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摘要
客观的肝细胞中游离脂肪酸(FFAs)的积累诱导脂毒性，导致非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。本研究旨在探讨FFA通过调节3-巯基丙酮酸硫转移酶(MPST)参与NAFLD发病机制的潜在机制，MPST是调节内源性硫化物氢(H2生物合成。
设计在小鼠和NAFLD患者中评估肝脏MPST表达。采用多种分子方法研究了MPST在体内外对肝脏脂肪变性的调控作用。
结果FFAs体外处理肝细胞后，MPST表达上调，部分依赖于NF-κB/p65。在高脂饮食(HFD)喂养的小鼠和NAFLD患者中，肝脏MPST表达显著增加。通过腺病毒传递MPST短发夹RNA或杂合缺失MPST的部分敲除Mpst基因显著改善hfd喂养小鼠肝脏脂肪变性。一致地，抑制MPST也减少了ffa诱导的L02细胞脂肪积累。有趣的是，抑制MPST显著增强而不是减少H2而过表达MPST显著抑制H . S的生成2年代生产。免疫共沉淀实验表明，MPST与胱胱硫氨酸γ-裂解酶(CSE)直接相互作用并负调控2S在肝脏中的产生。机制上，MPST通过抑制CSE/H促进脂肪变性2S以及随后固醇调节元件结合蛋白1c通路、C-Jun - n端激酶磷酸化和肝氧化应激的上调。
结论FFAs上调MPST在肝脏的表达，进而抑制CSE/H2S通路，导致NAFLD。MPST可能是NAFLD的潜在治疗靶点。
- 脂肪肝
- 肝脏代谢
- 肝细胞
- 硫化氢
- 氧化应激
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本研究的意义
关于这个主题我们已经知道了什么?
游离脂肪酸(FFAs)及其代谢产物是脂毒性的重要介质，导致非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的进展。
肝脏是调节硫化氢(H2S)新陈代谢，H2S稳态在肝脂毒性中起重要作用。
报道的证据表明，胱氨酸β-合成酶(CBS)和胱氨酸γ-裂解酶(CSE)系统有助于内源性H2S的生物合成，可能受到脂肪酸的调节。CBS/CSE系统在NAFLD发病机制中的作用已被积极研究，该系统被认为是NAFLD的潜在治疗靶点。
3-巯基吡喃酸硫转移酶(MPST)也是促成H2以3-巯基吡喃酸为底物，与以半胱氨酸为底物，以PLP为底物的CBS/CSE体系不同，采用不依赖于pyridoxal-5 ' -phosphate (PLP)的方式合成。
新的发现是什么?
FFAs在高脂饮食(HFD)喂养的小鼠和NAFLD患者中诱导肝脏MPST蛋白表达上调。
肝H2在体内和体外NAFLD模型中，S合成受损。MPST部分敲低显著升高H2S水平直接与CSE相互作用并负调控。
通过腺病毒传递MPST短发夹RNA或杂合缺失MPST的部分敲除Mpst基因显著改善hfd喂养小鼠肝脏脂肪变性。在ffa处理的L02细胞中，小干扰rna介导的部分敲除MPST减少了脂肪积累，而MPST过表达加剧了脂肪积累。
MPST上调固醇调节元件结合蛋白1c通路、C-Jun - n端激酶磷酸化和肝氧化应激，这是通过抑制CSE/H介导的2年代。
在可预见的未来，它会对临床实践产生怎样的影响?
