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客观的胃癌是癌症相关死亡的第二大原因,第五届全球最常见的恶性肿瘤。在这项研究中,人类和小鼠胃癌瀑样疾病模型,进行药物测试生成描述治疗策略。
设计人类胃癌瀑样文化建立了样本分类根据其分子概要文件和他们对常规化疗的反应测试。进行有针对性的治疗,根据特定制药突变。小鼠胃癌瀑样文化生成分子subtype-specific改变。
结果建立了二十人胃癌瀑样文化和四个选择进行全面深入的分析。瀑样展示不同的生长特性和形态。免疫组织化学显示类似的特征对应的主要组织。发散回应5-fluoruracil,铂,伊立替康、表阿霉素和多西他赛治疗观察。全基因组测序揭示突变谱,与先前发现微卫星不稳定,基因组稳定的胃癌和染色体不稳定的亚型。突变景观允许与曲妥珠单抗靶向治疗ERBB2改变和palbociclibCDKN2A的损失。老鼠癌症瀑样带喀斯特和Tp53或Apc和背景突变特征,作为模型系统研究诱导的信号通路。
结论我们人类和小鼠胃癌瀑样造型生成典型特征和改变人类胃癌的途径。成功干扰途径激活了他们的潜在有用的生活治疗反应测试的生物标志物。
- 胃癌
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来自Altmetric.com的统计
本研究的意义
已知在这个问题上是什么?
瀑样概括的器官来自很多方面。
癌症瀑样已被证明是一个有价值的工具之间的2 d细胞基于行的药物屏幕和病人试验。
有什么新发现吗?
人类胃癌生物银行可以成立。
人类胃癌瀑样显示不同对化疗的反应。
靶向治疗使用胃癌瀑样测试是可行的。
小鼠胃癌瀑样作为模型系统定义的遗传背景。
它会如何影响临床实践在可预见的未来吗?
胃癌瀑样可能作为活的生物标记物预测个体患者的治疗反应和阻力,从而指导个性化的治疗方法。
介绍
胃癌是最常见的第五全球恶性肿瘤和癌症相关死亡的第二大原因。1此外,腺癌的oesophagogastric结(AEG)构成一个实体与胃癌发病率上升和组织学重叠。2 3几个胃癌的组织学亚型分化腺癌的90%以上。虽然世卫组织分类四个主要类型的胃腺癌,4劳伦的标准作为使用最广泛的分类区分肠,扩散和混合类型。5癌症基因组图谱(TCGA)研究网络特征胃腺癌分为四个不同的分子子组6:那些积极的eb病毒(EBV)与频繁PIK3CA突变和CDKN2A沉默,一个微卫星不稳定(MSI)亚型hypermutation表型、基因稳定(GS)显示弥漫性组织学亚型和频繁背景和RHOA突变和染色体不稳定(CIN)亚型显示非整倍性和频繁的突变TP53以及活化的受体酪氨酸激酶(RTK) ras途径。AEG的分子描述显示高相似性CIN亚型的胃癌。7
胃癌的预后往往是穷人。频繁,缺乏临床症状导致延误诊断和四分之三的患者呈现non-curable先进的疾病。8手术是唯一的治疗选择。此外,跨学科的方法包括新辅助和辅助化疗导致改善生存率。9日10最常用的化疗药物对胃癌fluoropyrimidines(即5-fluoruracil(研究者用),卡培他滨,s - 1),铂化合物(即奥沙利铂、顺铂)、多烯紫杉醇和表柔比星。9 - 11除了经典化疗、基因改变代表小说分子靶点的治疗方案。到目前为止,唯一批准曲妥珠单抗靶向治疗,单克隆抗体抑制表皮生长因子受体2(她)信号和anti-vascular血管内皮生长因子(VEGF)抗体ramucirumab。12日13等有针对性的疗法抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体西妥昔单抗和帕尼单抗或抗vegf抗体贝伐单抗未能改善生存率。原因之一可能是失踪的可用性相关的生物标志物指导靶向治疗的病人。
