PDA发展的多个阶段:初级肿瘤生长、复发(二线疗法)和转移性设置和潜在可能遵循一个简单的生物标志物(RB蛋白)。pd - 0332991显著破坏周围的ECM组织,导致增加静止,细胞凋亡,改善化学敏感性,减少入侵,转移性传播和PDA体内发展。RB蛋白是主要流行的可操作的和转移性PDA,可能存在一个有前途的预测生物标志物指导这种治疗方法。
结论这项研究展示了在PDA到抑制标准治疗的承诺当应用于分子subtype-specific上下文。
- 胰腺癌
- 细胞外基质
- 分子机制
- 细胞周期
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本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
尽管最近的重大努力开发新的疗法,化疗仍是晚期胰腺癌患者的护理标准,尽管总体存活率仅略有改善。
我们之前和其他人表明胰腺癌是一种分子不同的疾病,需要发展个性化治疗策略以提高生存率。
胰腺癌港口经常放松管制的p16-cyclin D-CDK4/6-retinoblastoma (RB)蛋白通路(到通路),这可能是治疗利用。
有什么新发现吗?
利用一系列强劲patient-derived异种移植和细胞系模型,匹配患者胰腺肿瘤的化身,我们展示精美敏感性CDK4/6抑制剂组合在标准治疗胰腺癌的亚型,与细胞凋亡增加,静止和减少标记的表达与胰腺星状细胞活性有关。
pd - 0332991促进细胞外基质(ECM)的改造来提高治疗效果的吉西他滨(GEM) subtype-specific的方式和在疾病进展的多个阶段:初级肿瘤生长、复发(二线治疗)和转移性设置和可能由一个简单的指导,临床适用的生物标志物(RB蛋白)。
到抑制剂,pd - 0332991 (palbociclib)阻碍在肝脏转移性殖民化而使感光细胞剪切应力,通常转移所经历的循环肿瘤细胞,到一个额外的方式抑制可以直接影响转移在RB-high胰腺导管腺癌(PDA)。
RB蛋白表达被确认为患者生存的独立预后因子两个独立的胰腺癌病人群,可以检测到很大一部分转移病例(67%)。RB表达式之间的相关主要和匹配转移人体组织。
到通路抑制单独或结合化疗导致多方面的全球肿瘤细胞抑制作用在PDA的不同阶段,进展和减少肿瘤微环境中的关键组件(ECM),共同推动癌症细胞增殖、入侵和药物抗性。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
我们的研究结果与最近的临床证据的效力pd - 0332991治疗乳腺癌,支持进一步的临床同伴biomarker-driven pd - 0332991作为胰腺癌治疗的发展,特别是在结合化疗,宝石。
RB的使用组织的分析表达式可以用于诊断的临床应用。高RB表达式中检测出很大一部分的胰腺癌患者(~ 65% ~ 43%和67%在群主要可操作的和转移PDA检查),它可能使分层和浓缩的潜在反应CDK4/6联合治疗。
这些发现及时,可以补充和直接关系到当前non-biomarker-driven临床试验测试pd - 0332991在胰腺和其他固体癌症(NCT02501902,NCT03065062)。
介绍
胰腺导管腺癌(PDA)是一种分子不同的疾病,由畸变在至少10个核心信号通路。1 - 4除了揭示新的生物洞察PDA的分子发病机制,这些研究开发小说创造了重要机遇,量身定制的治疗,我们最近所示。5个6护理标准化疗吉西他滨(GEM),7结合纳米albumin-bound紫杉醇(nab-paclitaxel),8或FOLFIRINOX(铂、伊立替康、氟尿嘧啶和亚叶酸)9只提供适度增加病人生存在没有人群。10选择性措施个性化治疗这种攻击性疾病因此迫切需要。
的p16-cyclin D-CDK4/6-retinoblastoma (RB)(到通路)促进G蛋白途径1/ s阶段过渡,是一个关键的信号通路在PDA管制。1 2 11细胞周期素D复合物与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs) 4和6,驾驶RB蛋白磷酸化和G1阶段进展。12在癌症,到活动和随后的不受控制的增殖可以增强纯合缺失CDKN2A(编码p16基因INK4A蛋白质),CDK4/6突变和/或细胞周期蛋白D1 (CCND1)超表达或放大。13
发现细胞周期素D /到作为癌基因引发了小分子CDK抑制剂(CDKi)的发展。选择性CDK4/6i,包括pd - 0332991 (palbociclib),显示出巨大的潜力在ER + / HER2治疗转移性乳腺癌。14 - 16虽然没有发现,治疗反应的生物标记的一个关键要求灵敏度CDK4/6i乳腺癌可能与ER- - - - - -积极性和依赖ER +亚型的细胞周期蛋白D1信号,增强CDK4/6活动扩散。12日17
在PDA、短期抗增殖活动CDK4/6i被描述。18在这里,我们调查CDK4/6i的治疗效果和临床应用组合在现实与长期随访先进的临床前patient-derived和PDA的转基因模型。我们揭示了一个新的角色到抑制的调节主要肿瘤生长和基质粘连形成的几个独立的小鼠模型RB-high PDA、损害殖民化的二级网站(肝脏)和抗剪切应力,经常经历循环肿瘤细胞(ctc),而在转移性RB-high PDA延缓疾病进展。详细分析揭示了一个复杂的作用机制与pd - 0332991对肿瘤细胞和产生双重影响周围的环境。RB表达,评估候选人CDK4/6i伴侣生物标志物,显示高流行主要可操作的和人类PDA转移。总的来说,这些临床前研究可能提供有前景的新机会subtype-specific针对原发性和转移性PDA。
方法
Patient-derived模型
我们的Kinghorn癌症中心(TKCC) patient-derived异种移植(pdx;n = 45)和patient-derived细胞系(PDCLs;n = 19)曾是全基因组测序。1PDCLs经短串联重复序列(STR)分析独特的(cellbankaustralia.com)。文化条件下,荧光ubiquitination-based (FUCCI)和荧光素酶细胞周期指标引入PDCLs和相关体外研究:细胞周期,迁移,入侵,剪切应力、收缩和细胞凋亡分析详细在网上补充信息2。
补充材料
动物研究