MPST可能是NAFLD的潜在治疗靶点。
抑制MPST可能是治疗NAFLD的一种新的治疗策略。
简介
非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是西方国家最常见的肝脏疾病，在普通人群中患病率为20%-30%。1 2该疾病包括广泛的临床病理，从单纯脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH);后者可进一步发展为肝硬化和肝细胞癌。3 4全世界NAFLD患者的数量正在以惊人的速度增长。然而，其发病机制仍然知之甚少，但由于目前的治疗方案有限，因此引起了极大的兴趣。
新出现的数据表明，在NASH患者中，脂肪酸通过肝脏的通量增加。5游离脂肪酸(FFAs)及其代谢产物是脂毒性的重要介质，通过诱导脂质过度积聚，引起脂毒性肝细胞损伤和NAFLD的进展。6然而，脂肪酸引起脂肪毒性的确切机制尚不清楚。
硫化氢(H2S)，几个世纪以来，它一直被认为是一种臭鸡蛋味的有毒气体，7已被确定为继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子，参与广泛的生理过程，包括炎症、凋亡、血管舒张和神经调节。8 - 10H的作用2S在NAFLD中的作用在近二十年来得到了广泛的关注。肝脏是调节H的重要器官2年代的新陈代谢。11相反,H2S在肝脏疾病的病理生理中起重要作用。12H2S对缺血再灌注和四氯化碳致鼠肝损伤有保护作用。13 - 15近年来的研究表明，H2在高脂肪饮食(HFD)喂养的小鼠和NASH大鼠中，S受损。16日17用氢硫化钠(NaHS)处理2S供体，通过减少氧化应激和抑制炎症来预防啮齿动物的NASH。17日至19日这些发现表明H2S稳态在肝脂毒性中起重要作用。然而，如何H2S生物合成在NAFLD中是否受到调控尚不清楚。
在哺乳动物组织中，H2半胱氨酸可通过pyridoxal-5 ' -phosphate (PLP)依赖酶，包括胱胱硫氨酸β合成酶(CBS)和胱胱硫氨酸γ-裂解酶(CSE)产生S;前者主要在大脑中表达，后者在血管和肝脏中表达。20.3-巯基吡喃酸硫转移酶(MPST)是另一种以3-巯基吡喃酸为底物生成H的酶PLP2年代。21CBS/CSE系统可能受几种脂肪酸的调控，在NAFLD的发病机制中被积极研究，并被认为是NAFLD的潜在治疗靶点。22然而，MPST在NAFLD中的作用尚未被研究。到目前为止，MPST是否参与了肝脏脂质代谢的调节以及NAFLD的发病机制尚不清楚。
在本研究中，我们研究了脂肪酸参与NAFLD发病的潜在机制，包括MPST在NAFLD发生发展中的作用。我们的结果提供了新的证据，FFAs刺激NAFLD中肝脏MPST的表达，而上调的MPST通过抑制CSE/H促进NAFLD2年代的途径。
材料与方法
人类的样本
肝移植供体为健康成人(n=19)和NAFLD患者(n=37)，这些患者因疑似NAFLD或NASH或在肝脏手术中进行了肝活检，是从浙江大学医学院第一附属医院招募的肝活检样本中随机选取;杭州师范大学附属医院;上海交通大学医学院附属仁济医院;杭州市第六人民医院;宁波市医疗中心李慧丽医院。纳入标准和患者的临床特征在网上提供补充数据．本研究使用的患者肝组织样本均经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准，所有患者均提供书面知情同意书。
补充文件1
动物实验
将含有绿色荧光蛋白(AD-GFP)编码序列和MPST短发夹RNA (AD-shMPST)的腺病毒质粒静脉水动力注射给雄性C57BL/6小鼠以抑制肝脏MPST的表达。杂合性MPST缺陷(MPST+/-)小鼠在C57BL/6背景下由北京视固生物科技(北京，中国)通过tal -效应核酸酶系统移码突变产生。生成策略和所有动物处理的详细说明在在线补充数据和在线补充图1．所有动物实验均按照浙江大学医学院附属第一医院动物护理使用委员会批准的指导方针进行。
其他材料和方法在网上补充资料中有详细说明。
结果
FFAs在hfd喂养小鼠和NAFLD患者中上调肝脏MPST表达
先前的一项研究表明，CBS/CSE系统可能受到FFAs的监管。22在这里，我们确定FFAs是否也调节MPST。为了验证这一假设，我们用FFAs刺激人肝细胞细胞系，建立肝细胞脂肪变性的体外模型(在线)补充图2A, B)并测量MPST的表达。如图1一个和在线补充图2C在FFA刺激的L02细胞和7701细胞中，FFA处理显著上调了MPST蛋白的表达。NF-κB是FFAs的重要下游信号，23简化MPST表达(图1 b)，而过表达NF-κB/p65可增强ffa刺激的L02细胞中MPST的表达(图1 c)．接下来，我们研究了FFAs是否也上调了hfd喂养小鼠体内MPST的肝脏表达，与对照组相比，肝脏FFA水平显著升高(图1 d)．如图1 e，与对照饮食喂养的小鼠相比，hfd喂养的小鼠肝脏MPST蛋白表达上调了约1.5倍。最后，我们测量了NAFLD患者肝活检中的MPST蛋白水平，这些患者表现出通过肝脏的FFA通量增加和循环中的FFA浓度升高(在线)补充表1)．5日24如图1 f免疫组化实验显示NAFLD患者脂肪变性肝细胞细胞质内MPST蛋白表达明显高于健康对照组，通过对MPST阳性区域积分光密度半定量分析进一步证实了这一点。此外，NAFLD患者肝脏脂肪变性面积与MPST表达呈正相关(图1 g)．总的来说，这些数据表明，肝脏脂肪变性与ffa诱导的NAFLD中MPST的上调有关。
(a)用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时，然后进行western blot分析。(B)用吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(NF-κB特异性抑制剂)(100µM)预处理L02细胞1小时，然后用FFAs (1 mM)处理24小时。进行Western blot分析。(C)将pENTER-NF-κB/p65质粒或空载体转染到L02细胞24小时后，进行FFA处理24小时。进行Western blot分析。获得8周hfd喂养小鼠和scd喂养小鼠的肝组织，并对其进行肝内FFA测量(D)或western blot分析(E)。柱状图显示了标准化至微管蛋白后，通过免疫印迹法定量的MPST相对丰度。(F)对照组(n=19)和NAFLD患者(n=37)肝脏切片免疫组化染色的代表性图像。原放大倍数，上面板，×200;下面板，×400。图像右侧显示MPST阳性区域IOD的半定量分析。 (G) The area of steatosis positively correlated with MPST expression in the livers of patients with NAFLD. The results are expressed as the mean±SD of five mice per group or three independent experiments in A–E. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. FFA, free fatty acid; HFD, high fat diet; IOD, integral optical density; MPST, 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase; NAFLD, non-alcoholic fatty liver disease; SCD, standard chow diet.