最近开发的三维(3 d)文化系统称为“瀑样”在临床个性化治疗开辟了新的机会测试。最初开发基于小肠干细胞的生长需求,瀑样到现在已经发展了几个器官包括胃幽门和语料库的干细胞。14日至17日瀑样忠实地反映出组织的许多方面他们来自如分化能力组织血统以及干细胞自我更新。18 19人类胃瀑样已被证明是一个有价值的工具来研究病原体感染。20 21基于文化的方法正常组织成功的协议开发几个人类癌症。22 - 24瀑样文化的优点是短时间内建立与异种移植模型和操作的简便性。25日26日大瀑样个别病人样本的集合函数作为人类生物银行。其效用已经证明,例如,对于结直肠癌生物,可以让病人治疗和个人化的药物筛选筛选新的疗法。27除了主要cancer-derived瀑样,建立胃肠道瀑样从转移病变是可行的和治疗这些瀑样概括对应患者的临床反应。28
在这项研究中,我们人类胃癌瀑样精致的文化协议,根据其分子分类样本资料,评估他们的化疗反应,进行有针对性的治疗方法根据特定制药突变。
材料和方法
人类瀑样文化
人类胃癌及正常胃瀑样通过细菌培养如前所述,每周两次的分流比1:2/1:3。20.治疗化疗后进行24小时使用研究者用播种,铂,伊立替康、表阿霉素和多西他赛。选择瀑样服用曲妥珠单抗(赫赛汀,罗氏),palbociclib(没有S1116, Selleckchem)和伊马替尼(没有ST1571, Selleckchem)。进一步的信息在网上补充的方法。
补充材料
全基因组测序和RNA序列
全基因组DNA测序的瀑样进行HighSegXten (Illumina公司)使用340 ng DNA。DNA分离通过苯酚/氯仿提取和异丙醇沉淀根据标准协议。瀑样RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒)。进行测序与NextSeq500 (Illumina公司)和样品浓缩后TruSeq链RNA图书馆准备工具包(Illumina公司)使用200 ng RNA。详细的生物处理方法可以在网上找到补充的方法。
路径分析
基因集富集分析使用R包fgsea和KEGG通路和基因本体术语。29 30−log10 (p值)* log2(褶皱变化)作为排名功能和100 000排列p值的计算途径。使用R包pathview KEGG通路被绘制。31日
统计分析
统计分析使用学生的t检验和比较正常与癌症或癌症治疗与治疗(* < 0.05;* * < 0.01;* * * < 0.001)。图生成使用棱镜(GraphPad)。IC50与非线性回归计算确定。免疫印迹实验量化使用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)。
结果
人类胃癌瀑样的文化
组织在组织学诊断胃或得到oesophagogastric腺癌手术切除标本(图1一个)。文化开始使用相同的瀑样中胃部正常组织。20.增加成功的起始瀑样文化和减少携带的出现以及正常胃腺体,组织消化法和时间以及处理孤立的肿瘤块优化(网上所描述的补充的方法)。总的来说,20胃癌瀑样的文化可能会启动。我们选择四个瀑样行进一步的分析基于其高增长率的分裂率1:2/1:3每周两次。这些瀑样线显示不同形态表型,说明不同的分子基因型(图1 b)。DD107(来自语料库癌)有一个囊性增厚上皮结构。DD109 (AEG I)展示了一种非相干似的增长模式。DD191 (AEG II)和DD282(窦癌)有一个紧凑的形态没有腔,DD282是极其耐离解。正常胃瀑样(DD320N DD379N、DD392N DD399N)呈现单一层上皮和cyst-like结构。瀑样线都是不断在文化超过1年没有增长的行为或形态学表型的变化。另外,冻结和解冻周期并不影响或改变这些生长特性(数据没有显示)。胃癌瀑样扩散速度不同,但所有百分比高于正常瀑样(图1 c)。为了描述生长因子依赖,我们省略了一个接一个的每个相关媒体复合正常瀑样增长(图1 d)。总的来说,瀑样线之间的反应明显不同。正常瀑样长期增长只有在完全培养基。漏报A38-01 Fgf10和Wnt没有癌症表型影响线。‘诺金’,Egf和Wnt的组合加上Rspondin不同程度很重要。塑料电镀瀑样的2 d烧瓶导致附件的细胞,但进一步使通过机械分离或酶消化是不可能的(数据没有显示)。在异种移植移植实验中癌症瀑样行皮下注射在老鼠的后腿。观察肿瘤生长中所有瀑样线每个鼠标(图1 e)。人类起源的异种移植被antinucleoli染色证明(网上补充图1)。瀑样线显示最低的体外增殖率(DD191)也显示体内最慢增长。