生存研究由皮下注射植入早期第三段PDX(~ 4毫米3)免疫功能不全的Balb / c-Fox1nuAusb(裸体)老鼠。pd - 0332991、宝石和nab-Paclitaxel剂量是基于已发表的研究,5 18 19治疗时间表,响应测量和设置intrasplenic和原位研究详细的在网上补充信息2。
病人资料和免疫组织化学
患者样本和数据是通过澳大利亚胰腺基因组计划(APGI) /国际癌症基因组协会(ICGC) (n = 200),新南威尔士胰腺癌网络(NSWPCN;n = 365)和皇家北岸医院转移组(RNSH;n = 54),所述。1 5 20进一步队列描述和免疫组织化学程序概述了在网上补充信息2。
统计数据
统计分析使用GraphPad棱镜(美国加州拉霍亚,V7.0.1, GraphPad)和Statview (V5.0 SAS研究所Inc .,卡里,数控,美国)。相关性分析使用皮尔逊相关系数测试。比较临床病理的相关使用确切概率法进行,学生的学习任务和Χ2测试,在适当的地方。使用生存率较生存分析。为多个治疗组比较,意义是由单向方差分析,其次是图基事后多重比较的测试* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。临床病理的变量显示,单变量分析p < 0.25都进入到一个Cox比例风险回归模型进行多变量分析。评估RB的协议状态主要与转移性pda、科恩Kappa和独联体被报道的95%。
结果
pd - 0332991的敏感性胰腺癌patient-derived细胞系(PDCLs)与高水平的总和磷酸化RB蛋白
系统地检查在PDA CDK4/6i pd - 0332991的功效,我们确定其毒性19全基因组测序5主要PDCLs和比较这些数据与几个临床使用化疗(见在线补充表1)。PDCLs表现出广泛的pd - 50 (IC 0332991的敏感性(抑制浓度50)范围内8海里- - - - - -35µM),(26%)被一个子集(IC高度敏感50< 1µM)。“药物敏感性在癌症基因组学”(Wellcome Trust)数据库分析显示之间的关联RB1突变和pan-cancer pd (p = 3.3×10 - 0332991阻力- - - - - -17,看到在线补充图1)。作为RB1突变在胰腺癌中是罕见的1(1/19 PDCLs;在网上看到的补充表1),我们下一个相关的基线G蛋白表达的关键1/ S检查点组件(请参阅在线补充图1 b,补充表2)与体外pd - 0332991响应。值得注意的是,道达尔和磷酸化RB(复审委员会;Ser780)水平最重要的生物标记物预测pd - 0332991敏感性(图1一个;r =−0.751;p = 0.0002和r =−0.728, p = 0.0004),分别与G之间没有相关性1/ / S检查点突变表达和应对pd - 0332991或胰腺癌化疗PDCLs(见在线补充表3,补充图1汉英)。
补充材料
pd - 0332991强化吉西他滨(GEM)杀伤力patient-derived分层胰腺癌细胞株(PDCLs)和导致细胞凋亡增加,G0细胞周期静止。(一)相关性pd - 0332991的敏感性和表达(左)视网膜母细胞瘤(RB)或(右)磷酸化RB(复审委员会)19 PDCLs(正常化β-actin水平和low-expressing TKCC-16;包括在多个凝胶占任何intergel /传输可变性)。微密度分析正常蛋白质的表达和相关总结请参考补充表2和3。(B)表达在RB-high复审委员会(TKCC-03、TKCC-05 TKCC-26)和RB-negative (TKCC-27) PDCLs pd - 0332991治疗后24小时(0.3µM或1µM,分别)。(C)免疫印迹描绘微不足道的复审委员会和RB蛋白在胰腺癌细胞水平从转基因Pdx1-Cre孤立;KrasLSL.G12D / +;p53R172H / + (KPC)模型的胰腺癌。宝石的组合指数(CI) / pd - 0332991组合当特工被组合在一个固定的比例来自各自的抑制浓度50 (IC50)值(D) RB-high和(E) RB-low /负面PDCLs。CI值确定在不同有效剂量(EDs)使用CompuSyn程序计算。CI > 1表示对立,CI < 1协同和CI = 1添加剂。23数据提出了均值±扫描电镜;(n = 4执行独立的实验一式三份)。插图:热量地图的可行性和CI值宝石/ pd - 0332991组合在不同的比率在候选人(D) RB-high (TKCC-03)和(E) RB-negative细胞(TKCC-27;n = 3独立实验执行一式三份)。(F)荧光ubiquitination-based细胞周期指标(FUCCI)贴上TKCC-05或TKCC-27细胞治疗与宝石(0.01的µM), pd - 0332991(分别为0.3µM或1µM)或组合,在指定时间点(3 - 10天)沾Annexin-V-Cy5/4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)并使用流式细胞术分析。总在所有检查时间点凋亡量化和治疗(G) RB-high TKCC-05和(H) RB-negative TKCC-27细胞。(我)代表TKCC-05-FUCCI细胞周期情节和后处理(10天)控制策略和控制。量化细胞周期分布在所有检查治疗(10天时间点)(J) RB-high和(K) RB-negative PDCLs。插图:FUCCI细胞周期振荡的插图。数据显示为均值±SEM (n = 4独立实验),与对比对相关车辆执行控制,除非指定。意义是由单向方差分析,其次是图基事后多重比较测试,在* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。PDA、胰腺导管腺癌;PFA,多聚甲醛。
有效目标调制确认候选人RB-high PDCLs通过免疫印迹复审委员会pd - 0332991治疗后(TKCC-03 / -05;图1 b),不影响RB-negative pd - 0332991耐TKCC-27细胞(图1 b,正确的)。有趣的是,在RB-high p16-positive,CDK6-amplified TKCC-26,减少pd - 0332991后,这表明在PDACDK6放大可能支持对CDK4/6i敏感,无论p16的表达。