在体内，部分敲除MPST可显著改善肝脏脂肪变性
为了研究MPST在NAFLD中的作用，我们首先应用重组腺病毒介导的RNA干扰方法抑制hfd喂养小鼠肝脏MPST的表达。如图2一个，注射腺病毒后，肝脏MPST的表达在信使RNA (mRNA)水平上被抑制了大约40%，在蛋白质水平上被抑制了60%。值得注意的是，肝脏MPST表达部分下调后，肝脏脂肪变性得到改善，如H&E和油红O染色所示(图2 b)及测量甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)水平(图2 c)．此外，MPST敲除后，肝脏FFA水平和血浆TC水平也降低(图2 c,在线补充表2)．MPST敲低后血浆转氨酶水平也有降低的趋势，但差异没有达到统计学意义(在线)补充表2)．
在体内，部分敲除MPST可显著改善肝脏脂肪变性。(A-C) hfd喂养的C57/BL6小鼠给予1×109从实验开始每2周通过尾静脉注射AD-GFP或腺病毒介导的MPST (AD-shMPST)空斑形成单位，并在高fd喂养8周后处死。(A)对肝组织进行western blot检测MPST蛋白水平(上)或real-time qPCR检测MPST mRNA水平(下)。(B) hfd喂养小鼠感染AD-GFP和AD-shMPST后肝脏H&E和Oil Red O染色的代表性图像。原始放大×400。(C)肝组织进行肝内FFA测定(左)、肝内TG测定(中)或肝内TC测定(右)。(D-F) MPST+/+和MPST+/-小鼠连续8周食用HFD。(D)对肝组织进行western blot检测MPST蛋白水平(上)或real-time qPCR检测MPST mRNA水平(下)。(E) hfd -喂养MPST肝脏切片H&E和Oil Red O染色代表图像+/+和MPST+/-老鼠。原始放大×400。(F)肝组织进行肝内FFA测定(左)、肝内TG测定(中)或肝内TC测定(右)。结果以2个独立实验中每组3-5只小鼠的平均值±SD表示。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。FFA，游离脂肪酸;甘油醛-3-磷酸脱氢酶;HFD，高脂肪饮食;MPST, 3-巯基丙酮酸硫转移酶;qPCR，定量PCR; TC, total cholesterol; TG, triglyceride.
为了进一步研究MPST部分缺失对NAFLD、杂合子MPST的影响+ / -小鼠及其野生型(WT)对照(MPST+/+)进行了8周的高热量饮食。如图2 dhfd喂养的MPST在蛋白和mRNA水平上均降低了肝脏MPST的表达+/-与WT对照组小鼠进行比较。根据腺病毒介导的MPST在hfd喂养小鼠中部分敲除的作用，MPST在MPST中部分缺失+/-小鼠的脂肪肝表型显著改善(图2 e）;降低肝脏FFAs和TG及TC含量(图2 f）;并降低血浆TC水平，特别是极低密度脂蛋白胆固醇(在线)补充表3)．hfd喂养的MPST的血浆丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶水平也有下降趋势+/-与WT对照组小鼠进行比较(在线补充表3)．综上所述，这些结果表明MPST是促进NAFLD发展的重要因素。
在体外实验中，MPST的部分下调显著减弱，而MPST的过表达加剧了ffa诱导的肝细胞脂肪积累
为了研究MPST对体外培养的ffa诱导的肝细胞脂肪堆积的影响，用MPST小干扰RNA (siRNA)在培养的肝细胞中下调MPST的表达(图3一)，而敲低显著改善了脂肪堆积(油红O染色图3 b)以及ffa刺激的L02细胞内TG和TC含量(图3 c)．相比之下，通过转染pIRES2-GFP-MPST质粒过表达MPST (图3 d)明显增加脂质积聚(图3 e)以及ffa刺激的L02细胞中TG和TC水平的升高(图3 f)．
在体外实验中，MPST的部分下调显著减弱，而MPST的过表达加剧了ffa诱导的肝细胞脂肪积累。(A-C)用siRNA(阴性对照)和MPST siRNA转染24小时后，用FFAs处理L02细胞24小时。(A) Western blot和qPCR分析MPST的表达。(B)显示L02细胞Oil Red O染色的代表性图像。原始放大×400。(C)测定细胞内TG和TC含量。(D-F)用含有或不含全长MPST DNA的GFP质粒转染24小时后，用FFAs处理L02细胞24小时。(D) Western blot和qPCR分析MPST的表达。(E)显示L02细胞Oil Red O染色的代表性图像。原始放大×400。 (F) The intracellular TG and TC contents were determined. The results are expressed as the mean±SD of three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. FFA, free fatty acid; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GFP, green fluorescent protein; MPST, 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase; mRNA, messenger RNA; qPCR, quantitative PCR; siRNA, small interfering RNA; TC, total cholesterol; TG, triglyceride.