补充材料
人类胃癌瀑样文化扩大体外。(一)计划的癌症瀑样文化建立和执行分析。(B)代表四个不同的癌症瀑样线的照片和一个法线(100比例尺µm)。(C)增殖率的胃瀑样评估一个EdU扩散试验。(D)媒体组件损耗。每个注释组件是省略了从完全培养基和瀑样后5周。(E)的生长曲线瀑样异种移植为每个瀑样线)(n = 3。
分析如果瀑样保持类似的特征在文化作为他们来自的癌症,我们执行不同的免疫组织化学反应为典型的胃癌标志物,也就是说,细胞角蛋白,钙粘着蛋白17日carcinoembryonal抗原和高碘酸希夫反应(图2所示模拟)。这些反应比较主要的组织以及异种移植肿瘤。瀑样线以及异种移植派生忠实地和永久地重现了相应的主要癌症的免疫组织化学特征。
人类胃癌瀑样保持主要肿瘤的特征。免疫组织化学(A) DD107, (B) DD109, (C) DD191并使用他,(D) DD282 carcinoembryonal抗原(CEA)、细胞角蛋白7 (CK7),钙粘着蛋白17 (Cadh17)和高碘酸希夫(PAS)反应的主要癌症,瀑样和organoid-derived异种移植肿瘤(比例尺50µm)。
发散回应的胃癌瀑样常规化疗
胃癌患者新辅助治疗的目的与常规化疗反应不同程度,记录了他们的组织学回归等级。32调查如果胃癌瀑样反映这种发散反应我们对待瀑样线与常规化疗通常用于胃癌治疗,也就是说,研究者用,铂,伊立替康、表阿霉素和多西他赛。细胞生存能力化验记录不同对治疗的反应(图3 a e)。特别是对于研究者用、伊立替康和表柔比星四条线的反应差异很大。按照可行性分析结果,响应瀑样开始分解(在线和黑暗补充图3 a e)。研究者用不同反应的治疗方法是进一步分析膜联蛋白V /碘化propidium流式细胞术在两行显示差距最大的响应(实验示例图3 f)。减少响应行DD109可行性的分析显示,在正常情况下活细胞平均64.0%,略微转向61.7%在治疗1µM研究者用。另一方面,在响应线DD282膜联蛋白V染色从平均增加11.6%到41.7%的早期凋亡细胞和6.5%至16.4%的晚期凋亡细胞在治疗。只有平均30.0%的细胞治疗的影响,符合细胞生存能力结果记录响应DD282研究者用。一般来说,电阻可以记录模式,例如,DD109相对耐研究者用和表柔比星,而DD191相同的药物反应良好。同时,DD109伊立替康治疗反应良好,虽然DD107显示反应只有在更高的浓度。正常瀑样回应在一个相似的范围内化疗的癌症瀑样并显示特别是研究者用和铂微分响应之间的瀑样线(在线补充图2和表2)。原因比较、化疗反应是另外几个经典的二维分析胃癌细胞系(即AGS、KatoIII Snu1和Snu5)(在线补充图4)。倾向于更高的IC50值,因此更多的阻力在瀑样线,尤其是对铂和伊立替康(在线补充表2)。综上所述,至少对体外治疗,一个活跃的传统化疗药物可以被定义为每个癌症,以及潜在的阻力模式。
补充材料
补充材料
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人类胃癌瀑样显示不同疗法对常规化疗。(安妮)治疗后细胞生存能力分析5-fluoruracil(研究者用),铂,伊立替康、表阿霉素和多烯紫杉醇在不同浓度。分析铂、伊立替康、表阿霉素和多西他赛治疗24小时后进行。瀑样对待研究者用后处理分析了72个小时。值是正常治疗控制瀑样相同的病人。使用膜联蛋白V / propidium (F)细胞凋亡测定碘(PI)流式细胞术(三个独立实验的一个例子是显示)。