化疗的宝石把RB-high和pd - 0332991CDK6放大胰腺PDCLs
结合pd - 0332991标准的保健治疗PDA、宝石,7在PDCLs和初级鼠PDA细胞(图1 c)从转基因Pdx1-Cre LSL-KrasG12D / +,LSL-Trp53R172H / +(KPC)模型21日22强大的细胞产生line-specific功效,结合指数分析23显示之间的协同交互的宝石和pd - 0332991 RB-high PDCLs (TKCC-03、-05、-15、-17、-26;图1 d)和对抗RB-low /负面PDCLs (TKCC-06, -16年、-23年和-27年)和KPC细胞(图1 e)。协同作用的鲁棒性是通过检查确认宝石/ pd - 0332991治疗五PDCLs 25药物组合测试,与协同反复观察变量药物在RB-high比率和对抗RB-low /负线(图1 d, E插图,在网上看到的补充图2)。
pd - 0332991基于单药治疗和联合治疗对RB-high肿瘤细胞诱导关键影响
理解细胞的pd - 0332991的抗肿瘤活性及其机制协同作用与宝石,我们对选择治疗对细胞周期和细胞凋亡的影响在候选人RB-high / RB-negative PDCLs (图1 f)与FUCCI传导,细胞周期进展,双色荧光生物传感器24(见在线补充图3)。生物传感器和目标函数调制经活细胞成像的pd - 0332991治疗FUCCI-PDCLs(见在线补充图4),显示出强劲的G0/ G1逮捕尤其是RB-high TKCC-05,不是RB-negative TKCC-27细胞,证实了传统分析(见在线补充图4 e, F)。
接下来,pd - 0332991治疗FUCCI-TKCC-05显著诱导细胞凋亡(4到10天;分别为p < 0.0001, p < 0.01;图1 g,看到在线补充图5)。同意发表的工作,25宝石刺激了细胞凋亡。重要的是,宝石/ pd - 0332991组合的凋亡效应显著提高每个单一疗法(图1 g,看到在线补充图5 c, E, G),而不是在RB-negative TKCC-27 (图1 h,看到在线补充图5 d、F、H),支持潜在的细胞毒性的作用机制pd - 0332991在选定的细胞类型。作为比较,结合pd - 0332991和临床使用宝石/ nab-paclitaxel8被发现显著增强细胞凋亡RB-high TKCC-05(相比之下,宝石/ nab-paclitaxel;在网上看到的补充图5 c),尽管宝石/ pd - 0332991效果出现更健壮(早/晚时间点,图1 g)。
检查quiescence-associated改变细胞周期动力学,我们使用了一个建立了流量仪的方法26分析FUCCI G和量化0与G1积累后pd - 0332991基础治疗(图1我)。pd - 0332991和宝石/ pd - 0332991显著增加mKO2 + + G0静止的分数,26相比之下,宝石或车辆尤其是RB-high设置(图1 j, K;在网上看到的补充图6)。细胞周期分析,药物治疗显示凋亡细胞最重要的提高G0基于分数后pd - 0332991治疗(见在线补充图6 e)。总的来说,这些发现提供了证据表明,激活细胞凋亡和G0静止是关键机制背后的观察宝石和CDK4/6i 2 d之间的协同作用。
CDK4/6抑制调节RB-high PDA细胞的侵袭性和ECM组织
一项研究报道,孵化后pd - 0332991高的浓度(5µM),选择商业PDA显示迁移能力的提高。27因为三维拓扑和机械提供的线索基质可以塑造和驱动浸润性肿瘤的行为,28我们检查CDK4/6抑制的效果的入侵潜力RB-high和RB-negative PDA电池使用一个三维organotypic模型建立的入侵6 29(图2一个)。在3 d, pd - 0332991或宝石分别显著受损入侵RB-high TKCC-05细胞,与pd - 032291治疗更有效(图2 b,左,中间)。此外,宝石/ pd - 0332991组合明显优于每个单一疗法(图2 b, C)。pd - 0332991并不影响RB-negative KPC的入侵能力在3 d细胞(图2 d, E)。此外,观察到的抑制性影响RB-high TKCC-05入侵,伴随着减少核扩散和pd - 0332991细胞凋亡增加和宝石/ pd - 0332991治疗矩阵(图2做减法,看到在线补充图7 a, B)。相比之下,pd - 0332991治疗轻微增加入侵KPC细胞的增殖,不会影响细胞凋亡(见在线补充图7 c, D)。在2 d,宝石/ pd - 0332991的迁徙能力RB-high TKCC-05细胞(见在线补充图8),尽管pd - 0332991在3 d -介导的效果更明显,强调潜在的复杂CDK4/6针对肿瘤细胞在一个复杂的微环境。
CDK4/6i抑制损害视网膜母细胞瘤(RB)的入侵潜力-胰腺导管腺癌(PDA)细胞,破坏胶原蛋白基质的完整性。(A)与PDA细胞organotypic入侵检测的示意图表示。(B)入侵vehicle-treated和药物治疗增强型绿色荧光蛋白(eGFP) -luciferase-labelled TKCC-05细胞通过3 d organotypic矩阵在21天,显示绿色荧光蛋白(GFP)免疫组织化学。(C)量化细胞入侵(100µm- - - - - -400µm)。(D)入侵vehicle-treated和pd - 0332991治疗Pdx1-Cre;KrasLSL.G12D / +;p53R172H / + (KPC)细胞通过3 d organotypic矩阵在14天,由multi-cytokeratin染色和(E)量化表示。(F)的代表图像ki - 67染色标记的细胞增殖和量化的百分比TKCC-05 ki - 67细胞阳性organotypic矩阵与pd - 0332991治疗干预后的基础方法。(G)代表图像的裂解caspase-3 (CC3)染色标记的细胞凋亡和量化TKCC-05细胞阳性CC3(比正常控制)organotypic矩阵后处理。(H)示意图的收缩试验(前),代表图像telomerase-immortalised纤维母细胞(TIF)胶原蛋白控制矩阵(底部)(我)量化矩阵面积±pd - 0332991在端点(9天)。