部分敲低肝脏MPST显著增加H2年代生产
MPST是H的重要产生剂2S，在生理或病理生理条件下对维持正常脂质代谢起关键作用。12 25 26因此，我们推测MPST通过调控H2年代生产。首先，我们测量H2S水平在hfd喂养小鼠和ffa处理的L02细胞。如图4HFD喂养显著降低肝H2S水平(图4一)， FFA处理可降低上清液H2L02细胞的S水平(图4 b)．其次，我们研究了部分下调肝MPST对肝H的影响2S水平在hfd喂养小鼠和ffa处理的L02细胞。出人意料的是，通过腺病毒介导的短发夹RNA (shRNA)传递或杂合缺失部分敲除MPST显著上调肝H2hfd喂养小鼠的S水平(c, D)．与体内结果相似，sirna介导的部分敲除MPST显著升高H2ffa处理的L02细胞上清液中S的含量(图4 e)，而过表达MPST使H .2ffa处理的L02细胞上清液中S的含量(图4 f)．
MPST的部分敲低显著增加H2年代的水平。(A)用hfd和scd喂养8周小鼠的肝组织进行肝内H2年代测量。(B)用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时，收集新鲜上清液测定H2年代的水平。(C) hfd喂养的C57/BL6小鼠给予1×109从实验开始每2周通过尾静脉注射AD-GFP或腺病毒shMPST (AD-shMPST)形成斑块单位，并在高fd喂养8周后处死。肝内H2年代测量。(D)肝内H2HFD-fed MPST中的S水平+/+和MPST+/-老鼠。(E)用siRNA(阴性对照)和MPST siRNA转染24小时后，用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时。采集新鲜上清液测定H2年代的水平。(F) L02细胞转染含GFP质粒和全长MPST DNA转染24小时后，用FFAs处理24小时。采集新鲜上清液测定H2年代的水平。结果用2个独立实验或3个独立实验每组3-5只小鼠的均值±SD表示。* * * p < 0.05, p < 0.01。FFA，游离脂肪酸;GFP，绿色荧光蛋白;H2S，硫化氢;HFD，高脂肪饮食;MPST, 3-巯基丙酮酸硫转移酶;siRNA，小干扰RNA。
部分敲低肝脏MPST通过直接的MPST - CSE相互作用上调CSE
MPST是H的产生器2但出乎意料的是，我们上述数据显示，部分敲除MPST后，肝脏H升高2体内和体外的S水平。目的:阐明MPST对H2我们在STRING数据库中搜索了潜在的mpst相互作用蛋白27(在线补充图3A)并发现MPST与CSE(也称为CTH)有潜在的功能联系，主要的H2s生成酶，主要表达在脉管系统和肝脏(在线补充图3B)．MPST-CSE相互作用预测得分为0.977，在十大以mpst为中心的功能蛋白相互作用网络中排名第一(在线)补充图3C)．有趣的是，在hfd喂养的小鼠中，通过腺病毒介导的shRNA递送或杂合缺失部分敲除MPST显著上调肝脏CSE表达(图5A、B)．体外实验结果也显示，部分敲除MPST可显著增强CSE的表达(图5 c)，而过表达MPST可降低ffa处理的L02细胞中CSE的表达(图5 d)．
MPST的部分敲低通过与CSE的相互作用上调CSE。(A) hfd喂养的C57/BL6小鼠给予1×109从实验开始每2周通过尾静脉注射AD-GFP或AD-shMPST形成斑块单位，高热量fd喂养8周后处死。western blot检测肝组织CSE蛋白表达。(B) hfd喂养的MPST中肝脏CSE表达的Western blot分析+/+和MPST+/-老鼠。(C)用siRNA(阴性对照)和MPST siRNA转染24小时后，用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时。Western blot检测CSE蛋白表达。(D)用含有GFP的质粒转染或不含全长MPST DNA 24小时后，用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时。Western blot检测CSE蛋白表达。(E)免疫印迹分析MPST与CSE相互作用的共免疫沉淀。ffa处理后的L02细胞转染Flag-MPST，并用抗flag单克隆抗体进行免疫沉淀。用抗CSE抗体检测共免疫沉淀CSE。结果用2个独立实验或3个独立实验每组3-5只小鼠的均值±SD表示。* * * p < 0.05, p < 0.01。 CSE, cystathionine γ-lyase; FFA, free fatty acid; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GFP, green fluorescent protein; HFD, high fat diet; IB, immunoblot; IP, immunoprecipitation; MPST, 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase; siRNA, small interfering RNA.