突变的胃癌瀑样
从瀑样和相应的正常组织基因组DNA(白细胞)以及瀑样RNA进行详细的基因组和转录组分析。此外,主要的肿瘤在原始测序验证突变的组织。全基因组测序揭示了一个广泛的突变谱和特征匹配DD191 DD282前面描述的MSI亚型,DD107 GS亚型和DD109 CIN亚型(图4)。6未发现遗传EBV的痕迹在瀑样线。每megabasepair突变率(Mb)中不同的样本,显示低突变率DD107和DD109(32和42个傻瓜/ Mb)以及高突变率DD191(445狗/ Mb)和DD282(297狗/ Mb)。类似的模式在整体体细胞突变被发现数与191年和175年的其实或剪切位点突变DD107 DD109,分别和2401年和1814年的其实或剪切位点突变DD191 DD282,分别(在线补充表3)。这些值与平均值的观察,TCGA亚型GS, CIN MSI和163年,分别为123年和1312年的突变(图4)。
补充材料
胃癌的分子特性瀑样相比,癌症基因组图谱(TCGA)队列。癌症瀑样线被分配到微卫星不稳定(MSI)基因组稳定(GS)和染色体不稳定(CIN)亚型。代表是体细胞拷贝数畸变(大会)、微卫星不稳定性(MSI)状态,eb病毒(EBV)地位,突出基因和突变特性。状态显示为高(红色)、低(橙色)和稳定(浅灰色)和存在与否的特性分别在黑色或白色。* DD282携带一个MSH6突变输送微卫星不稳定。
经常突变基因在胃癌中发现我们的队列。一种和MSH6沉默,这两个关键基因在DNA错配修复,与微卫星不稳定,出现在DD191 Lys435fs突变和DD282 Arg248fs,分别。CDKN2A损失,目前在大多数GS情况下,被发现在DD109 biallelic删除与顺向的重要upregulation CDK4/6-E2F下游目标乳腺癌易感基因1和MYB(在线补充表3)。33 34TP53,本质上突变在CIN情况下,表现出一个停止Arg280 * DD109的突变。一个激活杂合的Glu542Lys突变PIK3CA,也出现在TCGA EBV, MSI和GS亚型,被发现在DD107和三个激活的杂合突变,即Arg88Gln Cys378Arg和Asp805Asn DD282中找到。一个主要的ERBB2放大以及激活Ser310Phe突变检测DD109 DD107,分别。评估如果这两个不同的改变确实导致RTK-RAS途径激活,RNASeq数据的ERBB2目标基因进行分析。这两个ERBB2放大以及Ser280Phe突变影响显著的原癌基因介导的靶基因的表达CCND2,CDKN1A和THBS1(在线补充表3)。35 36进一步组成错义突变在癌症相关的基因突变CDK10(Gly249Arg),极品(Gly13Asp),FGFR2(Glu201Lys)和SUFU(Asp182Asn) DD107(在线补充表3和图5)。DD109显示一个杂合的停止突变ARID1A(Gln1365 *)而DD282展出两个的杂合突变(Gln1614 *和Leu1816fs)。突变签名显示主要C > T > G基地交流DD191和DD282 C > T > C和一个小学位DD107 > G基本交流,而DD109同等分布的各种基本交流。类似的分布发现,TCGA样本(图4)。
圆环块整体胃癌瀑样的基因和染色体特征。代表DD107 (A), DD191 (B), DD109 (C)和DD282 (D)。从外部到内部:已知的致癌基因(绿色:错义、黑色:想法,看起来相当不可理喻红:放大,蓝色:删除),染色体编码变量表示成小方块(格林:错义,黑色:停止或接头地点,红色:转移),拷贝数变异(CNV)散点图和获得(红色)或丢失(蓝色)地区以及染色体间(红色)和染色体内(蓝色)重组大于1 Mb。CIN,染色体不稳定;GS基因稳定;MSI,微卫星不稳定。