(J)代表最大强度投影的二次谐波发生(宋惠乔)信号和宋惠乔(K)量化信号强度在高峰TIF-collagen矩阵收缩±9天后pd - 0332991。(左)和偏振光成像具有亮Picro天狼星红点的TIF-collagen矩阵±pd - 0332991和量化总胶原蛋白含量的测定(M)的总信号强度(亮场)和(N)通过偏振光强度信号的获取。(O)的贡献和量化信号发出纤维高、中、低双折射正常化总信号获得通过两极分化Picro天狼星红点的胶原蛋白的成像矩阵±pd - 0332991。厚改建胶原纤维高双折射(橙色),而少改建纤维较低双折射(绿色)。数据organotypic和胶原蛋白收缩研究提出了均值±SEM (n = 3独立实验,一式三份矩阵/条件执行,每重复)。意义是由单向方差分析,其次是图基事后多重比较测试,在* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。除非特别指出,针对车辆意义进行比较。宝石,吉西他滨;PDCL patient-derived细胞系。
从细胞外基质(ECM)沉积、纤维化和信号流程发挥重要作用在调节表型的胰腺肿瘤细胞和治疗反应,6 30我们调查的影响CDK4/6i ECM完整性使用初级fibroblast-driven收缩化验,31日最近通过我们的团队(图2 h)。32pd - 0332991明显受损的纤维母细胞的合同(图2我)和改造纤维胶原蛋白,通过二次谐波发生(宋惠乔)成像(图2 j - k;在网上看到的补充视频1),具有亮/偏振光显微镜Picro-Sirius红染色(图2 l-o),表明在pd - 0332991治疗明显混乱ECM网络矩阵。基质收缩障碍是独立成纤维细胞增殖的变化(在2 d和3 d;在网上看到的补充图9)。作为重要的anti-invasive这些实验显示,抗增殖和ECM-modulatory活动pd - 0332991在复杂的3 d环境中,因此我们试图评估pd - 0332991和组合是否影响PDA进展和体内药物反应。
补充材料
CDK4/6i单药治疗和联合治疗显著改善小鼠的生存的道与RB-high patient-derived胰腺肿瘤
治疗反应在我们early-passage pdx决心通过测量肿瘤生长,与实验设计(图3一,看到在线补充图10)使评估最初的治疗反应,和纵向分析,比较内在抗肿瘤和那些获得阻力随着时间的推移,如前所述。5 33 34引人注目的是,subtype-specific体内疗效观察,所有三个RB-high pdx检查显示显著的长期抑制肿瘤生长,改善整体生存后pd - 0332991单药治疗或宝石/ pd - 0332991治疗,相比之下,标准的护理(宝石和宝石/ nab-Paclitaxel;图3罪犯,看到在线补充表4得了)。因为宝石/ nab-Paclitaxel与累积肠毒性当管理4 - 5个治疗周期,靶向治疗的效果与宝石只有GEM-sensitive TKCC-PDX-26。除了改善生存,我们观察到显著提高复发存活率(定义在网上补充图10)后宝石/ pd - 0332991,相比之下,宝石(见在线补充图10)。相比之下,RB-negative TKCC-PDX-27, RB-low TKCC-PDX-16和RB-negative KPC orthografts抗pd - 0332991基础治疗(图3比,看到在线补充表5 a - c)。证实了“目标”调制测量抑制复审委员会和扩散(ki - 67;在网上看到的补充图11 a, B在pd - 0332991治疗RB-high PDX-05。
体内胰腺导管腺癌(PDA)模型的定制响应治疗pd - 0332991和合理设计的组合。(一)临床前测试管道在皮下模型。治疗开始时肿瘤达到150毫米3(100%),其中每个老鼠被随机分为治疗组概述:(a)吉西他滨(GEM) 120毫克/公斤每周两次腹腔内(IP)为25天,(b) pd - 0332991 150毫克/公斤每天填喂法21天,(c)宝石(120毫克/公斤)每周两次IP和pd - 0332991(150毫克/公斤)每日填喂法或(d)宝石(70毫克/公斤)和nab-Paclitaxel(30毫克/公斤)每周两次IP为25天。在组合臂,pd - 0332991管理从第2周21天,24小时内化疗后。治疗反应测量从起始的治疗(在最大容许剂量),通过时阻力发达(特点是进步的肿瘤生长的药物),是基于我们的出版工作,14日最小恢复时间额外的治疗周期。细节处理政府进一步补充信息2中列出。(罪犯)kaplan meier生存分析对pd - 0332991和宝石/ pd - 0332991 patient-derived异种移植(pdx)基于视网膜母细胞瘤(RB)分层状态,总体存活率。(eg)总体存活率的免疫力低下或同源的老鼠轴承RB-negative /低TKCC-PDX-27 PDX-16和皮下Pdx1-Cre;KrasLSL.G12D / +;p53R172H / + (KPC)肿瘤,分别接受CDK4/6i单一疗法和组合,而PDA的标准疗法。ki - 67免疫组织化学(H)代表图像上执行PDX-03和(I)分析RB-high pdx后处理在端点(收集)。(J)代表图像的裂解半胱天冬酶3 (CC3)染色,细胞凋亡的标志,在PDX-03和(K)量化RB-high pdx。 (L) Representative images of α-smooth muscle actin (SMA) stromal expression post-therapy and (M) staining quantified for RB-high PDXs across all treatment groups (n=6 mice per treatment group). Data are shown as mean ±SD. Significance was determined by one-way analysis of variance, followed by Tukey post hoc multiple comparisons test, where *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001. Unless specifically indicated, significance is compared against vehicle.