为了验证蛋白质-蛋白质相互作用的预测，我们制备了稳定表达Flag-MPST L02细胞，并进行免疫共沉淀(co-IP)试验(在线)补充图3D)．我们的结果显示FFA处理后MPST和CSE之间有显著的相互作用(图5 e)．
MPST衰减H2生成S并随后通过cse依赖机制促进肝细胞脂肪积累
以上数据表明，MPST下调了CSE的肝脏表达。最近的报告已经确定了CSE/H的作用2促进脂肪肝发展。25 28因此，我们假设mpst诱导H2通过CSE的代偿抑制促进S的产生。为了验证这一假设，我们首先测量了肝脏CSE水平。与上述hfd喂养的小鼠和ffa处理的L02细胞中MPST的上调相反，在这些条件下，CSE的肝脏表达下调(在线)补充图4A, B)．其次，我们用siRNA敲低CSE表达(在线补充图4C, D)定义CSE在mpst介导的H .2S.如下图所示图6抑制MPST可上调CSE蛋白在肝脏中的表达，而抑制CSE可增加MPST在肝脏中的表达。图6B, C结果表明，MPST的抑制作用使上清液H2S水平降低，细胞内TG水平降低;这两种作用均被CSE siRNA逆转。有趣的是，H2观察S水平和细胞内TG含量(图6 d)．这一观察促使我们调查H2S负责防止肝细胞内脂质沉积。我们发现NaHS (H2S供体)减少了ffa刺激的L02细胞的脂质积累(在线补充图5A, B)并抑制MPST和CSE的表达(在线补充图5C)．此外，外生H2添加S可降低MPST和CSE siRNAs处理的L02细胞内TG含量(图6 e)．最后，ffa处理的细胞与NaHS的孵育阻止了MPST过表达引起的脂肪积累的加剧(图6 f)．这些数据表明MPST对H2S通过cse依赖机制产生，H2S介导MPST调节肝细胞脂肪变性的强效抗脂肪肝作用。
MPST衰减H2生成S并通过CSE依赖机制促进肝细胞脂肪积累。(A-C)用siRNA(阴性对照)和MPST siRNA转染24小时后，L02细胞分别转染或不转染CSE siRNA 24小时。然后用FFAs (1 mM)处理细胞24小时，并进行western blot分析(A)。收集新鲜上清液测量H2具有代表性的Oil Red O染色图像和细胞内TG含量的测量结果见(C)。原始放大倍率×400。(D)上清液H2分析ffa处理的L02细胞S水平和细胞内TG含量。(E)用MPST siRNA和CSE siRNA转染的L02细胞用NaHS (1 mM)预处理2小时，然后用FFAs (1 mM)加或不加NaHS处理24小时。测定细胞内TG含量。(F) L02细胞用NaHS (1 mM)预处理2小时，然后用FFAs (1 mM)加或不加NaHS处理24小时。有代表性的油红O染色图像和细胞内TG含量的测量结果。结果用三个独立实验的平均值±标准差表示。*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001。胱氨酸γ-裂解酶;FFA，游离脂肪酸;甘油醛-3-磷酸脱氢酶; H2S，硫化氢;MPST, 3-巯基丙酮酸硫转移酶;NaHS，硫化氢钠;siRNA，小干扰RNA;TG,甘油三酸酯。
SREBP-1通路参与MPST对肝细胞脂肪积累的调控
从头脂肪生成(DNL)可以通过增加固醇调节元件结合蛋白1c (SREBP-1)来扩增，SREBP-1是一种中央转录因子，可诱导参与脂肪酸DNL、肝脏TG和胆固醇合成的酶的表达。29SREBP-1在动物模型中的过表达已被确定为脂毒性肝损伤的一个因素。30.