体细胞拷贝数畸变(大会)是目前在所有情况下。DD107显示小染色体重组而DD109强烈的基因组重排(在线补充图5一个),从而表现出典型特征的GS和CIN亚型,分别。尤其是染色体9、11和17 DD109显示强大的染色体内重组,而染色体易位被发现之间的各种其他的基因组。DD191和DD282没有任何染色体间重排但表现出高微卫星不稳定性(图5 c, D),没有在其他两种情况。
补充材料
综上所述,DD191和DD282分配给MSI亚型的存在一种和MSH6突变和微卫星不稳定。基因组的稳定性,PIK3CA以及ERBB2突变与DD107 GS亚型。DD109加上的高度重新安排基因组TP53突变和ERBB2放大被认为是特征匹配这瀑样线CIN亚型。瀑样线都是用相同的培养基培养表明文化方法不排除某些分子亚型。测序的主要肿瘤显示驱动突变和拷贝数守恒畸变瀑样(网上补充图5 b, C和表3)。
靶向治疗在胃癌瀑样测试
个性化的抗癌治疗带来巨大的肿瘤学的未来的承诺。37然而,许多方法目标具体包括表皮生长因子受体信号途径在胃癌,肝细胞生长因子/遇见或纤维母细胞生长因子受体(FGFR)通路已经失败了;一个原因是缺乏预测治疗反应的生物标记物。38探讨胃瀑样作为活的生物标志物的潜在使用治疗反应,激活途径基于单个瀑样线的突变模式定义(在线补充表4)。我们观察到一个已知的激活HER2受体突变(Ser310Phe)在DD107和意义不明的一个变体(VUS开头;在DD282 Gly201Asp)。突变Ser310Phe位于胞外受体和药物敏感的领域。6 39此外,我们发现一个放大DD109 ERBB2受体,可经免疫组织化学(图6)。Anti-HER2曲妥珠单抗治疗用抗体导致DD107生存能力降低到70.6%,DD282 DD109为79.2%和85.6% (图6 b)。VUS开头DD282可能因此实际上构成一个激活突变。为了探索的可行性测试组合治疗兵团,已知的两行携带Her2受体激活改变(DD107和DD109)和曲妥珠单抗治疗+研究者用。13曲妥珠单抗的累加效应相比,研究者用就可以观察到在两个瀑样线完全死在最高浓度,而研究者用一只可能导致减少最多40%(在线的可行性补充图6)。进一步描述曲妥珠单抗治疗的效果我们分析的磷酸化水平extracellular-signal调节激酶1/2 (ERK1/2)的下游成员RAS / RAF信号级联。而对于DD107 DD282没有改变被检测到,DD109表达下调的磷酸化水平ERK1/2 55% (图6 c, D)。显然,DD107显示,最高在曲妥珠单抗治疗的反应和携带一个激活Her2基因突变,信号通过一个独立的RAS / RAF路径,而DD109古典放大会使RAS / RAF信号级联。
补充材料
补充材料
针对突变的通路在人类胃癌瀑样。(一)免疫组织化学ERBB2确认的基因组扩增DD109(比例尺50µm)。(B)细胞生存72小时后测量0.1µM曲妥珠单抗。学生的学习任务处理和未经处理的;* * < 0.01;* * * < 0.001。免疫印迹(C)和密度测量分析(D) ERK1/2和phospho-ERK1/2后72小时的0.1µM曲妥珠单抗。(E)免疫印迹phospho-c-KIT 24小时100年后µM DD109 (p.Glu142Asp伊马替尼治疗c - kit突变)。(F)针对CDK4/6 DD109 (biallelic损失CDKN2A)和DD191(没有CDKN2A变更)以及DD320N(正常控制)使用5µM palbociclib。扩散分析治疗24小时后使用一个EdU化验。(G)长期治疗(11天,两个分裂)使用10µM palbociclib导致的损失DD191 DD320N文化(100比例尺µM)。
的DD109瀑样线进行干细胞生长因子受体的突变(c - kit)基因。突变是位于外显子3 (p.Glu142Asp),该编码受体的细胞外领域的一部分。这种氨基酸的突变c - kit之前我们的知识没有描述;这对c - kit突变信号的影响是未知的。100µM伊马替尼治疗,一个街区激活c - kit的酪氨酸激酶抑制剂,导致脱磷酸作用的受体(图6 e)。