分析pd - 0332991和宝石/ pd - 0332991治疗RB-high肿瘤残余透露重要,长期在体内抑制增殖和凋亡增加(图3 h-k),也与减少α-smooth肌肉肌动蛋白(SMA)表达式(图3 l m;在网上看到的补充图11 c),一个典型的胰腺星状细胞激活的标志(已经),推动广泛纤维化通常观察到PDA。35 36在pd - 0332991抗肿瘤,只有宝石/ nab-Paclitaxel治疗(见在线显示任何重要的调节效应补充图11 d-f)。与免疫组织化学(包含IHC)分析,重要的肿瘤回归RB-high和观察CDK6放大pdx后处理(30天的时间点;在网上看到的补充图11 g)进一步支持,除了其抑制细胞生长的活性,pd - 0332991可能发挥细胞毒性对体内特定的PDA亚型的影响。
基于pd - 0332991治疗干预抑制肝脏中蔓延而使感光RB-high肿瘤细胞剪切应力和减少细胞附件
接下来,我们执行intrasplenic注射RB-high TKCC-05-FUCCI细胞与系统性pd - 0332991政府的检验功效pd - 0332991为基础的疗法在限制胰腺癌扩散到遥远的网站(图4一)。病理分析串行部分肝转移(图4 b, C)证实小鼠治疗pd - 0332991和宝石/ pd - 0332991显示显著减少转移性传播与宝石/ nab-Paclitaxel相比。FUCCI分析相同的肝组织进一步证实体内pd - 0332991活动和能力有效地抑制CDK4/6肝转移(图4 d, E)。
CDK4/6抑制减少细胞殖民化和提高化疗反应转移性网站,使视网膜母细胞瘤(RB) -肿瘤细胞更容易受到剪切应力。(A)的示意图表示intrasplenic注入RB-high TKCC-05-fluorescent ubiquitination-based (FUCCI)细胞细胞周期指标和相关的治疗时间。(B)代表图像和(C)量化肝微小转移和转移正常肝脏表面总面积)串行部分。箭头指向转移在肝脏组织。数据显示为平均数±标准差(n = 4老鼠每组和5串行部分器官(50)µm一步)。(D)代表的照片转移通过成像FUCCI信号和识别(E)量化细胞周期分布在肝转移TKCC-05-FUCCI intrasplenic模型实验端点。(F)流体剪切应力分析的原理,改编自巴恩斯等(37]。(G)代表TKCC-05-FUCCI凋亡情节和(H)总额的量化,早期和晚期凋亡细胞在TKCC-05±pd - 0332991(0.3µM) 24小时后剪切应力。P0代表细胞不受剪应力和P5代表细胞受到连续5曝光剪切应力。(I)量化细胞依附到胶原蛋白矩阵,在剪切应力RB-high TKCC-05细胞±pd - 0332991治疗,测量种子期后24小时。轴值(P5 / P0比率)是细胞受到五接触剪应力值除以不接触剪应力值细胞。细胞的凋亡(J)量化RB-negative TKCC-27±pd - 0332991(1µM) 24小时后剪切应力。(K)量化细胞依附到胶原蛋白矩阵,在剪切应力RB-negative TKCC-27细胞±pd - 0332991治疗。数据显示为均值±SEM (n = 3生物重复与两个collagen-coated井/条件)。意义是由单向方差分析,其次是图基事后多重比较测试,在* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。除非特别指出,针对车辆意义进行比较。 DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole; GEM, gemcitabine.
进一步理解观察到的pd - 0332991 -介导的肝殖民化,我们检查了可行性(凋亡)和细胞RB-high依恋和比较,RB-negative PDA细胞接触后控制剪切应力(100µL / s,最大1950达因/厘米2,图4 f),6 37哪些ctc暴露于体内。pd - 0332991显著诱导中细胞凋亡和细胞减少附件到胶原蛋白矩阵,特别是在RB-high肿瘤细胞(图4胃肠道,j - k)。总的来说,这些实验表明CDK4/6目标的直接作用在感光ctc已经暴露在剪切应力作为一个潜在的机制中,pd - 0332991可能在PDA调制转移。
基于pd - 0332991治疗显著改善生存和延迟转移转移RB-high PDA
检查CDK4/6i PDA肿瘤进展和转移的影响,老鼠orthotopically注射luciferase-TKCC-05肿瘤成像1周post-injection(见在线补充图12)、随机和处理标准化疗,pd - 0332991和pd - 0332991为基础的组合,直到伦理端点(图5,前)。
CDK4/6i治疗诱发体内静止在原发性肿瘤的网站,会损害脑转移,提高吉西他滨(GEM)功效在转移性patient-derived retinoblastoma-positive胰腺导管腺癌(PDA)的模型。(一)示意图说明体内测试在转移性patient-derived模型(前)。短暂,15 000 luciferase-labelled patient-derived细胞系(PDCLs)注入胰腺6-8-week-old点头/ Scid / IL-2Rγnull (NSG)老鼠。小鼠随机分成治疗组1星期post-injection,两个额外的治疗包括武器,涉及的三重组合宝石(70毫克/公斤),nab-Paclitaxel(30毫克/公斤)每周两次腹腔注射与pd - 0332991(100毫克/公斤)填喂法从星期2上的5天,5天的假的时间表20天或与pd - 0332991管理维持治疗,每日填喂法完成后的宝石/ nab-Paclitaxel治疗。肿瘤负担被生物荧光成像监控每周到道德的端点。kaplan meier生存分析pd - 0332991单药治疗,结合宝石(左)或三重组合与宝石/ nab-Paclitaxel (正确的),而宝石/ nab-Paclitaxel。Log-rank分析,* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。(B)实验装置对体内二线治疗转移性PDA测试(前)。体内的效果宝石/ pd - 0332991组合后宝石/ nab-Paclitaxel进展(底)。(C)代表图像的胰腺肿瘤(左)和肝转移相关(正确的)从原位荧光ubiquitination-based (FUCCI) -TKCC-05肿瘤细胞周期指标收集50天后处理CDK4/6i-based治疗或标准治疗(宝石/ nab-Paclitaxel)。收集车辆控制在50天时间点之前,正如所料,由于沉重的肿瘤负担。