有趣的是，以往的研究表明，H2S是通过调节SREBP-1的表达介导的。17日31日本研究还发现，在ffa处理的L02细胞中，SREBP-1表达水平的上调被外源性H抵消2这表明H2S主要通过调节SREBP-1调节脂代谢(在线补充图5C)．因此，我们假设MPST通过调控H2S的产生和SREBP-1的表达。如图7在hfd喂养的小鼠中，抑制MPST显著降低了SREBP-1蛋白及其下游蛋白包括脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的肝脏表达。与体内实验结果一致，在ffa刺激的L02细胞中，MPST的下调显著抑制了SREBP-1及其下游蛋白的表达(图7 b)．相反，MPST的过表达显著上调了ffa刺激的L02细胞中SREBP-1、ACC和FAS的表达(图7 c)．此外，在ffa处理的L02细胞中，通过CSE siRNA处理，MPST siRNA介导的SREBP-1、ACC和FAS的下调得以恢复(图7 d)．最后，co-IP实验结果证实了MPST和SREBP-1之间的蛋白-蛋白相互作用。
SREBP-1通路参与mpst调控的肝细胞脂肪积累。(A) hfd喂养的C57/BL6小鼠给予1×109从实验开始每2周通过尾静脉注射AD-GFP或AD-shMPST形成斑块单位，高热量fd喂养8周后处死。对肝组织进行western blot分析。(B)用siRNA(阴性对照)和MPST siRNA转染24小时后，用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时。Western blot检测SREBP-1、FAS、ACC蛋白表达。(C)用含有或不含全长MPST DNA的GFP质粒转染24小时后，用FFAs (1 mM)处理L02细胞24小时。进行Western blot分析。(D) NC和MPST siRNA转染24小时后，L02细胞分别转染或不转染CSE siRNA 24小时。然后用FFAs (1 mM)处理细胞24小时，并进行western blot分析。(E)免疫印迹分析MPST与SREBP-1相互作用的共免疫沉淀。ffa处理后的L02细胞转染Flag-MPST，并用抗flag单克隆抗体进行免疫沉淀。 Co-immunoprecipitated SREBP-1 was detected with an anti-SREBP-1 antibody. The results are expressed as the mean±SD of five mice per group or three independent experiments. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. ACC, acetyl-CoA carboxylase; CSE, cystathionine γ-lyase; FAS, fatty acid synthase; FFA, free fatty acid; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GFP, green fluorescent protein; HFD, high fat diet; IB, immunoblot; IP, immunoprecipitation; MPST, 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase; siRNA, small interfering RNA; SREBP-1, sterol regulatory element-binding protein 1c.
脂肪酸氧化紊乱也解释了肝脏中过量的脂质储存。肝脏中脂肪酸氧化途径的关键酶受过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)调控，其表达在H2s调节的肝脏脂肪变性。17日31日然而，在本研究中，我们发现在hfd喂养的小鼠中，部分敲除MPST并不影响主要由PPARα调控的脂肪酸β-氧化相关基因的表达(在线)补充图6A, B)．在ffa处理的L02细胞中，MPST的过表达也不影响PPARα靶向下游基因的表达(在线补充图6C)．此外，内源性H2S和外生H2添加S影响ffa处理的L02细胞中CPT1A、FGF21、中链酰基辅酶a脱氢酶或长链酰基辅酶a脱氢酶蛋白水平(在线补充图6D, E)．这些数据表明，脂肪氧化途径可能不参与MPST对NAFLD的调控作用。
抑制MPST可减弱JNK磷酸化，改善肝脏氧化应激
H2S还被报道通过抑制C-Jun - n端激酶(JNK)信号通路来保护肝脏损伤，32它在脂肪性肝细胞中被激活并调节氧化应激和随后的炎症。33 34因此，我们评估了MPST对JNK信号、氧化应激和炎症的影响。如图8A, B，肝脏MPST的下调显著抑制了hfd喂养小鼠肝脏中JNK的磷酸化(图8)，在ffa处理的L02细胞中(图8 b)．相反，过表达MPST显著增强了ffa刺激的L02细胞中JNK的磷酸化(图8 c)．
MPST抑制JNK磷酸化，改善肝脏氧化应激，抑制MCP-1的释放。(A - C) Western blot和JNK磷酸化与JNK总磷酸化之比的定量，通过密度法从标准化后的免疫印迹定量到GAPDH表达，从经AD-shMPST或AD-GFP处理的hfd喂养的小鼠(A)，从经siMPST或siNC转染的FFA处理的L02细胞(B)或经GFP- mpst或GFP转染的FFA处理的L02细胞(C)。短发卡RNA或载体转染和FFA处理与其他图中所述相同。(D)腺病毒介导敲除MPST后hfd喂养小鼠的肝组织进行肝内MDA测定(左图)。用NC或MPST siRNA转染L02细胞24小时，然后用FFAs (1 mM)处理24小时。测定细胞内MDA含量和SOD活性。(E) NC和MPST siRNA转染24小时后，L02细胞分别转染或不转染CSE siRNA 24小时。然后用FFAs (1 mM)处理细胞24小时，并测量细胞内MDA含量。(F)用腺病毒介导的MPST敲除hfd喂养的小鼠肝脏组织，实时定量PCR检测MCP-1 mRNA水平(上图)。采集血浆样本，用ELISA试剂盒检测MCP-1水平(下图)。结果以每组5只小鼠或3个独立实验的平均值±SD表示。 *p<0.05, **p<0.01. (G) Proposed model by which FFA promotes NAFLD via the dysregulation of the MPST/H2年代的途径。在NAFLD中，升高的FFA通量上调肝脏MPST的表达，然后通过直接的MPST - CSE相互作用下调CSE的表达，从而降低H2年代生产。减少的H2S水平导致生脂酶SREBP-1及其下游基因ACC、FAS的表达增加，导致脂肪酸的重新合成增加，进而导致TG和胆固醇含量增加，从而引发肝脏脂质堆积加重、VLDL分泌增加的恶性循环。另一方面，还原后的H2S水平可激活JNK磷酸化信号，加重肝脏氧化应激，并引发MCP-1释放，协同促进NAFLD的加重。ACC，乙酰辅酶a羧化酶;胱氨酸γ-裂解酶;FAS，脂肪酸合成酶;FFA，游离脂肪酸;甘油醛-3-磷酸脱氢酶;GFP，绿色荧光蛋白;HFD，高脂肪饮食;JNK, C-Jun n端激酶;MDA(丙二醛; MPST, 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase; mRNA, messenger RNA; siRNA, small interfering RNA; SOD, superoxide dismutase; SREBP-1, sterol regulatory element-binding protein 1c; TG, triglyceride; VLDL, very-low-density lipoprotein.