此外,DD109怀有biallelic DNA的损失CDKN2A轨迹。CDKN2A肿瘤抑制基因p16的编码,起着重要的作用在调节细胞周期通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4/6) 4/6。我们对待DD109 DD191 (CDKN2A没有突变)和DD320N(正常控制)与palbociclib瀑样,CDK4/6的有效抑制剂。发现一个完整的块扩散DD191以及正常DD320N EdU扩散试验,而DD109表现出强烈的减少2%的细胞仍然骑自行车(图6 f)。长期治疗与palbociclib包括两次使DD191导致损失和DD320N文化中,表示一个完整的抑制增殖。DD109瀑样仍安然无恙(现在和表型图6克),而其经济增长来衡量分裂率以及EdU抑制试验。我们的结论是,DD109 p16的丧失导致的生存由于堵塞palbociclib CDK4/6的不足。
鼠标瀑样让胃癌模型定义的突变谱
人类胃癌瀑样允许一个详细的分析的干扰为个别病人一个激活途径。由于高的突变总数(平均140 GS和CIN亚型)靶向药物的影响总是需要解释的完整的突变谱出现在特定的瀑样线。为了建立模型深入分析路径干涉定义突变谱,我们选择了结合诱导突变等位基因频率在CIN和GS亚型在老鼠模型中。CIN亚型的特点是TP53RTK-RAS信号突变和活跃。基于自己的计算TCGA的公开数据的数据集,6突变出现在80%和57%的情况下,分别结合影响CIN病例的48%。为了模型CIN亚型胃癌,诱导突变的等位基因突变的两大特点,也就是说,喀斯特G12D和Tp53R172H结合(CIN模型)。6 40 41GS亚型细胞活性基因的突变背景和RHOA在45%的情况下。模型GS亚型液氧等位基因背景是使用。此外,GS癌症经常港口致癌驱动突变转化生长因子β(TGF-β)(33%)、RTK / RAS(31%)和WNT通路(24%)。6我们选择模型一个激活使用液氧Wnt通路Apc等位基因(GS-WNT模型)。42作为stomach-specific诱导体内目前不可能由于缺乏stomach-specific Cre鼠标线,诱导的等位基因在体外重组。从小鼠胃语料库建立正常胃瀑样后,重组是使用Cre-GFP诱导表达腺病毒和基因分型(在线确认补充图7)。
补充材料
肿瘤模型使用语料库鼠标瀑样模拟染色体不稳定(CIN)和基因组稳定的胃癌(GS)亚型。(a)建立肿瘤瀑样分析了有关突变通道并与正常瀑样。(a - b, E-F)代表瀑样的照片显示形态学差异。CIN肿瘤显示光滑层上皮细胞与正常瀑样。GS-WNT肿瘤瀑样似的结构。(C、G)免疫组织化学的正常与肿瘤瀑样。CIN瀑样显示细胞核Tp53的积累。GS-WNT瀑样显示β-catenin积累在细胞核而正常瀑样显示膜性表达。(D)喀斯特通路的CIN瀑样被免疫印迹量化。肿瘤瀑样增加Erk1/2磷酸化与正常瀑样。 (H) Quantitative RT-PCR experiments of GS-Wnt organoids. Tumours showed an increased Wnt signalling as measured byAxin2和细胞周期蛋白D1表达水平与正常瀑样。治疗5毫米calphostin C途径活性下降(比例尺g 100µm,学生的学习任务处理和摘要* < 0.05;* * < 0.01)。(我)媒体组件版本。每个表示介质组件是省略了从整个媒介,瀑样通过每周两次在1:2比率。(J)单细胞镀瀑样。每口井的镀一百单个细胞和原始瀑样后7天计算。学生的学习任务肿瘤和控制(* < 0.05)。