显示代表核染色(4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),前),FUCCI (mKO2-red mAG-green、overlay-yellow CD31-blue;中间)和圆)部分(底)。量化(D)细胞周期分布的主要肿瘤和肝转移(E)检查治疗组,(F)没有转移中发现pd - 0332991和宝石/ pd - 0332991治疗动物。(G)代表覆盖最大强度投影的二次谐波发生(宋惠乔)信号和FUCCI量化宋惠乔信号强度的峰值在原位FUCCI-TKCC-05肿瘤治疗后收集。(H)代表偏振光总双折射的肿瘤组织和量化的图像信号(黑色)和贡献信号发出胶原纤维与高(红色),中等(黄色)和低(绿色)双折射获得通过偏振光成像(n = 4每治疗组动物被用于分析(D, E, F, G, H)。意义是由单向方差分析,其次是图基事后多重比较测试,在* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001, * * * * p < 0.0001。
至关重要的是,基于pd - 0332991方案明显比标准疗法更有效图5一个,底,看到在线补充表6在PDA RB-high转移性),宝石/ pd - 0332991证明最好的治疗方法(中位数生存= 117天,p = 0.0001;vs宝石/ nab-Paclitaxel生存中值= 69天)。此外,metastasis-free生存,由体内成像系统(监控新;在网上看到的补充图12 c),显著增加了pd - 0332991基础治疗(见在线补充图13,补充表7)。鉴于体外观察疗效pd - 0332991结合宝石/ nab-Paclitaxel时(见在线补充图5),我们还研究了这种组合体内。虽然在实验动物治疗一般耐受性良好,两三重组合检查使用宝石/ nab-Paclitaxel和pd - 0332991与一些毒性有关,即便秘,石蜡油处理和控制通过调整pd - 0332991剂量。这两个方案,涉及伴随的pd - 0332991管理(伴随)或旨在评估潜在的CDK4/6i化疗周期之间的维持治疗(维护),表现出显著的疗效/珠宝/ nab-Paclitaxel (图5一个,右下角,看到在线补充表6和7),但并不优于宝石/ pd - 0332991。
最初的治疗与宝石/ nab-Paclitaxel后,短期反应的是发展,增加生物发光信号(见在线计量补充图12 c)。检查的治疗潜力宝石/ pd - 0332991在PDA进展放缓先进疾病设置,独立的群复发动物随后转向宝石/ pd - 0332991或控制,临床使用二线治疗,卡培他滨,38 39与上级疗效测量宝石/ pd - 0332991 (图5 b,看到在线补充表6和7)。在一致性,分析肿瘤原位FUCCI-TKCC-05收集50天后处理显示静止在主站点(胰腺肿瘤),无论靠近血管(图5汉英,看到在线补充图13 c),没有动物的肝转移治疗pd - 0332991或宝石/ pd - 0332991 (图5 c、F)。宋惠乔成像和偏振光显微镜的Picro-Sirius红点的TKCC-05-FUCCI肿瘤证实基于pd - 0332991治疗减少纤维胶原组织(图5 g-h;在网上看到的补充图14),导致细胞凋亡增加,减少α-SMA体内的表达(见在线补充图14 b, C)。
这些数据表明CDK4/6抑制显著延迟胰腺肿瘤进展通过直接针对肿瘤细胞(G0静止、凋亡)和关键部件的微环境可以调节药物抗性(即减少基质活化,减少纤维胶原组织)。作为健壮的功效在多个独立的模型RB-high PDA、RB-based分层可能促进一个更定制CDK4-targeting治疗胰腺癌的治疗方法。
核RB流行主要可操作的和转移人类PDA和具有预后价值
接下来,我们人类PDA和免疫组织化学检查RB的表达是否中断具有预后意义(图6)。高RB表达式中检测出64.5%的原发性肿瘤标本APGI / ICGC队列1(n = 200)和生存与显著提高(图6 c,看到在线补充表8)和较低的肿瘤等级(见在线补充表9)。多变量分析使用Cox比例风险模型演示了RB损失作为一个独立的预后不良因素针对疾病的生存(DSS) (HR 1.552, p = 0.0148,表1)。相比之下,p16表达,进行比较的研究,不是预后(见在线补充图15模拟)。放松管制的RB信号一直在与改善chemoresponsiveness乳腺癌40;然而当相关,RB表达式没有专门与生存在线辅助宝石(见后补充图15 e, F)。正如预期的那样,RB和p16水平强烈相关PDX (n = 45)和病人肿瘤的派生(p < 0.001,看到网上补充表10)。
![CDK4/6 inhibition decreases cell colonisation and improves chemotherapy response in metastatic sites and makes retinoblastoma (RB)-high tumour cells more vulnerable to shear stress. (A) Schematic representation of intrasplenic injection of RB-high TKCC-05-fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) cells and associated treatment timeline. (B) Representative images and (C) quantification of liver micrometastasis and total metastasis normalised to liver surface area in H&E serial sections. Arrows point to metastases in the liver tissue. Data are shown as mean±SD (n=4 mice per group and five serial sections per organ (50 µm step)). (D) Representative pictures of metastases identified via imaging of FUCCI signal and (E) quantified cell cycle distribution in liver metastases from the TKCC-05-FUCCI intrasplenic model at