肝内FFAs水平的增加提供了氧化应激的来源，因此，脂质过氧化促进NAFLD的进展。35我们发现，在hfd喂养的小鼠和L02细胞中，抑制肝脏MPST显著降低了肝内丙二醛(MDA)含量，而抑制MPST显著增强了L02细胞中的超氧化物歧化酶活性(图8 d)．此外，siRNA进一步敲低CSE可以恢复simpst处理的L02细胞中MDA的含量(图8 e)．在炎症基因中，hfd喂养小鼠在部分敲除肝脏MPST后，肝脏MCP-1基因的表达和循环水平显著降低(图8 f,在线补充图7)，而大多数其他炎症基因谱和循环炎症生物标志物在MPST抑制后没有改变(在线补充图7)．
讨论
在本研究中，我们提供了ffa诱导的肝细胞中MPST的病理性上调通过抑制CSE/H参与NAFLD的发病机制2S通路及其引起的SREBP-1、JNK和氧化应激通路上调。我们已经将这些发现整合到一个模型中(总结在图8 g)，描述了FFAs促进NAFLD的一个新的重要途径。下面的讨论将介绍该模型的合理性。
内源性H受损2据报道，S的合成与肝纤维化和肝硬化有关13 36 37高热量饲料诱发脂肪肝16日26日或蛋氨酸和胆碱缺乏(MCD)饲粮。17在本研究中，我们也证实了H2在NAFLD的细胞和小鼠模型中，S水平降低。然而，H2NAFLD中S合成受损尚不清楚。CBS/CSE系统被认为是内源性H的主要来源2而MPST在H的生成中起着截然不同的作用，MPST以3-巯基吡喃酸为底物，在非生理碱性条件下获得最大活性2年代。38以往的研究表明，缺乏CSE的小鼠内源性H2年代水平,10 25这与CSE在促进H2年代生产。理论上，MPST也刺激H2从过硫受体底物产生硫。21然而，令人惊讶的是，在目前的研究中，我们发现通过腺病毒介导的shRNA或杂合缺失的shRNA来抑制MPSTMpst基因显著增加H2S的产生和减弱hfd诱导的肝脏脂肪变性。我们的机制研究表明，MPST抑制H2通过降低CSE的产量。此外，我们提供了几行证据表明MPST通过蛋白-蛋白相互作用下调CSE。首先，基于蛋白质相互作用数据库的预测，我们发现MPST和CSE之间存在直接的功能相互作用。对STRING数据库的分析显示，MPST-CSE相互作用的预测得分在前10个以mpst为中心的功能蛋白相互作用网络中排名第一。其次，MPST表达的中度降低导致肝脏CSE表达的显著上调，而MPST的过表达导致CSE表达的显著下调。最后，co-IP分析表明，MPST与CSE直接相互作用，建立了两者之间反馈规则的分子机制2S-generating酶。此外，通过抑制mpst敲低ffa处理的L02细胞中CSE表达上调，我们发现H2与siMPST单独组相比，S水平显著降低，验证了mpst介导的H . S抑制的CSE依赖性2年代生产。这些结果表明，MPST和CSE之间存在负反馈，它们相互合作以维持H2S-metabolism体内平衡。有趣的是，在hfd喂养的小鼠肝脏中，CBS和CSE之间也发现了类似的代偿调节。16类似地，另一项最近的研究报道了dl -丙甘氨酸，CSE的抑制剂，增加了肝细胞中cbs介导的脱硫作用，这意味着H2年代生产。39
到目前为止，H2S对肝脂代谢的影响尚不清楚。最近的一项研究发现H2S处理降低了hfd喂养小鼠的血清TG水平并抵消了脂肪变性。26之前的研究已经证明了内源性H2S水平对cse缺陷或cbs缺陷小鼠血脂谱的影响。25 36在本研究中，我们发现肝内H2在hfd喂养的小鼠中，MPST部分敲除诱导的S水平与肝脏脂肪变性减弱有关。在培养细胞中，H2S水平与细胞内TG含量呈负相关。此外，我们提供了几行确凿的证据支持H2s介导的脂肪变性改善。首先，抑制CSE消除了mpst敲低细胞中CSE的代偿性上调，导致肝细胞脂肪变性反弹。其次，在ffa刺激的L02细胞中，NaHS改善了脂质积累，并防止了MPST过表达引起的脂肪积累的加剧。最后，外生H2在H降低的肝细胞中，S的补充逆转了细胞内TG含量的增加2MPST/CSE双重抑制后S下降。总的来说，受损H2S的合成可能是NAFLD的重要原因，MPST通过抑制H2年代生产。