CIN模型显示上皮增厚不规则,部分是多层次的,因此从同质单层正常胃瀑样表型不同的(图7 a, B)。的Tp53突变导致核积累相应的蛋白(图7 c)。Rtk / Ras激活信号记录了一个强大的Erk1/2磷酸化(图7 d)。因此,模型概括CIN癌症的关键特性:Tp53突变和Rtk / Ras途径激活。
的背景GS-WNT模型中的突变导致一个完整的结构改变对葡萄状形式与正常瀑样相比,引起的损失是携带者/ E-cadherin-mediated信息连接(图7 e, F)。的Apc损失导致异常的Wnt信号由核可观测的β-连环蛋白的积累(Ctnnb1)和Wnt信号基因的表达增加Axin2和CyclinD1(Ccnd1) (图7 g H)。GS-WNT模型的治疗与calphostin C,一个强有力的抑制剂β-catenin / TCF复杂,减少下游Wnt目标基因表达(图7 h)。的GS-WNT瀑样线因此构成模型系统来测试Wnt-activated GS癌症的靶向药物的效果。
进一步描述的变换瀑样病毒感染后,我们发布的‘诺金’,Wnt, Wnt + Rspondin Fgf10 Egf从媒体和比较了CIN GS-WNT模型与普通瀑样(图7我)。肿瘤瀑样未受影响而正常瀑样线丢了生长因子撤军后在不同的时间点。测试的能力不同的直线从单个细胞启动瀑样我们镀100单个细胞每7天培养后,数了数形成瀑样(图7 j)。瀑样形成效率的增加可能是肿瘤行记录,尤其是在GS-WNT模型。类似于人类瀑样线,这是不可能的文化鼠标肿瘤瀑样线塑料水瓶在更长的时间跨度(数据没有显示)。综上所述,只有两个癌症基因改变每个模型导致了一个健壮的转变瀑样线造型胃癌的分子亚型。
讨论
我们证明老鼠和人类的有用性胃癌瀑样研究分子突变模式及其对药物敏感性的影响。老鼠癌症瀑样与定义基因改变绕开经典问题的工作与癌症细胞系复杂突变景观难以解释。这些模型允许干扰个人的详细分析路径中定义的设置。人类瀑样线来自主要癌症,另一方面,模型测试的影响某些个别病人有针对性的药物。使用生物信息学,预测可以在给定的药物的潜在有效性为一个特定的突变,但往往高度改变遗传背景个体病人与癌症妨碍了精确预测,随着不同的激活或不激活通路可以相互干扰。人类癌症瀑样线允许药物测试生命系统,响应或电阻的结果同时发生突变的个体病人的礼物。它必须记住瀑样只由上皮细胞层没有周围的间质,血管或免疫细胞。癌症药物的微环境目标从而无法评估。
在这项研究中,我们说明了建立可能性大瀑样生物银行也为胃癌,类似于已被证明对结肠癌,前列腺癌和胰腺癌。22日24日27专注于四个胃癌瀑样线和不同的表型有关其增长模式(图1),我们首先分析他们的表型使用免疫组织化学染色通常用于胃癌病理特征。瀑样以及他们的异种移植在此拟表型的架构主要癌症源于(图2)。接下来,我们开始分析这些瀑样线经典化疗的反应。使用药物的选择是基于当前使用的临床治疗方案。9 - 11瀑样受到研究者用、铂、伊立替康、多烯紫杉醇和表柔比星,为每一个药物的反应可以记录(图3)。作为一个例子,DD109研究者用显示反应只有在较高的浓度,而DD191和DD282回应已经在低剂量(图3一)。每个瀑样行积极的化疗药物可以定义:例如,DD109显示抵抗大多数应用药物除了伊立替康(图3 c)。一样重要的个体病人定义一个“工作”药物是药物的定义存在一个固有的阻力,因此最有可能导致只有副作用和治疗反应。
全基因组测序允许我们匹配分析瀑样线最近描述胃癌的分子亚型,6DD107匹配GS, DD109 CIN和DD191以及DD282 MSI亚型,考虑体细胞突变和结构变化包括大会(图4和图5)。RNASeq数据提供额外的洞察下游靶基因和通路激活。识别已知的致癌基因或肿瘤抑制基因的突变允许我们测试瀑样线(在线靶向治疗的方法补充表4)。DD107携带一个已知的激活突变和DD282未知变量,而DD109显示的基因扩增ERBB2基因(HER2 / neu)。放大的ERBB2在胃癌在22%的情况下,可以成功目标与曲妥珠单抗,HER2受体抗体绑定,显示显著的整体生存利益在临床设置。