the experimental endpoint. (F) Schematic of the fluid shear stress assay, adapted from Barnes et al [37]. (G) Representative TKCC-05-FUCCI apoptosis plots and (H) quantification of total, early and late apoptosis in TKCC-05 cells±PD-0332991 (0.3 µM) 24 hours following shear stress. P0 represents cells not subjected to shear stress and P5 represents cells subjected to five consecutive exposures to shear stress. (I) Quantification of cell attachment onto the collagen matrix, following shear stress of RB-high TKCC-05 cells±PD-0332991 treatment, measured 24 hours post-seeding. Y-axis values (P5/P0 ratios) are values for cells subjected to five exposures to shear stress divided by values for cells not exposed to shear stress. (J) Quantification of apoptosis in RB-negative TKCC-27 cells±PD-0332991 (1 µM) 24 hours following shear stress. (K) Quantification of cell attachment onto the collagen matrix, following shear stress of RB-negative TKCC-27 cells±PD-0332991 treatment. Data are shown as mean±SEM (n=3 biological repeats with two collagen-coated wells per condition). Significance was determined by one-way analysis of variance, followed by Tukey post hoc multiple comparisons test, where *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001. Unless specifically indicated, significance is compared against vehicle. DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole; GEM, gemcitabine.](http://www.marcconsult.com/content/gutjnl/67/12/2142/F5.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
高视网膜母细胞瘤(RB)表达式是普遍的人类胰腺导管腺癌(PDA),是独立的预后相关性疾病的人群。(A)的例子(左)RB-negative主要肿瘤(0);(中间)(1 +)和弱RB-positive肿瘤(右)RB-high肿瘤(2 +)。kaplan meier分析针对疾病的生存基于RB免疫组织化学(B和C)澳大利亚胰腺基因组计划(APGI) /国际癌症基因组协会(ICGC)队列和新南威尔士(D和E)胰腺癌网络(NSWPCN)病人队列。生存分析比较(B和D)这三个RB团体和(C和E) RB-high(2 +)与RB-low两集。p值,log-rank。(F)的例子(左)RB-high和(右)RB-low主要肿瘤和转移。(G)之间的RB地位协议主要和PDA的转移性肿瘤。遵守协议的数量是11(91.67%的观察),Kappa评分0.75 (SE的卡巴0.232,95%可信区间0.296到1.000),表明协议是‘好’的力量。
RB随后的潜在的预后价值在一个独立的验证病人NSWPCN队列20.(n = 314),类似的RB表达式和生存之间的关系是明显的在单变量(图6 d e,看到在线补充表8)和多变量分析(HR 1.364, p = 0.02,表1)。像大多数PDA患者目前先进的阶段,我们也评估了RB状态转移性疾病(n = 54;在网上看到的补充表11和12)。RB蛋白高表达在转移性标本的67%。RB表达式之间的匹配相关的小学和转移性肿瘤的PDA、可供12 54转移的样本,观察11例(91.7%;科恩Kappa评分0.75;图6做减法)表明该协议是“好”的力量。
总的来说,这些数据表明,很大比例的主要操作和转移PDA表达高水平的影响预后相关的RB。制药,既定的积极途径可能代表一个有吸引力的治疗目标,用免疫组织化学分析,RB作为一个潜在的简单的预后和预测生物标志物指导这种治疗方法。
讨论
尽管最近的重大努力开发新颖的治疗组合,41化疗仍是大多数晚期胰腺癌患者的护理标准,尽管仅略有改善生存。8临床管理的快速实现特定的乳腺癌,CDK4/6i越来越被测试在其他固体肿瘤。42 43这里,我们检查到通路抑制结合化疗是否代表一个可行的治疗方法对胰腺肿瘤的特点是G1/ S检查点畸变,频繁在PDA的分子景观。1我们展示强大的功效亚型的单药和联合CDK4/6i治疗PDA的特点是高RB表达,显著提高长期生存而推迟转移的发展强劲的PDA的体内模型。我们还透露,CDK4/6i单药治疗和联合治疗的有效疗效发生通过一个复杂的机制,涉及放松管制的肿瘤细胞信号和干扰周围ECM共同驱动的癌症细胞增殖、侵袭和转移6 30 44而揭示出一个新的角色CDK4/6抑制统治耐剪切应力,一个经常被忽视的premetastatic利基领域形成ctc。45 46
活动调查的主要区域是生物标记的识别到抑制的治疗反应。在黑色素瘤的临床前模型和胶质母细胞瘤,纯合子的损失,甲基化或突变CDKN2ACDK4/6i基因被证明与灵敏度,47 48虽然在诊所,CDK4/6i敏感性可能不是严格定义的p16的地位。49在这里,我们表明,RB表达式,但不是G1/ S检查点突变或p16的水平,可能提供一个健壮的分层生物标志物基于pd - 0332991治疗PDA的先进的临床前模型。