当前研究的另一个重要发现是确定了H2S调节脂质代谢。肝脏脂质积累是脂质合成和脂质处理不平衡的结果。我们发现H2在MPST抑制后，在NAFLD的细胞和小鼠模型中，S水平与SREBP-1、FAS和ACC的显著抑制相关。相反，MPST过表达使H2促进SREBP-1的表达。进一步研究表明，外源H2添加S抑制了FFA刺激激活的SREBP-1的表达，而MPST和CSE的双重抑制降低了H2S的产生并增强了SREBP-1通路。这些结果表明H2S通过调节SREBP-1途径调节肝脏脂质代谢，这是脂质合成的关键因素。β-氧化是脂质代谢控制的另一个重要步骤，其中PPARα除了介导诱导性线粒体和过氧化物酶脂肪酸β-氧化外，还在调节编码几种线粒体脂肪酸分解酶的基因表达中起着核心作用。然而，我们的结果表明，H2体内外MPST调控引起的S水平不影响ppar α调控的脂肪酸β氧化相关基因的表达。此外，两者都没有还原H2S的产生是由于MPST/CSE的双重抑制和外源H2添加S可改变β-氧化途径相关基因的表达。因此，MPST对肝脏脂肪变性的调控作用在很大程度上依赖于srebp -1介导的脂质合成过程，而不依赖于脂肪酸氧化途径。
H2S也可能通过独立于srebp -1的机制调节NAFLD的发生。最近的一项研究表明H2S通过抑制JNK信号通路减弱肝细胞凋亡来保护肝脏缺血再灌注损伤。32作为肝脏脂毒损伤的主要效应因子，JNK通路在脂肪变性肝细胞中被激活，抑制JNK可以通过改善氧化应激和随后的炎症来保护肝细胞免受损伤。33 34在这项研究中，我们发现H2在hfd喂养的小鼠和ffa刺激的L02细胞中，MPST沉默诱导的S水平与肝脏JNK磷酸化的显著抑制相关，而H2MPST过表达诱导的S水平则相反。此外，肝脂毒性已知会产生氧化应激和炎症，40和H2补充S已被证明可以通过抑制氧化应激和抑制炎症来预防mcd诱导的大鼠NASH。17在目前的研究中，我们还发现H2S水平与氧化应激的显著改善和MCP-1表达的显著抑制相关，这表明mpst调节H2S是JNK信号通路和氧化应激以及炎症参与NAFLD发病机制的重要中介因子。
这项研究的发现为开发NAFLD的潜在治疗策略提供了新的线索。增加的内源性H2S是CSE在部分敲除MPST后代偿生成的产物，能不依赖受体轻易跨膜扩散，并能激活各种细胞靶标，是一种很有吸引力的药物。17MPST对H的具体调控机制有待进一步研究2S产量及其对NAFLD的后续影响。
综上所述，我们的研究为肝脂毒性的机制提供了新的见解，ffa诱导的MPST上调通过调控H2S以cse依赖的方式，确定MPST可能是NAFLD的潜在治疗靶点。
致谢
感谢朱华佗、佟荣亮、尹翔、宋圣文、杨梅、杨本以及浙江大学医学院附属第一医院外科肝胆胰外科联合多器官移植重点实验室的师生给予的杰出技术支持。我们感谢高斌教授(美国国立卫生研究院)对手稿进行了严格的修改和编辑。
参考文献
脚注
ML、CX和JS的贡献相当。
贡献者ML和CX设计并执行了研究，分析了数据并撰写了论文。JS收集患者数据，分析数据并对手稿进行批判性修改。JD、XW、JG、DC、CL、JZ、YL、ZT、XK进行了研究。YL和CY设计了研究，并对手稿进行了批判性的修改。
资金国家自然科学基金(No 81230012)资助YL, 81470838资助CX, 81570523资助CY。资助者在研究设计、数据收集和分析、关于数据发布或手稿准备的决策中没有发挥任何作用。
相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会。
出处和同行评审不是委托;外部同行评审。