13有趣的是,我们发现了一个在曲妥珠单抗治疗的反应的放大以及突变ERBB2瀑样线(图6)。此外,曲妥珠单抗结合研究者用治疗导致了添加剂(在线治疗的影响补充图6)。增殖作用的蛋白激酶(MAPK)通路以磷酸化ERK1/2只是表达下调的放大ERBB2瀑样行DD109 (图6 c, D)。突变线的作用机制仍不清楚ERBB2信号通过一组不同的下游信号通路。治疗的细胞系ERBB2前面展示的突变是导致混合反应,与一些突变对曲妥珠单抗,而另一些则没有。39使用瀑样,靶向治疗的有效性突变可以是专门为每个病人进行测试。
CDKN2A编码的重要的肿瘤抑制基因p16扮演重要角色在细胞周期控制和经常在胃癌突变。6DD109包含biallelic亏损CDKN2A我们对待palbociclib瀑样线,食品和药品管理局批准了CDK4/6抑制剂。瀑样增长被捕两个控制线路与功能CDKN2A导致死亡,而DD109继续显示2%的最小增殖细胞,这足够让行活着(图6 f, G)。一个可能的解释是由palbociclib的双重抑制细胞周期和功能CDK4/6控制线路,而在DD109的损失CDKN2A导致一个不完整的抑制细胞周期。43
线DD109携带未知突变的外显子3 c - kit受体。其他已知的突变也影响细胞外域激活下游信号通路。证实了这个假设一个强大的磷酸化Tyr719 c - kit,表明积极的信号(图6 e)。伊马替尼治疗导致脱磷酸作用的受体。瀑样也因此可以被用来描绘的治疗效果未知突变。
正如上面所讨论的,干扰到一个特定的信号通路的分析可以从其他受相声异常激活的信号通路。允许治疗干预的公正的测试,我们生成的两个鼠标瀑样模型定义的CIN和GS分子亚型突变负荷。瀑样带着热点突变Tp53R172H导致截断p53蛋白在细胞核的积累以及热点突变喀斯特G12D激活MAPK信号通路生成造型CIN亚型。激活突变导致的表型改变瀑样向多层非典型上皮与增加Erk1/2磷酸化激活MAPK信号指示(图7 d)。类似的观察也由李等使用collagen-based气液模型新生小鼠细胞直接转化的腺病毒Cre起始的文化。44瀑样造型GS-WNT亚型呈葡萄状结构导致扩散形态由于损失的信息连接,类似的古典弥漫型胃癌根据劳伦分类。随之而来的损失Apc导致增加的Wnt目标基因的表达,这可能是由calphostin C部分逆转治疗(图7 h)。两种肿瘤模型可以在未来遗传背景定义测试治疗干预。
总之,我们生成的人类和小鼠癌症瀑样代表典型特征和改变人类胃癌的途径。成功干扰途径激活了他们的潜在有用性测试对个别患者治疗反应和阻力。少数情况下,比较患者瀑样反应已经展示了高瀑样的预测能力。28包括瀑样并排临床试验和治疗他们的病人的瀑样派生的最终测试其效用作为生物标志物来预测个体治疗的反应。除了治疗反应测试,瀑样已经填补差距的传统2 d细胞系建立药物筛选和临床试验。
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确认
我们感谢Susanne辛德勒,亚历山大·克鲁格和卡佳舒曼优秀技术援助以及基因组学和蛋白质组学的核心设备,德国癌症研究中心(DKFZ)提供优秀的高通量测序服务。
引用
脚注
TS、SRM和AR同样起到了推波助澜的作用。
贡献者研究概念和设计:TS、SRM DES。收购数据:TS, SRM, FZ, CvN, AR,公斤,CS,党卫军,千瓦,HU, DEA, BK。分析和解释数据:所有的合作者。起草的手稿:TS、SRM DES。关键的修订手稿的重要知识内容:GBB, TW, DEA,可,JW。统计分析:TS、SRM FZ,公斤,汉堡王。
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相互竞争的利益没有宣布。
病人的同意获得的。
伦理批准伦理委员会涂德累斯顿(无EK451122014)。
出处和同行评议不是委托;外部同行评议。