pd - 0332991一直被认为发挥抗肿瘤效应通过促进白细胞郁滞,也支持通过在PDA数据有限,即使用7天的评估增殖的读出pd - 0332991活动,早期疗效已经在几乎所有PDA测量外植体检查。18深层勘探的长期响应性pd - 0332991和联合治疗,直接与标准治疗相比,在这项研究强调了需要一个个性化的方法治疗胰腺癌,其中RB-high PDA肿瘤长期应对pd - 0332991治疗体内和RB-low / -肿瘤不。此外,根据最近的研究在其他癌症,这表明CDK4/6i更复杂的作用机制,包括EMT信号在乳腺癌转移的抑制作用50和改进抗肿瘤免疫力,51我们的研究提供了额外的新证据表明,pd - 0332991显示多方面影响肿瘤细胞(静止,细胞凋亡),改变ECM组织,减少耐剪切应力(图4),从而产生全球影响在这个积极的疾病,没有检查之前。
使用2 d、3 d体外和体内模型,我们特别表明,pd - 0332991明显凋亡RB-high胰腺肿瘤也设置和提高化疗的凋亡效应的宝石,同时和临床使用代理在PDA (图1 - 3)。监测体内肝转移的出现表明,pd - 0332991单药治疗和联合治疗显著受损肝脏殖民RB-high设置(图4 a e),延缓疾病进展转移PDA模型(图5)。值得注意的是,CDK4/6i可能是一个有益的二线治疗,在RB-high PDA宝石/ nab-Paclitaxel进展之后,作为我们的体内发现(图5 b)。鉴于化疗耐药性的高速率先进PDA患者接受这些化疗及其随后的极度贫困的结果,等待进一步的临床前研究,CDK4/6i-based方法可能是一个可行的二线治疗特定亚型的先进的PDA。
CDK4/6抑制调制ECM组织体外和体内(图2、5),体内反应pd - 0332991基础治疗与α-SMA的表达下降有关,已经被激活的标志和基质激活。作为我们的体外研究表明,抗增殖活性的影响ECM是独立的pd - 0332991,它是合理的假设,ECM力学变化引起的pd - 0332991可以直接破坏PSC激活,随后肿瘤cell-PSC相声,最终进一步改善治疗的敏感性。事实上,最近的研究表明,刚度矩阵和组织可以直接调节分化,已经被迁移。52
pd - 0332991和宝石强烈把p16和p53无关的状态(例如,胰腺肿瘤是否怀有一种灭活TP53突变(C124 *;PDX-26)突变导致部分救援(V173M;PDX-03)或高于野生型p53活动(G245S;PDX-05)。53CDK4 /CDK6放大或超表达与体外CDK4/6i阻力有关,47虽然CDK对pd - 0332991 4-amplified脂肪肉瘤是敏感。54有趣的是,CDK6-amplified PDX-26和匹配PDCL回应pd - 0332991为基础的治疗。这表明在PDACDK6放大功能的上下文中RB并不排除有效到通路抑制。尽管CDK6强烈功能联系到,这种酶可以发挥其他kinase-independent功能调节血管生成和/或细胞分化,55代表一个潜在的独立迄今为止在PDA CDK6抑制治疗未经检验的作用。
几个较小的研究调查了在PDA、RB的预后作用与不一致的结果。56这里,RB蛋白高表达在很大一部分的PDA (65%, APGI / ICGC;43%,NSWPCN;67%,转移队列),这表明这可能是一个可行的治疗目标定制CDK4/6i-based治疗作用于这个信号网络。此外,观察到的一致性在RB水平小组可用的匹配主要和转移性组织借希望转移可能仍然co-targeted这种疗法。RB蛋白损失与病人有关的结果,与RB DSS的一个独立预后因素在两个相当大的独立的PDA军团(表1)。RB免疫组织化学是一个干净的核染色没有相当大的背景。在我们的手中,似乎比较与雌激素受体(ER)染色的解释在加工材料强度。有待进一步验证,使用RB的组织的分析表达式可以用于诊断的临床应用,结合其他标记,帮助识别那些贫穷的预测也可能识别一群病人CDK4/6i审判。
总之,我们提供临床前概念验证疗效的个性化治疗策略使用CDK4/6i治疗RB-high PDA。我们揭示关键机制,CDK4-targeting疗法可以调节多种细胞过程和环境因素在原发性肿瘤,CTC过境期间二级网站和集体管理胰腺癌进展。我们希望有两个non-biomarker-driven I / II期试验的胰腺癌进行pd - 0332991 (NCT02501902,NCT03065062),这些发现可能有补充和潜在的重要治疗对PDA在未来的个性化治疗的影响。
确认
作者要感谢消费者代表Ros Pesman教授本杰明勇敢先生和简·芒福德女士为他们参与这个项目的评论手稿。周博士还想承认副教授艾德丽安莫雷导师在博士研究。
引用
脚注
贡献者研究概念和设计(MP, AJG, AC, SJC PT);数据采集(AC, DF、飞行员,利用DW,美联社,,RS,广告,KJM, JT);分析和数据解释(AC, DF, DW,美联社,曾经,TJM, JT,简历,KJM, AB,橙汁,JM);起草手稿(AC, DF, MP);评论和编辑的手稿(SJC AJG PT, AJ, JS, NW, SMG、虫胶、AB,委员会,真空断路,TJM,橙汁,JM);病人队列数据(APGI AJ,真空断路,JS、AJG JT, SMG);统计(AC, MC, MP, DKC);获得资金(MP, AJG, AC, SJC PT, JS,飞行员,AB, NW);研究监督(MP, AJG)。
资金这项工作得到了澳大利亚国家健康与医学研究理事会(NHMRC)项目资助1081312和1081312,癌症澳大利亚项目赠款1060522和1060522奖学金的支持癌症研究所新南威尔士、澳大利亚研究理事会和NHMRC奖学金支持NHMRC和悉尼催化剂和慈善的支持会员胰腺癌基础,胰腺癌的菲利普Hemstritch奖学金;莱恩·安斯沃思胰腺癌奖学金,房地产的RT大厅癌症基因发现和验证项目和诺曼绿色支持格兰特。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意细节已被删除从这种情况下描述/这些案例描述,以确保匿名性。编辑和审稿人的详细信息和满意的信息备份的情况下,作者。
伦理批准伦理批准收购数据和生物材料是人类研究伦理委员会获得每个参与机构(悉尼当地卫生区人类研究伦理委员会x11 - 0220)。体内实验得到Garvan /圣文森特动物伦理委员会的批准(14/11,14/12)。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。